一種具有趨化功能的生物活性支架的制備和應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種具有趨化功能的生物活性支架的制備和應(yīng)用 所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本實(shí)用新型涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的支架材料，尤其是能夠吸引內(nèi)源性細(xì)胞 迀移、促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞存活和分化的生物活性支架。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，公知的用于修復(fù)脊髓損傷的支架是由支架和外源性細(xì)胞組成的。主要是通 過(guò)外源性細(xì)胞移植到受損傷處來(lái)達(dá)到替換丟失神經(jīng)元和治療脊髓損傷的效果，而支架僅僅 是作為一種支撐細(xì)胞附著的載體。但是，臨床應(yīng)用過(guò)程中，外源性細(xì)胞的移植面臨著來(lái)源、 倫理和免疫排斥等重重困難，這使得脊髓損傷的外源性細(xì)胞移植治療受到了極大的限制。 因此，找到一種有效的方式即可規(guī)避細(xì)胞移植的細(xì)胞來(lái)源性問(wèn)題，又能滿足脊髓損傷/移 植區(qū)對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞迀移、存活、分化和提供營(yíng)養(yǎng)活性因子的需求是關(guān)鍵。
[0003] 細(xì)胞的靶向迀移及其機(jī)制，一直是科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前的研究主要集中 于外源性細(xì)胞體內(nèi)移植之后的定向迀移。將能夠刺激細(xì)胞迀移的趨化因子注射到病變部 位，能夠?qū)⒁浦驳耐庠葱约?xì)胞特異性吸引迀移過(guò)來(lái)，并能呈現(xiàn)治療和替換的效果。常用的 趨化因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)和基質(zhì)細(xì)胞源性因子-I(SDF-I)等[Takeuchi H，et al. Intravenously transplanted human neural stem cells migrate to the injured spinal cord in adult mice in an SDF-1-and HGF-dependent manner. Neurosci Lett，2007,426 (2) :69-74]。近年來(lái)，利用具有神經(jīng)保護(hù)作用的營(yíng)養(yǎng)因子作為趨化因子， 也展現(xiàn)出很好的趨化效果，同時(shí)這些因子還具有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和改善脊髓損傷微環(huán)境的作 用，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT_3)等[Chen YF，et al.Neurotrophin_3stimulates migration of mesenchymal stem cells overexpressing TrkC. Curr Med Chem，2013,20(24)： 3022-3033]。
[0004] 維甲酸（RA)是維生素A(Vit. A)的一種代謝產(chǎn)物。動(dòng)物自身不能合成Vit. A，必 須從植物中以胡蘿卜素的形式和在動(dòng)物中以視黃酸等形式攝取。RA在神經(jīng)發(fā)育中扮演著 主要角色。研究表明，RA能夠誘導(dǎo)不同種類的特殊細(xì)胞用于移植治療。本課題組前期研 究發(fā)現(xiàn)，在體外，利用RA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)向神經(jīng)組織細(xì)胞方向分化，提高相 關(guān)受體 mRNA 表達(dá)水平[Zhang W，et al. Combination of adenoviral vector-mediated neurotrophin-3gene transfer and retinoic acid promotes adult bone marrow cells to differentiate into neuronal phenotypes. Neurosci Lett，2006,408(2)： 98]。在體內(nèi)，經(jīng)過(guò)RA誘導(dǎo)的MSCs在NT-3和督脈電針的協(xié)同作用下，具有向神經(jīng)元方 向分化的會(huì)K 力[Zhang K，et al. Electro-acupuncture promotes the survival and differentiation of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells pre-induced with neurotrophin-3and retinoic acid in gelatin sponge scaffold after rat spinal cord transection. Stem Cell RevRep，2014,10 (4) :612]。因此，RA 在神經(jīng)組織細(xì) 胞的誘導(dǎo)和分化中有著關(guān)鍵性的作用。
[0005]目前在國(guó)內(nèi)、外，一種自身具有生物活性并能夠趨化內(nèi)源性細(xì)胞迀移到脊髓損傷/ 移植處的支架材料仍未見(jiàn)報(bào)道。為此，我們?cè)O(shè)想構(gòu)建一種具有趨化內(nèi)源性細(xì)胞迀移功能的 生物活性支架。擬將這種具有趨化活性支架移植入脊髓損傷處，調(diào)動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞迀移到損 傷/移植處實(shí)施自我修復(fù)脊髓損傷。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上治療脊髓損傷的技 術(shù)和方法上的不足，應(yīng)用我們構(gòu)建的具有趨化性能的生物活性支架為內(nèi)源性細(xì)胞修復(fù)脊髓 損傷提供嶄新的思路和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有的生物活性支架移植治療脊髓損傷的方案不足，本實(shí)用新型提供一 種具有趨化活性支架，該支架不僅能夠吸引內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞迀移到支架內(nèi)部存活和分化， 而且能夠通過(guò)緩釋神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和誘導(dǎo)因子來(lái)改善脊髓損傷/移植區(qū)的微環(huán)境。
[0007] 本實(shí)用新型解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 利用蠶繭中提取的天然絲蛋白作為媒介，利用冷凍干燥技術(shù)使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 素-3 (NT-3)、維甲酸（RA)和絲蛋白混合液去水和除菌，乙醇促進(jìn)趨化活性因子混合液的晶 形轉(zhuǎn)變，將趨化因子和誘導(dǎo)因子交聯(lián)固定在三維支架中。移植后，支架上的趨化活性因子會(huì) 緩慢釋放到脊髓損傷區(qū)的微環(huán)境中，以支架移植部位為中心形成一種趨化因子富集區(qū)，促 進(jìn)相關(guān)的內(nèi)源性細(xì)胞向該區(qū)域迀移，達(dá)到吸引內(nèi)源性細(xì)胞迀移到支架內(nèi)部存活和分化修復(fù) 脊髓損傷的目的。
[0009] 本實(shí)用新型的有益效果是：
[0010] 這種具有功能性生物活性支架材料移植到脊髓損傷處后，可以較長(zhǎng)時(shí)間釋放趨化 因子（NT-3)，持續(xù)吸引內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞迀移到支架內(nèi)，在誘導(dǎo)因子（RA)的協(xié)同作用下這些 內(nèi)源性相關(guān)細(xì)胞能夠更好地存活，并且向神經(jīng)組織細(xì)胞方向分化；同時(shí)釋放的NT-3具有神 經(jīng)保護(hù)作用，持續(xù)改善脊髓損傷/移植區(qū)的微環(huán)境。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)一步說(shuō)明。
[0012] 圖1是具有趨化功能的生物活性支架的原理圖（1示：趨化因子、誘導(dǎo)因子和絲蛋 白復(fù)合物；2示：三維明膠海綿；3示：支架內(nèi)部的不規(guī)則多孔隙結(jié)構(gòu)；4示：PLGA外殼）。
[0013] 圖2是具有趨化功能的生物活性支架的溶脹率。
[0014] 圖3是具有趨化功能的生物活性支架的吸水率。
[0015] 圖4是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到神經(jīng) 纖維生長(zhǎng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞迀移進(jìn)入損傷/移植區(qū)。
[0016] 圖5是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到包繞 著髓鞘結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)進(jìn)入損傷/移植區(qū)。
[0017] 圖6是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后，可觀察到損傷 /移植區(qū)有表達(dá)TrkC的細(xì)胞迀移進(jìn)入。
[0018] 圖7是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后，可觀察到血管樣 的結(jié)構(gòu)延伸進(jìn)入損傷/移植區(qū)。
[0019] 圖8是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后，可觀察到大量細(xì) 胞迀移進(jìn)入損傷/移植區(qū)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型所用的主要儀器、趨化活性支架和試劑作詳盡 的描述：
[0021] 1?主要儀器
[0022] 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化電子設(shè)備廠）；普通離心機(jī)（久保田日本）；恒溫水浴箱 (北京醫(yī)療設(shè)備廠）；5% CO2培養(yǎng)箱（Queue美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus日本）；熒 光顯微鏡（Leica德國(guó)）；掃描電鏡（Philips荷蘭）；透射電鏡（Philips荷蘭）；激光共聚 焦成像系統(tǒng)（Carl Zeiss德國(guó)）；低溫烤箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；高溫烤箱（上海躍進(jìn) 醫(yī)療器械廠）；高壓消毒鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）；恒冷箱切片機(jī)（Shandon英國(guó)）；超純 水儀（Molsheim法國(guó)）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Rad美國(guó)）；電泳儀電源（Bio-Rad美國(guó)）； 垂直板電泳槽（Bio-Rad美國(guó)）；電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad美國(guó)）；超高速低溫離心機(jī)（Beckman美 國(guó)）；-80°C超低溫冰箱（Revco Tech美國(guó)）JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科 技股份有限公司）。
[0023] 2.趨化活性支架
[0024] 制備支架的多孔隙明膠圓柱體支架材料是購(gòu)自于南京金陵藥業(yè)股份有限公司的 產(chǎn)品一醫(yī)用明膠海綿。包繞在多孔隙明膠圓柱體支架周圍形成外殼薄壁的PLGA(50 : 50) 薄膜是購(gòu)自于濟(jì)南岱罡生物科技公司的產(chǎn)品。蠶繭是由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所贈(zèng) 送。NT-3和RA均購(gòu)自Sigma公司。
[0025] 3?主