專利名稱：海藻培養(yǎng)中提高脂質(zhì)和ω－3脂肪酸產(chǎn)量的方法
表3用L-半乳糖作為底物進(jìn)行微量靜止反應(yīng)
L-GaLL-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯；L-GaAL-半乳糖酸；++超過10mM；+10mM或更少；nd無法探測(cè)到。
參考文獻(xiàn)W.Yongmanitchai和O.P.War(1989；omega-3 fattyocidsalternative sources of production；Proc.Biochem 24117-125)和J.K.Volman等。(1989；Fatty acid and lipid composition of 10species of microalgae used in mariculture；J.Exp.Mar.Biol.Ecol.128219-240)根據(jù)那些已知含有豐富脂肪酸的種類，如Crypthecodinium cohnii，已經(jīng)初步建立了微藻生產(chǎn)PUFAs的海水養(yǎng)殖業(yè)。
微藻的脂質(zhì)含量，例如PUFAs，根據(jù)其培養(yǎng)條件而變化。然而，為獲得藻類中的這種濃度(concentration)脂肪酸而優(yōu)化的條件不能相比于培養(yǎng)中藻類生長(zhǎng)的那些必要條件。因此，富含如脂肪酸的脂質(zhì)的藻類培養(yǎng)，只能在低濃度下得以實(shí)施。
因此，本發(fā)明優(yōu)勢(shì)在于通過減少培養(yǎng)容積來獲得相同的PUFAs產(chǎn)量，從而提供高濃度生產(chǎn)PUFAs的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)PUFAs的新方法，以獲得高濃度的脂質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，通過抑制細(xì)胞分裂及其培養(yǎng)物生長(zhǎng)、以獲得富集脂質(zhì)培養(yǎng)物，來提供生產(chǎn)PUFAs的方法。
然而根據(jù)本發(fā)明，提供從藻類生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其步驟包括至少在藻類培養(yǎng)中應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子、引起所述藻類培養(yǎng)分裂停止和通過培養(yǎng)的藻類生產(chǎn)和貯存多不飽和脂肪酸。
生長(zhǎng)限制因子可以是例如缺乏(deprivation)硅酸鹽的其他營(yíng)養(yǎng)缺乏或例如光強(qiáng)度的物理因素。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可同時(shí)地或并發(fā)地應(yīng)用多種生長(zhǎng)限制因子。實(shí)施本發(fā)明方法的優(yōu)選藻類是硅藻(diatomaceous)Chaetoceros gracilis或硅藻Skeleonema costatum。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在指數(shù)生長(zhǎng)期的末期應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子，優(yōu)選藻類培養(yǎng)物達(dá)到至少107細(xì)胞/毫升的濃度的時(shí)候。在特定的時(shí)間點(diǎn)抑制培養(yǎng)中藻類細(xì)胞的分裂，以獲得富含PUFAs、更具體是ω-3脂肪酸的藻類。
發(fā)明詳述在適合生長(zhǎng)的溫度、pH和光照條件下以半連續(xù)方法培養(yǎng)藻類。更具體地，優(yōu)選在溫度18至20℃、pH7.5至8.0和培養(yǎng)瓶?jī)H一側(cè)光照的條件下培養(yǎng)藻類。通過Cool-whiteTM和GrowliteTM熒光燈在光強(qiáng)60至250uE s-1m-2的變化來提供光照。光周期為16小時(shí)光照循環(huán)，隨即8小時(shí)黑暗。培養(yǎng)中用的水以在1μm條件下過濾并80℃滅菌。
在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將2-3ml原始藻類接種體加至含75ml f/2培養(yǎng)基(Guillard，R.，1975；Culture of phytoplankton for feediag marineinvertebrates inSmith，W.L.，Chanley，M.H.(Eds.)，Culture ofmarine invertebrates animals，(海洋無脊椎動(dòng)物的培養(yǎng))，Plenum出版社，紐約，pp.29-60)的125ml錐形瓶中。在接種七天后，將錐形瓶?jī)?nèi)含物轉(zhuǎn)入含300ml f/2培養(yǎng)基的500ml錐形瓶容器中。五天后，將500ml錐形瓶?jī)?nèi)含物轉(zhuǎn)入20升的培養(yǎng)瓶。在125和500ml錐形瓶的培養(yǎng)期間，培養(yǎng)物中不加入特殊的額外元素或營(yíng)養(yǎng)物。
將8ml f/2培養(yǎng)基與18升水加入20升的培養(yǎng)瓶中。兩天后，加入4ml硅酸鹽和，在另外的3天后，將20升培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)入7英尺高、170升的培養(yǎng)管中。然后將62ml f/2培養(yǎng)基和31ml硅酸鹽加入此后用水充滿的培養(yǎng)管中。根據(jù)生長(zhǎng)的種類，每隔一天加入含或不含硅酸鹽的營(yíng)養(yǎng)物。在20升和170升的培養(yǎng)瓶或管中，以0.2至0.3L/min的速率加入過濾空氣和CO2。
在170升管中培育6-7天后，藻類培養(yǎng)物進(jìn)入其指數(shù)生長(zhǎng)期的末期，這樣達(dá)到最大濃度。為了調(diào)節(jié)/改變?cè)孱惖拇x，只有在指數(shù)生長(zhǎng)期的末期才通過缺乏其營(yíng)養(yǎng)來脅迫藻類。對(duì)脅迫產(chǎn)生反應(yīng)的藻類，停止分裂并開始貯存主要是PUFAs的脂質(zhì)。合適的天然營(yíng)養(yǎng)物或施加于藻類的環(huán)境脅迫取決于所培養(yǎng)的種類。對(duì)于某些種類，當(dāng)其與未缺乏營(yíng)養(yǎng)的同一藻類培養(yǎng)比較時(shí)，PUFAs的濃度幾乎是其兩倍。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了施加于藻類培養(yǎng)中脅迫，其引起藻類停止生長(zhǎng)并開始貯存主要是PUFAs的脂質(zhì)。施加于藻類培養(yǎng)的多種脅迫類型，例如在細(xì)胞培養(yǎng)中缺乏營(yíng)養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)脅迫，或調(diào)節(jié)pH和/或光照條件的環(huán)境脅迫，以至于引起藻類停止生長(zhǎng)/分裂。優(yōu)選地，一旦藻類完成指數(shù)生長(zhǎng)期，便對(duì)藻類施加脅迫，此時(shí)培養(yǎng)的藻類濃度為最佳。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解為了獲得盡量多的脂質(zhì)，理想的是有最大濃度的藻類輪流生產(chǎn)最大濃度的脂質(zhì)。然而，在本發(fā)明中，表明營(yíng)養(yǎng)缺乏或其他方面脅迫藻類培養(yǎng)的會(huì)引起藻類停止生長(zhǎng)/分裂和開始貯存脂質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，已檢驗(yàn)了多種藻類并表明本發(fā)明的方法的確有效，并可獲得富集脂質(zhì)的藻類培養(yǎng)物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解多種藻類在代謝過程中具有相同的變化，即停止(arrest)細(xì)胞分裂，以及提供相同重要的在PUFAs方面的增殖。
本發(fā)明通過以下涉及的用于舉例說明本發(fā)明而不是限制其范圍的實(shí)施例更容易地得到理解。
實(shí)施例1以大于107細(xì)胞/ml的濃度在170升的半連續(xù)系統(tǒng)中培養(yǎng)硅藻Chaetoceros gracilis。在一些培養(yǎng)管中補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)物，而在其他培養(yǎng)管中缺乏硅酸鹽。下文表2所示的結(jié)果表明脂肪酸按照所處理的分布。
表2不同培養(yǎng)條件所獲得的多種脂肪酸的濃度
在脅迫(缺乏硅酸鹽)開始7天后對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行分析。
實(shí)施例2在170升的半連續(xù)系統(tǒng)中培養(yǎng)硅藻Skeletonema costatum。在一些培養(yǎng)管中缺乏硅酸鹽，而在其他培養(yǎng)管中維持完全營(yíng)養(yǎng)。下文表3所示的結(jié)果表明脂肪酸按照所施加脅迫的分布。
表3相應(yīng)缺乏硅的情況下多種脂肪酸的分布有硅酸鹽 無硅酸鹽％ ％205n3 16. 37.6226n3 5.5 7.54PUFA總量41.0 59.9n3總量 24.6 42.0這里再次，在缺乏硅酸鹽開始7天后對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行分析。
在此給出的上述實(shí)施例用于說明但不限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，在此其表明，在脅迫藻類培養(yǎng)并引起其分裂停止和生長(zhǎng)降低的基礎(chǔ)上，可增加脂肪和尤其是PUFAs和ω-3的產(chǎn)量。
對(duì)本發(fā)明以及其具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，應(yīng)當(dāng)理解其能進(jìn)一步進(jìn)行修改，并且本申請(qǐng)包括所有的變化，用途或本發(fā)明下述的修改，總的來說，根據(jù)本發(fā)明的原理，以及包括在本領(lǐng)域已知的或常規(guī)技術(shù)對(duì)本說明書所作的這種改變都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且如上文所述的可適用于必要特征的內(nèi)容，歸入所附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.從藻類中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，其包括下述步驟在藻類培養(yǎng)中至少應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子，引起所述藻類培養(yǎng)的生長(zhǎng)停止和通過培養(yǎng)中的藻類產(chǎn)生和貯存多不飽和脂肪酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生長(zhǎng)限制因子是硅酸鹽缺乏。
3.權(quán)利要求1的方法，其中生長(zhǎng)限制因子是營(yíng)養(yǎng)物缺乏。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中應(yīng)用一種以上的生長(zhǎng)限制因子。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中藻類是diatomaceous Chaetocerosgracilis。
6.權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中藻類是diatomaceous Skeleonemacostatum。
7.權(quán)利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中在指數(shù)生長(zhǎng)期的末期應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子。
8.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中一旦藻類培養(yǎng)達(dá)到至少107細(xì)胞/ml的濃度時(shí)應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及從藻類中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的新方法。方法包括至少在藻類培養(yǎng)中應(yīng)用生長(zhǎng)限制因子、引起所述藻類培養(yǎng)物生長(zhǎng)停止和多不飽和脂肪酸通過在培養(yǎng)的藻類中產(chǎn)生和貯存的步驟。
文檔編號(hào)C11C1/00GK1681934SQ03821618
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者雷瓊·特倫布萊, 法布里斯·佩尼特, 埃德溫·布格特 申請(qǐng)人:舍布魯克大學(xué), 拉瓦爾大學(xué), 里瓦爾S.E.C.公司