專利名稱：從含油種子和微生物來源提取和冬化脂類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂類且更具體的說是含有長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFAs)的脂類的提取和純化方法。本發(fā)明特別提供了獲得高濃度所需LCPUFAs和低濃度不需要的化合物、諸如三飽和酸甘油酯類(trisaturated glycerides)的方法。
背景技術(shù)：
一般來說，冬化是對(duì)除去在低溫下植物油中出現(xiàn)的沉降物的過程給予的名稱。它來源于使棉子油在寒冷的冬月中保持戶外儲(chǔ)存并過濾出不含沉降物的油的早期實(shí)踐。干燥分級(jí)結(jié)晶是具有最高熔點(diǎn)溫度的甘油三酯類優(yōu)選從純液體(例如液液)中冷卻過程中結(jié)晶的過程。在結(jié)晶完全后，通過幾種類型的物理方法之一從液相中分離固相。另一方面，將溶劑結(jié)晶用于促進(jìn)甘油三酯晶體形成，因?yàn)樵诘蜏叵?，使用溶劑的甘油三酯類一般比不使用溶劑形成更穩(wěn)定的晶體。
使用常規(guī)技術(shù)和溶劑(例如己烷)從通過發(fā)酵產(chǎn)生的Schizochytrium菌生物質(zhì)中提取富含二十二碳六烯酸(DHA)的脂類且通過將所得提取的脂類冷卻至-2-2℃、隨后離心而使其冬化。然后將脂類精制、漂白并除臭且放入膠囊而作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑銷售。從這種產(chǎn)品中產(chǎn)生的問題在于在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)品中會(huì)形成渾濁。
在從生物質(zhì)中回收脂類的一種方法中，正如附

圖1中所示，使干燥的微藻類懸浮于商品級(jí)正己烷中并濕磨。己烷主要提取甘油三酯類、二脂酰甘油酯類、單酸甘油酯類和酯化的甾醇類，不過，也可以提取較低程度的總脂類級(jí)分中的其它成分，諸如磷脂類、游離甾醇類和類胡蘿卜素。將離心用于從富含脂類的溶劑油中分離剩余的生物質(zhì)。所得脂類與溶劑的混合物稱作溶劑油(miscella)。使用正己烷將澄清溶劑油中的脂類含量調(diào)整至約45wt％。使該溶劑油冬化，特別是將該溶劑油冷卻至約-1℃并保持8-12小時(shí)以便結(jié)晶出任何飽和脂肪或高熔點(diǎn)成分。然后過濾溶劑油以除去結(jié)晶的硬脂精相。從溶劑油中除去己烷，此后得到冬化脂類。
正如附圖2中所示，加熱冬化脂類并用檸檬酸或磷酸處理以水化脂類中存在的任何磷脂類。加入氫氧化鈉以中和存在的任何游離脂肪酸。使用離心機(jī)除去產(chǎn)生的樹膠(水合磷脂類)和皂腳(中性脂肪酸)。將脂類與水混合并重新離心以除去任何殘余的樹膠/皂腳?？梢允褂玫谝淮坞x心進(jìn)行該步驟。在用檸檬酸預(yù)處理后用二氧化硅和漂白土漂白精制的脂類以除去過氧化物、有顏色的化合物和微量皂腳、磷脂類和金屬。在該循環(huán)結(jié)束時(shí)加入助濾劑以便有利于通過過濾從脂類中除去剩余的漂白化合物。
可以進(jìn)行另一個(gè)步驟，其中將漂白的脂類冷卻至約5℃-約15℃并保持約6-約8小時(shí)以結(jié)晶任何保留的硬脂精或蠟，條件是顯然在穩(wěn)定時(shí)形成沉降物層。如果進(jìn)行該步驟，那么可以將過濾器用于促進(jìn)通過過濾除去結(jié)晶。
將在高度真空中和升溫下起作用的除臭機(jī)用于破壞過氧化物，如果它完全保留下來，則可以在隨后分解和啟動(dòng)自由基反應(yīng)。該步驟還可以除去任何殘留的可以產(chǎn)生臭氣和香味的低分子量化合物。使在除臭機(jī)中的接觸時(shí)間最少以防止形成反式-脂肪酸。加入安全而合適的批準(zhǔn)食品使用的抗氧化劑。在氮?dú)猸h(huán)境中將穩(wěn)定的脂類包裝在含酚的(phenolic-lined)金屬容器內(nèi)以防止氧化。
分析脂類填充的膠囊中形成的渾濁物且發(fā)現(xiàn)它由含肉豆蔻酸(C14:0)和棕櫚酸(C16:0)脂肪酸的甘油三酯類晶體、即一種三飽和脂肪酸甘油酯組成。這些晶體具有的熔點(diǎn)約為50-55℃。三飽和酸甘油酯類包括6-8％的提取的粗脂類。上述冬化過程將這些三飽和酸甘油酯類的濃度降至＜1％；然而，還不足以低至完全消除脂類中渾濁(haze)的形成。另外，用這種傳統(tǒng)的己烷(55％己烷和45％粗油)冬化方法除去了約30％的脂類和相應(yīng)30％的DHA。另一個(gè)問題是當(dāng)溫度降至結(jié)晶剩余＜1％的三飽和酸甘油三酯類時(shí)，更多的所需LCPUFA、例如含有一個(gè)DHA分子的二飽和酸甘油三酯類也會(huì)結(jié)晶出來。這會(huì)導(dǎo)致靶產(chǎn)物DHA顯著損耗。還可能損耗8-10％的脂類。所以雖經(jīng)試圖解決一個(gè)問題，而另一個(gè)問題又產(chǎn)生了。需要擁有可以將LCPUFA濃度維持在所需高水平上并可以減少或消除渾濁的方法。
概述本發(fā)明包括主要具有中性脂類成分的脂類組合物的純化方法，其中該組合物含有至少一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)和至少一種其它化合物。該方法包括使所述脂類組合物接觸極性溶劑的步驟且對(duì)所述溶劑進(jìn)行選擇以使溶于該溶劑的其它化合物少于溶于該溶劑的LCPUFA。例如，所述的極性溶劑選自丙酮、異丙醇、甲醇、乙醇、乙酸乙酯及其混合物。該方法進(jìn)一步包括將所述脂類組合物維持在有效沉淀至少部分其它化合物的溫度范圍的步驟。例如，該溫度范圍可以約為-20℃-約50℃、約-5℃-約20℃、約-5℃-約5℃或約0℃。該方法隨后包括從脂類組合物中除去至少部分其它化合物而形成脂類產(chǎn)物的步驟。該方法可以特別用于減少脂類組合物中形成的渾濁，其中除去的化合物為形成渾濁的化合物。
在各種實(shí)施方案中，所述的脂類組合物可以包括至少50％或85％的中性脂類或至少50％的甘油三酯。以重量百分比計(jì)，所述LCPUFA的濃度在所述方法后大于它在此前的濃度；而以重量百分比計(jì)，其它化合物的濃度在所述方法后低于它在此前的濃度。例如，以重量百分比計(jì)，脂類中存在的任何含磷化合物的總濃度在所述方法后均低于它在此前的濃度。本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生需要較少下游加工、諸如減少脫膠或不需要脫膠加工的可接受產(chǎn)品。
LCPUFA可以為花生四烯酸(ARA)、ω-6二十二碳五烯酸(DPA(n-6))、ω-3二十二碳五烯酸(DPA(n-3))、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。其它化合物可以為三飽和酸甘油酯類、含磷物質(zhì)、蠟酯類、含飽和脂肪酸的甾醇酯類、甾醇類、角鯊烯和/或烴類。另一方面，其它化合物可以為三飽和酸甘油酯類、磷脂類和蠟酯類。另一方面，其它化合物可以為月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)脂肪酸的三飽和酸甘油酯類和/或其混合物。在具體的實(shí)施方案中，所述的脂類組合物最初包括至少一種LCPUFA和至少一種三飽和酸甘油酯。所述的LCPUFA可以獲自含LCPUFA的生物材料，這些生物材料選自含LCPUFA的微生物生物質(zhì)和來自已經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生含LCPUFA的脂類的植物的含油種子。此外，所述的LCPUFA可以獲自已經(jīng)用來自微生物的產(chǎn)生LCPUFA的基因修飾的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的LCPUFA可以獲自選自thraustochytrid生物質(zhì)、腰鞭毛蟲目(dinoflagellate)生物質(zhì)、被孢霉屬(Mortierella)生物質(zhì)和含油種子(oilseed)組成的組的來源，其中所述的含油種子來源于含有來自thraustochytrids、腰鞭毛蟲目或被孢霉屬的基因的遺傳修飾的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的LCPUFA獲自包括Schizochytrium、Thraustochytrium或Crypthecodinium cohnii生物質(zhì)或來源于含有來自Schizochytrium或Thraustochytrium的基因的遺傳修飾的植物的含油種子在內(nèi)的組。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，溶劑脂類組合物之比約為1∶10-約20∶1、約為1∶8-約10∶1、約為1∶5-約5∶1、約為1∶2-約2.5∶1或約為1∶1。在其它實(shí)施方案中，所述溶劑與所述脂類組合物的接觸時(shí)間約為0.5-約12小時(shí)、約2-約6小時(shí)或約為4小時(shí)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用極性溶劑在低溫下提取脂類，使得選擇性提取含有LCPUFA的甘油三酯分子，而不提取不溶于極性溶劑的其它化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從生物質(zhì)中提取脂類組合物并從包括LCPUFA和極性溶劑的溶劑油中分離細(xì)胞碎片和沉淀的其它化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括下列步驟使用所述的極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類、形成包括所述脂類組合物和所述極性溶劑的混合物的溶劑油；冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物；和從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。在該實(shí)施方案中，可以從生物質(zhì)中提取脂類組合物并從包括LCPUFA和極性溶劑的溶劑油中分離細(xì)胞碎片和沉淀的其它化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括下列步驟使用所述的極性溶劑從在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中的生物質(zhì)中回收脂類、形成包括所述脂類組合物、所述極性溶劑和細(xì)胞碎片的混合物的溶劑油。該方法進(jìn)一步包括從所述溶劑油中分離所述的細(xì)胞碎片并冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物的步驟。最終從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括下列步驟使用非極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類、形成包括所述脂類組合物和所述非極性溶劑的混合物的溶劑油。該方法進(jìn)一步包括下列步驟從所述溶劑油中除去大部分所述的非極性溶劑、向所述溶劑油中加入極性溶劑并冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物。最終從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括下列步驟使用非極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類、形成包括所述脂類組合物和所述非極性溶劑的混合物的溶劑油；并冬化該溶劑油。從所述溶劑油中除去大部分所述的非極性溶劑并向其中加入極性溶劑。冷卻該溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物，然后將其從溶劑油中分離。當(dāng)從該溶劑油中除去非極性溶劑時(shí)，除去后殘余的非極性溶劑約為0-約4％重量或約1-約4％重量。
在使用非極性溶劑的本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，所述的非極性溶劑可以為己烷。在使用分離或除去步驟用于沉淀的其它化合物的本發(fā)明各種實(shí)施方案中，該步驟可以使用液相/固相分離技術(shù)，諸如離心、過濾或其組合。
附圖簡(jiǎn)述附圖1是現(xiàn)有提取方法的流程圖。
附圖2是現(xiàn)有精制、漂白和除臭工藝的流程圖。
附圖3是在一個(gè)步驟中使用丙酮的本發(fā)明富含DHA的脂類提取方法的流程圖。
附圖4是在兩個(gè)步驟中使用丙酮的本發(fā)明富含DHA的脂類提取方法的流程圖。
附圖5是本發(fā)明富含DHA的脂類的己烷提取方法和丙酮冬化方法的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了優(yōu)選降低脂類中不需要成分的濃度、同時(shí)維持高濃度所需LCPUFAs的方法。本文所用的LCPUFAs是含有20個(gè)或20個(gè)以上碳原子和2個(gè)(優(yōu)選3個(gè))或2個(gè)以上雙鍵的脂肪酸。所述的LCPUFAs可以為各種形式，諸如磷脂類、游離脂肪酸類和脂肪酸酯類、包括脂肪酸的甘油三酯類。可以理解的是當(dāng)指所需的LCPUFA時(shí)意味著是指以脂類形式存在的LCPUFA、最典型的情況是甘油三酯且較低程度為單酸甘油酯類和二脂酰甘油酯類。正如以重量百分比為基礎(chǔ)測(cè)定的，優(yōu)選所需LCPUFA在所得脂類產(chǎn)物中的濃度高于它在起始脂類組合物中的濃度。不需要的成分優(yōu)選為三飽和酸甘油酯類，諸如月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)脂肪酸的三飽和酸甘油酯類及其混合物。除三飽和酸甘油酯類外，其它不需要成分的實(shí)例還包括含磷化合物(例如磷脂類)、蠟酯類、含飽和脂肪酸的甾醇酯類、甾醇類、角鯊烯、烴類等。正如以重量百分比為基礎(chǔ)測(cè)定的，優(yōu)選在所得產(chǎn)物中不需要化合物中的兩種或多種比起始脂類中減少。除非另有說明，本文所用的用量一般以重量百分比計(jì)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)與起始脂類相比時(shí)，使所得產(chǎn)物的渾濁或霧化程度較低。作為本發(fā)明方法的結(jié)果，可以減少或消除后續(xù)加工步驟、諸如精制。例如，后續(xù)加工步驟、諸如漂白和/或除臭可以幫助減少或消除精制(或脫膠)步驟。精制、漂白和除臭工藝的實(shí)例如對(duì)比例2中所述。如果不取消精制工藝，那么可以通過減少使用的腐蝕劑的量而減少它。盡管不希望受到任何理論約束，但是認(rèn)為渾濁或霧化的主要原因是由三飽和酸甘油三酯類造成的?？雌饋頊p少單-取代或二-取代的甘油三酯類并非重要。
本文所用的術(shù)語″脂類″一般指的是各種脂類，諸如磷脂類；游離脂肪酸類；脂肪酸酯類，包括脂肪酸甘油三酯；甾醇類；色素(例如類胡蘿卜素和氧化類胡蘿卜素)及其它脂類；和與脂類相關(guān)的化合物，諸如植物甾醇類、麥角硫因(ergothionine)、硫辛酸和抗氧化劑、包括β-胡蘿卜素、生育三烯酚類和生育酚。優(yōu)選的脂類和與脂類相關(guān)的化合物包括、但不限于膽固醇；植物甾醇類；鏈甾醇；生育三烯酚類；生育酚類；泛醌類；類胡蘿卜素和葉黃素，諸如β-胡蘿卜素、黃體素、番茄紅素、蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素；和脂肪酸類，諸如共軛亞油酸；以及ω-3和ω-6高級(jí)不飽和脂肪酸，諸如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、雙高亞麻酸和γ-亞麻酸或其混合物。為方便起見，除非另有說明，術(shù)語″脂類″指的是脂類和/或與脂類相關(guān)的化合物。
不需要的成分共有相對(duì)不溶于冷丙酮或類似極性溶劑的常見特征。另一方面，所需的LCPUFAs、諸如花生四烯酸(ARA)、ω-6二十二碳五烯酸(DPA(n-6))，ω-3二十二碳五烯酸(DPA(n-3))、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)溶于冷丙酮或類似溶劑。無論是丙酮還是類似極性溶劑，關(guān)鍵特征在于所需的LCPUFAs在所需溫度下溶于該溶劑，而不需要的化合物在相同溫度下不溶于該溶劑。有用的指導(dǎo)在于選擇具有與丙酮或乙酸乙酯近似介電常數(shù)的溶劑。用于本發(fā)明該方面的優(yōu)選溶劑包括丙酮和類似極性溶劑，諸如異丙醇、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或這些溶劑的混合物。這些溶劑均為極性溶劑且含有雙鍵和長(zhǎng)碳鏈的LCPUFAs也是極性的且由此溶于這些極性溶劑。然而，如果這些溶劑極性過強(qiáng)，那么LCPUFAs也可能不溶。所述溶劑還優(yōu)選用于食品應(yīng)用。
令人意外地發(fā)現(xiàn)丙酮可以用于從粗脂類中選擇性沉淀三飽和酸甘油酯類。當(dāng)用5個(gè)體積的丙酮處理來自Schizochytrium屬的大量未冬化富含DHA的脂類并冷卻時(shí)，通過結(jié)晶、隨后離心除去基本上全部的三飽和酸甘油酯類。該方法幾乎不會(huì)除去或不會(huì)除去含DHA的甘油三酯類。與通過標(biāo)準(zhǔn)冬化方法得到的37％相比，所得冬化脂類含有41％DHA。
通過將丙酮或類似溶劑提取與″原位″冬化法合并而更好地改善在破壞了三飽和酸甘油酯類情況下含有長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的甘油三酯類或來自含有兩種飽和脂肪酸和一種單不飽和脂肪酸的甘油三酯類的回收效率可以找到進(jìn)一步利用該發(fā)現(xiàn)的方式。本發(fā)明該方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于幾乎不損耗所需LCPUFAs。例如，在現(xiàn)有的方法中，含有所需LCPUFAs的約30％提取脂類在冬化過程中損耗。相反，最直接的與現(xiàn)有技術(shù)方法相差無幾的本發(fā)明方法的實(shí)施方案(即己烷提取，隨后進(jìn)行丙酮冬化)僅使起始提取的脂類損耗了約7％-約10％作為丙酮冬化的結(jié)果。結(jié)果是在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，在產(chǎn)率損失上實(shí)現(xiàn)了約40％或40％以上的下降。這是超過現(xiàn)有技術(shù)方法(己烷提取和冬化+完全精制、漂白和除臭(RBD))的顯著改進(jìn)。在現(xiàn)有技術(shù)方法的冬化步驟中導(dǎo)致的DHA和脂類的損耗最大。
首先，在優(yōu)選的方法中，使用丙酮或類似極性溶劑(不是己烷)在低溫下提取脂類以便從Schizochytrium屬生物質(zhì)中選擇性提取含有LCPUFA的甘油三酯分子。這類方法的流程圖如附圖3中所示。由于丙酮在低溫下的選擇性(三飽和酸甘油酯類不溶于冷丙酮，而含LCPUFA-的甘油三酯類溶于冷丙酮)，所以易于從生物質(zhì)中選擇性提取出含LCPUFA的甘油三酯且由此消除了對(duì)單獨(dú)的冬化步驟的需求?？梢园凑杖我膺m當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行溶劑提取。例如，可以在有冷溶劑存在的情況下對(duì)干生物質(zhì)進(jìn)行機(jī)械(例如使用研磨機(jī)或勻化器)或化學(xué)(例如使用酸、酶或堿)裂解。在一步法中從溶劑油中分離細(xì)胞碎片和沉淀的三飽和酸甘油酯類。如果需要，在加工步驟后，可以進(jìn)行諸如經(jīng)精制、漂白和除臭這樣的純化步驟。
第二個(gè)選擇是在常用提取方法(包括任意類型的研磨技術(shù))中使用丙酮或類似極性溶劑從生物質(zhì)中定量回收脂類。在使全部甘油三酯成分溶解的溫度下進(jìn)行這種提取。在從溶劑油中除去細(xì)胞碎片前(含有甘油三酯類的脂類在溶劑中)，冷卻溶劑油以便選擇性除去三飽和酸甘油酯類。然后將冷卻的溶劑油離心、過濾或使用其它技術(shù)分離以便除去細(xì)胞碎片和三飽和酸甘油酯成分。這種選擇將提取與冬化方法并入了一步中。
第三種選擇是在常用提取方法(包括任意類型的研磨技術(shù))中使用丙酮或類似極性溶劑從生物質(zhì)中定量回收脂類。在使全部甘油三酯成分溶解的溫度下進(jìn)行這種提取。使用常規(guī)分離技術(shù)從溶劑油中除去細(xì)胞碎片(含有甘油三酯類的脂類在溶劑中)。然后冷卻溶劑油以便結(jié)晶出三飽和酸甘油酯類，通過離心、過濾或使用其它技術(shù)分離除去它們。這種選擇在兩個(gè)階段中使用了提取和冬化；然而，使用丙酮或類似極性溶劑可以完成這兩項(xiàng)任務(wù)。這類方法的流程圖如附圖4中所示。
第四種選擇是將諸如己烷(例如正己烷、異己烷或其組合)這樣的非極性溶劑用作提取溶劑并將丙酮用作冬化溶劑。優(yōu)選在冬化前除去至少95％、更優(yōu)選至少96％、更優(yōu)選至少97％、更優(yōu)選至少98％且更優(yōu)選至少99％的非極性溶劑?？梢栽诔羟暗娜我怆A段上使用冬化步驟。這類方法的流程圖入附圖5中所示。
第五種選擇是使用常規(guī)己烷提取和基于己烷的冬化以便除去大部分三飽和酸甘油酯成分并在除臭前使用″磨光(polishing)″步驟以除去少量使脂類中形成渾濁的三飽和酸甘油酯類。該磨光步驟使用丙酮和/或類似溶劑。這種選擇除去了因渾濁產(chǎn)生的問題，但脂類濃度也下降了。
優(yōu)選所述的脂類組合物開始包括至少一種LCPUFA和至少一種三飽和酸甘油酯。其它或不需要的化合物在以起始起始濃度包含在脂類組合物中時(shí)優(yōu)先使渾濁形成。優(yōu)選從包括下列物質(zhì)的組中選擇用于脂類提取的含LCPUFA的生物材料含LCPUFA的微生物生物質(zhì)或來自已經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生含有LCPUFA的脂類的植物、特別是已經(jīng)用來自微生物(藻類、真菌、原生生物或細(xì)菌)的產(chǎn)生LCPUFA的基因修飾的植物的含油種子。更優(yōu)選用于脂類提取的含LCPUFA的生物材料選自包括下列物質(zhì)的組thraustochytrid生物質(zhì)、腰鞭毛蟲目生物質(zhì)和/或被孢霉屬生物質(zhì)和/或含油種子，其中所述的含油種子來源于含有來自thraustochytrids、腰鞭毛蟲目和/或被孢霉屬的基因的遺傳修飾的植物。更優(yōu)選用于脂類提取的含LCPUFA的生物材料選自包括下列物質(zhì)的組Schizochytrium、Thraustochytrium和/或Crypthecodinium(優(yōu)選Crypthecodinium cohnii)生物質(zhì)或來源于含有來自Schizochytrium或Thraustochytrium和/或Crypthecodinium (優(yōu)選Crypthecodinium cohnii)的基因的遺傳修飾的植物的含油種子。
優(yōu)選起始的脂類組合物主要由中性脂類組成。優(yōu)選起始的脂類組合物包括至少50％的中性脂類、優(yōu)選至少60％的中性脂類、優(yōu)選至少75％的中性脂類、優(yōu)選至少85％的中性脂類且優(yōu)選至少90％的中性脂類。優(yōu)選該中性脂類主要包括甘油三酯。優(yōu)選起始的脂類組合物包括至少50％的甘油三酯、優(yōu)選至少60％的甘油三酯、優(yōu)選至少75％的甘油三酯且優(yōu)選至少85％的甘油三酯。在本段落中上述的百分比指的是重量百分比。優(yōu)選所需LCPUFA在所得產(chǎn)物中的濃度高于在起始脂類組合物中的濃度。
為提取或冬化過程而基于重量?jī)?yōu)選的極性溶劑脂類之比約為1∶10-約20∶1、更優(yōu)選約1∶8-約10∶1、優(yōu)選約1∶5-約5∶1且優(yōu)選約1∶2-約2.5∶1。優(yōu)選極性溶劑與脂類的接觸時(shí)間約為0.5-約12小時(shí)、優(yōu)選約2-約6小時(shí)優(yōu)選約4小時(shí)。如果使用非極性脂類，則優(yōu)選殘余的非極性脂類約為0-約4重量百分比且優(yōu)選約1-約4重量百分比。
為下列方法和目的優(yōu)選的溫度為脂類凝固點(diǎn)-不需要成分(例如三飽和酸甘油酯類)的熔點(diǎn)、更優(yōu)選約-20℃-約50℃、更優(yōu)選約-5℃-約20℃、更優(yōu)選約-5℃-約5℃、更優(yōu)選約0℃(i)冷提取法；(ii)提取、隨后冷卻并過濾/離心；(iii)提取、過濾/離心細(xì)胞碎片；、隨后冷卻和過濾/離心和(iv)溶劑冬化或磨光步驟的冷卻條件。
本方法其它優(yōu)選的屬性包括在破壞在冷丙酮中相對(duì)不溶的三飽和酸甘油酯類和其它成分的情況下僅選擇性回收含LCPUFA的甘油三酯類，所述的其它成分包括磷脂類、蠟酯類、含飽和脂肪酸的甾醇酯類、甾醇類、角鯊烯、烴類等。通過在破壞這些不需要的成分情況下僅選擇性回收含LCPUFA的甘油三酯類使得消除或減少其它下游純化步驟(諸如冬化、精制和漂白)的可能性得以實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例1概述分析獲自Schizochytrium的富含DHA的脂類的樣品(樣品1，未冬化的脂類，a.k.a.″高熔點(diǎn)″)和從獲自Schizochytrium的另一種富含DHA的脂類中分離的沉降物(樣品2)以便測(cè)定固相(樣品1)和絮凝物/沉降物(樣品2)的性質(zhì)。
將植物等級(jí)(scale)(環(huán)境溫度下為半固體)下產(chǎn)生的未冬化脂類樣品1溶于4個(gè)體積的冷丙酮并混合。通過經(jīng)玻璃纖維濾器過濾分離固體白色粉末(約7％重量)。經(jīng)證實(shí)具有52.4-53.5℃熔點(diǎn)溫度的該固體白色粉末為甘油三酯類(基于通過薄層色譜法(TLC)的單斑點(diǎn))且當(dāng)用GLC分析時(shí)主要含有肉豆蔻酸(26％)和棕櫚酸(66％)。這種高熔點(diǎn)甘油三酯級(jí)分含有幾乎不含DHA/DPA的飽和脂肪酸。分離的脂類級(jí)分(91％重量)在室溫下為橙色液體且含有41.0％DHA和16.0％DPA。與樣品1的原料脂肪酸分布相比，富集了約8％的DHA和DPA-這是確切的DHA和DPA″純化″。
另一種來自Schizochytrium的富含DHA的重新加工的脂類在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存數(shù)天期限時(shí)含有明顯絮凝樣的物質(zhì)(渾濁)。通過離心分離這種絮凝物。將絮凝物/沉降物(″樣品2沉降物″)溶于10個(gè)體積的冷丙酮、混合并過濾。通過經(jīng)玻璃纖維濾器過濾分離約15％重量的固體白色粉末。該固體白色粉末具有50.1-51.4℃熔點(diǎn)溫度且證實(shí)為含有肉豆蔻酸(29％)和棕櫚酸(59％)的甘油三酯類(基于TLC的單斑點(diǎn))。這就是含有幾乎不含DHA/DPA的飽和脂肪酸的高熔點(diǎn)甘油三酯級(jí)分。分離的脂類級(jí)分(85％重量)在室溫下為澄清的橙色液體且含有41.1％DHA和16.3％DPA。認(rèn)為來自Schizochytrium的重新加工的脂類中有絮凝物形成是因含有在穩(wěn)定時(shí)從脂類中結(jié)晶出的肉豆蔻酸和棕櫚酸的高熔點(diǎn)溫度的甘油三酯導(dǎo)致的。
實(shí)驗(yàn)一般情況-從冷凍儲(chǔ)存中取出來自樣品1(250g瓶)的富含DHA的樣品。這是未冬化的脂類樣品。將該樣品溫至環(huán)境溫度并照此使用。
使用實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)從富含DHA的脂類中分離沉降物(樣品2)。富含DHA的脂類是大量重新加工的脂類，它們?cè)诃h(huán)境溫度下保持穩(wěn)定時(shí)含有可見的絮凝物。通過離心樣品并從沉降物中潷析液體級(jí)分來分離這種絮凝物。液體級(jí)分中在環(huán)境溫度下保持澄清；因此，認(rèn)為這種絮凝物存在于分離的沉降物中。
丙酮冬化-使用丙酮冬化步驟對(duì)分離自重新加工的脂類(樣品2)的未冬化的脂類(樣品1)和沉降物進(jìn)行分級(jí)分離。將沉降物與未冬化的樣品溶于過量丙酮(冰/水浴溫度)并混合以溶解和懸浮液體成分。立即在真空中通過玻璃纖維濾器過濾該溶液/混懸液。用少量冷丙酮洗滌濾紙和保留在濾紙上的內(nèi)含物。使濾紙上的內(nèi)含物風(fēng)干并稱重。在真空中濃縮脂類/丙酮級(jí)分而得到純脂類并稱重。
TLC-進(jìn)行TLC以便使用硅膠60板測(cè)定脂類組合物。研發(fā)的溶劑系統(tǒng)由石油醚∶乙醚∶乙酸的90∶10∶1混合物組成。將斑點(diǎn)的Rf值與那些列在Morris Kates的″Techniques in Lipidology″中的值進(jìn)行比較。
熔點(diǎn)測(cè)定-使用實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)設(shè)備測(cè)定熔點(diǎn)。
紅外光譜法-使用Perkin Elmer 283B紅外分光計(jì)獲得紅外光譜。經(jīng)分析液體級(jí)分為純的。在氯仿中分析來自丙酮冬化的固體級(jí)分。
脂肪酸甲酯類(FAMEs)-使用無水HCl的甲醇溶液、按照用于測(cè)定C12-C22:6游離脂肪酸分布的步驟對(duì)富含DHA的脂類樣品1、樣品2(重新加工的)與丙酮冬化級(jí)分的等分部分進(jìn)行酯交換。完成了全部FAME制備和GLC操作。鑒定FAME′s并使用NuChek Prep分析參比標(biāo)準(zhǔn)品502、應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)(C19:0)定量以便測(cè)定實(shí)驗(yàn)響應(yīng)因子。
氣相-液相色譜法-使用安裝了Hewlet -Packard自動(dòng)取樣器、ChemStation軟件、30m×0.32mm SP-2380毛細(xì)管柱(Supelco)和火焰離子化檢測(cè)器的Hewlett-Packard Model 6890 Series II氣相-液相色譜儀對(duì)甲酯類進(jìn)行氣相-液相色譜。將烘干溫度保持在120℃下3分鐘、按照程序以5℃/分鐘達(dá)到190℃下、保持在190℃下1分鐘、按照程序以20℃/分鐘達(dá)到260℃下且然后保持在260℃下3分鐘。將注射器溫度設(shè)定在295℃并將檢測(cè)器溫度設(shè)定在280℃。將氦用作載氣并使用分流注射技術(shù)。
結(jié)果富含DHA的脂類樣品1從冷凍儲(chǔ)存中取出來自的富含DHA的脂類樣品(250g瓶)、即樣品1。該樣品在環(huán)境溫度下保持半固體且在技術(shù)術(shù)語上稱作″脂肪″而不稱作″油″。將這種脂肪的等分部分(14.44g)轉(zhuǎn)入錐形瓶并加入60ml冷丙酮(冰/水浴)。渦動(dòng)該瓶至溶解/懸浮脂肪成分并立即在真空中通過玻璃纖維濾器過濾。固體白色級(jí)分保留在濾紙上并用幾微升冷丙酮洗滌且干燥。分離到產(chǎn)率為6.3％的固體白色級(jí)分(從14.44g脂肪原料得到0.91g)。
通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮通過過濾得到的脂類/丙酮級(jí)分而得到13.13g橙色液體物質(zhì)(環(huán)境溫度下為液體)。該步驟得到91％的總回收率；因此，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上損耗了約2％的物質(zhì)。
為測(cè)定脂類組合物而通過TLC分析″丙酮冬化″后分離的固體白色級(jí)分和液體級(jí)分?；赥LC證實(shí)固體白色級(jí)分為甘油三酯類(觀察到了一個(gè)具有相當(dāng)于甘油三酯的Rf值的斑點(diǎn))。通過TLC在點(diǎn)樣并展開液體級(jí)分時(shí)觀察到了許多斑點(diǎn)。這些斑點(diǎn)的Rf值與包括角鯊烯、甾酯類、甘油三酯類和甾醇類的脂類成分一致(全部是初步的分布)。沒有進(jìn)一步對(duì)脂類組合物進(jìn)行分析。
丙酮冬化后分離的固體白色級(jí)分具有的熔點(diǎn)范圍在52.4-53.5℃。
將丙酮冬化后分離的固體和液體級(jí)分酯交換成甲酯類并通過氣相-液相色譜法分析甲酯類。通過丙酮冬化分離的固體和液體級(jí)分的FAME′s的完整分布與未冬化的富含DHA的脂肪(樣品1)如表1中所示。正如顯而易見的，固體級(jí)分中含有極少的DHA(2.4％)和DPA(0.9％)，而含有主要的脂肪酸肉豆蔻酸甲酯(26％)和棕櫚酸甲酯(66％)。丙酮冬化后分離的液體級(jí)分中含有肉豆蔻酸酯(8.3％)、棕櫚酸酯(23.1％)、DPA(16.0％)、DHA(41.0％)與其它少量脂肪酸。當(dāng)將這種分布與起始的未冬化脂類比較時(shí)，觀察到富集了約8％的DHA，這一結(jié)果與除去了主要的三飽和酸甘油酯成分的結(jié)果一致。這一階段代表純化步驟。
富含DHA的液體沉降物(樣品2)由重新精制的脂類產(chǎn)生的沉降物在己烷中完全溶混，而在甲醇中不溶混。當(dāng)向沉降物中加入少量丙酮時(shí)，從液體黃色脂類/丙酮相中分離的白色沉淀形成?；谶@些溶出試驗(yàn)，將丙酮分級(jí)分離用于分離白色粉末。
將沉降物的等分部分(1.11g)轉(zhuǎn)入錐形瓶并加入10ml冷丙酮(冰/水浴)。渦動(dòng)該瓶至溶解/懸浮脂肪成分并立即在真空中通過玻璃纖維濾器過濾。固體白色級(jí)分保留在濾紙上并用幾微升冷丙酮洗滌且干燥。分離到產(chǎn)率為15％的固體白色級(jí)分(從1.11g沉降物得到0.17g)。
通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮通過過濾得到的脂類/丙酮級(jí)分而得到0.94g橙色液體物質(zhì)(環(huán)境溫度下為液體)。該步驟得到85％的從回收率。
通過TLC分析丙酮分級(jí)分離后分離的固體白色級(jí)分和液體級(jí)分。基于TLC證實(shí)固體白色級(jí)分為甘油三酯類(觀察到了一個(gè)具有相當(dāng)于甘油三酯的Rf值的斑點(diǎn))。通過TLC在點(diǎn)樣并展開液體級(jí)分時(shí)觀察到了許多斑點(diǎn)。這些斑點(diǎn)的Rf值與包括角鯊烯、甾酯類、甘油三酯類和甾醇類的脂類成分一致(全部是初步的分布)。沒有進(jìn)一步對(duì)脂類組合物進(jìn)行分析。
丙酮冬化后分離的固體白色級(jí)分具有的熔點(diǎn)范圍在50.1-51.4℃。
將丙酮冬化后分離的固體和液體級(jí)分酯交換成甲酯類并通過氣相-液相色譜法分析甲酯類。通過丙酮冬化分離的固體和液體級(jí)分的FAME′s的完整分布與樣品2的沉降物如表1中所示。正如顯而易見的，固體級(jí)分中含有極少的DHA(6.4％)和DPA(2.6％)，而含有主要的脂肪酸肉豆蔻酸甲酯(29％)和棕櫚酸甲酯(59％)。丙酮冬化后分離的液體級(jí)分中含有肉豆蔻酸酯(8.4％)、棕櫚酸酯(23.2％)、DPA(16.3％)、DHA(41.1％)與其它少量脂肪酸。
表1.未冬化油(樣品1)、樣品2的沉降物和通過丙酮分級(jí)分離自樣品1和樣品2的沉降物的級(jí)分的脂肪酸分布
對(duì)比例下面所列的表2表示如對(duì)比附圖1和后面的對(duì)比附圖2中所示的相差無幾的現(xiàn)有技術(shù)方法。
表2分析證明(Schizochytrium生物質(zhì))添加抗氧化劑后精制、除臭、漂白的(RDB)冬化的Schizochytrium油表2A
表2B
*因添加迷迭香提取物得到的ppte。
下面所列的表3表示本發(fā)明的方法，正如附圖5中所示，后面是對(duì)比附圖2的漂白、除臭和精制。
表3丙酮冬化的Schizo油添加抗氧化劑后的RDB Schizo油(來自Schizochytrium生物質(zhì))表3A
表3B
實(shí)施例3使Schizochytrium油的粗提取物進(jìn)行各種冬化步驟，其中用己烷從生物質(zhì)中提取脂類組合物。除去己烷而得到含有殘余量己烷的粗提取油。然后按照特定的丙酮/油比用丙酮提取提取的油并在特定溫度下冬化指定的時(shí)間期限。殘余己烷％、丙酮/油比、冬化溫度和冬化時(shí)間在不同實(shí)驗(yàn)中是可變的。2周后，根據(jù)過濾時(shí)間、油的回收率和混濁度評(píng)價(jià)方法。具體實(shí)驗(yàn)和結(jié)果如下面的表4中所示。
表4.丙酮冬化的Schizochytrium油的測(cè)試變量和觀察結(jié)果的水平
對(duì)照組在-3C下己烷冬化(45∶55，油∶己烷)5小時(shí)PPT-旋轉(zhuǎn)測(cè)試后觀察到的沉淀*己烷冬化的樣品在過濾后顯示PPT(同一天)，表示結(jié)晶不完全。如果使用封閉濾器沒有實(shí)現(xiàn)對(duì)濾餅的徹底干燥，那么在實(shí)驗(yàn)室中不可能從植物中得到加倍的回收率。
一般從植物中得到的回收率約為70-75％。
表5.粗油、己烷和丙酮冬化的油的油回收率、過濾時(shí)間和分析數(shù)據(jù)
*小規(guī)模己烷的DHA回收率的估計(jì)值-冬化油基于上述Schizo油法的數(shù)據(jù)表6.丙酮冬化的蠟的脂肪酸組成
結(jié)論基于對(duì)實(shí)施例2沉降物的分析，認(rèn)為絮凝物為主要含有肉豆蔻酸和棕櫚酸的甘油三酯類。這一結(jié)果基于TLC、IR和通過GLC對(duì)所得FAME的分析。包括所述絮凝物的甘油三酯類具有高熔點(diǎn)溫度(50.1-51.4℃)。
合并這種級(jí)分的甘油三酯脂類組成的分離的白色粉末的高熔點(diǎn)溫度表明在標(biāo)準(zhǔn)加工過程中使用的冬化步驟沒有從脂類中定量除去″高熔點(diǎn)″級(jí)分。因此，推薦使用附加的″磨光″步驟以便實(shí)現(xiàn)最終的成品中的澄明度。
為了估計(jì)樣品1中未冬化脂類的固體分布，使用丙酮冬化步驟。經(jīng)證實(shí)分離自樣品1的產(chǎn)率為6-7％的固體白色級(jí)分為主要含有肉豆蔻酸和棕櫚酸類的甘油三酯類(在這種甘油三酯成分中＞94％的脂肪酸為飽和脂肪)。棕櫚酸與肉豆蔻酸的含量約為2∶1的比例且這一結(jié)果與窄熔點(diǎn)范圍組合提示了這種甘油三酯的確定結(jié)構(gòu)。在固體甘油三酯級(jí)分中含有極少的DPA和DHA。與起始未冬化脂類中的37.7％DHA相比，丙酮冬化后分離的液體級(jí)分含有41.0％的DHA(表示為總脂肪酸甲酯類的百分比)。這種富集了約8％DHA的結(jié)果與除去了7％的三飽和脂肪酸甘油酯類的結(jié)果一致。
在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的丙酮冬化法中證實(shí)DHA損耗極少，表明在冬化過程中可以得到接近定量的DHA回收率。
固體或溶劑輔助的冬化(本文所述的丙酮冬化，不過，可以有其它溶劑存在)提供了下面的可能性且可以看作加工步驟的選擇。
(1)確實(shí)可以除去高熔點(diǎn)固體物質(zhì)。
(2)所述的固體物質(zhì)主要是含有極少DHA(2.4％)的三飽和脂肪酸甘油酯(＞94％的飽和脂肪酸)。
(3)作為實(shí)例，以1,000kg粗脂類中的DHA作為原料計(jì)算，在丙酮冬化過程中會(huì)遇到約2kg的DHA損耗(1,000×0.07×0.024)。這是基于絕對(duì)重量的約0.2％的損耗DHA的回收率。
(4)與起始未冬化的脂類脂肪酸分布相比，冬化后保留下富含DHA的澄清液體。
(5)可以將溶劑輔助的冬化用于進(jìn)行DHA純化。
(6)由于三飽和脂肪酸甘油酯成分的高熔點(diǎn)溫度(＞50℃)，所以可以不需要傳統(tǒng)的低溫冷卻條件。
本申請(qǐng)引入2001年12月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/341,180作為參考。
盡管已經(jīng)具體描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行修改和適應(yīng)性改變。然而，特別應(yīng)理解這類修改和適應(yīng)性改變屬于如下所列的權(quán)利要求的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.主要包括中性脂類的脂類組合物的純化方法，其中所述的脂類組合物含有至少一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)和至少一種其它化合物，所述的方法包括下列步驟(a)使所述脂類組合物接觸極性溶劑，其中所述的其它化合物在所述極性溶劑中的可溶性低于所述LCPUFA在所述極性溶劑中的可溶性；(b)將所述脂類組合物維持在有效沉淀至少部分所述其它化合物的溫度范圍；和(c)從所述脂類組合物中除去至少部分所述的其它化合物而形成脂類產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂類組合物包括至少50％的中性脂類。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂類組合物包括至少85％的中性脂類。
4.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的中性脂類包括甘油三酯。
5.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的中性脂類包括至少50％的甘油三酯。
6.減少脂類組合物中渾濁形成的方法，其中所述的脂類組合物含有至少一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)和至少一種可形成渾濁的化合物，所述的方法包括下列步驟(a)使所述脂類組合物接觸極性溶劑，其中所述可形成渾濁的化合物在所述極性溶劑中的可溶性低于所述LCPUFA在所述極性溶劑中的可溶性；(b)將所述脂類組合物維持在有效沉淀至少部分所述可形成渾濁的化合物的溫度范圍；和(c)從所述脂類組合物中除去至少部分所述可形成渾濁的化合物而形成脂類產(chǎn)物。
7.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中以重量百分比計(jì)，所述LCPUFA的濃度在所述方法后大于它在此前的濃度。
8.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中以重量百分比計(jì)，所述其它化合物的濃度在所述方法后小于它在此前的濃度。
9.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中以重量百分比計(jì)，存在于所述脂類中的任意含磷化合物的濃度在所述方法后低于它在此前的濃度。
10.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的方法產(chǎn)生使下游加工程序減少的可接受的產(chǎn)品。
11.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的方法產(chǎn)生使脫膠減少或不需要脫膠的可接受的產(chǎn)品。
12.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的極性溶劑選自丙酮、異丙醇、甲醇、乙醇、乙酸乙酯及其混合物組成的組。
13.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的極性溶劑包括丙酮。
14.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的溫度范圍約為-20℃-約50℃。
15.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的溫度范圍約為-5℃-約20℃。
16.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的溫度范圍約為-5℃-約5℃。
17.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的溫度約為0℃。
18.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的LCPUFA選自花生四烯酸(ARA)、ω-6二十二碳五烯酸(DPA(n-6))、ω-3二十二碳五烯酸(DPA(n-3))、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)組成的組。
19.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的其它化合物選自三飽和酸甘油酯類、含磷物質(zhì)、蠟酯類、含飽和脂肪酸的甾醇酯類、甾醇類、角鯊烯和烴類組成的組。
20.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的其它化合物選自三飽和酸甘油酯類、磷脂類和蠟酯類組成的組。
21.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的其它化合物選自月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)脂肪酸的三飽和酸甘油酯類及其混合物組成的組。
22.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的脂類組合物最初包括至少一種LCPUFA和至少一種三飽和酸甘油酯。
23.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的其它化合物在以起始濃度存在于最初的脂類組合物中時(shí)形成渾濁。
24.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的LCPUFA獲自含LCPUFA的生物材料，這些生物材料選自含LCPUFA的微生物生物質(zhì)和來自己經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生含LCPUFA的脂類的植物的含油種子組成的組。
25.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的LCPUFA獲自己經(jīng)用來自微生物的產(chǎn)生LCPUFA的基因修飾的植物。
26.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的LCPUFA獲自選自thraustochytrid生物質(zhì)、腰鞭毛蟲目生物質(zhì)、被孢霉屬生物質(zhì)和含油種子組成的組的來源，其中所述的含油種子來源于含有來自thraustochytrids、腰鞭毛蟲目或被孢霉屬的基因的遺傳修飾的植物。
27.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的LCPUFA獲自包括Schizochytrium、Thraustochytrium或Crypthecodinium cohnii生物質(zhì)或來源于含有來自Schizochytrium或Thraustochytrium的基因的遺傳修飾的植物的含油種子在內(nèi)的組。
28.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑脂類組合物之比約為1∶10-約20∶1。
29.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑脂類組合物之比約為1∶8-約10∶1。
30.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑脂類組合物之比約為1∶5-約5∶1。
31.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑脂類組合物之比約為1∶2-約2.5∶1。
32.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑脂類組合物之比約為1∶1。
33.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中使用極性溶劑在低溫下提取脂類以便選擇性地提取含有所述LCPUFA的甘油三酯分子，而不提取不溶于所述極性溶劑的其它化合物。
34.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中從生物質(zhì)中提取所述的脂類組合物且其中從包括所述LCPUFA和所述極性溶劑的溶劑油中分離細(xì)胞碎片和沉淀的其它化合物。
35.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶劑與所述脂類組合物的接觸時(shí)間約為0.5-約12小時(shí)。
36.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶劑與所述脂類組合物的接觸時(shí)間約為2-約6小時(shí)。
37.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶劑與所述脂類組合物的接觸時(shí)間約為4小時(shí)。
38.權(quán)利要求1-37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(a)使用所述的極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類，形成包括所述脂類組合物和所述極性溶劑混合物的溶劑油；(b)冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物；和(c)從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中從生物質(zhì)中提取所述的脂類組合物且其中從包括所述LCPUFA和所述極性溶劑的溶劑油中分離細(xì)胞碎片和所述沉淀的其它化合物。
40.權(quán)利要求1-37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(a)使用所述的極性溶劑從在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中的生物質(zhì)中回收脂類，形成包括所述脂類組合物、所述極性溶劑和細(xì)胞碎片的混合物的溶劑油；(b)從所述溶劑油中分離所述的細(xì)胞碎片；(c)冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物；和(d)從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。
41.權(quán)利要求1-37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(a)使用非極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類，形成包括所述脂類組合物和所述非極性溶劑混合物的溶劑油；(b)從所述溶劑油中除去大部分所述的非極性溶劑；(c)向所述溶劑油中加入極性溶劑；(d)冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物；和(e)從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。
42.權(quán)利要求1-37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(a)使用非極性溶劑在基本上溶解全部甘油三酯成分的溫度下進(jìn)行的提取過程中回收脂類，形成包括所述脂類組合物和所述非極性溶劑混合物的溶劑油；(b)對(duì)所述溶劑油冬化；(c)從所述溶劑油中除去大部分所述的非極性溶劑；(d)向所述溶劑油中加入極性溶劑；(e)冷卻所述溶劑油以便選擇性沉淀不需要的化合物；和(f)從所述溶劑油中分離所述沉淀的其它化合物。
43.權(quán)利要求40-41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在從所述溶劑油中除去大部分所述非極性溶劑后殘余的非極性溶劑約為所述溶劑油的0-約4％重量。
44.權(quán)利要求40-41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在從所述溶劑油中除去大部分所述非極性溶劑后殘余的非極性溶劑約為所述溶劑油的1-約4％重量。
45.權(quán)利要求40-43中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的非極性溶劑為己烷。
46.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的分離或除去步驟包括通過液相/固相分離技術(shù)分離或除去沉淀的其它化合物。
47.上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的分離或除去步驟包括通過離心、過濾或其組合分離或除去沉淀的其它化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了主要具有含有至少一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的中性脂類成分的脂類組合物的純化方法。該方法使用使所述的脂類組合物接觸極性溶劑、諸如丙酮接觸的步驟，其中對(duì)所述的溶劑進(jìn)行選擇，使得溶于該溶劑的污染物比溶于所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的少。該方法一般在冷卻溫度、包括約0℃下進(jìn)行。在從所述脂類組合物中沉淀污染物時(shí)，進(jìn)行分離以便從該脂類組合物中除去沉淀的物質(zhì)。所述的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸可以包括ARA、DPA、EPA和/或DHA。該方法可以有效使脂類組合物冬化，由此減少這類組合物變渾濁的傾向。
文檔編號(hào)C11B7/00GK1620330SQ02828043
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者丹尼爾·G·杜彭, 塞繆爾·G·澤勒, 桑德拉·I·迪爾茨, 羅伯特·H·德賴弗 申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)博爾德公司