肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo)vegf表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用途。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)研究，首次發(fā)現(xiàn)了肉桂醛能夠作為有效成分來誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌，能夠創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益和廣泛的社會(huì)效益。
【專利說明】
肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用途
[0001] 本申請(qǐng)是原申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為：2014-5-22;申請(qǐng)?zhí)枮椋?2014102198731;發(fā)明創(chuàng)造名稱為：肉桂醛在制備促血管新生藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑 中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 肉桂醛，英文名：Cinnamic aldehyde，分子式:C6H5CHCHCHo，分子量：132.16，CAS登 錄號(hào)：104-55-2，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0004]
[0005] 肉桂醛是一種醛類有機(jī)化合物，為黃色黏稠狀液體，天然存在于肉桂油、桂皮油、 藿香油、風(fēng)信子油和玫瑰油等精油中。自然界中天然存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)，該分子為 一個(gè)丙烯醛上連接上一個(gè)苯基，因此可被認(rèn)為是一種丙烯醛衍生物。
[0006] 最常用的肉桂醛合成方法是在近臨界水中，以苯甲醛和乙醛為原料，在無外加任 何催化劑的條件下，合成肉桂醛。天然肉桂醛可自肉桂油和桂皮油中，用亞硫酸氫鈉生成加 成物，再用堿分解分離，然后精制而得。
[0007]目前已公開的肉桂醛在醫(yī)藥方面的應(yīng)用包括：1.殺菌防腐，特別是對(duì)真菌有顯著 療效。對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌及金黃色葡萄菌、白色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、傷寒和副傷 寒甲桿菌、肺炎球菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、炭疽桿菌、腸炎沙門氏菌，霍亂弧菌等有抑制作 用。且對(duì)革蘭氏陽性菌殺菌效果顯著，可用于治療多種因細(xì)菌感染引起的疾病。最小抑制濃 度(MIC)為0.02-0.07ul/ml，對(duì)深部致病真菌MIC為0.1 -0.3ul/ml。2.抗?jié)?，加?qiáng)胃、腸 道運(yùn)動(dòng)。其作用機(jī)制是由于潰瘍活性因素（胃液與胃蛋白酶）的抑制與防御因素（胃粘膜血 流速率)的加強(qiáng)，以及抑制胃粘膜電位降低和對(duì)粘膜保護(hù)作用所致。除此之外，肉桂醛能降 低胰酶活性。肉桂醛系芳香性健胃驅(qū)風(fēng)劑，對(duì)腸胃有緩和的刺激作用，可促進(jìn)唾液及胃液分 泌，增強(qiáng)消化功能，解除胃腸平滑肌痙攣，緩解腸道痙攣性疼痛，有顯著的健胃、驅(qū)風(fēng)效果。 3.脂肪分解作用。肉桂醛具有抑制腎上腺素及ACTH對(duì)脂肪酸的游離，促進(jìn)葡萄糖的脂肪合 成作用，可用于血糖控制藥中，加強(qiáng)胰島素替換葡萄糖的性能，防治糖尿病。4.抗病毒作用。 對(duì)流感病毒，SVlO病毒引起的腫瘤抑制作用強(qiáng)大。5.抗癌作用?？梢种颇[瘤的發(fā)生，并具抗 誘變和抗輻射作用。6.降壓作用。對(duì)腎上腺皮質(zhì)性高血壓有降壓作用。7.壯陽作用。美國(guó)芝 加哥治療研究中心的一份研究表明，肉桂醛對(duì)男性壯陽有一定的功效。
[0008] 但是，目前關(guān)于肉桂醛在誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌方面的作用未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于公開肉桂醛作為促進(jìn)血管新生有效成分在制備血管新生促進(jìn) 劑中的新用途，并基于肉桂醛新用途的發(fā)現(xiàn)，提供了通過促進(jìn)血管新生產(chǎn)生治療作用的藥 物。
[0010] 本發(fā)明第一方面公開了肉桂醛作為促進(jìn)血管新生有效成分在制備血管新生促進(jìn) 劑中的新用途。
[0011] 進(jìn)一步的，所述血管新生促進(jìn)劑起到下列作用中的一種或多種：
[0012] a)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖；
[0013 ] b)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷愈合；
[0014] c)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞迀移；
[0015] d)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成；
[0016] e)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌；
[0017] f)激活PI3K/AKT信號(hào)通路；
[0018] g)激活 c-Raf/MEK/Erkl/2 信號(hào)通路，和/或
[0019] h)促進(jìn)傷口組織血管數(shù)目增加。
[0020] 本發(fā)明第二方面公開了肉桂醛在制備通過促進(jìn)血管新生產(chǎn)生治療作用的藥物中 的用途。
[0021] 進(jìn)一步的，所述藥物為促進(jìn)傷口愈合和/或創(chuàng)傷愈合和/或創(chuàng)面愈合的藥物。
[0022]優(yōu)選的，所述藥物為治療皮膚急性傷口、皮膚慢性創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的藥物。
[0023]更優(yōu)選的，所述藥物為預(yù)防和/或治療糖尿病引起的皮膚損傷的藥物。
[0024] 進(jìn)一步的，所述藥物為促進(jìn)側(cè)枝血管形成的藥物。
[0025] 優(yōu)選的，所述藥物為預(yù)防和/或治療冠心病心肌缺血的藥物。
[0026]本發(fā)明第三方面還公開了通過促進(jìn)血管新生產(chǎn)生治療作用的藥物組合物，所述藥 物的有效成分中含有肉桂醛。
[0027] 優(yōu)選的，上述藥物組合物中，肉桂醛為該藥物組合物的唯一有效成分。
[0028] 優(yōu)選的，上述藥物組合物中還包含藥學(xué)上可接受的載體。
[0029] "藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激 和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。"藥學(xué)上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的肉 桂醛傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體 或固體。
[0030] 藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖 類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物(如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤(rùn)滑劑(如硬脂 酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元 醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯 蓖麻油），潤(rùn)濕劑(如月桂基硫酸鈉），著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑，無 熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等;該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活性及生物 有效性等。
[0031] 本發(fā)明藥物組合物使用時(shí)，所述肉桂醛作為唯一有效成分，或者所述肉桂醛作為 有效成分之一，可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥 物劑型。
[0032] 優(yōu)選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、 口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可 以按照藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)定義理解，上述制劑的制備可以 按照藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)制劑的方法配制。
[0033] 優(yōu)選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑或口服液。
[0034] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述藥物組合物可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
[0035] 優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物組合物生產(chǎn)時(shí)可以通過濾膜過濾除菌，或者進(jìn)行高壓滅菌。
[0036] 肉桂醛作為活性成分的有效劑量可隨給藥模式和疾病的嚴(yán)重程度而變化。對(duì)大部 分大型哺乳動(dòng)物而言，每天有效成分肉桂醛的服用劑量約為0.01~l〇〇〇mg。優(yōu)選的，成人臨 床給藥量的范圍為0.01-200mg/日，更優(yōu)選為0.05-100mg/日。
[0037] 本發(fā)明的藥物具有明顯的促進(jìn)血管新生的作用，可用于多種原因引起的血管損傷 的治療。
[0038] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)研究，首次發(fā)現(xiàn)了肉桂醛作為有效成 分在制備血管新生促進(jìn)劑中的新用途以及肉桂醛在制備通過促進(jìn)血管新生產(chǎn)生治療作用 的藥物中的新用途。肉桂醛原料豐富，價(jià)格低廉，毒副作用小，劑型易于選擇，制劑成分明 確、制備工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)便于控制，具有良好的市場(chǎng)順應(yīng)性和應(yīng)用前景，能夠創(chuàng)造良好的 經(jīng)濟(jì)效益和廣泛的社會(huì)效益。
[0039] 附圖標(biāo)記
[0040] 圖1:肉桂醛對(duì)!1爪^08增殖的影響，林？〈0.01，*林？〈0.001￥8(3〇11廿〇1。
[0041 ]圖2:肉桂醛對(duì)HUVECs損傷愈合的影響，（A) (B)為劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，（C)為爬片實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，**P〈0 · 01，***P〈0 · OOlvs control 〇
[0042] 圖 3:肉桂醛對(duì)HUVECs迀移的影響，a · controI，b · 0 · ΙμΜ，c · ΙμΜ，d · 5μΜ，e · 10μΜ，*** Ρ〈0.OOlvs control。
[0043] 圖4:肉桂醛對(duì)HUVECs管腔形成的影響，a · control，b · 0 · ΙμΜ，c · ΙμΜ，cL 5μΜ，e · 10μ Μ，***Ρ〈0.OOlvs control。
[0044] 圖5:肉桂醛對(duì)HUVECs分泌VEGF的影響，*#Ρ〈0·OOlvs control。
[0045] 圖6:肉桂醛促進(jìn)AKT、eN0S蛋白磷酸化，**P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001vs control〇
[0046] 圖7:肉桂醛促進(jìn)c-Raf、Erkl/2、p38蛋白磷酸化。
[0047] 圖8:抑制劑對(duì)肉桂醛誘導(dǎo)的HUVECs增殖、VEGF分泌及AKT和Erkl/2蛋白磷酸化的 影響，***Ρ〈〇· 001 vs control，###Ρ〈0· 001 vs CA。
[0048] 圖9:野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷后的傷口面積，Ρ〈0.05vs control。
[0049] 圖10:小鼠皮膚組織病理學(xué)切片(H&E染色），4X 10放大倍數(shù)。
[0050] 圖11:小鼠皮膚組織的CD-31免疫熒光切片，10\20放大倍數(shù)，林撲〈0.001" control ο
[0051] 圖12: VEGF在野生型小鼠（A)和糖尿病小鼠（B)皮膚組織中的表達(dá)，#*P〈0.OOlvs control〇
【具體實(shí)施方式】
[0052]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)均按重量計(jì)。
[0053]實(shí)施例1肉桂醛促進(jìn)血管新生體外實(shí)驗(yàn) [0054](一)實(shí)驗(yàn)方法
[0055] 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購(gòu)自美國(guó)ALLCELLs公司，每批細(xì)胞的純度均95% 以上，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物(⑶31，vWF，⑶54)的表達(dá)，陽性率均達(dá)到 99%以上，鑒定為原代細(xì)胞。
[0056] 1.肉桂醛促進(jìn)HUVECs增殖實(shí)驗(yàn)
[0057]取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(111^^(^)，用如0813完全培養(yǎng)基制成5乂 104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以5 X 103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種到96孔板，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中；待 細(xì)胞貼壁良好以后，棄原培養(yǎng)基，換含1 % FBS和不同濃度肉桂醛(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢 定所公司，純度為98%以上）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基;對(duì)照組為含等量DMSO的不含藥培養(yǎng)基，陽性對(duì) 照組為加入VEGF(20ng/ml)的不含藥培養(yǎng)基;24小時(shí)后，加入CCK-8溶液（10μ1/孔），在培養(yǎng) 箱中反應(yīng)3小時(shí)，選取450nm波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度值(0D值）；增殖率％ = (0D給 藥/OD對(duì)照-I) X 100%。
[0058] 2.肉桂醛促進(jìn)HUVECs損傷愈合實(shí)驗(yàn)
[0059] 在24孔板中加入0.5%明膠(400μ1/孔），置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育至少2小 時(shí)后，棄明膠，晾干備用;取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs )，用MCDBl 31完全 培養(yǎng)基制成I X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以3 X 104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種到明膠包被的24孔板，置 于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中；待細(xì)胞貼壁良好以后，用200μ1槍頭在每孔中間位置垂直劃一道 直線，棄原培養(yǎng)基，PBS洗掉漂浮的細(xì)胞(洗2次即可），換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎(chǔ) 培養(yǎng)基;分別TO和T24時(shí)間點(diǎn)在同一位置于100倍顯微鏡下拍照，記錄劃痕距離;愈合率％ = (1-T24劃痕距離/TO劃痕距離）XlOO^j.爬片實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肉桂醛促進(jìn)HUVECs損傷愈合的能 力
[0060] 在12孔板中每孔放入一片直徑為13mm的圓形塑料蓋玻片，加入0.5%明膠(800μ1/ 孔），置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育至少2小時(shí)后，棄明膠，晾干備用;取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用M⑶Bl31完全培養(yǎng)基制成I X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以3 X 104 個(gè)/孔細(xì)胞密度接種到明膠包被的24孔板，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中；24小時(shí)后，用無菌鑷 子把每孔中的蓋玻片輕輕夾出來，棄原培養(yǎng)基，換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基;24小時(shí)后，按照細(xì)胞消化的方法將每孔細(xì)胞消化下來分別移至1.5ml離心管中，輕輕混 勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄每孔細(xì)胞數(shù)；用細(xì)胞數(shù)的多少來評(píng)價(jià)肉桂醛促進(jìn)HUVECs損傷愈合 的能力。
[0061 ] 4.肉桂醛促進(jìn)HUVECs迀移實(shí)驗(yàn)
[0062] 24孔板中每孔加入600μ1下室培養(yǎng)基（MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50ng/ml VEGF+10% FBS)，將Transwe11小室放入24孔板中；取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)， 用MCDB131基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成5 X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以5 X 104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種Transwell 小室中，加入不同濃度的肉桂醛，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中；24小時(shí)后，在一塊干凈的24孔 板中加入I3BS 600μ1/孔，將小室轉(zhuǎn)移至新24孔板中，用小棉球輕輕擦拭小室上表面(注：力 度要輕以免膜表面不平）；用1〇μΜ Hochest33258染色10分鐘(室溫，避光）；再取出另一塊干 凈的24孔板，加入4%多聚甲醛600μ1/孔，細(xì)胞固定15分鐘；于40倍熒光顯微鏡下每孔隨機(jī)5 個(gè)視野拍照;利用IPP圖像分析軟件計(jì)算每張圖片的細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0063] 5.肉桂醛促進(jìn)HUVECs管腔形成實(shí)驗(yàn)
[0064] 將96孔板和200μ1無菌槍頭在-20°C條件下預(yù)冷2小時(shí)，Matrigel膠4 °C解凍。在無 菌條件下，吸取Matrigel膠于96孔板中（50μ1/孔，避免產(chǎn)生氣泡），置于37°C、5 %C02培養(yǎng)箱 中1小時(shí)，待膠凝固后備用；取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用MCDB131基 礎(chǔ)培養(yǎng)基制成5 X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以5 X 104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于Matrigel膠包被的96 孔板中，加入不同濃度的肉桂醛，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中；4小時(shí)后，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視 野于40倍顯微鏡下拍照，利用Image pr〇-plUS(IPP)圖像分析軟件計(jì)算每張圖片的管腔數(shù) 目并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0065] 6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肉桂醛誘導(dǎo)VEGF釋放
[0066] 取指數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用M⑶B131完全培養(yǎng)基制成I X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以3 X 104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種到24孔板，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中；待 細(xì)胞貼壁良好后，棄原培養(yǎng)基，換含1%FBS和不同濃度肉桂醛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)照組為含等 量DMSO的不含藥培養(yǎng)基，分別在0、24、36、48、72小時(shí)收集細(xì)胞上清，4°(：，1500印111離心15分 鐘，取上清于-20°C保存待測(cè)。檢測(cè)方法參考試劑盒操作說明，所述試劑盒為Human VEGF ELISA試劑盒(eBioscience公司）。
[0067] 7. Western-Blot方法檢測(cè)肉桂醛誘導(dǎo)HUVECs各蛋白表達(dá)
[0068]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用MCDB131完全培養(yǎng)基制成1.5 X 105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，以3 X 105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種到6孔板，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中； 待細(xì)胞貼壁良好后，棄原培養(yǎng)基，換含I %FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓兩個(gè)小時(shí)，再加入不同濃度 藥物，分別作用不同時(shí)間后提取蛋白；棄原培養(yǎng)基，馬上用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后將 殘液完全吸凈，加入裂解液(90μ1/孔），冰上放置15分鐘(每隔5分鐘震搖培養(yǎng)板一次以便細(xì) 胞裂解完全）；將裂解勻漿收集于1.5ml EP管中，4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清;取少量 蛋白用于蛋白濃度測(cè)定，其余大部分蛋白加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘變性，于-20°C保存待 測(cè)。以每孔等量蛋白上樣于10 % SDS-PAGE，電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用相應(yīng)的單克隆 抗體檢測(cè)，以β-act in作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目標(biāo)蛋白與β-act in蛋白表達(dá)量比值表示。 [0069](二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0070] 1.肉桂醛對(duì)HUVECs增殖的影響結(jié)果
[0071]肉桂醛能夠顯著地誘導(dǎo)HUVECs增殖，加藥處理24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增 殖情況并計(jì)算細(xì)胞增殖率。結(jié)果如圖IA顯示，肉桂醛可呈濃度依賴性地促進(jìn)HUVECs增殖，在 ΙΟμΜ時(shí)增殖率達(dá)到33%。繼而進(jìn)一步觀察肉桂醛是否呈時(shí)間依賴性地促進(jìn)HUVECs增殖，結(jié) 果如圖1Β，活細(xì)胞數(shù)目可隨時(shí)間（6~24小時(shí)）依次增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖顯示，肉桂醛呈 現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
[0072] 2.肉桂醛對(duì)HUVECs損傷愈合的影響結(jié)果
[0073] 細(xì)胞劃痕結(jié)果如圖2A和圖2B顯示，加藥處理受損細(xì)胞24小時(shí)后，肉桂醛在Ο.ΙμΜ時(shí) 能夠顯著地促進(jìn)細(xì)胞損傷愈合，愈合率達(dá)到54.1 %，而此時(shí)對(duì)照組則僅為40.4% ;當(dāng)ΙΟμΜ濃 度時(shí)，損傷細(xì)胞已經(jīng)完全愈合。細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明肉桂醛的這一能力，如圖2C所示， 肉桂醛于IyM可顯著提高細(xì)胞數(shù)量，為對(duì)照組的1.15倍。提示，肉桂醛能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損 傷愈合且呈濃度依賴性。
[0074] 3.肉桂醛對(duì)HUVECs迀移的影響結(jié)果
[0075]內(nèi)皮細(xì)胞迀移是促進(jìn)血管形成因子和抑制血管形成因子相互作用的復(fù)雜的過程， 其表現(xiàn)了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，肉桂醛可顯著地誘導(dǎo)HUVECs迀 移，在濃度為〇. I，1，5和ΙΟμΜ時(shí)，迀移到膜下的細(xì)胞數(shù)分別為22，28，35，33個(gè)/視野。提示肉 桂醛能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞迀移。
[0076] 4.肉桂醛對(duì)HUVECs管腔形成的影響結(jié)果
[0077] 體外血管新生主要通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖、迀移及管腔形成等幾個(gè)步驟，管腔形成是 其中最為關(guān)鍵的一步。如圖4所示，與對(duì)照組相比，肉桂醛可顯著地誘導(dǎo)HUVECs管腔形成，于 ΙΟμΜ時(shí)，管腔結(jié)構(gòu)數(shù)目比對(duì)照組增加35% (P〈0.001)。提示肉桂醛能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管腔結(jié) 構(gòu)形成并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。
[0078] 5.肉桂醛誘導(dǎo)HUVECs分泌VEGF
[0079] VEGF是重要的促血管生成因子，在血管新生過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖5)，肉桂醛呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGFA.肉桂醛 對(duì)PI3Κ/ΑΚΤ信號(hào)通路的影響結(jié)果
[0080] ΡΙ3Κ/ΑΚΤ是血管新生過程中一條重要的信號(hào)通路，主要維持內(nèi)皮細(xì)胞生存與增 殖。肉桂醛對(duì)HUVECs胞內(nèi)PI3Κ/ΑΚΤ信號(hào)通路的影響結(jié)果顯示，肉桂醛誘導(dǎo)AKT及其下游蛋白 eNOS磷酸化呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。如圖6Β所示，肉桂醛于5分鐘時(shí)誘導(dǎo)AKT磷酸化直至 120分鐘。同時(shí)其可誘導(dǎo)AKT下游信號(hào)分子eNOS于5分鐘時(shí)磷酸化直至60分鐘（圖6D)。如圖6A 和圖6C所示，隨著肉桂醛濃度的增加（1~10μΜ)，AKT、eNOS的磷酸化水平依次提高。提示肉 桂醛能夠顯著性地激活PI3K/AKT信號(hào)通路。
[0081 ] 7.肉桂醛對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響結(jié)果
[0082]血管新生的另一條主要通路為MAPK信號(hào)通路，其包括:Erkl/2信號(hào)通路、p38信號(hào) 通路和JNK/SPAK信號(hào)通路。如圖7B和圖7D所示，肉桂醛于5分鐘顯著誘導(dǎo)c-Raf磷酸化直至 120分鐘，而微弱誘導(dǎo)c-Raf下游信號(hào)分子Erkl/2直至120分鐘。同時(shí)，隨著肉桂醛濃度的增 加（1~1(^)，(：-1^』41/2的磷酸化水平依次提高（圖74和圖7〇。如圖8?所示，肉桂醛于5 分鐘顯著誘導(dǎo)P38磷酸化直至120分鐘。然而其磷酸化水平并未因濃度的增加而改變（圖 7E)。對(duì)于JNK/SAPK信號(hào)通路，肉桂醛對(duì)其沒有任何影響。提示肉桂醛能夠顯著性地激活C-Raf/MEK/Erkl/2 信號(hào)通路。
[0083] 8.PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號(hào)通路參與肉桂醛調(diào)節(jié)體外血管新生過程
[0084] 為進(jìn)一步證明PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號(hào)通路與肉桂醛調(diào)節(jié)體外血管新生 過程相關(guān)，我們采用PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑U0126,觀察其對(duì)肉桂醛誘導(dǎo)體外血 管新生的影響。如圖8A和圖8B所示，LY294002和U0126能夠明顯抑制HUVECs增殖和分泌 VEGF。同時(shí)，圖8C和圖8D顯示，LY294002和UO126可抑制HUVECs管腔形成。此外，如圖8E所示， LY294002可阻斷肉桂醛誘導(dǎo)AKT磷酸化而對(duì)肉桂醛誘導(dǎo)Erkl/2磷酸化沒有影響。如圖8F所 示，U0126可阻斷肉桂醛誘導(dǎo)Erkl/2磷酸化而對(duì)肉桂醛誘導(dǎo)AKT磷酸化沒有影響。由以上結(jié) 果得出，PI3K/AKT和Raf/MEK/Erkl/2信號(hào)通路與肉桂醛調(diào)節(jié)體外血管新生過程相關(guān)，但兩 條通路之間并沒有直接的相互介導(dǎo)作用。
[0085] 實(shí)施例2肉桂醛促進(jìn)血管新生體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0086] ( - )實(shí)驗(yàn)方法
[0087] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0088]野生型（C57BL/6)小鼠，雄性，體重 18-22g;糖尿病型（BSK · Cg-m+/+L印rdb; db/db) 小鼠，雄性，體重55-60g，血糖值27.3 ± 0.6mmol/L，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司。
[0089] 2.動(dòng)物模型建立
[0090] 小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，用寵物剃毛器逆毛方向背部剃毛，大約露出 4cm見方大小的皮膚(盡量把毛剃到最短，但不能傷及皮膚），隨后均勻涂抹脫毛膏在空白皮 膚處，2分鐘后，用酒精棉球擦拭，以便除凈小鼠背部的毛;利用消毒后的角膜環(huán)鉆在小鼠背 部打一圓孔，切取8_直徑大小的圓形皮膚，即形成皮膚損傷模型。
[0091] 3.動(dòng)物分組及給藥
[0092] 分別將造模后的64只C57小鼠和64只db/db小鼠均隨機(jī)分為4組，每組16只，分別為 100mg/kg肉桂醛給藥組(高劑量組）、50mg/kg肉桂醛給藥組（中劑量組）、25mg/kg肉桂醛給 藥組(低劑量組）、生理鹽水組(對(duì)照組）；將小鼠分籠喂養(yǎng)(4只/籠），每天腹腔注射給藥。
[0093] 4.取材
[0094] 分別于給藥后第6天和第12天，每組隨機(jī)挑選四只小鼠脫頸處死，切取傷口組織， 將其平均分配成兩個(gè)部分:一部分用于免疫組織學(xué)實(shí)驗(yàn)，置于4%多聚甲醛中固定；另一部 分用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，_80°C保存。
[0095] 5.指標(biāo)檢測(cè)
[0096] (1)傷 口直徑
[0097]隔天給小鼠背部傷口拍照，利用Image J圖像分析軟件測(cè)量傷口直徑大小并計(jì)算 損傷愈合率。愈合率（％ ) = (1-第η天傷口直徑大小/第0天傷口直徑大小）X 100% (η為拍照 當(dāng)天）。
[0098] (2)免疫印跡法測(cè)損傷組織VEGF蛋白表達(dá)
[0099]稱取-80°C凍存的皮膚組織，盡可能剪成小碎塊，裝入1.5mlEP管中，按比例加入組 織蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑），用電動(dòng)組織勻漿儀將其研碎（冰上操作，以防蛋白變 性）；4°C，12000rpm離心10分鐘，吸取上清，取少量蛋白用于蛋白濃度測(cè)定，其余大部分蛋白 加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘變性，于-20 °C保存待測(cè)。以每孔等量蛋白上樣于10 % SDS-PAGE，電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用相應(yīng)的單克隆抗體檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果以目標(biāo)蛋白與β-actin蛋白表達(dá)量比值表示。
[0100](二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0101 ] 1.肉桂醛加速小鼠皮膚傷口愈合實(shí)驗(yàn)
[0102]血管新生是傷口愈合過程中一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而傷口愈合不良是糖尿病的嚴(yán)重并 發(fā)癥之一，其根本原因是由于血管新生不充足。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)肉桂醛是否能夠促進(jìn)野生型 小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷愈合進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，野生型小鼠皮膚傷口愈合速度（12 天）明顯高于糖尿病小鼠（22天）。當(dāng)腹腔注射肉桂醛后，小鼠皮膚傷口愈合速度顯著提高。 野生型小鼠皮膚傷口在給藥10天后達(dá)到完全愈合，而糖尿病小鼠則需要16天。對(duì)于野生型 小鼠，在給藥第4天，加藥組的傷口面積明顯比對(duì)照組小。如圖9A所示，低劑量組傷口愈合率 (47 % )與對(duì)照組(36 % )相比(P〈0.01)，中劑量組(58 % )與對(duì)照組(36 % )相比(P〈0.001)，高 劑量組(59 % )與對(duì)照組(36 % )相比(P〈0.001)。而對(duì)于糖尿病小鼠（圖9B)，在第4天，低劑量 組與對(duì)照組傷口愈合率無顯著性差異，中劑量組(49%)與對(duì)照組（18%)相比(P〈0.001)，高 劑量組(50 % )與對(duì)照組（18 % )相比(P〈0.001)。
[0103] 2.組織學(xué)觀察小鼠皮膚傷口愈合情況
[0104] 為更好的證明肉桂醛加速小鼠皮膚傷口愈合的活性，本實(shí)驗(yàn)采用H&E染色觀察小 鼠皮膚傷口愈合的組織學(xué)效應(yīng)。如圖10,第10天病理組織切片顯示，糖尿病對(duì)照組小鼠皮膚 缺損面積仍然很大，僅有少量表皮覆蓋且連續(xù)性較差，有大量的肉芽組織存在;而野生型對(duì) 照組小鼠皮膚缺損面積很小，大量表皮覆蓋，可見瘢痕組織，有少量的肉芽組織。給予肉桂 醛以后，糖尿病小鼠傷口表皮基本覆蓋但較薄，仍有肉芽組織存在;而野生型小鼠傷口完全 修復(fù)，肉芽組織消失。結(jié)果顯示，肉桂醛能夠良好地修復(fù)小鼠皮膚傷口愈合過程。
[0105] 3.肉桂醛對(duì)小鼠皮膚傷口組織血管新生的影響
[0106] 為觀察肉桂醛是否能夠促進(jìn)小鼠皮膚傷口組織血管新生，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光的 方法檢測(cè)血管壁上⑶31抗原，從而顯示傷口組織的血管新生。如圖11所示，在第10天，野生 型小鼠傷口組織血管數(shù)目（56個(gè)/視野）明顯多于糖尿病小鼠（33個(gè)/視野）（P〈0.05)。而給予 肉桂醛以后傷口組織血管數(shù)目明顯增多，野生型小鼠和糖尿病小鼠傷口組織血管數(shù)目分別 為166個(gè)/視野和156個(gè)/視野。以上結(jié)果顯示，肉桂醛可促進(jìn)野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚 傷口組織血管新生。
[0107] 4.肉桂醛對(duì)小鼠皮膚傷口組織VEGF蛋白表達(dá)的影響
[0108] 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉桂醛可促進(jìn)HUVECs分泌VEGF，繼而采用動(dòng)物模型觀察肉桂醛 是否能夠誘導(dǎo)小鼠皮膚傷口組織VEGF蛋白的表達(dá)。如圖12所示，生理鹽水對(duì)照組小鼠皮膚 傷口組織VEGF表達(dá)量高于未受損皮膚組織，提示創(chuàng)傷后的皮膚組織本身會(huì)分泌VEGF。當(dāng)給 予肉桂醛后，小鼠傷口組織VEGF表達(dá)量均明顯升高。結(jié)果顯示，肉桂醛促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈 合與其誘導(dǎo)VEGF蛋白的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。
[0109] 實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)總結(jié)
[0110] 綜上所述，本發(fā)明通過建立原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)體外培養(yǎng)體系評(píng)價(jià)了 不同濃度的肉桂醛對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。
[0111] 1.分別采用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕與爬片實(shí)驗(yàn)、Transwell迀移實(shí)驗(yàn)及體外成 管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肉桂醛誘導(dǎo)體外血管新生的活性。結(jié)果顯示，肉桂醛于0.01~1〇〇μΜ濃度時(shí)可誘 導(dǎo)HUVECs增殖、損傷愈合、迀移以及管腔形成，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
[0112] 2.利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定HUVECs培養(yǎng)上清中分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠于24~48小時(shí)誘導(dǎo)VEGF的分泌量顯著增加。
[0113] 3.蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)結(jié)果顯示，肉桂醛能夠激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/AKT和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activatedproteinkinases，MAPK)兩條信號(hào)通路，可呈時(shí)間和濃度依賴性地上調(diào)其中的主 要革巴蛋白：AKT、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、胞外 信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinasesl/2，Erkl/2)、c_Raf、p38激酶 (?381^1^86，？38);此外，？131(和]\^1(特異性抑制劑1^294002和1]0126能夠阻斷肉桂醛誘導(dǎo) AKT和Erkl/2的磷酸化，并且抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、管腔形成及VEGF的分泌。
[0114] 4.本發(fā)明還采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷模型，對(duì)肉桂醛促血管新生作 用的藥效進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，每天分別腹腔注射肉桂醛10~IOOmg/ kg后，小鼠皮膚傷口明顯縮小(P〈0.05)。此外，肉桂醛可通過升高傷口組織VEGF蛋白的表達(dá) 量并誘導(dǎo)傷口周圍組織新血管的形成，從而誘導(dǎo)皮膚損傷愈合，并證實(shí)其對(duì)小鼠本身沒有 毒副作用。同時(shí)對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，肉桂醛誘導(dǎo)糖尿病小鼠皮膚損傷 愈合并不依賴于血糖值的變化。
[0115] 由此可見，肉桂醛在0.01~IOOyM濃度范圍內(nèi)能夠顯著誘導(dǎo)體外血管新生，并于10 ~100mg/kg劑量時(shí)加速小鼠皮膚損傷愈合，其作用機(jī)制可能與激活ΡΙ3Κ/ΑΚΤ和MAPK信號(hào)通 路相關(guān)。
[0116] 實(shí)施例4肉桂醛在制備藥物中的新用途
[0117] 本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)肉桂醛可用于：
[0118] a)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，
[0119] b)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷愈合，
[0120] c)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞迀移，
[0121] d)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成，
[0122] e)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌，
[0123] f)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，
[0124] g)激活 c-Raf/MEK/Erkl/2 信號(hào)通路，和/或
[0125] h)促進(jìn)傷口組織血管數(shù)目增加。
[0126] 因此，肉桂醛在制備促血管新生相關(guān)藥物中的新用途包括：
[0127] 第一，制備傷口愈合/創(chuàng)傷愈合/創(chuàng)面愈合藥物
[0128] 創(chuàng)傷愈合包括細(xì)胞增殖、迀移及胞外基質(zhì)沉積等復(fù)雜的生物學(xué)及分子學(xué)過程，其 需要良好的動(dòng)態(tài)循環(huán)系統(tǒng)、充足的營(yíng)養(yǎng)，并盡可能避免機(jī)械外力的傷害，此過程的順利完成 通常需要3到14天，一般分為三個(gè)階段:炎癥階段、增殖階段、組織重構(gòu)階段。新血管的形成 主要發(fā)生在增殖階段，首先成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原基質(zhì)，隨之新生成的血管入侵肉芽組織，最 后表皮細(xì)胞迀移到損傷表面封閉裂痕組織。眾所周知，血管新生是傷口愈合過程的關(guān)鍵階 段，新生的血管可為受損組織的生長(zhǎng)傳輸足夠的氧氣與營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)排泄組織周圍細(xì)胞代謝 所產(chǎn)生的副產(chǎn)物?；謴?fù)受損區(qū)域的血流量有利于損傷組織的修復(fù)，并且皮膚損傷愈合過程 易于控制與處理，因此它將是血管新生研究的最理想模型。
[0129] 慢性創(chuàng)傷是世界上嚴(yán)重的臨床疾病之一，其具有較高的發(fā)病率卻往往缺乏較好的 治療手段。它是一種阻斷皮膚連續(xù)性和組織完整性的疾病，達(dá)到完全愈合需要很長(zhǎng)的一段 時(shí)間（至少8周），甚至不能愈合或者再次復(fù)發(fā)。創(chuàng)傷愈合受損將直接導(dǎo)致皮膚潰瘍，是一種 嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，稱之為"糖尿病足"，其原因可能是血管新生不足。據(jù)估計(jì)，多達(dá)兩百 萬美國(guó)人都患有下肢傷口不愈疾病。根據(jù)疾病控制和預(yù)防中心報(bào)道，即使在創(chuàng)傷治療方面 已經(jīng)有所進(jìn)步，但頑固性創(chuàng)傷仍然導(dǎo)致每年有72000糖尿病人面臨截肢。21世紀(jì)的今天，糖 尿病足每年的增長(zhǎng)率在1 %到4.1 %之間，而截肢增長(zhǎng)率在0.21 %到0.37%之間。因此，探究 有效的治療手段來攻克因血管新生不足而導(dǎo)致的慢性創(chuàng)傷是目前研究者們的首要任務(wù)。 [0130]第二，制備冠心病心肌缺血治療藥物
[0131] 冠心病是在諸如高血壓、高血脂癥、吸煙、糖尿病、不良飲食習(xí)慣和缺乏運(yùn)動(dòng)等多 種危險(xiǎn)因素的作用下，冠狀動(dòng)脈發(fā)生并形成粥樣硬化病灶，使得管狀動(dòng)脈腔徑狹小或阻塞， 而引起心肌缺血缺氧直至心肌細(xì)胞死亡的嚴(yán)重疾病。目前對(duì)冠心病心肌缺血的經(jīng)典治療包 括：⑴藥物治療。擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血供，如硝酸酯類藥物;減慢心率，降低血壓以減 少心肌氧旁路移植術(shù)耗，如β受體阻滯劑;抗血小板、抗凝治療，穩(wěn)定粥樣硬化板塊，如低分 子肝素等。（2)介入治療。（3)外科治療。而促進(jìn)缺血心肌區(qū)域側(cè)枝循環(huán)的建立健全和動(dòng)脈血 管的新生，即治療性血管生成（therapeutic angiogenesis)，是目前國(guó)際心血管病學(xué)界的 研究熱點(diǎn)。治療性血管生成的定義是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)性側(cè)枝循環(huán)血管的生成，在業(yè)已阻塞或狹窄 的動(dòng)脈周圍組成內(nèi)生的旁路循環(huán)。它包括血管生成：指心肌內(nèi)側(cè)枝循環(huán)血管（<200um)和毛 細(xì)血管(<20um)增多；以及動(dòng)脈新生:指已狹窄或阻塞的心外膜冠狀動(dòng)脈供血區(qū)域中新生成 較大的動(dòng)脈血管（>200um) 〇
[0132] 心肌缺血或梗死的早期，毛細(xì)血管和毛細(xì)血管密度增加，內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞活 化，隨后壞死的心肌細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞釋放成血管性生長(zhǎng)因子(Bfgf、VECF)、細(xì)胞因子 (MCP-1、IL-6、IL-8)，并且細(xì)胞間粘附因子(ICAM)表達(dá)的增加，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞 有絲分裂增加，最終形成正常肌性動(dòng)脈。冠脈阻塞后酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)mRNA 轉(zhuǎn)錄增加，aFGF有活化的單核細(xì)胞釋放，是內(nèi)皮、結(jié)締組織和平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)力有絲分裂 原，并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌尿纖溶酶原。冠狀動(dòng)脈內(nèi)或靜脈注射重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(bFGF)亦可加速側(cè)枝循環(huán)的建立。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞有 絲分裂原，其mRNA存在于鄰近側(cè)枝血管重建或心肌細(xì)胞。冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射VEGF可在漸進(jìn)性 冠狀動(dòng)脈阻塞4周后使側(cè)枝循環(huán)血流量增加40%。
[0133] 第三，制備糖尿病皮膚損傷預(yù)防/治療藥物
[0134] 發(fā)明還采用野生型小鼠和糖尿病小鼠皮膚損傷模型，對(duì)肉桂醛促血管新生作用的 藥效進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，每天分別腹腔注射肉桂醛10~l〇〇mg/kg 后，小鼠皮膚傷口明顯縮小(P〈〇. 05)。此外，肉桂醛可通過升高傷口組織VEGF蛋白的表達(dá)量 并誘導(dǎo)傷口周圍組織新血管的形成，從而誘導(dǎo)皮膚損傷愈合，并證實(shí)其對(duì)小鼠本身沒有毒 副作用。同時(shí)對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，肉桂醛誘導(dǎo)糖尿病小鼠皮膚損傷愈 合并不依賴于血糖值的變化。
[0135] 基于本發(fā)明實(shí)施例1和2的研究?jī)?nèi)容，肉桂醛是具有促進(jìn)血管新生作用的一種活性 物質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，對(duì)于通過血管新生手段能達(dá)到疾病康復(fù)或緩解的病理過程，如 上述傷口愈合、冠心病心肌缺血或糖尿病皮膚損傷，肉桂醛作為有效成分，在制備促血管新 生相關(guān)藥物方面具有重要的意義。
[0136] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及 其功效，而并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情 況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本 發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的 更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具體為：肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo) 內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具體為：肉桂醛在制備能夠誘導(dǎo) 血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達(dá)和分泌的誘導(dǎo)劑中的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，肉桂醛為所述誘導(dǎo)劑的唯一有效成分或多 個(gè)有效成分之一。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK106074468SQ201610387833
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2014年5月22日 公開號(hào)201610387833.7, CN 106074468 A, CN 106074468A, CN 201610387833, CN-A-106074468, CN106074468 A, CN106074468A, CN201610387833, CN201610387833.7
【發(fā)明人】詹常森, 周俊杰, 張衛(wèi)東, 柳潤(rùn)輝, 韓琳, 姜鵬, 黃昕明
【申請(qǐng)人】上海和黃藥業(yè)有限公司, 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)