專利名稱：一種消毒制劑和消毒濕巾及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種消毒制劑和消毒材料，尤其涉及一種含有抗菌肽的消毒制劑和消毒濕巾。
中國專利申請文件93103890.1公開了一種嬰兒衛(wèi)生濕巾，采用一種外用消毒劑醋酸雙氯苯雙胍己烷代替常用的含有活性氯及過氧化物的消毒劑作為殺菌活性成分，該成分殺菌活性強(qiáng)，有效劑量低，減少了對嬰兒肌膚的刺激性，但還屬于化學(xué)成分，無法徹底克服上述缺陷。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之三是提供一種消毒濕巾的制備方法。
本發(fā)明需要解決的另一個技術(shù)問題公開所述消毒濕巾的應(yīng)用。
本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是這樣的抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，抗菌肽的研究越來越成為生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的熱門課題。至今為止，在許多動物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上已發(fā)現(xiàn)了超過200多種抗菌肽，這類短肽不僅對細(xì)菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有攻擊作用。臨床試驗也表明，在機(jī)體感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續(xù)侵染。由于抗菌肽是一種生物制品，在用量非常小的時候，也能產(chǎn)生很強(qiáng)的殺菌活性，對人體的皮膚黏膜刺激和毒副作用，對環(huán)境也不會造成任何影響，故而是制備消毒產(chǎn)品的非常好的成分。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的一種消毒制劑，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污劑0.01～2wt％，潤膚劑0.1～15wt％，水余量。
以所述及的抗菌肽GK是具有如下序列的一組人工合成抗菌肽Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(Al′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys lle Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)序列為抗菌肽序列的核心結(jié)構(gòu)。其中A1、A1′、A1″為Lys或Arg中的一種，A2、A2′、A2″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種，A3、A3′、A3″為Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一種，A4、A4′、A4″為Lys或Arg中的一種。(A1-A2-A3-A4)的氨基端連接有11個氨基酸，11個氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸為賴氨酸或精氨酸中的一種，11個氨基酸中第2位氨基酸為色氨酸或苯丙氨酸中的一種，11個氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸或甘氨酸中的一種。
抗菌肽GK還包括以上所述多肽中個別氨基酸的取代、環(huán)化、L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
抗菌肽GK的制備方法可以是固相化學(xué)法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得。其中表達(dá)載體可以是質(zhì)粒或病毒中的一種，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞、包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。制備的抗菌肽可通過質(zhì)譜鑒定。
所述及的去污劑包括非離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，優(yōu)選的為20≥HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80等以及甜菜堿等，其主要作用是去除污垢，使制劑中的活性成分充分作用于皮膚表面，有利于防止細(xì)菌的生長。
所述及的潤膚劑是選自甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄欖油、十四酸異丙酯、油脂蠟中的一種或一種以上。
可將上述的消毒制劑負(fù)載于載體上，制成一種消毒濕巾，載體包括無紡材料或棉紗布。
所述及的殺菌濕巾的制備方法包括如下步驟1、按上述比例稱取抗菌肽GK、潤膚劑，去污劑與水，在30℃～65℃的條件下，采用常規(guī)的方法進(jìn)行乳化，獲得乳液；2、將配制好的溶液噴涂于所需規(guī)格的載體上或?qū)⑤d體浸漬于溶液中，取出，即獲得本發(fā)明的消毒濕巾。
本發(fā)明的制劑和消毒濕巾可用于成人手，臉，皮膚黏膜的清潔和傷口創(chuàng)面的消毒，保持皮膚滋潤，又能防止細(xì)菌的生長。
本發(fā)明的制劑和消毒濕巾可用于嬰兒體表的清潔和消毒，包括擦拭奶漬、汗?jié)n、尿漬、便垢等。
為了深入研究本發(fā)明這類生物學(xué)活性抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，利用美國應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備一組多肽，以進(jìn)行研究。下面以制備的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作為舉例來進(jìn)行敘述GK-1Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg LysLeu Leu Lys
GK-2Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg ArgLeu Leu ArgGK-3Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg利用96孔板法檢測多肽的殺菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以預(yù)先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1為對照，進(jìn)行殺菌活性檢測。結(jié)果表明本發(fā)明合成抗菌肽的殺菌活性強(qiáng)于所述兩種天然抗菌肽的殺菌活性。
同樣對多肽中氨基酸缺失、環(huán)化衍生物的抗菌肽功能等同物也進(jìn)行了制備與生物活性測定，測定結(jié)果顯示這些多肽的殺菌活性也基本上強(qiáng)于上述的天然抗菌肽的殺菌活性。
抗菌肽在高效殺菌的同時也有可能作用于高等有機(jī)體包括人體細(xì)胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細(xì)胞膜上穿孔使得細(xì)胞發(fā)生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，就可以通過檢測OD490值確定毒性的大小。因此本發(fā)明還檢測了合成抗菌肽對人體紅細(xì)胞的溶血活性，實驗表明，抗菌肽溶血率值很低，證實本發(fā)明合成抗菌肽的溶血毒性極小。
消毒濕巾通過體外殺菌試驗，證明它對一些主要的致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的殺菌效果十分理想，殺滅率均超過99％。
消毒濕巾對昆明小白鼠的急性毒性試驗結(jié)果表明，動物經(jīng)肌注7天后，無異常反應(yīng)，活動正常。經(jīng)7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明無毒性作用。
消毒濕巾對SD大鼠陰道黏膜刺激試驗，參照消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)評分及皮膚刺激強(qiáng)度分級，進(jìn)行對陰道黏膜刺激強(qiáng)度的評定。結(jié)果表明，消毒濕巾對大鼠陰道黏膜刺激反應(yīng)最高總積分均值為0，屬無刺激性。
實施例1抗菌肽的制備及分離純化按上述序列制備GK-1，GK-2和GK-3，同時制備cecropin A1和buforin II作為對照。
cecropin A1的序列(參見Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990，B 95(3)，551-554)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp GlyLeu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leubuforin II的序列(參見Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218(1)，408-413)Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg LeuLeu Arg Lys本實施例采用固相化學(xué)法合成，所用儀器為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀。合成的多肽經(jīng)過高濃度的TFA剪切后，用反向柱純化，純化后的多肽通過質(zhì)譜鑒定。具體試驗步驟如下1、抗菌肽的制備(以制備0.1mmol量的GK-2為例)以下所有制備抗菌肽的試劑均購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
制備的GK-2多肽序列為N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu LeuArg Arg Leu Leu Arg-C制備從C端到N端逐個進(jìn)行，由合成儀自動控制。首先稱量0.1mmol的結(jié)合了第一個氨基酸即Arg的樹脂(購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，裝柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脫保護(hù)，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30分鐘，二甲基甲酰胺清洗重復(fù)以上脫保護(hù)到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束(具體操作步驟見pioneer多肽合成儀操作指南)。
制備后的多肽經(jīng)如下步驟剪切取下反應(yīng)后的樹脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三異丙基硅烷)，室溫反應(yīng)2小時，過濾，濾出液中加入10倍體積的預(yù)冷無水乙醚，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀并室溫干燥。
2、抗菌肽純化稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，樣品處理后經(jīng)反向柱分離(洗脫液為含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脫峰。
3、抗菌肽的鑒定如

圖1所示，制備的抗菌肽GK-2經(jīng)過質(zhì)譜分析，GK-2在質(zhì)譜圖中顯示的分子量計算如下(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934計算出GK-2的分子量為2934。由多肽序列計算出的理論值為2932.74。證明制備的多肽即為設(shè)計的GK-2抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用。
抗菌肽GK-l和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用類似于GK-2抗菌肽的制備方法制備。
實施例2抗菌肽GK-1基因在大腸桿菌中的表達(dá)首先設(shè)計合成編碼抗菌肽的GK-1基因，將其克隆到pGEX-4T1載體上(購自AmershamPharmcia Biotech公司)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-GK-1融合蛋白，再經(jīng)凝血酶切割后，得抗菌肽GK-l。
實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內(nèi)切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產(chǎn)品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。
有關(guān)DNA的分離、純化、PCR擴(kuò)增、酶解、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J(rèn).沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進(jìn)行。大腸桿菌JM109培養(yǎng)在液體或固體的LB培養(yǎng)基中。
采用大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計編碼優(yōu)選抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位點BamHI(GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)，所得構(gòu)建基因的長度為78bp。
通過DNA合成儀直接合成該核苷酸片斷。首先用PCR方法對基因進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計一對引物5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反應(yīng)30個循環(huán)。PCR反應(yīng)后將該片斷經(jīng)過Klenow酶補平后用BamHI酶切，酶切片斷經(jīng)過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與pGEX-4T1載體的BamHI和SmaI的雙酶切片斷連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化子通過SmaI酶切鑒定、篩選。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經(jīng)凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具體操作參照試劑盒操作說明。
GK-1蛋白序列Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu Lys編碼GK-1的核苷酸序列GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAAACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG實施例3抗菌肽GK-1基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)本實施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶，Klenow酶、限制性內(nèi)切酶除特別指明外均為BIOLAB公司產(chǎn)品，割膠回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品，寡聚核苷酸為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。凝血酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。
設(shè)計合成編碼抗菌肽的GK-1基因，經(jīng)過BamHI酶切與編碼GST的DNA序列連接，后將其連接到質(zhì)粒pBluescriptSKII(購自美國Stratagene公司)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購自武漢大學(xué)菌種保藏中心)，提取質(zhì)粒經(jīng)過測序證明序列正確后，質(zhì)粒經(jīng)過EcoRI，XhoI酶切后連接到pPIC9載體(購自美國Invitrogen公司)中，后轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株KM71(購自美國Invitrogen公司)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-GK-1。
有關(guān)DNA的分離、純化、PCR擴(kuò)增、酶解、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J(rèn).沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進(jìn)行。畢氏酵母菌株KM71培養(yǎng)在液體或固體的BMGY培養(yǎng)基中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-GK-1時酵母菌株培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，每隔24小時補加甲醇至終濃度為1％。
采用酵母菌偏愛的密碼子設(shè)計編碼優(yōu)選抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位點BamHI(GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)及EcoRI酶切位點(GAATCC)，所得構(gòu)建基因的長度為84bp，同時在GK-1基因前段接編碼GST的DNA序列，同時在GST的DNA序列的5’端加了一個XhoI酶切位點。
GK-1核苷酸片斷的制備通過DNA合成儀直接合成編碼GK-1核苷酸片斷。然后用PCR方法對基因進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)計一對引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC3’。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反應(yīng)35個循環(huán)。
編碼GST的DNA序列的的制備設(shè)計一對引物5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’用以上引物擴(kuò)增pGEX-4T1載體。PCR反應(yīng)條件如下94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反應(yīng)30個循環(huán)。
擴(kuò)增片段與質(zhì)粒的連接將GK-1的PCR擴(kuò)增片斷經(jīng)過Klenow酶補平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片斷經(jīng)過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與編碼GST的DNA擴(kuò)增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過抗性、藍(lán)白斑、酶切鑒定后，進(jìn)一步經(jīng)過測序確定表達(dá)序列正確。提取質(zhì)粒經(jīng)XhoI和EcoRI酶切回收小片段，與pPIC9的XhoI和EcoRI酶切連接構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-gst-gkl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。按文獻(xiàn)報道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105205-212)制備畢氏酵母KM71的感受態(tài)細(xì)胞，并將SacI單酶切的線性化重組質(zhì)粒pPIC9-gst-gkl經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化的條件為1.5KV，22.5uF。將電轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞涂板于YPD平板，30℃培養(yǎng)兩天后，篩選表達(dá)融合蛋白的陽性克隆。
轉(zhuǎn)化子經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經(jīng)凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具體操作參照試劑盒操作說明。
GST-GK-1融合蛋白序列Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu LeuGlu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn LysLys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The GlnSer Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg AlaGlu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp ArgLeu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala LeuAsp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys ArgIle Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln GlyTrp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys TrpLys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu LysGST-GK-l核苷酸序列TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAATATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGTCCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGATTTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTAAATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCTTTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGGCCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT實施例4合成抗菌肽的殺菌活性檢測以下實施例中所使用的各種菌株購于中國生物制品檢定所。
采用96孔板法對合成抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作為對照，以評價本發(fā)明中作為舉例的三條抗菌肽GK-1，GK-2和GK-3的殺菌活性。
按以下步驟進(jìn)行測定抗菌肽的殺菌活性菌種復(fù)蘇，接種斜面37℃培養(yǎng)過夜，挑菌于普通LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接種于96孔板中，將多肽以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37℃培養(yǎng)過夜，酶標(biāo)儀檢測OD620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。檢測結(jié)果見表1。
含有抗菌肽的細(xì)菌的生長濃度(OD620)與不加抗菌肽的細(xì)菌的生長濃度的比值大于90％時的抗菌肽濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細(xì)菌生長的最低的濃度)。
表1 五種抗菌肽對不同細(xì)菌的抗菌活性最小抑菌濃度(MIC)的比較

上表中的的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強(qiáng)。
實施例6體外溶血活性檢測本實施例用于檢測合成抗菌肽對人體紅細(xì)胞是否具有溶血活性，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作為對照。使用的的血樣取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的檢測步驟是4％的新鮮紅細(xì)胞懸液在414nm下血紅蛋白的釋放來檢測的。人紅細(xì)胞經(jīng)PBS(PBS35mM磷酸緩沖液/0.15MNaCl，PH7.0)洗滌，取100ul的8％人紅細(xì)胞懸液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小時后，1500rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移100ul上清于新的96孔板中，通過酶標(biāo)儀檢測414nm下的吸收。陰性對照用PBS，陽性對照用0.1％TritonX-100。檢測結(jié)果見表2表2 五種抗菌肽溶血活性檢測結(jié)果

實施例7成人用消毒濕巾的制備1.配制100g用于消毒濕巾的制劑，其中抗菌肽GK-1的含量0.001g(0.001wt％)，聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)香精0.1g(0.1wt％)。
2.對桌面、儀器、器皿、配料桶消毒。
3.在電子天平上準(zhǔn)確稱取溶抗菌肽GK-10.001g，聚梨山醇酯0.2g，甘油2g，羊毛酯0.5g，香精0.1g，置于配料桶中，按比例加水97.199g，在60℃下攪拌乳化形成乳液。
4.將無紡布剪裁成8cm×8cm，經(jīng)過紫外光消毒20分鐘后，浸入上述溶液中，待浸透后撈出，滴去多余溶液，即可使用。
實施例8嬰兒用消毒濕巾的制備1、配制100用于消毒濕巾的制劑，其中抗菌肽GK-2的含量0.0005g(0.0005wt％)，聚梨山醇酯40含量0.15g(0.15wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，蘆薈汁0.5(0.5wt％)，余量為水。
2、余下步驟參照實施例1完成。
實施例9消毒濕巾體外殺菌試驗1、試驗樣品的制備(1)殺菌濕巾樣品按實施例1的方法制備，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量為水。
(2)對照濕巾聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量為水。
2、試驗菌株金黃色葡萄球菌CMCC26003，枯草桿菌DB430，大腸桿菌ATCC8099，肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，綠膿桿菌CMCC10104，白色念珠菌ATCC10231。(以上菌株來自于中國生物制品檢定所)。
3、試驗步驟(1)將培養(yǎng)好的試驗菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鮮斜面，并稀釋到適宜濃度，在107～108cfu/ml。
(2)將樣品濕巾和對照濕巾制成1×3cm大小，并放置在無菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到濕巾上，涂抹均勻同時開始計時。
(4)作用到預(yù)定時間后用無菌鑷子將濕巾投入含5ml中和劑的試管中，充分振蕩混勻。
(5)對照濕巾投入中和劑試管，充分振蕩后做適當(dāng)稀釋。
(6)取終液0.5ml進(jìn)行傾注平板，37恒溫倒置培養(yǎng)48小時。
(7)計算對照回收菌量及樣品回收菌量，得出殺滅率。
4、試驗結(jié)果表3殺菌濕巾體外殺菌試驗殺滅率結(jié)果試驗菌株 殺菌濕巾對照濕巾金黃色葡萄球菌 99.92％0CMCC26003，，，枯草桿菌DB430 99.98％0大腸桿菌ATCC809999.92％0綠膿桿菌CMCC10104 99.97％0白色念珠菌ATCC10231 99.56％0肺炎克雷伯氏菌 99.46％0CMCC46117實施例10動物體內(nèi)急性毒性試驗1、樣品的制備按實施例7的方法制備，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量為水。
2、試驗動物采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，體重33.5±0.25g，由復(fù)旦大學(xué)實驗動物部提供。
3、試驗方法每日一次連續(xù)7天經(jīng)肌注小白鼠，觀察動物在最大劑量下毒性反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，動物經(jīng)肌注7天后，無異常反應(yīng)，活動正常。經(jīng)7天觀察，60只小白鼠全部存活。證明無毒性作用。
實施例11消毒濕巾對試驗動物陰道黏膜刺激試驗1、樣品制備按實施例7的方法制備，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量為水。
2、試驗動物SD大鼠，雌性，普通級，18只，體重230克-250克，隨機(jī)分三組，殺菌濕巾組、賦形劑組和空白對照組，每組6只，由復(fù)旦大學(xué)實驗動物部提供。
3、試驗方法參照消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中的3.8條。將殺菌濕巾置動物陰道內(nèi)，與陰道黏膜接觸4小時。賦形劑組用棉條0.01克浸以滅菌生理鹽水作同樣的試驗?？瞻讓φ战M不做任何處理。于24小時處死動物，取出局部陰道組織，觀察有無充血、水腫現(xiàn)象。參照消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)評分及皮膚刺激強(qiáng)度分級，進(jìn)行對陰道黏膜刺激強(qiáng)度的評定。
4、試驗結(jié)果
表3殺菌濕巾對試驗動物陰道黏膜刺激試驗刺激反應(yīng)評分組別動物數(shù)(只)紅斑 水腫總分消毒濕巾組 60 00賦形劑組 60 00空白對照組 60 00殺菌濕巾對大鼠陰道黏膜刺激反應(yīng)最高總積分均值為0，屬無刺激性。
序列表<110>上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司<120>一種消毒制劑和消毒濕巾及其制備方法和應(yīng)用<130>SPI028296<160>54<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>1Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>2Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>3<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>3Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa 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Xaa<210>16<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>16Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>17Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>18<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>18Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa510 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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20<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>21Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>22<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>22Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>23<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>23Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>24<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>24Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>25<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>25Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>26<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>26Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>27<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>27Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>28<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>28Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>29<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>29Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>30Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>31<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>31Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>32<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>32Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>33<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>33Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>34Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>35<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>35Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>36<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>36Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>37Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>38<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>38Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>39<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>39Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>40<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>40Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>41<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<22 3>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>41Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>42<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>42Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>43Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>44<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>44Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>45Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>46<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>46Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa XaaXaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>47Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>48<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>48Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>49Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>50<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>50Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>51<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>51Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>52<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>52Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>53Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>54<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>54Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20
權(quán)利要求
1.一種消毒制劑，其特征在于包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污劑0.01～2wt％，潤膚劑0.1～15wt％，水余量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消毒制劑，其特征在于所述及的抗菌肽GK具有序列表中所列氨基酸序列中的一種或一種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消毒制劑，其特征在于所述及的去污劑是非離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的消毒制劑，其特征在于所述及的非離子表面活性劑是20≥親水親油平衡值≥6的非離子表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的消毒制劑，其特征在于非離子表面活性劑為聚山梨醇酯系列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的消毒制劑，其特征在于所述及的兩性離子表面活性劑是甜菜堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消毒制劑，其特征在于所述及的潤膚劑是甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄欖油、十四酸異丙酯、油脂蠟中的一種或一種以上。
8.一種消毒濕巾，其特征在于由載體和負(fù)載于其上的權(quán)利要求1～7任一所述的消毒制劑組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的消毒濕巾，其特征在于所述載體包括無紡材料或棉紗布。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的消毒濕巾的制備方法，其特征在于包括根據(jù)下步驟1)按比例稱取稱取抗菌肽GK、潤膚劑，去污劑與水進(jìn)行乳化，獲得乳液；2)將配制好的溶液噴涂于所需規(guī)格的載體上或?qū)⑤d體浸漬于溶液中，取出，即獲得本發(fā)明的消毒濕巾。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的的消毒濕巾的應(yīng)用，其特征在于用于手，臉和其它部位的皮膚及黏膜的清潔和消毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的的消毒濕巾的應(yīng)用，其特征在于用于傷口創(chuàng)面的消毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的的消毒濕巾的應(yīng)用，其特征在于用于嬰兒體表的清潔和消毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種消毒制劑和消毒濕巾及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的消毒制劑，包括抗菌肽GK0.00001～0.01wt％，去污劑0.01～2wt％，潤膚劑0.1～15wt％。本發(fā)明的消毒濕巾通過體外殺菌試驗，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的殺菌效果十分理想，殺滅率均超過99％。消毒濕巾對昆明小白鼠的急性毒性試驗結(jié)果表明無毒性。消毒濕巾對SD大鼠陰道黏膜刺激試驗結(jié)果表明，無刺激性。本發(fā)明的制劑和消毒濕巾可用于成人手，臉，皮膚黏膜的清潔和傷口創(chuàng)面的消毒，保持皮膚滋潤，又能防止細(xì)菌的生長。特別適宜用于嬰兒體表的清潔和消毒，包括擦拭奶漬、汗?jié)n、尿漬、便垢等。
文檔編號A47K10/00GK1415203SQ0213740
公開日2003年5月7日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者黃青山 申請人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司