一種fliC蛋白和GAPDH蛋白微膠囊疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種fliC蛋白和GAPDH蛋白微膠囊疫苗，其中抗原是fliC蛋白和GAPDH蛋白；其中fliC蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；GAPDH蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明所制備的微膠囊疫苗使用方便，粒徑合適，具有良好的緩釋性和抗原保護性，且能有效刺激魚體腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答，使魚體獲得對遲鈍愛德華氏菌的特異性免疫保護力，可用于魚類遲鈍愛德華氏菌病的防治。
【專利說明】
_種1:1 i C蛋白和GAPDH蛋白微膠囊疫苗
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖疫苗制備技術領域，具體涉及一種fl iC蛋白和GAPDH蛋白微 膠囊疫苗。
【背景技術】
[0002] 遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種水產(chǎn)動物重要的致病菌，屬于腸桿 菌科，愛德華氏菌屬，該菌由Hoshina首次在鰻麵紅病中報道，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危 害的病原菌。該菌可以感染包括淡水與海水養(yǎng)殖的多種魚類，并能在短期內(nèi)引起大量死亡， 給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。
[0003] 疫苗的使用可提高養(yǎng)殖魚類特異性免疫水平，使魚體產(chǎn)生抵抗特定病原微生物感 染的免疫力，不污染環(huán)境，無藥物殘留等問題，是今后魚類疾病防控的主流發(fā)展方向。因此， 篩選免疫原性好的抗原，并用其制備疫苗就具有現(xiàn)實的應用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種fl iC蛋白和GAPDH蛋白微膠囊疫苗，可以有效的預防 遲鈍愛德華氏菌引起的疾病，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0005] 本發(fā)明提供的微膠囊疫苗，其中抗原是fliC蛋白和GATOH蛋白；其中fliC蛋白的氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1;GAPDH蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:2;
[0006] 上述的fliC蛋白和GAPDH蛋白用脂多糖進行了偶聯(lián)；
[0007] 本發(fā)明的微膠囊疫苗;是將fl iC蛋白和GAPDH蛋白與黃芪多糖混合，再與海藻酸鈉 混合，用蒸餾水配制成乳濁液，其中海藻酸鈉終濃度為2%，將乳濁液攪拌均勻后，噴入濃度 為3%CaCl 2的溶液中，形成海藻酸鈣微膠囊，噴霧完畢后繼續(xù)攪拌20min;離心收集海藻酸 鈣微膠囊，然后將微膠囊分散到0.2%的殼聚糖溶液中，充分攪拌后，離心收集微膠囊，蒸餾 水洗滌后，再將收集的微膠囊分散在甘露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干燥后制成微膠囊 疫苗。
[0008] 本發(fā)明的微膠囊疫苗可用作牙鲆或大菱鲆的飼料添加劑來使用。
[0009] 本發(fā)明提供的fliC蛋白疫苗具有強的免疫原性，其的免疫效果好。且口服免疫對 個體較小的魚體應激小，人力成本低，便于規(guī)?；茝V應用。該疫苗無異味，適口性好，魚體 易米食。
【附圖說明】
[0010] 圖1:本發(fā)明的fliC蛋白與NCBI中的fliC基因的序列比較圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0012]實施例1: flic蛋白、GAPDH蛋白的獲得及序列分析
[0013] 1)遲鈍愛德華氏菌的分離
[0014] 2015年山東某牙鲆養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的牙鲆出現(xiàn)了明顯的遲鈍愛德華氏菌感染的病癥， 但患病魚之前已經(jīng)進行過遲鈍愛德華氏菌疫苗的免疫處理。取瀕死病魚，無菌條件下獲得 肝臟組織，劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)后挑取優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，直至獲得 純培養(yǎng)菌。
[0015] 將分離獲得各菌株純培養(yǎng)物，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上進行擴大培養(yǎng)，然后用無菌 生理鹽水洗脫菌落，獲得菌懸液用于注射感染。最終篩選的菌株顯示出對健康牙鲆具有較 高的毒力，可引起90%牙鲆死亡，且死亡牙鲆出現(xiàn)與患病牙鲆相同的癥狀。因此，證實篩選 的遲鈍愛德華氏菌ET株為牙鲆腹水癥的病原。且在感染患病的牙鲆體內(nèi)可再次分離到該菌 株。
[0016] 對比實驗表明，用目前市場上出售的遲鈍愛德華氏菌疫苗對牙鲆幼苗進行免疫 后，再用本發(fā)明篩選的ET株進行攻毒實驗;結(jié)果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠 低于用本發(fā)明ET株制成的滅活疫苗的效果。推測是由于ET株的某個致病基因發(fā)生變異導致 目前疫苗的免疫效果不好。
[0017] 2)遲鈍愛德華氏菌ET菌株GAPDH、鞭毛蛋白flic的擴增及序列分析
[0018]根據(jù)Genbank遲鈍愛德華氏GAPDH、f IiC的基因序列，分別設計其特異性引物：
[0019] f IiC正向引物：CGGGATCCATGGCACAAGTAATCAACACC、
[0020] f I i C反向引物：CCGCTCGAGACGCAGCAGAGACAGGACGTTC;
[0021] GAPDH正向引物：CGGGATCCATGACTATCAAAGTAGGTATTAACG、
[0022] GAPDH反向引物：CCGCTCGAGCTTAGAGATGTGAGCGATTAGGTC;
[0023] 利用細菌基因組抽提試劑盒，以抽提細菌基因組DNA為模板，分別配合各基因的正 反向引物進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件為:50μ1反應體系，包含37μ1 Η20、5μ1 10 XTaq buffer、4yl dNTP(2.5mM)、正反引物各 1μ1、1μ1 Taq DNA Polymerase及ΙμL DNA模 板;PCR 反應程序為 94°C 變性 1〇11^11;94°(：變性，11^11，50°(：退火11^11，72°(：延伸11^11，進行30 個循環(huán)，最后72°C延伸8min WCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察， 結(jié)果顯示GAPDH、f IiC基因擴增成功，且擴增產(chǎn)物大小與目的基因一致。
[0024]對擴增產(chǎn)物回收后進行測序，結(jié)果表明，fliC基因的序列與NCBI中已公開的序列 存在明顯的差異；本發(fā)明獲得的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的fliC蛋白相比于NCBI中的 fliC基因存在10個以上氨基的區(qū)別（圖1)。獲得的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的氨基酸 序列為SEQ ID NO:2，NCBI比對結(jié)果表明GAPDH與NCBI中已公開的序列一致。
[0025]而免疫效果表明，用氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的fliC蛋白制成的疫苗對ET株的 免疫效果明顯好于NCBI中已公開的fliC蛋白制成的疫苗的免疫效果。
[0026]實施例2:重組蛋白的表達及與脂多糖進行偶聯(lián)
[0027] I) GAPDH、f I i C基因表達載體的構(gòu)建:將擴增的遲鈍愛德華氏菌GATOH、f I i C基因產(chǎn) 物切膠回收進行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xhol I雙酶切后，連接至原核表達載體pET32a，分 別構(gòu)建其表達載體pET32a-GAH)H、pET32a-fliC，并將表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)， 于含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，待長出菌落后，利用PCR方法篩選陽性克隆表達菌，將PCR 檢測為陽性克隆的菌株進一步利用測序進行確認。
[0028] 2)重組蛋白的表達與純化:經(jīng)測序確認載體中插入序列正確后，將篩選到的遲鈍 愛德華氏菌GAPDH、fliC陽性克隆表達菌分別接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床上 培養(yǎng)至指數(shù)生長期時，加入終濃度為ImM的IPTG誘導表達6h，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后， 以Ni離子螯合的親和層析柱(HisTrap HP Iml ,GE)對重組蛋白進行純化，洗脫產(chǎn)物經(jīng)尿素 濃度梯度透析后，最后以PBS進行透析，透析完成后對樣品進行冷凍干燥以濃縮樣品，SDS-PAGE檢測純化的重組蛋白。遲鈍愛德華氏菌fliC重組蛋白分子量為63kDa，該目的基因編碼 416個氨基酸，表達的蛋白片段理論分子量為43kDa，質(zhì)粒pET32a的標簽蛋白大小則約為 20kDa左右，結(jié)果與理論大小相符;GAPDH重組蛋白分子量為55kDa，該目的基因編碼331個氨 基酸，表達的蛋白片段理論分子量為35kDa，質(zhì)粒pET32a的標簽蛋白大小則約為20kDa左右， 結(jié)果與理論大小相符。
[0029] 3)重組蛋白與LPS的偶聯(lián):將IIOmg脂多糖干粉溶解于IOml蒸餾水中，往該LPS水溶 液中加入400mg固體NaKk，混合孵育2min，然后加入220μ1乙醇胺終止氧化反應，將反應產(chǎn) 物加入孔徑為3Κ大小的透析袋中，置于0.01m〇l/L的PBS中，在4°C條件下透析過夜，期間換 兩次透析液。同時，稱取390mg碳化二亞胺(EDC)，溶解于5ml蒸餾水中，然后加入90mg純化后 的GATOH重組蛋白，利用IM HCl將反應體系pH調(diào)整至5.4,室溫震蕩孵育2h。將上述完成氧化 反應后的LPS與含EDC的重組GATOH蛋白溶解混合，在22°C條件下孵育Ih，最后將反應液置于 PBS緩沖液中透析過夜，期間更換透析液，最后將透析后的溶液在8000g下離心30min，所得 上清即為GAPDH與LPS的偶聯(lián)粗制物。FliC與LPS的偶聯(lián)同樣參照以上方法進行。
[0030] 4)重組蛋白-LPS偶聯(lián)物的純化:各重組蛋白的偶聯(lián)粗制物，利用Sephacryl S-300 凝膠柱層析分離純化各重組蛋白-LPS偶聯(lián)物。具體為:首先將粗制偶聯(lián)產(chǎn)物以孔徑為0.22μ m的濾膜過濾，然后往柱體積為120mL的Sephacryl S-300層析柱內(nèi)上樣IOml偶聯(lián)粗制物，以 PBS緩沖液作為平衡與洗脫緩沖液，均勻?qū)⒘魉倏刂茷?ml/min，根據(jù)紫外吸收波收集樣品， 根據(jù)分子篩原理，分子量較大的偶聯(lián)產(chǎn)物將會首先分離獲得。將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物以超純 水透析，然后進行冷凍干燥，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 實施例3: flic和GAPDH二聯(lián)亞單位口服微膠囊疫苗的制備
[0032]將上述制備的GAPDH、f IiC與LPS的偶聯(lián)產(chǎn)物按等重量混合后，然后將混合物總量 為3:1的比例與黃芪多糖混合，將抗原混合物與海藻酸鈉以1:4(W/W)比例混合，用蒸餾水配 制成海藻酸鈉-抗原乳濁液，其中海藻酸鈉終濃度為2%，在混勻器的攪拌作用下包埋 30min。將該乳濁液利用噴霧式銳孔凝固浴法，直接噴入經(jīng)混勻器攪動的3%CaCl 2溶液中， 形成海藻酸鈣微膠囊，乳濁液與CaCl2溶液的體積比為1:1，噴霧完畢后繼續(xù)攪拌20min。離 心收集海藻酸鈣微膠囊，然后將微膠囊分散到〇. 2%的殼聚糖溶液中，充分攪拌30min，離心 收集海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊，蒸餾水洗滌3次并離心后，再將收集的微膠囊分散在8 %的甘 露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干燥后，封蓋包裝，即為本發(fā)明所述的遲鈍愛德華氏菌亞 單位口服微膠囊疫苗。利用顯微鏡對制備的微膠囊進行表觀特性觀察，可見微膠囊顆粒大 小均勻，平均直徑為150 ± 1 Ομπι。
[0033]實施例4:微膠囊疫苗對牙鲆的免疫保護效果
[0034] 準備健康牙鲆共100尾，平均體重為50g ± 5g，利用可控溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)對牙鲆暫 養(yǎng)7天，水溫控制為21°C，期間正常投喂商品化顆粒飼料。實驗前，將魚平均分為2組，每組50 尾，在對供試魚體禁食24h后，對免疫組魚體投喂fl iC亞單位口服微膠囊疫苗，投喂方法:將 口服微膠囊疫苗與魚飼料混合投入水體，供魚體自由采食，使用劑量為:每kg體重魚體投放 微膠囊疫苗〇.5g，連續(xù)投喂5天。首次投喂后15天，再次進行二次免疫，用法及用量與首次相 同。對照組魚體投喂以不含免疫原與黃芪多糖的海藻酸鈉溶液制備的微膠囊顆粒，投喂方 法與投喂量與免疫組相同，在首次投喂后35天，利用生理鹽水配制遲鈍愛德華氏菌活菌懸 液，濃度為I X IO7CFlVml，采用肌肉注射方式對實驗魚體進行攻毒，每尾注射100μΙ。攻毒后 連續(xù)觀察并記錄魚體發(fā)病與死亡狀況，計算遲鈍愛德華氏菌亞單位口服微膠囊疫苗對牙鲆 的相對免疫保護率。結(jié)果顯示對照組魚體累計死亡率為95%，免疫組魚體在攻毒后20天的 累計死亡率為17.5%，通過計算得知，本發(fā)明研制的遲鈍愛德華氏菌亞單位口服微膠囊疫 苗對牙鲆的相對免疫保護率為81.6%。
[0035]而且，用遲鈍愛德華氏菌ET菌株攻毒實驗結(jié)果表明，本發(fā)明制備的微膠囊疫苗相 比于市售的其它遲鈍愛德華氏菌有關的疫苗的免疫效果明顯更好(Ρ<〇.05)，推測是由于 fliC基因的氨基酸序列差異導致的。
【主權項】
1. 一種微膠囊疫苗，其特征在于，所述的微膠囊疫苗，其抗原為fl ic蛋白和GAPDH蛋白。2. 如權利要求1所述的微膠囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1〇3. 如權利要求1所述的微膠囊疫苗，其特征在于，所述的GAPDH蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:2〇4. 如權利要求1所述的微膠囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白和GAPDH蛋白用脂多 糖進行了偶聯(lián)。5. 權利要求1所述的微膠囊疫苗的制備方法，其特征在于，所述的方法是將fliC蛋白和 GAPDH蛋白與黃芪多糖混合，再與海藻酸鈉混合，用蒸餾水配制成乳濁液，將乳濁液攪拌均 勻后，噴入濃度為3%CaCl2的溶液中，形成海藻酸鈣微膠囊，噴霧完畢后繼續(xù)攪拌20min;離 心收集海藻酸鈣微膠囊，然后將微膠囊分散到〇 . 2 %的殼聚糖溶液中，充分攪拌后，離心收 集微膠囊，蒸餾水洗滌后，再將收集的微膠囊分散在甘露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干 燥后制成微膠囊疫苗。6. 權利要求1所述的微膠囊疫苗作為魚類飼料添加劑的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的魚類為牙鲆或大菱鲆。
【文檔編號】A23K20/147GK106075418SQ201610408814
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】類延樂, 張銘, 李明亮, 沈彤, 孫翠彥
【申請人】類延樂