一種輪葉黨參提取物在制備預(yù)防腎損傷藥物及保健品中的新用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輪葉黨參（Codonopsis lanceolata）提取物在制備保護順鉑（Cisplatin）致急性腎損傷藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥產(chǎn)品研究開發(fā)領(lǐng)域。動物實驗研究表明：與模型組相比，該輪葉黨參提取物可以有效降低血清中肌酐（CRE），尿素氮（BUN），炎癥因子(TNF?α)，白介素1β（IL?1β）和腎組織中丙二醛（MDA）的含量；此外，組織病理學表明，該輪葉黨參提取物可以減少腎組織的病變，減少腎組織細胞的凋亡；免疫組織化學表明輪葉黨參提取物能夠有效降低Bax的表達，并且升高Bcl?2的表達。因此，可把該輪葉黨參提取物及含有該提取物的有效組分制備成預(yù)防急性腎損傷的藥物或保健品，其藥物或保健品形式可以是現(xiàn)有的任何劑型，如片劑，膠囊劑，丸劑，軟膠囊，顆粒劑和貼劑等。
【專利說明】
一種輪葉黨參提取物在制備預(yù)防腎損傷藥物及保健品中的新 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開了蒸制輪葉黨參(Steamed Coc/o/3opsis _/a/3 ceo_/a ia)在制備預(yù) 防急性腎損傷藥物的新用途，屬于中藥的新生物活性的醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 順鉑（Cisplatin)對多種腫瘤具有良好的療效，是臨床使用的最有效和最常見的 抗腫瘤藥物之一。目前，順鉑作為一種重要的化療藥物在臨床廣泛應(yīng)用。順鉑作為一種廣譜 抗癌藥物，療效與用藥量成正比，但同時隨著用量的增大，藥物毒性也增大，容易引起多種 不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、耳毒性等，尤其是它在腎臟中高聚集、高排泄、高代謝。 其中腎毒作用尤為突出，這對順鉑的劑量使用造成了影響，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。 統(tǒng)計顯示，單用順鉑時，腎毒性發(fā)生率高達28-36%，而臨床化療腎損害的發(fā)生率為25%- 35%。這極大的限制了順鉑的用量和臨床的應(yīng)用。如何預(yù)防順鉑的毒副作用成為了人們關(guān)注 的問題。 氧化應(yīng)激已被證實是順鉑腎毒性的重要機制之一，順鉑進入機體后，通過抑制細胞還 原和清除活性氧簇(ROS)的能力，使細胞中ROS水平升高，使機體發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導致機 體組織器官的損傷。生物體內(nèi)存在兩類活性氧清除系統(tǒng)，一類是酶促防御系統(tǒng)，主要包括超 氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽氧過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶 (GSH-R)等，另一類是非酶促反應(yīng)系統(tǒng)，包括維生素 A、C、E，半胱氨酸，輔酶Q、硒等。在正常情 況下，機體的活性氧代謝處于平衡狀態(tài)，順鉑可以通過三種方式影響活性氧簇打破機體的 這種平衡：其一，順鉑經(jīng)過水解后產(chǎn)物的活性物質(zhì)可以迅速與機體內(nèi)含巰基的谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧劑反應(yīng)，使它們降解或失活，從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。 其二，順鉑在機體內(nèi)代謝的過程中會產(chǎn)生大量的氧自由基，自由基可以引起線粒體膜脂質(zhì) 過氧化反應(yīng)導致線粒體功能抑制，還可以使膜蛋白功能的受損，破壞核酸及染色體。其三， 在機體長成ROS的過程中，鐵離子是重要的催化劑，而細胞內(nèi)的鐵離子的主要來源為細胞色 素 P450(CYP)系統(tǒng)，順鉑可以通過影響CYP系統(tǒng)誘導ROS的產(chǎn)生，進而引發(fā)機體氧化過激反 應(yīng)。 目前，相關(guān)證據(jù)表明，熱加工方法會使中草藥的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并導致生物活性的變 化，且具有改變口感，便于保存等優(yōu)點。在這些熱加工方法中，蒸制是對于中草藥最有效的 方法。蒸制人參(紅參)就是一個具有代表性的例子，蒸制使其人參皂苷進行廣泛的轉(zhuǎn)換，因 此紅參比之前具有更多的藥理活性（Weon, J.B. Cognitive-Enhancing Effect of Steamed and Fermented Codonopsis lanceolata \ A Behavioral and Biochemical Study. Evid Based Complement Alternat Med, 2014. 2014: p. 319-436)。并且之前的研究表明，蒸制和發(fā)酵能夠增強輪葉黨參對神經(jīng)的認知和保護作用(Lili Jiao , X.Z., Mingzhu Wang, e t a 1 · Chemical and antihyperglycemic activity changes of ginseng pectin induced by heat processing. Carbohydrate Polymers, 2014. 114: p. 567-573)。但單純探討蒸制輪葉黨參對順鉑致腎損傷保護作用尚無研究。 輪葉黨參Coc/o/3OjOSis 2a/3ceo2a ia屬桔梗科黨參屬多年生草本植物，有補虛潤 肺、通乳排膿之功效，常用于氣津兩傷或氣血兩虧(李曉峰.黨參的化學成分及藥理作用研 究概況[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥，2014, 21: 83-84)。輪葉黨參主要的藥理功效包括抗炎癥、對 缺血性損傷和酒精性肝損傷的保護作用(Cho, K. Protective effect of Coc/ofiOjOsis lanceola ta root extract against alcoholic fatty liver in the rat. J Med Food, 2009. 12(6): p. 1293-301)。 基于傳統(tǒng)中藥熱處理理論，輪葉黨參經(jīng)蒸制處理后，還原糖含量增加，口感好，有效成 分容易溶出，極大的提高了輪葉黨參的利用率。 到目前為止，未見有關(guān)該藥物對順鉑(Cisplatin)所致急性腎損傷保護作用的報道，本 發(fā)明創(chuàng)造性的提出并證明了該提取物的急性腎損傷保護作用。蒸制輪葉黨參可以通過高溫 處理輪葉黨參而獲得，操作簡便，是一種非常有前途和開發(fā)價值的腎保護劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了蒸制輪葉黨參在制備預(yù)防順鉑(Cisplatin)誘導的急性腎損傷藥物 中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述的蒸制輪葉黨參在用于上述用途時，其口服是安全的，在口服情況下，其可 以以常規(guī)的形式給藥，如片劑，膠囊劑，丸劑，軟膠囊，顆粒劑和貼劑等。 本發(fā)明制備保護急性腎損傷藥物是由該藥物粉末與固體或液體的賦形劑一起構(gòu)成的， 這里使用的固體或液體的賦形劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，下面舉幾個例子，散劑是內(nèi)服的 粉末劑，它的賦形劑有乳糖，淀粉，糊精，碳酸鈣，合成或天然硫酸鋁，氧化鎂，硬脂酸鎂，碳 酸氫鈉，干燥酵母等;溶液劑的賦形劑有水，甘油，1，2-丙二醇，單糖漿，乙醇，乙二醇，聚乙 二醇，山梨糖醇等;軟膏劑的賦形劑可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、木蠟、 液體石蠟等組合成的疏水劑或親水劑。本發(fā)明的藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法 如混合、制粒、壓片來制備。本發(fā)明藥物組合物還可以包括各種藥學使用的任何組分，如香 味劑、著色劑、甜味劑等。 本發(fā)明的有益效果在于，蒸制輪葉黨參可以通過高溫加熱來獲得，其操作方便，容易獲 得，工業(yè)化前景好，同時具有療效顯著和毒副作用小等優(yōu)點。 本發(fā)明可以通過下面的實驗例進一步說明。 實驗例.蒸制輪葉黨參對順鉑致小鼠腎損傷的保護作用及機制 1材料與方法 1.1實驗動物 SPF級ICR小鼠，雄性，體重20-22g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，合格 證號：SCXK(吉）2011-0004。在12h白天和夜晚循環(huán)的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水和進食， 1周后進彳丁試驗。 1.2試劑與藥物 新鮮的輪葉黨參，購自吉林省白山市，由吉林農(nóng)業(yè)大學李偉副教授鑒定;順鉑，上海思 域化工科技有限公司，純度>99.0%;蘇木素-伊紅染液(H&E)，肌酐(CRE)，尿素氮(BUN)，丙二 醛(MDA)等試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;炎癥因子TNF-α和IL-Ιβ，購自美國R&D公 司；兔來源單克隆抗體Bax和Bcl-2,購自美國Cell Signaling Technology公司；免疫組化 試劑盒，購自武漢博士德;Hoechst 33258染色液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余 試劑均為分析純。 1.3儀器 BP21ID分析天平，德國Sartorius ;HC-2517高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公 司；組織勻漿機，上海書俊儀器設(shè)備有限公司；連續(xù)光譜掃描式酶標儀Spectra Max Plus 384，美國分子生物儀器公司；高壓滅菌蒸汽鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；顯微鏡Olympus BX-60,日本奧林巴斯株式會社。 1.4樣品的制備 蒸制輪葉黨參(steamed Coc/o/3〇j〇sis _/a/3ceo_/aia, SCL)的制備:鮮輪葉黨參洗 凈、去皮，高壓滅菌蒸汽鍋105°C蒸Ih，烘箱45°C烘干，打碎成粉狀，過40目篩，經(jīng)水超聲波提 取即得蒸制輪葉黨參提取物。該提取物加入CMC-Na助懸，根據(jù)預(yù)實驗及參考文獻，確定SCL 給藥劑量為200和400mg/Kg。 2實驗方法 2.1動物分組及給藥 將ICR小鼠隨機分成空白對照組(Normal )、腎損傷模型組(Cisplatin)、SCL低劑量給藥 組(Cisplatin+SCL-200 mg/kg)、SCL高劑量給藥組(Cisplatin+SCL-400 mg/kg)劑量組，每 組10只。每天各給藥組按體重lOmL/Kg連續(xù)灌胃10天，每天1次，空白組和模型組均灌胃同體 積生理鹽水。于第7天給藥后，禁食不禁水12h，腎損傷模型組和各給藥組一次性腹腔注射 20mg/Kg順鉑生理鹽水溶液，繼續(xù)給藥3天，末次給藥后禁食不禁水12h后眼眶靜脈叢取血， 離心制備血清，脫臼處死小鼠，迅速取出腎組織。將左腎置于生理鹽水中制成勻漿，3000 rmp/min離心5 min，取上清液，試劑盒檢測相關(guān)生化指標;右腎10%甲醛固定后進行病理學 及免疫組織化學分析。 2.2血清中CRE，BUN及腎組織中MDA的測定 取離心后的血清，分別采用肌氨酸氧化酶法和脲酶法試劑盒測定血清中CRE和BUN水 平;取腎組織勻漿上清液，采用TBA法測試盒測定MDA的含量，按照試劑盒說明書進行操作， 酶標儀相應(yīng)波長處比色測定OD值，計算含量。 2.3血清中了即-€1和11^1|3炎癥因子的測定 采用ELISA法測定血清中炎癥因子TNF-α和IL-W的水平，根據(jù)說明書進行操作，酶標儀 450nm波長處比色法測定OD值，計算含量。 2.4 H&E病理組織學染色 取小鼠腎臟中部做橫切面取材，常規(guī)石蠟包埋、切成5μπι的切片，每組隨機選取3張組織 切片，進行脫蠟，梯度過酒精，蘇木素 (Hematoxy I in)染細胞核，自來水沖洗返藍，之后伊紅 (Eosin)染細胞質(zhì)，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察腎小管病變。 2.5 Hoechst 33258染色 隨機從每組中選取3張組織切片，常規(guī)石蠟包埋，切成5μπι的切片，用Hoechst 33258 (10 yg/mL)進行染色，之后PBS洗3次，染色的細胞核在紫外光的激發(fā)下可視并在熒光顯微 鏡下拍攝。 2.6免疫組織化學染色 同上，腎組織5μπι石蠟切片進行常規(guī)脫蠟，在檸檬酸緩沖液（0.01M，pH 6.0)中進行 20min抗原修復，之后用TBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，加入1%血清蛋白孵育111，加入8&1(1: 200)，Bcl-2( 1:400)抗體4° C孵育過夜，之后加入二抗孵育30min，用DAB顯色和蘇木素染 色，光學顯微鏡下檢測，細胞周圍有棕黃色即為陽性染色。 2.7統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行分析處理。各項數(shù)據(jù)以Mean 土 SD表示，P〈0.01或P 〈0.05具有統(tǒng)計學意義。 3結(jié)果 3.1對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響 與正常對照組小鼠相比，一次性順鉑注射3天后，小鼠狀態(tài)萎靡，毛色灰暗，體重略有減 輕，但無統(tǒng)計學意義(P >0.05)，腎指數(shù)顯著升高(P〈0.05)，表明代謝器官受損嚴重，出現(xiàn) 了免疫抑制反應(yīng);SCL各給藥組，小鼠狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，體重下降得到緩解，可以明顯改善順鉑 所致的腎指數(shù)下降(P〈0.05)，但對肝和脾指數(shù)影響較小。 表1. SCL對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響（Mean 土 SD，n=10) Table I. Effects of SCL on body weight and organ indices in mice (Mean ± SD, n=10^
注:與空白對照組比較，<0.01;與模型組比較，<0.05 3.2對小鼠血清中BUN,CRE水平及腎組織中MDA含量的影響 如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中BUN和CRE水平均顯著性升高（P < 〇.01 )，表明急性腎損傷模型成立;與模型組比較，SCL低劑量組(200 mg/Kg)能夠降低血清 中BUN和CRE水平，但不具有顯著性(P > 0.05);SCL高劑量組(400 mg/Kg)小鼠血清中BUN和 CRE水平均顯著性降低(P < 0.05)。 與空白組相比，模型組小鼠腎組織勻漿中MDA的含量顯著增加 (P < 0.05)，表明順鉑急 性腎損傷導致脂質(zhì)過氧化;與模型組相比，SCL各劑量組均能不同程度的降低腎組織中MDA 的含量，高劑量具有顯著性差異(P <〇.〇5)。 表2. SCL對小鼠血清中BUN, CRE及腎組織中MDA水平的影響（Mean 土 SD, /3 =10) Table 2. Effects of SCL on BUN and CRE in serum, and MDA content in kidney tissues (Mean ± SDj n =10)
注:與空白對照組比較，<0.01;與模型組比較，bP <0.05 3.3對小鼠血清中TNF-α和IL-1 β水平的影響 研究表明：炎癥反應(yīng)在順鉑致腎毒性的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，因此采用ELISA法 觀察血清中TNF-a和IL-Ιβ炎癥因子的水平。結(jié)果見附圖1，與空白組比較，模型組中小鼠血 清中TNF-a和IL-Ιβ的水平明顯升高(P < 0.01或P < 0.05);與模型組相比，SCL各劑量給藥 組均能夠降低血清中TNF-a和IL-Ιβ的水平，且具有顯著性差異(P <0.01或P <0.05)。表 明SCL能夠部分通過抑制炎癥因子的表達而發(fā)揮腎保護作用。 3.4 H&E腎組織病理形態(tài)學 H&E染色結(jié)果表明（見附圖2A):空白組腎組織結(jié)構(gòu)正常，可見正常腎小球及其周圍腎小 管，無腎小管變性壞死及透明管型等現(xiàn)象;而模型組可見腎小管上皮細胞胞界不清，部分細 胞壞死，核固縮或消失，腎小管管腔內(nèi)有均質(zhì)紅染的透明管型等現(xiàn)象;低劑量組與模型組比 較，細胞壞死程度減輕，核固縮或消失現(xiàn)象減少，但仍可見部分透明管型；高劑量組細胞壞 死明顯減少，透明管型現(xiàn)象顯著減少，可見清晰的球囊腔，細胞形態(tài)基本正常。 3.5 Hoechst 33258染色 Hoechst 33258染色結(jié)果表明（見附圖2B):空白組無藍色熒光的細胞核，說明無細胞凋 亡現(xiàn)象；而模型組可見大量的具有均勻熒光強度的細胞核且大部分細胞核表現(xiàn)出正常輪 廓;SCL低、高劑量組中表現(xiàn)出明顯的細胞核破碎和凝結(jié)減少，說明其能顯著抑制細胞凋亡， 且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。 3.6對細胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達的影響 抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在調(diào)控線粒體依賴通路中具有重要角色[11]，因此 本實驗用免疫組織化學法檢測了 SCL對Bcl-2和Bax表達的影響。如附圖3A和3B所示:模型組 表現(xiàn)出Bax的高表達和Bcl-2的低表達;而相反地，SCL各劑量給藥組均在不同程度上降低了 Bax的表達，并且升高了 Bcl-2的表達，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系，此結(jié)果進一步驗證了 病理學觀察結(jié)果，亦證明SCL部分通過抗凋亡信號通路而發(fā)揮腎保護作用。 3.7對腎纖維化的影響 經(jīng)給藥治療后，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，SCL能有效減少順鉑所致的腎組織纖維化病變。 4結(jié)論 SCL在200-400mg/kg劑量范圍內(nèi)，可以顯著改善順鉑誘導的小鼠急性腎損傷，主要通過 改善急性氧化應(yīng)激水平及降低炎癥因子，部分通過抗凋亡信號通路而發(fā)揮腎保護作用，是 一種很有前景的腎組織保護劑。 實施例藥物的實施例 制備藥劑的實施例一 膠囊劑的制備200g蒸制輪葉黨參粉末，藥用淀粉適量，兩者充分混勻，裝膠囊，制成 1000粒膠囊，每粒重0.25g，每粒含蒸制輪葉黨參200mg?？诜看?粒，每日三次。 制備藥劑的實施例二 片劑的制備200g蒸制輪葉黨參，藥用淀粉適量，兩者充分混勻，用乙醇做粘合劑制濕 顆粒，干燥，過120目篩整粒，裝膠囊，每粒200 mg，每次口服1 -2粒，每日2次。 制備藥劑的實施例三 滴丸劑的制備聚乙二醇4議300g，在水浴上熔化，加入蒸制輪葉黨參原料200g，攪拌 均勻，傾入保溫管中，調(diào)節(jié)恒溫裝置，使藥液在80-90 °C下滴入冷卻過的液體石蠟中（溫度土 4°C )，滴完后，將藥丸傾入濾紙上吸干石蠟油，再加入少量滑石粉，混勻，得蒸制輪葉黨參滴 丸1000粒?？诜?，一次4粒，每日三次，飯后服用。 以上根據(jù)上述實施方式對本發(fā)明的蒸制輪葉黨參在制備預(yù)防急性腎損傷藥物的應(yīng)用 進行了說明，但本發(fā)明并不限于上述實施方式，在不脫離其要旨的范圍內(nèi)，可在各種方式中 實施本發(fā)明。除了上述實施方式之外，其它等同技術(shù)方案也應(yīng)當在其保護范圍之內(nèi)，在此不 再--敘述。 附圖1.蒸制輪葉黨參對小鼠血清中炎癥因子的影響(Mean±SD, /3 =10) 附圖2.腎臟組織學變化和Hoechst 33258染色（X400) 附圖3. SCL對凋亡相關(guān)蛋白表達的免疫組織化學分析（X 400)。
【主權(quán)項】
1. 一種輪葉黨參（C oc/o/JOjOsis』a/3ceo』aia )提取物在制備預(yù)防急性腎損傷 藥物及保健品中的新用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的輪葉黨參提取物，其特征在于:輪葉黨參根經(jīng)高溫蒸制，干燥， 粉碎，提取所獲得的提取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的腎損傷疾病為順鉑(Cisplatin)所 致的氧化應(yīng)激損傷，具體包括改善順鉑所致的腎纖維化，細胞凋亡及炎癥反應(yīng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:將蒸制輪葉黨參(Steamed Cot/o/3〇j〇sis h/jceohia)提取物作為有效組分或與其它藥物組合，與制藥中可以接受的輔助和/或 添加成份混合后，按常規(guī)的制藥方法和工藝要求，制成用于治療或預(yù)防急性腎損傷的制藥 中可接受的劑型，如片劑，膠囊劑，丸劑，軟膠囊，顆粒劑和貼劑等。
【文檔編號】A23L33/00GK106074661SQ201610559411
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月16日
【發(fā)明人】李偉, 趙立春, 孫印石
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學