專利名稱：化妝品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酸性糖化合物在化妝品中的應(yīng)用。
另一方面，育發(fā)劑是促進(jìn)或刺激頭發(fā)生長(zhǎng)的產(chǎn)品，用于通過生發(fā)補(bǔ)償頭發(fā)的脫落，防止頭發(fā)的絕對(duì)數(shù)量減少。一般情況下，作為頭部脫發(fā)的原因，可以認(rèn)為是發(fā)根和皮脂腺這些器官中的雄性激素活化、流向毛囊的血流量降低，皮脂分泌過剩、過氧化物生成引起的頭皮異常、營(yíng)養(yǎng)不良、壓力等多種因素。一般來說，以前的育發(fā)劑是去除這些被認(rèn)為是頭部脫發(fā)原因的因素，或者配合具有減輕作用的物質(zhì)的育發(fā)劑。例如配合維生素B、維生素E等維生素，絲氨酸、蛋氨酸等氨基酸類，當(dāng)藥提取物、乙酰膽堿衍生物等血管擴(kuò)張劑，紫草根提取物、日柏酚等抗炎劑，雌二醇等雌性激素，頂花防己堿等皮膚功能亢進(jìn)劑等，用于預(yù)防和治療脫發(fā)。
但是，盡管如上所述進(jìn)行了多種嘗試，但以前的育發(fā)劑其預(yù)防脫發(fā)的作用和生發(fā)作用等較弱，未必能夠得到充分的生發(fā)效果。
本發(fā)明的主要目的在于發(fā)現(xiàn)對(duì)皮膚美容(防止皮膚老化、改善敏感性皮膚、抑制搔癢等)有效，且能夠成為育發(fā)劑有效成分的物質(zhì)，并提供一種含有該有效成分的化妝品。
本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖只要能表現(xiàn)出皮膚美容效果(例如通過防止皮膚老化作用、改善敏感性皮膚作用、抑制搔癢作用等產(chǎn)生的效果)和/或育發(fā)效果(例如通過生發(fā)作用、育發(fā)作用、養(yǎng)發(fā)作用、防止脫發(fā)作用等產(chǎn)生的效果)，并沒有特別限定。作為巖藻依聚糖，優(yōu)選使用來源于藻類的巖藻依聚糖、來源于棘皮動(dòng)物的巖藻依聚糖。作為本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖，結(jié)構(gòu)明確的巖藻依聚糖較為合適，優(yōu)選使用選自下述物質(zhì)中的巖藻依聚糖，即分別以下述通式(I)～(IV)表示的硫酸化糖作為構(gòu)成糖的必須成分的來源于Kjellmaniellacrassifolia的U-巖藻依聚糖、F-巖藻依聚糖、G-巖藻依聚糖以及來源于沖繩海蘊(yùn)(Cladosiphon okamuranus)的巖藻依聚糖。 (式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)。) (式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)。) (式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)。) (式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)。)另外，作為巖藻依聚糖，從不形成沉淀、對(duì)化妝品基質(zhì)的溶解性等觀點(diǎn)來看，優(yōu)選非拉絲性巖藻依聚糖。
作為巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物，可以使用例如巖藻依聚糖的酸分解產(chǎn)物、巖藻依聚糖的酶分解產(chǎn)物。作為本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖的酸分解產(chǎn)物、巖藻依聚糖的酶分解產(chǎn)物，只要顯示皮膚美容作用和/或育發(fā)作用即可，能夠以這些物質(zhì)的作用為指標(biāo)進(jìn)行制備。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用選自下述式(V)表示的化合物、下述式(VI)表示的化合物和下述式(VII)表示的化合物中的化合物。 (式中，R為OH或OSO3H。) (式中，R為OH或OSO3H。) (式中，R為OH或OSO3H。)作為本發(fā)明化妝品的形態(tài)，例如洗劑類、乳液類、面霜類、濕布劑類、軟膏類、浴用劑、浴用洗劑、洗面劑、毛發(fā)劑、育發(fā)劑和洗發(fā)劑。另外，也能夠以藥品、保健品、食品或飲料等形態(tài)提供。
本發(fā)明的化妝品可以用作防止老化用、改善敏感性皮膚用、抑制搔癢用、改善過敏用、改善特應(yīng)性癥狀用化妝品等。
另外，作為本發(fā)明的化妝品，提供含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或它們的鹽的物質(zhì)作為有效成分的育發(fā)作用優(yōu)良的育發(fā)劑，以及進(jìn)一步含有通過與選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)一起使用能夠協(xié)同增強(qiáng)育發(fā)作用的成分(育發(fā)作用增強(qiáng)成分)的育發(fā)劑。另外，所述化妝品、育發(fā)劑也可以作為食品或飲料提供。另外，作為優(yōu)選的育發(fā)作用增強(qiáng)成分，例如米諾地爾和卡普氯銨。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明化妝品的一個(gè)最大特征在于，含有選自具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用這些生理作用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及其鹽的物質(zhì)作為有效成分。本說明書中“選自”表示選擇1種或2種以上的物質(zhì)。
另外，本說明書中“皮膚美容作用”是指防止皮膚老化的作用、改善敏感性皮膚的作用、抑制搔癢的作用等。另外，基于這些作用產(chǎn)生的效果稱為“皮膚美容效果”。另外，防止皮膚老化的作用是指賦予皮膚濕潤(rùn)感和光滑度，減少粗糙、老年斑等抑制皮膚老化的作用。皮膚美容作用可以通過例如實(shí)施例13-(8)～(10)記載的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。至少只要是對(duì)于實(shí)施例13-(8)～(10)記載的評(píng)價(jià)事項(xiàng)能夠顯示優(yōu)良效果的選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及其鹽的物質(zhì)，就能夠顯示出所需的皮膚美容效果。
另外，“育發(fā)作用”是指生發(fā)作用、育發(fā)作用、養(yǎng)發(fā)作用、防止脫發(fā)作用等，另外，基于這些作用產(chǎn)生的效果稱為“育發(fā)效果”。育發(fā)作用可以通過例如實(shí)施例13～20記載的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，選自具有所述作用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)能夠顯示出育發(fā)效果。
本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物只要具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用，并沒有特別的限定，例如可以使用來源于藻類的巖藻依聚糖。另外，在本發(fā)明中，所謂巖藻依聚糖是以巖藻糖硫酸(有時(shí)稱為硫酸化巖藻糖)為構(gòu)成糖的多糖的總稱，也就是說，本發(fā)明中可以使用含有巖藻糖硫酸的多糖和/或其分解產(chǎn)物。
作為含有巖藻糖硫酸的多糖，例如硫酸化藻聚糖、硫酸化巖藻半乳聚糖、硫酸化墨角藻甘露聚糖、硫酸化葡萄糖醛酸木糖基藻聚糖、硫酸化木糖基墨角藻糖、硫酸化ascofiran、硫酸化葡萄糖醛酸半乳藻聚糖、硫酸化葡萄糖醛酸藻聚糖等。
這些巖藻依聚糖的制備可以分別采用公知的方法進(jìn)行制備，純化物或含有該巖藻依聚糖的物質(zhì)等可以用于本發(fā)明。
例如，Kjellmaniella crassifolia、海帶(Laminariajaponica)、Kjellmaniella gyrata、墨角藻屬(Fucus)、海蘊(yùn)(Nemacystus)、沖繩海蘊(yùn)(Cladosiphon okamuranus)、裙帶菜屬(Undaria)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、昆布(Eckloniakurome)、茶色海藻(Eisenia bicyclis)、褐藻(Ecklonia cava)、巨藻(Giant kelp)、黑巨藻(Lessonia nigrescence)、泡葉藻(Ascophyllum nodosum)等海帶目(Laminariales)、索藻目(Chordariales)、巖藻目(Fucales)等海藻富含適用于本發(fā)明的巖藻依聚糖，適合作為原料。另外，來源于紅藻的硫酸化多糖，例如來源于飼草(マグサ)、江籬、雞毛菜(Pterocladiella capillacea)的硫酸化多糖也具有與本發(fā)明使用的巖藻依聚糖同樣的效果，可以用于本發(fā)明。
作為本發(fā)明使用的巖藻依聚糖，可以例舉上述來源于藻類的巖藻依聚糖，但只要以硫酸化巖藻糖為構(gòu)成成分的多糖且具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用，并沒有特別的限定，也可以使用源于棘皮動(dòng)物，例如海參、海膽、海星等的巖藻依聚糖。
例如由Kjellmaniella crassifolia制備巖藻依聚糖，該巖藻依聚糖可以進(jìn)一步分離成具有通式(I)所示硫酸化糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的含有葡萄糖醛酸的巖藻依聚糖(上述U-巖藻依聚糖)以及具有通式(II)所示硫酸化糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的不含葡萄糖醛酸的巖藻依聚糖(上述F-巖藻依聚糖)。作為本發(fā)明的有效成分可以優(yōu)選使用各種巖藻依聚糖。另外，也可以由Kjellmaniella crassifolia制備具有通式(III)所示硫酸化糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的硫酸化巖藻半乳聚糖(上述G-巖藻依聚糖)進(jìn)行使用。
另外，也可以由沖繩海蘊(yùn)制備具有通式(IV)所示硫酸化糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的來源于沖繩海蘊(yùn)的巖藻依聚糖進(jìn)行使用。
U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖在由Kjellmaniellacrassifolia按照公知方法制備巖藻依聚糖后，用陰離子交換樹脂、表面活性劑等分離。源于Kjellmaniella crassifolia的U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖的存在比按重量比約為1∶2，U-巖藻依聚糖含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等，硫酸含量為約20重量％，F(xiàn)-巖藻依聚糖含有巖藻糖作為主成分，硫酸含量為約50重量％，兩種物質(zhì)的分子量均以約20萬為中心分布(第18次糖質(zhì)討論會(huì)要旨集，第159頁，1996年)。
例如將由Kjellmaniella crassifolia制備的巖藻依聚糖溶液施于DEAE-Cellulofine A-800柱上后，用含有NaCl的緩沖液按濃度梯度法進(jìn)行洗脫，可以分離U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖。

圖1表示其中的一個(gè)實(shí)例。也就是說，圖1是表示U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖的分離的圖，圖中前峰為U-巖藻依聚糖，后峰為F-巖藻依聚糖。
另外，例如源于墨角藻屬的巖藻依聚糖、源于海蘊(yùn)的巖藻依聚糖、源于沖繩海蘊(yùn)的巖藻依聚糖、源于裙帶菜屬的巖藻依聚糖、源于裙帶菜的巖藻依聚糖、源于飼草(マクサ)的硫酸化多糖、源于江籬的硫酸化多糖、源于黑巨藻的巖藻依聚糖、源于泡葉藻的巖藻依聚糖、源于雞毛菜的硫酸化多糖、源于其他藻類的巖藻依聚糖也可以分別按照公知的方法制備，用于本發(fā)明。
作為本發(fā)明中適用的源于棘皮動(dòng)物的巖藻依聚糖，例如特開平4-91027號(hào)公報(bào)中記載的海參中含有的巖藻依聚糖，可以按照該公報(bào)中記載的方法由海參制備該巖藻依聚糖。
另外，本發(fā)明的具有皮膚美容和/或育發(fā)作用的巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物可以通過酶學(xué)方法、化學(xué)方法、物理方法等公知的方法進(jìn)行制備，選擇所需的具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的分解產(chǎn)物進(jìn)行使用。
作為本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物的優(yōu)選制備方法，有酸分解法和酶分解法，可以通過對(duì)巖藻依聚糖進(jìn)行酸分解和酶分解，制備具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的分解產(chǎn)物。
本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖的酸分解條件只要是生成具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的分解產(chǎn)物(以下稱為本發(fā)明的分解產(chǎn)物)的條件即可，沒有特別的限定，通過對(duì)所得分解產(chǎn)物的生理作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以確定其條件。
例如通過將巖藻依聚糖溶解或懸濁于酸中，使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的分解產(chǎn)物。另外，通過在反應(yīng)時(shí)進(jìn)行加熱，可以縮短生成本發(fā)明的分解產(chǎn)物所必需的時(shí)間。
溶解或懸濁巖藻依聚糖的酸的種類沒有特別的限定，可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無機(jī)酸，枸櫞酸、甲酸、醋酸、乳酸、抗壞血酸等有機(jī)酸，以及陽離子交換樹脂、陽離子交換纖維、陽離子交換膜等固體酸。
酸的濃度沒有特別的限定，優(yōu)選以0.0001～5N，更優(yōu)選以0.01～1N左右的濃度使用。另外，反應(yīng)溫度也沒有特別的限定，可以設(shè)定為0～200℃，優(yōu)選設(shè)定為20～130℃。
另外，反應(yīng)時(shí)間也沒有特別的限定，優(yōu)選設(shè)定為數(shù)秒～數(shù)日。酸的種類和濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間最好根據(jù)本發(fā)明分解產(chǎn)物的產(chǎn)量、分解產(chǎn)物的聚合度適當(dāng)選擇。另外，制備本發(fā)明的分解產(chǎn)物時(shí)，優(yōu)選使用枸櫞酸、乳酸、蘋果酸等有機(jī)酸，酸的濃度在10mM～數(shù)M的范圍內(nèi)選擇，加熱溫度在50～110℃，更優(yōu)選在70～95℃的范圍內(nèi)選擇，加熱時(shí)間在數(shù)分鐘～24小時(shí)的范圍內(nèi)選擇，可以制備本發(fā)明的分解產(chǎn)物。作為巖藻依聚糖的酸分解產(chǎn)物，例如源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖的酸分解產(chǎn)物，該分解產(chǎn)物可以作為具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的強(qiáng)效新生理功能的食物纖維使用。
本發(fā)明的分解產(chǎn)物能夠以皮膚美容作用和/或育發(fā)作用為指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)，例如可以按照凝膠過濾法、采用分子量分級(jí)膜的分級(jí)法等對(duì)酸分解產(chǎn)物進(jìn)行分子量分級(jí)。
作為凝膠過濾法的實(shí)例，使用Cellulofine GCL-300，可以制備例如分子量25000以上、分子量25000～10000以上、分子量10000～5000以上、分子量5000以下等任意的分子量級(jí)分，使用CellulofineGCL-25，可以將分子量為5000以下的級(jí)分制備成分子量5000～3000以上、分子量3000～2000以上、分子量2000～1000以上、分子量1000～500以上、分子量500以下等任意的分子量級(jí)分。
另外，也可以使用超濾膜進(jìn)行工業(yè)分子量分級(jí)，例如可以通過使用DAICEL公司生產(chǎn)的FE10-FUSO382制備分子量30000以下的級(jí)分，通過使用DAICEL公司生產(chǎn)的FE-FUS-T653制備分子量6000以下的級(jí)分。也可以進(jìn)一步使用納米濾膜得到分子量500以下的級(jí)分，可以通過將這些凝膠過濾法、分子量分級(jí)法組合，制備任意的分子量級(jí)分。例如來源于巖藻屬的巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物中分子量為3萬以上的級(jí)分顯示強(qiáng)效的皮膚美容作用和/或育發(fā)作用，在本發(fā)明中適于使用分子量為3萬以上的來源于巖藻屬的巖藻依聚糖。
作為本發(fā)明中能夠使用的具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的巖藻依聚糖分解產(chǎn)物，例如式(V)表示的化合物、式(VI)表示的化合物、式(VII)表示的化合物，這些化合物可以按照國(guó)際公開第99/41288號(hào)說明書、國(guó)際公開第96/34004號(hào)說明書、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/JP00/00965號(hào)說明書中記載的方法制備。另外，以式(V)表示的化合物為基本骨架并具有其重復(fù)結(jié)構(gòu)的低聚糖，和以式(VI)表示的化合物為基本骨架并具有其重復(fù)結(jié)構(gòu)的低聚糖也可以分別用于本發(fā)明中。而且，以式(VII)表示的化合物為基本骨架并具有其重復(fù)結(jié)構(gòu)的低聚糖也可以分別用于本發(fā)明中。另外，作為本發(fā)明的分解產(chǎn)物，也包括國(guó)際公開第99/41288號(hào)說明書、國(guó)際公開第96/34004號(hào)說明書、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/JP00/00965號(hào)說明書中記載的巖藻依聚糖分解產(chǎn)物。
式(V)表示的化合物可以通過用交替單胞菌屬SN-1009(FERM BP-5747)產(chǎn)生的內(nèi)切型硫酸化多糖分解酶(F-巖藻依聚糖分解酶)處理上述F-巖藻依聚糖，由其分解產(chǎn)物純化得到。關(guān)于該化合物中硫酸基的含量、部位，可以由其分解產(chǎn)物中純化得到任意的物質(zhì)。另外，該分解產(chǎn)物中也含有式(V)所示化合物的聚合物，可以根據(jù)目的進(jìn)行分離、純化。
式(VI)表示的化合物可以通過用黃桿菌屬SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的內(nèi)切型硫酸化多糖分解酶(U-巖藻依聚糖分解酶)處理上述U-巖藻依聚糖，由其分解產(chǎn)物純化得到。關(guān)于該化合物中硫酸基的含量、部位，可以由其分解產(chǎn)物中純化得到任意的物質(zhì)。另外，該分解產(chǎn)物中也含有以式(VI)所示化合物為基本骨架的其聚合物，可以根據(jù)目的進(jìn)行分離、純化。
通過將源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖用交替單胞菌屬SN-1009(FERM BP-5747)產(chǎn)生的F-巖藻依聚糖分解酶以及黃桿菌屬SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的U-巖藻依聚糖分解酶分解，除去分解產(chǎn)物，可以純化上述G-巖藻依聚糖。
黃桿菌屬SA-0082(FERM BP-5402)也產(chǎn)生特異地分解該G-巖藻依聚糖的內(nèi)切型硫酸化多糖分解酶(G-巖藻依聚糖分解酶)，可以通過使該G-巖藻依聚糖分解酶作用于G-巖藻依聚糖，制備該G-巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物，由該分解產(chǎn)物中根據(jù)需要純化分解產(chǎn)物。式(VII)表示的化合物就是其中一個(gè)實(shí)例。關(guān)于該化合物中硫酸基的含量、部位，可以由其分解產(chǎn)物中純化得到任意的物質(zhì)。另外，該分解產(chǎn)物中也含有以式(VII)所示化合物為基本骨架的其聚合物，可以根據(jù)目的進(jìn)行分離、純化。
另外，作為式(V)表示的化合物的實(shí)例，有下述式(VIII)表示的化合物。另外，作為式(VI)表示的化合物的實(shí)例，有下述式(X)表示的化合物。而且，作為式(VII)表示的化合物的實(shí)例，有下述式(IX)表示的化合物。
另外，上述F-巖藻依聚糖分解酶、U-巖藻依聚糖分解酶、G-巖藻依聚糖分解酶的1單位(U)定義為1分鐘內(nèi)分別將相當(dāng)于1μmol的F-巖藻依聚糖、U-巖藻依聚糖、G-巖藻依聚糖的糖基鍵切斷的酶量。
巖藻依聚糖的鹽、其分解產(chǎn)物的鹽可以由巖藻依聚糖或其分解產(chǎn)物按照常規(guī)方法制備。另外，巖藻依聚糖的分解產(chǎn)物也可以根據(jù)需要適當(dāng)硫酸化后進(jìn)行使用，硫酸化的方法可以按照公知的方法進(jìn)行。
具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物及其鹽基于其皮膚美容作用(防止皮膚老化的作用等)，作為洗劑類、乳液類、面霜類、濕布劑類、軟膏類、浴用劑、浴用洗劑或洗面劑等化妝品的有效成分是有用的。另外，基于其育發(fā)作用，作為育發(fā)劑這類化妝品，例如毛發(fā)劑、育發(fā)劑、養(yǎng)發(fā)劑、脫發(fā)防止劑的有效成分是有用的，按照本發(fā)明可以提供以選自具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物或它們的鹽的物質(zhì)作為有效成分的皮膚美容作用和/或育發(fā)作用優(yōu)良的化妝品。作為該化合物的有效成分，例如選自U-巖藻依聚糖、F-巖藻依聚糖、G-巖藻依聚糖、源于沖繩海蘊(yùn)的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物的物質(zhì)較為合適，本發(fā)明可以提供以這些物質(zhì)為有效成分的生物化妝品。其中，作為巖藻依聚糖分解產(chǎn)物優(yōu)選使用例如從式(V)～(VII)表示的化合物中選擇的化合物。
巖藻依聚糖是含有硫酸化巖藻糖的多糖，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)硫酸化單糖也具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用。也就是說，本發(fā)明人等也提供含有硫酸化單糖或它們的鹽為有效成分的化妝品。
該化妝品中使用的硫酸化單糖或其鹽只要是具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的硫酸化單糖或其鹽即可，并沒有特別的限定，例如硫酸化巖藻糖、硫酸化葡萄糖、硫酸化半乳糖、硫酸化木糖、硫酸化2-去氧葡萄糖、硫酸化甘露糖、硫酸化塔羅糖及它們的鹽。
這些硫酸化單糖可以按照公知的合成方法合成，也可以由天然物中分解硫酸化多糖，并由該分解產(chǎn)物中純化進(jìn)行制備。另外，可以按照常規(guī)方法制備其鹽。
本發(fā)明的化妝品中，選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或它們的鹽的物質(zhì)的含量通常優(yōu)選0.0001～20重量％，更優(yōu)選0.001～5重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.03～3重量％。
本發(fā)明的化妝品可以按照常規(guī)方法進(jìn)行制備，可以適當(dāng)選擇配合通?；瘖y品中使用的烴類、蠟類、油脂類、酯類、高級(jí)脂肪酸類、高級(jí)醇類、表面活性劑類、香料、色素、防腐劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、醇類、pH調(diào)節(jié)劑、各種藥效成分等。另外，根據(jù)需要也可以添加本發(fā)明化妝品的有效成分即選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或它們的鹽的物質(zhì)以外的具有皮膚美容作用的成分、具有育發(fā)作用的生發(fā)成分、育發(fā)成分、養(yǎng)發(fā)成分、脫發(fā)防止成分等。例如作為上述具有皮膚美容作用的成分，可以例舉視黃酸、α-羥基酸、視黃醇、甘油、聚乙二醇、氫氧化鉀、三乙醇胺、其他糖類等，作為上述具有育發(fā)作用的成分，可以例舉米諾地爾、卡普氯銨、肝素類似物質(zhì)、甘油一亞油酸酯(リレ-ト)、亞油酸、各種生藥提取物等。
作為本發(fā)明的化妝品中含有的巖藻依聚糖，非拉絲性的巖藻依聚糖在不形成沉淀、對(duì)化妝品基質(zhì)的溶解性等方面比拉絲性的巖藻依聚糖優(yōu)良，因而優(yōu)選非拉絲性的巖藻依聚糖。
化妝品的形態(tài)只要能夠期待獲得皮膚美容作用，并沒有特別的限定，例如洗劑類、乳液類、面霜類、濕布劑類、軟膏類、浴用劑、浴用洗劑、洗面劑、洗發(fā)劑等。
另外，作為育發(fā)劑的化妝品形態(tài)只要能夠期待獲得對(duì)毛發(fā)的作用，并沒有特別的限定，例如洗劑類、乳液類、乳膏類、軟膏類、毛發(fā)劑、育發(fā)劑、養(yǎng)發(fā)劑、脫發(fā)防止劑或洗發(fā)劑。
作為本發(fā)明化妝品的一種方式的育發(fā)劑，可以涂敷或貼付在需要育發(fā)的部位進(jìn)行使用。另外，本發(fā)明的育發(fā)劑也可以制成能夠飲食的形態(tài)口服攝取。
本發(fā)明化妝品的使用方式?jīng)]有特別的限定，例如作為上述育發(fā)劑的使用方式，可以至少1天1次將1mL中含有巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖和/或它們的鹽0.1ng～100mg的該育發(fā)劑數(shù)mL涂敷在需要育發(fā)的部位，或者將含有同量的濕布劑等貼付在需要育發(fā)的部位。
另外，從期待獲得皮膚美容作用的觀點(diǎn)來看，使用本發(fā)明化妝品的場(chǎng)合也能夠以與上述育發(fā)劑同樣的使用方式進(jìn)行使用，從而得到所需的效果。
作為口服攝取的量，只要攝取巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖和/或它們的鹽顯示皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的量即可，并沒有特別的限定，通常每天優(yōu)選0.1mg～10g，更優(yōu)選2mg～5g，進(jìn)一步優(yōu)選10mg～2g。
另外，以前對(duì)促進(jìn)或維持人的頭發(fā)生長(zhǎng)所使用的育發(fā)劑提出了各種技術(shù)，并已實(shí)際使用。
作為以前的育發(fā)劑的有效成分，已知米諾地爾(特開平9-169622號(hào)公報(bào))、卡普氯銨(特開平9-175950號(hào))等。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過將選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)以及以前的育發(fā)劑的有效成分一起使用，育發(fā)作用協(xié)同增強(qiáng)。
也就是說，按照本發(fā)明提供含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)以及育發(fā)作用增強(qiáng)成分，例如以前育發(fā)劑的有效成分的育發(fā)劑。
作為上述育發(fā)作用增強(qiáng)成分，只要通過與選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)一起使用能夠協(xié)同增強(qiáng)育發(fā)作用即可，可以按照本發(fā)明公開的方法(例如實(shí)施例19記載的方法)適當(dāng)選擇。作為所述育發(fā)作用增強(qiáng)成分，本發(fā)明中適于使用的以前的育發(fā)劑的有效成分可以例舉米諾地爾以及卡普氯銨。另外，這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用，或混合使用。
含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)以及育發(fā)作用增強(qiáng)成分的育發(fā)劑中，選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化多糖及它們的鹽的物質(zhì)以及育發(fā)作用增強(qiáng)成分的含量只要是能夠發(fā)揮這些物質(zhì)產(chǎn)生的協(xié)同效果的量即可，并沒有特別的限定，作為選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)，在該育發(fā)劑中優(yōu)選0.01～30重量％，更優(yōu)選0.1～10重量％。另外，作為育發(fā)作用增強(qiáng)成分的含量，米諾地爾的場(chǎng)合，在該育發(fā)劑中優(yōu)選0.1～5重量％，更優(yōu)選0.5～2重量％。另一方面，卡普氯銨的場(chǎng)合，在該育發(fā)劑中優(yōu)選0.1～10重量％，更優(yōu)選0.5～5重量％。分別在上述含量范圍內(nèi)含有本發(fā)明中使用的上述有效成分以及育發(fā)作用增強(qiáng)成分的育發(fā)劑其育發(fā)作用非常優(yōu)良。
另外，本發(fā)明的育發(fā)劑中也可以進(jìn)一步含有能夠增強(qiáng)米諾地爾和/或卡普氯銨的效果的物質(zhì)。作為具有所述效果的物質(zhì)，例如腎上腺素、四氫萘唑啉、鹽酸萘唑啉等局部滯留化劑，丙二醇、1，3-丁二醇等極性溶劑，紫草根、獨(dú)活、麻黃、腰果、日本人參等生藥提取物，泛醇、乙醚、水溶性殼多糖衍生物等。
而且，作為本發(fā)明的一種方式，提供能夠作為食品或飲料使用的化妝品。所述化妝品通過含有、添加和/或稀釋具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或它們的鹽而成，基于其皮膚美容作用和/或育發(fā)作用，作為例如皮膚美容用食品或飲料、脫發(fā)防止用食品或飲料、或者育發(fā)用食品或飲料是非常有用的。
本發(fā)明的皮膚美容用食品或飲料、育發(fā)用食品或飲料等的制備方法沒有特別的限定，可以列舉烹調(diào)、加工以及一般采用公知的食品或飲料的制備方法，只要制得的食品或飲料中含有、添加和/或稀釋有具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的本發(fā)明使用的選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)作為有效成分即可。
另外，本方式中，“含有”是指食品或飲料等中含有本發(fā)明使用的有效成分的方式，“添加”是指在食品或飲料等的原料中添加本發(fā)明使用的有效成分的方式，“稀釋”是指在本發(fā)明使用的有效成分中添加食品或飲料等原料的方式。
作為本發(fā)明的皮膚美容用食品或飲料、或者育發(fā)用食品或飲料的形態(tài)，沒有特別的限定，例如谷類加工品(小麥粉加工品、淀粉加工品、預(yù)混合加工品、面類、通心粉類、面包類、餡類、蕎麥面類、麩子、米粉、粉條、包裝餅等)，油脂加工品(可塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黃醬類、調(diào)味汁等)，大豆加工品(豆腐類、豆醬、納豆等)，肉類加工品(火腿、熏豬肉、壓縮火腿、香腸等)，水產(chǎn)品(冷凍碎魚肉、魚糕、魚卷、魚肉山芋蒸餅、油炸魚丸子、汆魚丸子、飯卷、魚肉火腿、香腸、干狐鰹、魚子加工品、水產(chǎn)品罐頭、煮的魚貝等)，乳制品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、煉乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果實(shí)加工品(餡類、果醬類、腌菜類、果類飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)，糖果類(巧克力、餅干類、甜點(diǎn)類、蛋糕、年糕、米糕類等)，酒精飲料(日本酒、中國(guó)酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸餾酒、伏特加酒、白蘭地、杜松子酒、糖蜜酒、啤酒、清涼醇飲料、果酒、利口酒等)，嗜好飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)，調(diào)料(醬油、辣醬油、醋、料酒等)，罐裝、瓶裝、袋裝食品(牛肉蓋飯、小鍋什錦飯、紅小豆飯、咖哩飯、其它各種烹調(diào)好的食品)，半干燥或濃縮食品(肝醬、其它涂抹果醬的食品、蕎麥·面條的汁、濃縮的湯類)，干燥食品(速食面類、速食咖哩飯、速溶咖啡、果汁粉、湯粉、速食醬類、烹調(diào)好的食品、烹調(diào)好的飲料、烹調(diào)好的湯等)，冷凍食品(素?zé)?、蒸雞蛋羹、烤鰻魚串、漢堡包、燒麥、餃子、各種面條、雞尾酒等)，固態(tài)食品、液態(tài)食品(湯等)，香料類等農(nóng)產(chǎn)·林產(chǎn)加工品、畜牧加工品、水產(chǎn)加工品等。
作為本發(fā)明的食品或飲料，含有、添加和/或稀釋有選自具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及其鹽的物質(zhì)，只要含有用于表達(dá)其生理作用的必要量即可，對(duì)其形狀沒有特別的限定，也包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等能夠口服攝取的形狀。另外，具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的源于藻類的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物作為同時(shí)具有該生理作用和食物纖維功能的健康食品原料，作為食品和飲料的制造原料是非常有用的。
本發(fā)明的皮膚美容用食品、育發(fā)用食品等中選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及其鹽的物質(zhì)的含量只要含有顯示皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的量即可，并沒有限定，優(yōu)選0.001～100重量％，更優(yōu)選0.01～10重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.05～5重量％。作為該皮膚美容用食品、育發(fā)用食品等，也可以將選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)直接作為粉末或片劑攝取。
另外，皮膚美容用飲料、育發(fā)用飲料等中選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的物質(zhì)的含量只要含有顯示皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的量即可，并沒有限定，優(yōu)選0.0001～10重量％，更優(yōu)選0.005～5重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.02～2重量％。
皮膚美容用食品或飲料、育發(fā)用食品或飲料等的使用方式?jīng)]有特別的限定，但是從有效獲得皮膚美容效果和/或育發(fā)效果的觀點(diǎn)來看，最好使本發(fā)明使用的上述有效成分能夠每天攝取0.1mg～10g，更優(yōu)選2mg～5g，進(jìn)一步優(yōu)選10mg～2g。
本發(fā)明中使用的巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽在給大鼠口服時(shí)，確認(rèn)即使1次口服給藥1g/kg，也沒有死亡例。
另外，剃除Harlee系土撥鼠背部的毛，將巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽的3％乳液連續(xù)涂敷給藥5日，1日1次，每次0.05mL，給藥開始后第6天按照貼付試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(日本皮膚科學(xué)會(huì))進(jìn)行判斷，沒有反應(yīng)，確認(rèn)巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖及它們的鹽沒有皮膚刺激性。
本發(fā)明提供的化妝品作為皮膚美容用和/或育發(fā)用化妝品是非常有用的。
將氯化鈣二水合物(日本曹達(dá)社制)7.3kg溶解于自來水900升中，其次混合Kjellmaniella crassifolia粉碎物20kg。通入水蒸氣使之由液體溫度12℃升溫40分鐘達(dá)到液體溫度90℃，接著攪拌條件下在90～95℃保溫1小時(shí)，接著冷卻，得到冷卻物1100升。
接著，使用固液分離裝置(West Farrier Separator公司制CNA型)，對(duì)冷卻物進(jìn)行固液分離，制備約900升的固液分離上清液。
使用DAICEL公司制FE10-FC-FUS0382(級(jí)分分子量3萬)，將固液分離上清液360升濃縮至20升。接著，加入自來水20升，再濃縮至20升，這種操作進(jìn)行5次，進(jìn)行脫鹽處理，配制源于Kjellmaniella crassifolia的萃取液25升。
冷凍干燥該溶液1升，得到源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖干燥物13g。
按照上述方法由海帶干燥粉碎物制備非拉絲性的源于海帶的巖藻依聚糖的干燥物。另外，同樣由黑巨藻(Lessonia nigrescens)的干燥粉末(商品名Sea Weed PowderAndis貿(mào)易株式會(huì)社出售)制備非拉絲性的源于黑巨藻的巖藻依聚糖干燥物。
(2)將實(shí)施例1-(1)記載的巖藻依聚糖干燥物7g溶解于含有50mM氯化鈉和10％乙醇的20mM的咪唑緩沖液(pH8.0)700ml中，通過離心分離除去不溶物。用同樣的緩沖液將DEAE-Cellulofine A-800柱(φ11.4cm×48cm)平衡化，供給離心分離上清液后，用同樣的緩沖液洗滌，按照氯化鈉50mM至1.95M的濃度梯度進(jìn)行洗脫(1級(jí)分250ml)。用酚硫酸法以及咔唑硫酸法求出總糖量和糖醛酸含量，按洗脫順序得到級(jí)分43～49、級(jí)分50～55、級(jí)分56～67。接著，通過電透析將這些級(jí)分脫鹽后進(jìn)行冷凍干燥，分別由級(jí)分43～49制得I級(jí)分(340mg)，由級(jí)分50～55制得II級(jí)分(870mg)，由級(jí)分56～67制得III級(jí)分(2.64g)。
圖1表示源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脫曲線。圖1中縱軸表示按咔唑硫酸法得到的530nm處的吸光度(圖中黑圓圈)、按酚硫酸法得到的480nm處的吸光度(圖中白圓圈)以及電導(dǎo)率(mS/cm圖中白方塊)，橫軸表示級(jí)分序號(hào)。實(shí)施例2(1)在分別注入了含有葡萄糖0.25％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH8.2構(gòu)成的培養(yǎng)基600ml并滅菌(120℃，20分鐘)后的2升錐形瓶中接種交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)，在25℃下培養(yǎng)26小時(shí)，得到種培養(yǎng)液。將含有蛋白胨1.0％、酵母提取物0.02％、下述實(shí)施例2-(2)記載的硫酸化多糖0.2％以及消泡劑(信越化學(xué)工業(yè)社制KM70)0.01％的人工海水pH8.0構(gòu)成的培養(yǎng)基20升裝入30升容量的發(fā)酵罐中，在120℃下殺菌20分鐘。冷卻后，接種上述種培養(yǎng)液600ml，在每分鐘10升的通氣量和每分鐘250轉(zhuǎn)的攪拌速度的條件下，在24℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離培養(yǎng)液，得到菌體和培養(yǎng)上清液。用裝有排除分子量1萬的全纖維的超濾器濃縮得到的培養(yǎng)上清液，之后用85％飽和硫酸銨鹽析，通過離心分離收集生成的沉淀，對(duì)含有十分之一濃度人工海水的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.2)充分透析，配制600ml選擇性作用于F-巖藻依聚糖的F-巖藻依聚糖分解酶液。
(2)用裝有直徑1mm的篩網(wǎng)的切磨機(jī)(增幸產(chǎn)業(yè)社制)將干燥后的Kjellmaniella crassifolia 2Kg粉碎，將得到的海帶碎片懸濁于20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時(shí)，用濾紙過濾后，充分洗滌殘?jiān)⒌玫降臍堅(jiān)鼞覞嵊诩訜嶂?5℃的40升含有50mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液pH6.5中，不斷攪拌的同時(shí)在95℃下處理2小時(shí)，提取硫酸化多糖。
過濾提取液中的懸濁物，制得濾液后，用3.5升100mM氯化鈉洗滌過濾殘?jiān)俚玫綖V液。
將兩次的濾液合并后，將溫度降低至30℃，添加3000U的海藻酸裂合酶(Nagase生化學(xué)工業(yè)社制)后，加入乙醇4升，在25℃下攪拌24小時(shí)。其次，進(jìn)行離心分離，用具備排除分子量10萬的全纖維的超濾器將得到的上清液濃縮至4升，再用含有10％乙醇的100mM氯化鈉繼續(xù)超濾，直到著色性物質(zhì)不再過濾。
通過離心分離除去非濾液中生成的沉淀，將該上清液的溫度降低至5℃，用0.5N鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0后，通過離心分離除去生成的蛋白質(zhì)等沉淀，迅速用1N氫氧化鈉將得到的上清液的pH調(diào)節(jié)至8.0。
其次，用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器進(jìn)行超濾，用20mM氯化鈉pH8.0完全取代溶劑后，再調(diào)節(jié)pH至8.0，離心分離后，進(jìn)行冷凍干燥，制得約95g的硫酸化多糖。
(3)用裝有直徑1mm篩網(wǎng)的切磨機(jī)粉碎干燥的Kjellmaniellacrassifolia 2Kg，將得到的海帶碎片懸濁于20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時(shí)，用濾紙過濾后，充分洗滌殘?jiān)?。將得到的殘?jiān)鼞覞嵊诤?0mL上述實(shí)施例2-(1)制得的F-巖藻依聚糖分解酶、10％乙醇、100mM氯化鈉、50mM氯化鈣以及50mM咪唑的20升緩沖液(pH8.2)中，在25℃下攪拌48小時(shí)。用網(wǎng)眼的直徑為32μm的不銹鋼金屬網(wǎng)過濾該懸濁液，用含有50mM氯化鈣的10％乙醇洗滌殘?jiān)?。再將該殘?jiān)鼞覞嵊?0升含有50mM氯化鈣的10％乙醇中，攪拌3小時(shí)后，用不銹鋼金屬網(wǎng)過濾，洗滌。再將該殘?jiān)谕瑯拥臈l件下懸濁后，攪拌16小時(shí)，用直徑32μm的不銹鋼金屬網(wǎng)過濾，洗滌。
收集這樣得到的濾液和洗滌液，用裝有排除分子量3000的全纖維的超濾器進(jìn)行超濾，分離成濾液和非濾液。
用旋轉(zhuǎn)式汽化器將該濾液濃縮至約3升后，離心分離得到上清液。用裝有排除分子量300的膜的電透析器將得到的上清液脫鹽后，向該溶液中添加醋酸鈣達(dá)到0.1M，離心分離除去生成的沉淀。將該上清液裝入預(yù)先用50mM醋酸鈣平衡后的DEAE-Cellulofine(樹脂量4升)，用50mM醋酸鈣和50mM氯化鈉充分洗滌后，按50mM～800mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。這時(shí)的收集量按每1級(jí)分500ml進(jìn)行。用醋酸纖維素膜電泳法〔Analytical Biochemistry，第37卷，第197～202頁(1970)〕分析收集的級(jí)分，用氯化鈉濃度為約0.4M洗脫的硫酸化糖(級(jí)分序號(hào)63附近)是均一的。
然后，首先將級(jí)分序號(hào)63的溶液濃縮至150mL后，添加氯化鈉使?jié)舛冗_(dá)到4M，裝入預(yù)先用4M氯化鈉平衡后的Phenyl-Cellulofine(樹脂量200mL)，用4M氯化鈉充分洗滌。收集非吸附性的硫酸化糖級(jí)分，用裝有排除分子量300的膜的電透析器脫鹽，得到脫鹽液505mL。
將得到的脫鹽液中40mL裝入用含有10％乙醇的0.2M氯化鈉平衡后的Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)中，進(jìn)行凝膠過濾。收集按每1級(jí)分9.2mL進(jìn)行。
按照酚硫酸法〔Analytical Chemistry，第28卷，第350頁(1956)〕對(duì)總級(jí)分進(jìn)行總糖量的分析。
結(jié)果，由于硫酸化糖形成了1個(gè)峰，收集其峰的中央部分，即級(jí)分序號(hào)63～70，用裝有排除分子量300的膜的電透析器脫鹽后，冷凍干燥，得到112mg下述式(VIII)表示的化合物的干燥品。以下將該化合物稱為7-12SFd-F。 (4)向?qū)嵤├?-(2)制得的III級(jí)分(F-巖藻依聚糖)的2.5％水溶液80mL中添加1M Tris-鹽酸緩沖液(pH7.6)16mL、1M CaCl2水溶液16mL、4M NaCl水溶液24mL、實(shí)施例2-(1)得到的F-巖藻依聚糖分解酶8mL、蒸餾水176mL，在30℃下加熱3小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)式汽化器將該酶處理F-巖藻依聚糖溶液濃縮至酶處理F-巖藻依聚糖的最終濃度達(dá)到2％，之后在蒸餾水中進(jìn)行透析操作，制得2％酶處理F-巖藻依聚糖水溶液。用HPLC(柱SB 802.5，柱溫度35℃，移動(dòng)相50mM NaCl，流速0.5mL/min，檢測(cè)RI ATT＝8)分析該試樣。結(jié)果得知試樣中的約40％為式(VIII)記載的7-12SFd-F。
(2)將上述冷凍干燥物15g溶解于含有培養(yǎng)國(guó)際公開第97/26896號(hào)說明書記載的黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)SA-0082(FERM BP-5402)由該培養(yǎng)物得到的內(nèi)切型硫酸化多糖分解酶(U-巖藻依聚糖分解酶)9U以及400mM氯化鈉的1.5升50mM Tris-鹽酸緩沖液中，在25℃下反應(yīng)6天后，用蒸發(fā)器濃縮至約300ml。將濃縮液加入到排除分子量3500的透析管中徹底透析，將殘留在透析管內(nèi)的液體裝入用50mM氯化鈉平衡后的4升DEAE-Cellulofine A-800中，用50mM氯化鈉充分洗滌后，按照50～650mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。再用650mM的氯化鈉充分洗脫同一柱。收集洗脫級(jí)分中用650mM氯化鈉洗脫出的級(jí)分作為硫酸化巖藻半乳聚糖級(jí)分，用排除分子量10萬的超濾器濃縮后，用10mM的氯化鈉更換溶液，冷凍干燥得到非拉絲性的硫酸化巖藻半乳聚糖的冷凍干燥物0.85g。得到的硫酸化巖藻半乳聚糖(G-巖藻依聚糖)含有半乳糖和巖藻糖作為構(gòu)成糖，其摩爾比為約2∶1。
(3)為了生產(chǎn)G-巖藻依聚糖分解酶，將含有葡萄糖0.1％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH7.5構(gòu)成的培養(yǎng)基600ml在120℃滅菌20分鐘后，在該培養(yǎng)基中接種黃桿菌屬SA-0082(FERM BP-5402)，在24℃下培養(yǎng)23小時(shí)，得到種培養(yǎng)液。將含有按實(shí)施例3-(1)的方法制得的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖級(jí)分0.2％、蛋白胨2.0％、酵母提取物0.01％以及消泡劑(KM70，信越化學(xué)工業(yè)制)0.01％的人工海水(pH7.5)構(gòu)成的培養(yǎng)基20升裝入30升容量的發(fā)酵罐中，在120℃下殺菌20分鐘。冷卻后，接種上述種培養(yǎng)液600ml，在每分鐘10升的通氣量和每分鐘125轉(zhuǎn)的攪拌速度的條件下，在24℃培養(yǎng)23小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離培養(yǎng)液，得到菌體。
將得到的菌體懸濁于1200mL含有0.4M氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中，超聲波粉碎后，進(jìn)行離心分離，得到菌體提取液。用相同緩沖液對(duì)得到的菌體提取液進(jìn)行充分透析，離心分離得到上清液。向得到的上清液中添加硫酸銨使最終濃度達(dá)到90％飽和，離心分離收集生成的沉淀。將得到的沉淀溶解于150mL含有50mM氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中，用相同的緩沖液進(jìn)行充分透析，離心分離。將得到的上清液裝入用相同緩沖液平衡后的500mL DEAE-Cephalose FF(Amasiam Pharmasia社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照50mM至600mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集活性級(jí)分。
用含有0.1M氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)對(duì)得到的活性級(jí)分進(jìn)行充分透析，裝入用相同緩沖液平衡后的100mL DEAE-Cellulofine A-800(Tisso社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按0.1M至0.4M氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集活性級(jí)分。向得到的活性級(jí)分中添加氯化鈉使之達(dá)到4M，裝入用含有4M氯化鈉的10mMTris-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡后的20mL Phenyl-Cellulofine(Tisso社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照4M至1M氯化鈉的濃度梯度洗脫后，再用含有1M氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)充分洗脫，收集活性級(jí)分。向得到的活性級(jí)分中添加氯化鈉使之達(dá)到3M，裝入用含有3M氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡后的10mL Phenyl-Cellulofine(Tisso社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照3M至0.5M氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫后，再用含有0.5M氯化鈉的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)充分洗脫，收集活性級(jí)分。使用這樣得到的純化酶作為G-巖藻依聚糖分解酶。
(4)使上述純化G-巖藻依聚糖分解酶作用于實(shí)施例3-(2)記載的G-巖藻依聚糖，制備低分子化物。也就是說，將1.94g的G-巖藻依聚糖溶解于含有0.2M氯化鈉的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)后，加入186mU的G-巖藻依聚糖分解酶，在25℃下使之反應(yīng)6天。用蒸發(fā)器將反應(yīng)液濃縮至80mL，采用Cellulofine GCL-1000(Tisso社制)的柱(4×90cm)進(jìn)行分子量分級(jí)。收集分子量15000以下的級(jí)分，作為G-巖藻依聚糖酶消化物級(jí)分。
(5)用蒸發(fā)器將上述G-巖藻依聚糖酶消化物級(jí)分濃縮至500mL后，通過電透析裝置進(jìn)行脫鹽，裝入預(yù)先用含有10mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800(Tisso社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，按照10mM至900mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫級(jí)分每次收集61mL，采用酚硫酸法測(cè)定每一級(jí)分的糖含量。用270mM左右的氯化鈉洗脫的級(jí)分形成了糖含量的峰，因此收集這些級(jí)分作為270mM洗脫級(jí)分(a)。
另外，關(guān)于上述270mM洗脫級(jí)分(a)，添加水使之達(dá)到與含有150mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8)相同的導(dǎo)電度，裝入預(yù)先用含有150mM氯化鈉的10mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH8)平衡后的200mLDEAE-Cellulofine A-800(Tisso社制)柱中，用相同緩沖液洗滌后，采用150mM至300mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫級(jí)分每次收集12mL，采用酚硫酸法測(cè)定每一級(jí)分的糖含量。收集用160mM至180mM左右的氯化鈉洗脫的級(jí)分，用Speed Back(Savant Instruments社制)濃縮至2mL后，裝入預(yù)先用10％乙醇平衡后的200mLCellulofine GCL-25(Tisso社制)柱中，用相同溶液洗脫。洗脫級(jí)分每次收集2mL，采用酚硫酸法測(cè)定每一級(jí)分的糖含量。收集糖含量形成峰的級(jí)分，作為(D)。
對(duì)于上述(D)級(jí)分，采用電透析裝置進(jìn)行脫鹽后，冷凍干燥，分析糖組成和分子量。另外，按照常規(guī)方法用重水取代后，采用NMR分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。(D)的物理性質(zhì)分子量13581H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.62(1H，與HOD重復(fù)，G1-1-H)，4.59(1H，與HOD重復(fù)，G2-1-H)，4.54(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.46(1H，m，F(xiàn)2-3-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.37(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.21(1H，m，G3-3-H)，4.19(1H，m，G4-3-H)，4.15(1H，br-s，G4-4-H)，4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.7Hz，F(xiàn)1-4-H)，4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F(xiàn)2-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)、3.96(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.93(1H，m，G3-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F(xiàn)2-2-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，G1-6-H)，3.64(1H，m，G4-6-H)，3.61(1H，m，G4-5-H)，3.58(1H，m，G1-2-H)，3.56(1H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G4-6-H)，3.55(1H，m，G4-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.20(3H，d，J＝6.7，F(xiàn)1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)2-6-H)糖組成(摩爾比)L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶4硫酸基 5分子另外，1H-NMR的峰所歸屬的序號(hào)如下述式(IX)所示。以下，將該化合物稱為6-5SFd-G。

向超濾內(nèi)液中添加34U的實(shí)施例3-(2)記載的U-巖藻依聚糖分解酶，在25℃下攪拌2天，進(jìn)行裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾，在添加水的同時(shí)進(jìn)行超濾。
收集濾液后，用蒸發(fā)器濃縮至1.5升后，采用脫鹽裝置完全脫碳，裝入預(yù)先用含有30mM氯化鈉的5mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6.5)平衡后的3升DEAE-Cellulofine A-800(Tisso社制)柱中，用6升相同緩沖液洗滌后，按照30mM至500mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫需要的液量為48升。洗脫液每次收集180mL，采用酚硫酸法測(cè)定其糖含量。另外，同時(shí)測(cè)定232nm處的吸光度。由于130mM至170mM氯化鈉的洗脫級(jí)分形成了一個(gè)峰，因此收集這些級(jí)分，用脫鹽裝置進(jìn)行脫鹽后，冷凍干燥，得到5.85g的低聚糖。該低聚糖通過質(zhì)量分析確認(rèn)分子量為1128，通過NMR分析確認(rèn)為下述式(X)表示的化合物。以下，將該化合物稱為6-2SFd-U。

在攪拌的同時(shí)，向該巖藻依聚糖溶液46升中添加將1g棕櫚油(花王社制化妝品用)溶解于1升乙醇中制得的棕櫚油溶液1升，再添加1升甘油，制得化妝水。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物，也采用同樣的方法制得化妝水。
(2)向?qū)嵤├?-(1)制得的巖藻依聚糖溶液中添加明膠和香料使最終濃度達(dá)到0.02％，得到使用明膠的化妝水。另外，同樣添加膠原得到使用膠原的化妝水。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物，也采用同樣的方法制得化妝水。
(3)向?qū)嵤├?-(1)制得的巖藻依聚糖中添加香料，制得毛發(fā)劑。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物，也同樣制得毛發(fā)劑。
按照上述方法，由泡葉藻(Ascophyllum nodosum)的干燥粉末(商品名Algin GoldAndis貿(mào)易株式會(huì)社出售)制得非拉絲性的來源于泡葉藻的巖藻依聚糖。
(2)按照實(shí)施例10-(1)記載的方法由干燥江籬50g制得源于江籬的硫酸化多糖4.4g。另外，同樣由干燥雞毛菜(Pterocladiellacapillacea)制得源于雞毛菜的硫酸化多糖1.0g。
(3)-①將市售的干燥黑巨藻粉末1kg懸濁于10升的80％乙醇中后，在25℃下攪拌3小時(shí)，用濾紙過濾。將得到的殘?jiān)鼞覞嵊?0升含有100mM氯化鈉的30mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，在95℃下處理2小時(shí)后，用孔徑106μm的不銹鋼制篩過濾。向得到的濾液中加入100g活性炭、2.4升乙醇、6000U海藻酸裂合酶K，在25℃下攪拌22小時(shí)后，離心分離。將得到的上清液用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器濃縮至1.2升后，離心分離除去不溶物，在5℃下放置24小時(shí)。離心分離除去生成的沉淀，通過超濾器對(duì)得到的上清液進(jìn)行溶液交換，得到100mM氯化鈉溶液。將該溶液冷卻至4℃以下后，用鹽酸將pH調(diào)節(jié)為2.0，離心分離除去生成的沉淀。用氫氧化鈉將得到的上清液的pH調(diào)節(jié)為8.0，濃縮至2升后，通過超濾器溶液交換為20mM氯化鈉溶液。離心分離除去該溶液中的不溶物后，冷凍干燥，得到非拉絲性的源于黑巨藻的巖藻依聚糖級(jí)分的干燥物41g。
(3)-②將上述冷凍干燥物6g溶解于含有100mM氯化鈉的60mL的20mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH6)中，裝入預(yù)先用相同緩沖液平衡后的5升DEAE-Cellulofine A-800中，用10升相同緩沖液洗滌后，按照100～1600mM氯化鈉的濃度梯度進(jìn)行洗脫。洗脫使用的液量為13升，收集按每1級(jí)分500mL進(jìn)行。分別將洗脫級(jí)分中250mM、530mM和700mM左右的氯化鈉洗脫級(jí)分每500mL用純水進(jìn)行透析，冷凍干燥，將冷凍干燥物分別命名為DEAE33級(jí)分、DEAE37級(jí)分、DEAE40級(jí)分，分別得到57mg、24mg和62mg。
(2)使Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234(FERM P-17517)產(chǎn)生的巖藻依聚糖分解酶作用于該巖藻依聚糖，對(duì)得到的酶分解產(chǎn)物進(jìn)行NMR、MASS等的儀器分析，結(jié)果判斷出該巖藻依聚糖是以上述通式(IV)的結(jié)構(gòu)為重復(fù)單元的巖藻依聚糖。另外，該巖藻依聚糖是以35∶10～44∶10的摩爾比含有巖藻糖和葡萄糖醛酸的巖藻依聚糖，其平均分子量為約100萬。
結(jié)果如表1所示。另外，在表中對(duì)于毛的長(zhǎng)度用5例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，對(duì)于皮膚顏色用以對(duì)照組的色調(diào)為100時(shí)色調(diào)黑度的5例平均值表示。
觀察到對(duì)照組處于明顯向靜止期轉(zhuǎn)移的狀態(tài)，皮膚顏色向白色轉(zhuǎn)移。另一方面，巖藻依聚糖給藥組維持成長(zhǎng)期，皮膚顏色比對(duì)照組顯灰色。毛的長(zhǎng)度是巖藻依聚糖給藥組比對(duì)照組長(zhǎng)。也就是說，確認(rèn)巖藻依聚糖給藥組有育發(fā)效果。
表1毛的長(zhǎng)度(mm) 皮膚顏色源于Kjellmaniella crassifolia6.86±0.20 125的巖藻依聚糖給藥組(N＝5)對(duì)照組(N＝5) 6.38±0.19 100平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差C3H/He小鼠多用于評(píng)價(jià)育毛效果。5周齡時(shí)的毛發(fā)相當(dāng)于成長(zhǎng)期，是毛和毛囊旺盛成長(zhǎng)的時(shí)期。在這一時(shí)期毛囊細(xì)胞中色素和酶的分泌旺盛，因此可見皮膚顏色發(fā)黑。但是，如果毛發(fā)的狀態(tài)開始由成長(zhǎng)期向靜止期轉(zhuǎn)移，則毛停止生長(zhǎng)，毛囊變小，分泌功能衰退。因此，可見皮膚顏色逐漸變淡，由粉色轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)白。毛發(fā)的循環(huán)原本是生理性循環(huán)，但是如果能夠維持成長(zhǎng)期，則生長(zhǎng)的毛發(fā)的比例增加，作為育發(fā)劑是有用的(The Journal of Dermatology 1045-54，1983)。
另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
(2)由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在8周齡用于實(shí)驗(yàn)。用理發(fā)剪子剪掉小鼠背部的毛。
將實(shí)施例1-(1)制得的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖用乙醇懸濁溶解至3％濃度，涂敷于小鼠背部的上述剃毛部位，每只200μL。對(duì)照組同樣涂敷乙醇。給藥為1日1次，連續(xù)進(jìn)行。
從給藥開始后經(jīng)時(shí)觀察給藥部位，使皮膚色調(diào)的變化評(píng)分化進(jìn)行判斷。也就是說，評(píng)分化的標(biāo)準(zhǔn)如下所述，評(píng)分0皮膚顏色沒有變化，評(píng)分1皮膚顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗌?，評(píng)分2皮膚顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗪凇疑?，評(píng)分3可見毛發(fā)生成，評(píng)分4幾乎恢復(fù)到剃毛前的狀態(tài)。
求出各組評(píng)分的平均值，其結(jié)果如表2所示。
如表2所示，相對(duì)于對(duì)照組，源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖給藥組早期觀察到皮膚顏色變化，促進(jìn)毛發(fā)發(fā)育，最終達(dá)到毛發(fā)生成。也就是說，能夠確認(rèn)育發(fā)效果。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表2給藥時(shí)間(周)5 678910評(píng)分平均值源于Kjellmaniella crassifolia 00.3 1.7 2.0 2.3 3.0的巖藻依聚糖給藥組(N＝3)對(duì)照組(N＝3)0001.0 1.0 2.0(3)由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在8周齡用于實(shí)驗(yàn)。用理發(fā)剪子將小鼠背部的毛剪掉后，再用剃刀剃毛。
使用實(shí)施例1-(1)制得的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖，或者實(shí)施例2-(3)制得的7-12SFd-F，采用與實(shí)施例13-(2)同樣的方法對(duì)其育發(fā)效果進(jìn)行試驗(yàn)。
求出各組評(píng)分的平均值，其結(jié)果如表3所示。
如表3所示，相對(duì)于對(duì)照組，源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖給藥組、7-12SFd-F給藥組均在早期觀察到皮膚顏色變化，促進(jìn)毛發(fā)發(fā)育，最終達(dá)到毛發(fā)生成。另外，7-12SFd-F給藥組較源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖給藥組在較早時(shí)期就可見皮膚顏色的變化。另外，對(duì)各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表3給藥時(shí)間(天) 89 10 11 12評(píng)分平均值7-12SFd-F給藥組(N＝8)00.40.51.11.8源于Kjellmaniella crassifolia00 0.40.71.3的巖藻依聚糖給藥組(N＝7)對(duì)照組(N＝8) 00 0 0.50.6(4)由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在5周齡用于實(shí)驗(yàn)。將實(shí)施例2-(3)制得的7-12SFd-F用乙醇懸濁溶解至3％濃度，涂敷于小鼠的背部，每只200μL。對(duì)照組同樣涂敷乙醇。給藥為1日1次，連續(xù)進(jìn)行8天。給藥開始第9天脫血致死后將皮膚剝離，通過圖象解析軟件對(duì)里側(cè)皮膚顏色進(jìn)行解析處理。
結(jié)果如表4所示。表中的數(shù)字表示5例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。表中的*符號(hào)表示相對(duì)于對(duì)照組，以5％以下的顯著水平具有顯著性差異。皮膚色調(diào)表示以白色為0，以黑色為100時(shí)的色調(diào)程度。
觀察到對(duì)照組處于明顯向靜止期轉(zhuǎn)移的狀態(tài)，皮膚顏色向白色轉(zhuǎn)移。另一方面，7-12SFd-F給藥組維持成長(zhǎng)期，皮膚顏色比對(duì)照組顯灰色。基于上述內(nèi)容可知，7-12SFd-F顯示后期成長(zhǎng)期維持作用，即與實(shí)施例13-(1)同樣顯示育發(fā)作用。另外，對(duì)各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表4皮膚色調(diào)7-12SFd-F給藥組(N＝5) 24.8±0.61*對(duì)照組(N＝5) 20.9±1.19平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差*p＜0.05(5)由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在8周齡用于實(shí)驗(yàn)。用理發(fā)剪子將小鼠背部的毛剪掉后，再用剃刀剃毛。將實(shí)施例2-(3)制得的7-12SFd-F用乙醇懸濁溶解至3％濃度，涂敷于小鼠背部的上述剃毛部位，每只200μL。對(duì)照組同樣涂敷乙醇。給藥為1日1次，連續(xù)進(jìn)行。測(cè)定給藥開始之日(剃毛的第二天)后第21天毛發(fā)生成的面積，用相對(duì)于剃毛面積的比例(％)表示。
結(jié)果如表5所示。表中的數(shù)字表示7～8例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
與對(duì)照組相比，7-12SFd-F給藥組明顯促進(jìn)由靜止期轉(zhuǎn)移至成長(zhǎng)期，達(dá)到毛發(fā)生成的比例多。另外，對(duì)各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表5毛發(fā)生成比例(％)(毛發(fā)生成面積/剃毛面積)7-12SFd-F給藥組(N＝7) 31.8±12.8對(duì)照組(N＝8) 12.0±4.17平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差
(6)采用與實(shí)施例13-(5)同樣的方法，使用實(shí)施例1-(1)制得的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖、后述實(shí)施例16-(2)制得的F-rich巖藻依聚糖，確認(rèn)其育發(fā)效果。結(jié)果如表6所示。與對(duì)照組相比，巖藻依聚糖給藥組、F-rich巖藻依聚糖給藥組達(dá)到毛發(fā)生成的比例高。
表6毛發(fā)生成比例(％)(毛發(fā)生成面積/剃毛面積)巖藻依聚糖給藥組(N＝6)44.4±10.6F-rich巖藻依聚糖給藥組(N＝6) 45.6±9.6對(duì)照組(N＝6) 26.7±7.5平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(7)由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在8周齡用于實(shí)驗(yàn)。用理發(fā)剪子將小鼠背部的毛剪掉后，再用剃刀剃毛。將實(shí)施例2-(3)制得的7-12SFd-F用乙醇懸濁溶解至3％濃度，涂敷于小鼠背部的上述剃毛部位，每只200μL。對(duì)照組同樣涂敷乙醇。給藥為1日1次，連續(xù)進(jìn)行。給藥開始之日(剃毛的第二天)起第21天脫血致死后，剝離背部皮膚，用勻漿機(jī)制得提取液。用RochesDiagnostics株式會(huì)社制的試驗(yàn)用試劑盒測(cè)定背部皮膚提取液中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性(G-6-PDH活性)，并用和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制的試驗(yàn)用試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶活性(ALP活性)。另外，已知G-6-PDH和ALP在可見育發(fā)效果的組織中其酶活性上升。
其結(jié)果如表7所示。表中的數(shù)字表示7～8例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。與對(duì)照組相比，7-12SFd-F給藥組皮膚組織中的酶活性顯著上升，表明促進(jìn)由靜止期向成長(zhǎng)期轉(zhuǎn)移。也就是說，確認(rèn)有育發(fā)效果。另外，對(duì)各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。表7G-6-PDH活性ALP活性(IU/g組織)(IU/g組織)7-12SFd-F給藥組(N＝7)1.22±0.260.35±0.08對(duì)照組(N＝8) 0.84±0.180.22±0.06平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(8)比較實(shí)施例5-(1)記載的含有本發(fā)明的源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖的化妝水以及不含有巖藻依聚糖的對(duì)照的化妝水，對(duì)20～35歲的成年女性25人進(jìn)行盲目功能檢查。結(jié)果，判斷為較有效的人數(shù)如表8所示。
表8皮膚的濕潤(rùn)度 皮膚的光滑度 皮膚的張力本發(fā)明的化妝水 211916對(duì)照的化妝水 5 6 9以上結(jié)果表明配合巖藻依聚糖的化妝水在皮膚的濕潤(rùn)度、光滑度、張力各項(xiàng)均顯示優(yōu)良的檢查結(jié)果，是具有皮膚美容作用的化妝品。
另外，對(duì)含有其它巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物的化妝水，分別進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的皮膚美容效果。
(9)制備含有實(shí)施例1-(1)記載的源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖200mg的50mL容量的清涼飲料(麥芽糖溶液3％、梅粉末0.05％、1/5檸檬透明果汁0.2％、枸櫞酸酐0.02％)，討論該飲料的皮膚美容效果。每日飲用1瓶該飲料，飲用3個(gè)月后，確認(rèn)抑制了皮膚的搔癢、眼的搔癢，老年斑減少。另外，還確認(rèn)毛發(fā)增多，抑制了白發(fā)的發(fā)展。而且，也改善了干燥皮膚。
另外，對(duì)含有其它巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物的飲料，分別進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的皮膚美容效果、育發(fā)效果。
(10)使用實(shí)施例1-(1)記載的源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖，制備以下成分的乳液。另外，“份”表示重量份。液體石蠟 23.0份肉豆蔻酸異丙酯5.0份凡士林6.0份蜂蠟 5.0份硬脂酸2.0份二十二烷醇1.0份單硬脂酸脫水山梨醇酯 3.0份聚氧乙烯(20)單硬脂酸脫水山梨醇酯 3.0份1，3-丁二醇 3.0份對(duì)羥基苯甲酸酯0.3份巖藻依聚糖1.0份香料 適量蒸餾水余量讓敏感性皮膚的人6名使用上述乳液，早晚2次，連續(xù)使用3個(gè)月，完全沒有出現(xiàn)炎癥等不理想的現(xiàn)象，皮膚狀態(tài)也全部得以改善。
(2)采用與實(shí)施例13-(3)同樣的方法，對(duì)實(shí)施例14-(1)制備的硫酸化葡萄糖的育發(fā)效果進(jìn)行討論。其中，硫酸化葡萄糖溶解于50％乙醇中達(dá)到3％，涂敷于小鼠的背部，1日1次，每次200μL。對(duì)照組僅涂敷50％乙醇。結(jié)果如表9所示，相對(duì)于對(duì)照組，硫酸化葡萄糖給藥組早期觀察到皮膚顏色變化，促進(jìn)毛發(fā)發(fā)育，最終達(dá)到毛發(fā)生成。另外，對(duì)硫酸化巖藻糖、硫酸化甘露糖、硫酸化半乳糖、硫酸化木糖、硫酸化2-去氧葡萄糖、硫酸化塔羅糖進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表9給藥時(shí)間(天) 11 12 13 14 15評(píng)分平均值硫酸化葡萄糖給藥組(N＝5) 0.60.61.01.61.8對(duì)照組(N＝5) 0.20.40.60.81.0
將實(shí)施例1-(1)記載的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖以及實(shí)施例2-(3)記載的7-12SFd-F溶解于RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成給定濃度的20倍濃度溶液。向培養(yǎng)體系中加入20分之1的量。對(duì)照組加入相同量的培養(yǎng)基。另外，各添加試樣的給定濃度如表10所示，分別用每1mL培養(yǎng)基的濃度(mg/mL)表示。觸須的培養(yǎng)使用組織培養(yǎng)皿Falcon 3037(Becton Dickinson Labware社制)，在中央的孔中裝入0.7mL添加有20％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基，并敷上滅菌后的不銹鋼網(wǎng)(池田理化株式會(huì)社制)和拭鏡紙(T.C.Ks株式會(huì)社制)。將觸須置于其上進(jìn)行培養(yǎng)。源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖和7-12SFd-F預(yù)先添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)在35℃、5％CO2存在下進(jìn)行6天。觸須的長(zhǎng)度在培養(yǎng)開始前和結(jié)束后，在顯微鏡下使用測(cè)徑規(guī)測(cè)定到0.1mm的位數(shù)。對(duì)于各試樣濃度的一組，使用3～5根觸須進(jìn)行測(cè)定。伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。另外，顯著性差異檢驗(yàn)進(jìn)行Student′s t-test，相對(duì)于對(duì)照組求出P值。其結(jié)果如表10所示。表10添加試樣 濃度檢測(cè)數(shù)觸須的伸長(zhǎng)(mm) P值(mg/mL) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差0.01 31.33±0.88 0.587-12SFd-F0.131.67±0.88 0.381 42.75±0.63 0.04源于 0.141.25±0.95 0.67KjellmaniellaCrassifolia的1 42.50±0.50 0.05巖藻依聚糖對(duì)照 0 50.80±0.49 -結(jié)果，源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖和7-12SFd-F與對(duì)照相比，能夠濃度依存性地使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。也就是說，確認(rèn)源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖和7-12SFd-F具有育發(fā)效果。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
(2)由日本SLC社購(gòu)入出生后2日齡的雄性C3H/He小鼠以及母鼠，在9日齡用于實(shí)驗(yàn)，采用與實(shí)施例15-(1)同樣的方法，對(duì)實(shí)施例1-(1)記載的源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖以及實(shí)施例2-(3)記載的7-12SFd-F的育發(fā)效果進(jìn)行考察。其結(jié)果如表11所示。
表11添加試樣濃度檢測(cè)數(shù) 觸須的伸長(zhǎng)(mm) P值(mg/mL) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差0.001 5 0.34±0.10 0.127-12SFd-F 0.01 5 0.66±0.16 0.020.1 5 0.51±0.10 0.01源于Kjellmaniella 0.01 5 0.62±0.17 0.03Crassifolia的 0.1 5 0.80±0.17 0.01巖藻依聚糖對(duì)照0 5 0.10±0.10 -
結(jié)果，使用9日齡小鼠的觸須時(shí)，源于Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖和7-12SFd-F與對(duì)照相比，同樣顯著使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。也就是說，確認(rèn)源于Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖和7-12SFd-F具有育發(fā)效果。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
(2)將干燥Kjellmaniella crassifolia 500g粉碎，用10L的80％乙醇洗滌后，在50升含有1mM氯化鉀的10％乙醇中，在25℃下攪拌3天，用網(wǎng)眼直徑32μm的不銹鋼金屬網(wǎng)過濾，得到濾液約45升。將該濾液34升在80℃下加熱3小時(shí)后，冷卻至50℃。保持液體溫度50℃的同時(shí)將其用排除分子量1萬的超濾OMEGA過濾片(filtron社制)濃縮。接著，用加溫至50℃的蒸餾水5升進(jìn)行脫鹽，加入同樣的蒸餾水200mL洗滌流路2次并回收，得到濃縮液1.5升。將其冷凍干燥，得到8.2g的F-rich巖藻依聚糖。
(3)由日本SLC社購(gòu)入出生后2日齡的雄性C3H/He小鼠以及母鼠，在14日齡用于實(shí)驗(yàn)，采用與實(shí)施例15-(1)同樣的方法，對(duì)實(shí)施例16-(1)記載的巖藻依聚糖Bf以及實(shí)施例16-(2)記載的F-rich巖藻依聚糖的育發(fā)效果進(jìn)行考察。觸須的長(zhǎng)度在培養(yǎng)開始前和結(jié)束后，在顯微鏡下使用測(cè)徑規(guī)測(cè)定到0.1mm的位數(shù)，伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。另外，顯著性差異檢驗(yàn)進(jìn)行Student′s t-test，相對(duì)于對(duì)照組求出P值。其結(jié)果如表12所示。
表12添加試樣濃度 檢測(cè)數(shù)觸須的伸長(zhǎng)(mm) P值(mg/mL) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差巖藻依聚糖Bf0.01 60.62±0.180.030.1 60.82±0.180.01F-rich巖藻依聚糖0.01 60.68±0.220.030.1 60.65±0.120.01對(duì)照060.10±0.10 -結(jié)果，巖藻依聚糖Bf和F-rich巖藻依聚糖與對(duì)照相比，顯著使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。也就是說，能夠確認(rèn)具有育發(fā)效果。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)同樣的育發(fā)效果。
表13添加試樣 濃度 檢測(cè)數(shù) 觸須的伸長(zhǎng)(mm) P值(mg/mL)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差F-rich巖藻依聚糖 0.0151.72±0.420.02源于裙帶菜的 0.0150.62±0.300.54巖藻依聚糖源于墨角藻的 0.0151.40±0.380.04巖藻依聚糖源于海蘊(yùn)的0.0150.74±0.240.31巖藻依聚糖源于沖繩海蘊(yùn)的0.0150.90±0.250.17巖藻依聚糖對(duì)照 0 60.38±0.23 -
結(jié)果，這些巖藻依聚糖與對(duì)照相比，顯著使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。另外，F(xiàn)-rich巖藻依聚糖以及源于墨角藻的巖藻依聚糖特別優(yōu)良地使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。也就是說，能夠確認(rèn)根據(jù)巖藻依聚糖的種類使小鼠觸須伸長(zhǎng)的作用存在強(qiáng)弱之分，源于Kjellmaniella crassifolia的F-rich巖藻依聚糖以及源于墨角藻的巖藻依聚糖與其它相比具有強(qiáng)的育發(fā)效果。另外，對(duì)于各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解產(chǎn)物進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，能夠確認(rèn)育發(fā)效果。
表14添加試樣 濃度 檢測(cè)數(shù) 觸須的伸長(zhǎng)(mm) P值(mg/mL)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差硫酸化葡萄糖 0.190.39±0.11 0.8901 81.31±0.31 0.004對(duì)照 0 18 0.42±0.13 -結(jié)果，硫酸化葡萄糖1mg/mL與對(duì)照相比，顯著使小鼠的觸須伸長(zhǎng)。也就是說，能夠確認(rèn)在該實(shí)驗(yàn)體系中硫酸化葡萄糖具有育發(fā)效果。另外，能夠確認(rèn)實(shí)施例14記載的各硫酸化單糖也具有同樣的效果。
市售育發(fā)劑——育發(fā)劑A的有效成分卡普氯銨的涂敷給藥產(chǎn)生的育發(fā)效果在本實(shí)驗(yàn)體系中沒有得到確認(rèn)，因此認(rèn)為與對(duì)照組沒有差異。但是，巖藻依聚糖Bf與卡普氯銨的聯(lián)合給藥組早期可觀察到皮膚顏色的變化，達(dá)到毛發(fā)生成。毛發(fā)生成比例比對(duì)照組高。確認(rèn)顯示60％以上毛發(fā)生成比例的個(gè)體在對(duì)照組和卡普氯銨給藥組中均沒有，與此相對(duì)巖藻依聚糖Bf聯(lián)合給藥組則6例中有3例。
另一方面，市售育發(fā)劑B的有效成分米諾地爾通過以1％的濃度涂敷確認(rèn)具有育發(fā)效果，早期觀察到皮膚顏色的變化，達(dá)到毛發(fā)生成。采用0.1％的濃度則效果較弱。而且，巖藻依聚糖Bf與米諾地爾的聯(lián)合給藥組確認(rèn)存在促進(jìn)育發(fā)效果的趨勢(shì)。也就是說，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)顯示60％以上毛發(fā)生成比例的個(gè)體在米諾地爾1％給藥組為6例中有4例，與此相對(duì)巖藻依聚糖Bf聯(lián)合給藥組6例均呈現(xiàn)良好的毛發(fā)生成狀態(tài)。另一方面，效果弱的米諾地爾0.1％給藥組為6例中有1例，與此相對(duì)巖藻依聚糖Bf聯(lián)合給藥組為6例中有3例。
由以上內(nèi)容可知，通過使用巖藻依聚糖Bf以及米諾地爾或卡普氯銨，育發(fā)作用協(xié)同地增強(qiáng)。另外，對(duì)其它巖藻依聚糖、巖藻依聚糖分解產(chǎn)物、硫酸化單糖等進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，得到同樣的結(jié)果。
表15添加試樣的濃度毛發(fā)生成比例(％) 60％以上毛發(fā)(毛發(fā)生成面積/剃毛面積) 生成的個(gè)體數(shù)卡普氯銨0.5％23.9±4.90/6卡普氯銨0.5％+ 55.4±11.1 3/6巖藻依聚糖Bf 3％米諾地爾1％ 69.1±13.9 4/6米諾地爾1％+ 92.2±2.56/6巖藻依聚糖Bf 3％米諾地爾0.1％42.9±5.51/6米諾地爾0.1％+ 48.2±10.0 3/6巖藻依聚糖Bf 3％對(duì)照組 29.2±9.20/6平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差實(shí)施例20由日本SLC社購(gòu)入雄性C3H/He小鼠，預(yù)飼養(yǎng)后在8周齡用于實(shí)驗(yàn)。用理發(fā)剪子將小鼠背部的毛剪掉后，再用剃刀剃毛。將實(shí)施例16-(1)記載的巖藻依聚糖Bf混合到軟膏基質(zhì)〔(親水軟膏(丸石制藥社制)〕中達(dá)到3％濃度(巖藻依聚糖軟膏)，涂敷于小鼠背部的上述剃毛部位，每只0.2g。對(duì)照組僅涂敷軟膏基質(zhì)。給藥為1日1次，連續(xù)進(jìn)行。由給藥開始之日(剃毛的第二天)起經(jīng)時(shí)觀察給藥部位，使皮膚色調(diào)的變化評(píng)分化進(jìn)行判斷。也就是說，評(píng)分化的標(biāo)準(zhǔn)如下所述，評(píng)分0沒有變化，評(píng)分1皮膚顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗌?，評(píng)分2皮膚顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗪凇疑?，評(píng)分3可見毛發(fā)生成，評(píng)分4幾乎恢復(fù)到剃毛前的狀態(tài)。各組的評(píng)分如表16所示，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。另外，測(cè)定剃毛后第21天毛發(fā)生成的面積，用相對(duì)于剃毛面積的比例(％)表示。顯著性差異檢驗(yàn)進(jìn)行Student′s t-test，相對(duì)于對(duì)照組求出P值。其結(jié)果如表17所示。另外，表中的毛發(fā)生成比例用每組6只的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
其結(jié)果，確認(rèn)涂布巖藻依聚糖軟膏具有顯著的育發(fā)效果。與對(duì)照組相比，觀察到早期的皮膚色的變化，直至發(fā)毛。另外，在實(shí)施結(jié)束時(shí)，全部大致回復(fù)到剃毛前的狀態(tài)。另外，制備含各實(shí)施例記載的巖藻依聚糖及其分解物的同樣的軟膏，進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，確認(rèn)有同樣的育毛效果。
表16剃毛后的天數(shù)9 101112 131415評(píng)分(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)巖藻依聚糖軟膏組(N＝6)0.0±0.0 0.7±0.2 1.0±0.0 1.5±0.2 2.0±0.0 2.7±0.2 3.0±0.0對(duì)照組(N＝6)0.0±0.0 0.2±0.2 0.4±0.2 1.2±0.2 1.6±0.2 1.8±0.4 2.4±0.0平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表17毛發(fā)生成比例(％) P值(毛發(fā)生成面積/剃毛面積)巖藻依聚糖軟膏組(N＝6) 95.4±2.9 P＜0.0001對(duì)照組(N＝6)31.3±5.7 -平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差保藏的生物材料(1)保藏機(jī)構(gòu)的名稱通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)(2)保藏的微生物(i)交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009原保藏日 平成8年2月13日移送至國(guó)際保藏的請(qǐng)求日平成8年11月15日保藏號(hào)FERM BP-5747(ii)黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)SA-0082原保藏日 平成7年3月29日移送至國(guó)際保藏的請(qǐng)求日平成8年2月15保藏號(hào)FERM BP-5402工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明提供一種含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或其鹽的物質(zhì)作為有效成分的安全性優(yōu)良的生物化妝品。另外，還提供以選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或其鹽的物質(zhì)為有效成分的能夠用作皮膚美容用食品或飲料、以及育發(fā)用食品或飲料等的化妝品，這些食品或飲料作為具有皮膚美容作用和/或育發(fā)作用的功能性食品或飲料是有用的。特別是以選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或其鹽的物質(zhì)為有效成分的飲料能夠作為飲用的化妝品、育發(fā)劑日常攝取，對(duì)于維持皮膚美容、防止皮膚老化、預(yù)防皮膚老化、維持毛發(fā)·養(yǎng)發(fā)·增發(fā)等是非常有用的。
另外，通過使用本發(fā)明使用的上述有效成分以及以前的育發(fā)劑的有效成分(育發(fā)作用增強(qiáng)成分)，育發(fā)作用能夠協(xié)同地增強(qiáng)，因此按照本發(fā)明可以提供含有上述有效成分以及育發(fā)作用增強(qiáng)成分的與以前相比具有非常優(yōu)良的育發(fā)作用的育發(fā)劑。
權(quán)利要求
1.一種化妝品，其特征在于含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖和它們的鹽的物質(zhì)作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的化妝品，巖藻依聚糖是從以下述通式(I)～(IV)表示的硫酸化糖作為構(gòu)成糖的必須成分的巖藻依聚糖中選擇的巖藻依聚糖， 式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)； 式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)； 式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)； 式中，R為OH或OSO3H，n為1以上的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求1所述的化妝品，巖藻依聚糖為非拉絲性巖藻依聚糖。
4.如權(quán)利要求1所述的化妝品，分解產(chǎn)物是從下述式(V)～(VII)表示的化合物中選擇的化合物， 式中，R為OH或OSO3H； 式中，R為OH或OSO3H； 式中，R為OH或OSO3H。
5.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的化妝品，為洗劑類、乳液類、膏霜類、濕布劑類、軟膏類、浴用劑、浴用洗劑、洗面劑、毛發(fā)劑、育發(fā)劑或洗發(fā)劑。
6.如權(quán)利要求5所述的化妝品，為育發(fā)劑。
7.如權(quán)利要求6所述的化妝品，進(jìn)一步含有育發(fā)作用增強(qiáng)成分。
8.如權(quán)利要求7所述的化妝品，育發(fā)作用增強(qiáng)成分為米諾地爾和/或卡普氯銨。
9.如權(quán)利要求1所述的化妝品，作為食品或飲料使用。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了對(duì)皮膚美容(防止皮膚老化、改善敏感性皮膚、抑制搔癢等)有效，且能夠成為育發(fā)劑有效成分的物質(zhì)，并提供一種含有該有效成分的化妝品。具體而言，提供一種化妝品，其特征在于，含有選自巖藻依聚糖、其分解產(chǎn)物、硫酸化單糖或其鹽的物質(zhì)作為有效成分。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1433295SQ00818724
公開日2003年7月30日 申請(qǐng)日期2000年11月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者水谷滋利, 出口壽壽, 小林英二, 西山英治, 佐川裕章, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社