專利名稱：美白劑、皮膚外用劑和化妝品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以camu camu(一種秘魯水果)種子的提取物作為有效成分的美白劑，使用該提取物的皮膚外用劑和化妝品。
背景技術(shù)：
近年來，在化妝品產(chǎn)業(yè)界或食品產(chǎn)業(yè)界，來源于動物的原料對人體的影響越來越大，對其限制也不斷增加，人們對來源于植物的原料的關(guān)心日漸增強(qiáng)。另外，因從機(jī)體外攝取、在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧等的氧化反應(yīng)引起促進(jìn)老化作用、紫外線引起皮膚著色、致癌作用等問題也日益深刻。
例如，化妝品或食品的制造、加工或儲藏、保存過程中，各種材料中所含的油脂類通過空氣中的氧而被氧化或過氧化，該問題越來越嚴(yán)重。尤其是已知油脂中含有的亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸容易因為空氣中的氧而過氧化，生成過氧化脂質(zhì)或自由基，并生成致癌物質(zhì)。發(fā)生這樣的氧化或過氧化，則產(chǎn)品發(fā)生著色、變色、變性、產(chǎn)生異味或營養(yǎng)價、有效性降低等質(zhì)變。并且變性逐步發(fā)展，還會產(chǎn)生有毒物質(zhì)等，導(dǎo)致產(chǎn)品的品質(zhì)劣化。
因此，為了抑制上述不飽和脂肪酸的氧化和過氧化，防止品質(zhì)劣化，以往采用了各種抗氧化劑?？寡趸瘎┳饔糜谘趸瘯r產(chǎn)生的過氧化自由基，使氧化連鎖反應(yīng)終止，或者與自由基作用，使氧化反應(yīng)終止。通常這樣的抗氧化劑例如采用丁基羥基茴香醚(BHA)或丁基羥基甲苯(BHT)等合成抗氧化劑。但是近年來，隨著合成抗氧化劑使用的增加，其對人體的影響和安全性成為人們關(guān)注的問題，消費者的抗拒反應(yīng)逐漸強(qiáng)烈。并且，這些合成抗氧化劑是油溶性的，難以應(yīng)用在水溶液中。
另一方面，作為來自安全性高的天然物質(zhì)的抗氧化劑例如已知有天然維生素E(α-生育酚)、維生素C等。但是，這些來自天然物質(zhì)的抗氧化劑具有極端脂溶性或水溶性這樣的兩個極端的性質(zhì)，因此，其應(yīng)用受到限制。另外，也具有其活性不能長時間穩(wěn)定持續(xù)等缺點。
因此，人們需求抗氧化活性強(qiáng)、在水中的溶解性優(yōu)異、且抗氧化活性長時間穩(wěn)定的來自天然物質(zhì)的抗氧化劑。
皮膚的著色或斑點等色素沉淀的原因有肌體內(nèi)的代謝障礙等內(nèi)因要素和紫外線等引起的外因要素。一般常見的是由于后者的外因要素引起的，通過紫外線，黑素細(xì)胞受到刺激，黑素細(xì)胞活化，從而酪氨酸酶起作用，使皮膚產(chǎn)生色素沉著。已知通過抑制該黑素細(xì)胞的活性，抑制酪氨酸酶和黑色素的生成，可以防治皮膚的著色或斑點等色素沉著。因此在化妝品業(yè)界，具有美白作用的物質(zhì)的開發(fā)一直都受到重視，一直都致力于開發(fā)各種美白劑。并且，由于近年臭氧層的破壞等，紫外線的量正在增加，與此相伴，消費者對預(yù)防紫外線的要求進(jìn)一步提高，強(qiáng)烈需求安全、有效的美白劑。
還已知起到保持皮膚水分、使皮膚具有柔軟性、彈性的物質(zhì)是膠原或透明質(zhì)酸等。膠原在皮膚中占真皮的90％，分布于整個真皮組織中，使皮膚保持適度的彈性和強(qiáng)度。透明質(zhì)酸廣泛分布于皮膚、關(guān)節(jié)液、玻璃體、韌帶等機(jī)體中，在皮膚中擔(dān)負(fù)著細(xì)胞連接、細(xì)胞保護(hù)、皮膚組織的形成、組織的水分保持、柔軟性的保持等功能。已知生物體內(nèi)分解膠原的酶是膠原酶，分解透明質(zhì)酸的酶是透明質(zhì)酸酶，通過它們，膠原、透明質(zhì)酸被分解，其量減少，皮膚就會失去潤澤、張力，發(fā)生皮膚的老化現(xiàn)象-皺紋或松弛。
因此，有人提出了在皮膚外用劑或各種化妝品中混合抑制上述酶活性的物質(zhì)等，期待具有防止皮膚老化或防止皺紋等作用，開發(fā)出各種膠原酶活性抑制劑或透明質(zhì)酸酶活性抑制劑。
其中，camu camu的果實與西印度櫻桃的果實同樣，作為含有豐富的維生素C的植物，近年來廣為人所知。camu camu的果實在南美已作為化妝品或食品在市場上銷售，近年來，日本也有作為食品原材料的進(jìn)口、銷售。另外由于上述camu camu的果實較多含有的成分是維生素C，因此人們發(fā)現(xiàn)了其提取物在抗氧化劑、保濕劑、美白劑方面的用途(例如，日本特開平9-221429號公報、日本特開平11-246636號公報、日本特開2000-327549號公報、日本特開2000-327550號公報、日本特開2001-31558號公報)。
但是，camu camu的果實中，能夠用作化妝品或食品的只是較多含有維生素C的果肉，其種子只含有極微量的維生素C，因此尚未發(fā)現(xiàn)其有效利用途徑，目前大都被扔棄不用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種美白劑，該美白劑可以有效利用以往做廢棄處理的camu camu種子，安全性優(yōu)異，可用于皮膚外用劑或化妝品等，具有美白作用；本發(fā)明還提供混合有該美白劑的皮膚外用劑和化妝品。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種皮膚外用劑和化妝品，所述皮膚外用劑和化妝品有望具有穩(wěn)定的抗氧化作用、膠原酶活性抑制作用或透明質(zhì)酸酶活性抑制作用，安全性優(yōu)異，有望具有防止皮膚老化、防止皺紋的作用。
本發(fā)明人為了解決上述課題，首先對以往壓榨果汁后扔棄的camucamu種子的有用性進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由camu camu種子得到的提取物可用于皮膚外用劑、化妝品等用途，具有強(qiáng)效抗氧化作用、美白作用、膠原酶活性抑制作用和透明質(zhì)酸酶活性抑制作用，還具有抗老化作用，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供含有camu camu種子提取物作為有效成分的美白劑。
本發(fā)明還提供含有上述美白劑的皮膚外用劑或化妝品。
附圖簡述

圖1是表示參考例1中進(jìn)行的DPPH自由基清除能力測試結(jié)果的圖譜。
圖2是表示參考例2-4中進(jìn)行的DPPH自由基清除能力測試結(jié)果的圖譜。
圖3是表示參考例5中進(jìn)行的亞油酸自氧化抑制能力測試結(jié)果的圖譜。
圖4是表示參考例5中進(jìn)行的亞油酸自氧化抑制能力測試中各樣品在第7天的氧化率的圖譜。
圖5是表示實施例1中進(jìn)行的黑色素生成抑制試驗的結(jié)果的圖譜。
圖6是表示實施例1中進(jìn)行的測定各種培養(yǎng)基的總蛋白重量的結(jié)果的圖譜。
圖7是表示參考例6中進(jìn)行的膠原酶活性抑制作用試驗結(jié)果的圖譜。
圖8是表示參考例7中進(jìn)行的透明質(zhì)酸酶活性抑制作用試驗結(jié)果的圖譜。
實施發(fā)明的最佳方式以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的美白劑含有camu camu種子提取物作為有效成分，該提取物也可作為抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑的有效成分。作為該提取物原料使用的camu camu種子是桃金娘科(Myrtaceae)擬香桃木屬(Myrciaria)果樹camu camu(學(xué)名Myrciaria dubia)的種子。
上述camu camu生長于中南美熱帶雨林地區(qū)河流附近的濕地，是高2-3米、結(jié)直徑2-3厘米紅色果實的灌木。camu camu的果實含有豐富的維生素C，但camu camu種子卻實質(zhì)不含維生素C，幾乎未見其用途，以往均作廢棄處理。
由實驗結(jié)果可知camu camu果實的提取物中，維生素C含量通常為1789mg/100g(還原型維生素C1485mg/100g+氧化型維生素C295mg/100g)，而camu camu種子提取物中，維生素C含量通常僅為1mg/100g(還原型維生素C0mg/100g+氧化型維生素C1mg/100g)。
本發(fā)明的美白劑以及抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑和抗老化劑中作為有效成分含有的camu camu種子提取物只要是用提取溶劑提取camu camu種子得到的物質(zhì)即可，對此并沒有特別限定，可以是提取液，也可以是將提取液進(jìn)行濃縮、干燥等而得到的提取固態(tài)物質(zhì)。提取可以是一次的提取操作，也可以根據(jù)需要用其它溶劑進(jìn)行多次提取操作。
優(yōu)選提取上述camu camu種子提取物，使其含有沒食子酸及其鹽。
上述提取溶劑例如有水、有機(jī)溶劑，該有機(jī)溶劑可以是任意的親水性有機(jī)溶劑、疏水性有機(jī)溶劑。親水性有機(jī)溶劑例如有甲醇、乙醇、甘油、丙二醇、1，3-丁二醇等醇；丙酮、四氫呋喃、乙腈、1，4-二噁烷、吡啶、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸等公知的有機(jī)溶劑。疏水性有機(jī)溶劑例如有己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二乙醚、乙酸乙酯、苯、甲苯等公知的有機(jī)溶劑。這些有機(jī)溶劑在使用時可以使用1種，或?qū)?種以上組合使用。其中，優(yōu)選水和/或親水性有機(jī)溶劑，特別是甲醇、乙醇、1，3-丁二醇，水或它們的混合物或組合。
對于提取條件并沒有特別的限定，例如溫度5-95℃、優(yōu)選10-90℃、進(jìn)一步優(yōu)選15-85℃，在常溫下也可提取。溫度越高，則提取效率有增高趨勢。提取時間為數(shù)小時至數(shù)天，提取所使用的溶劑量相對于原料，按重量比通常為1-50倍量，優(yōu)選5-25倍量。
對于提取操作沒有特別限定，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行。為了提高提取效率，可以進(jìn)行振蕩提取，使用具備攪拌機(jī)等的提取機(jī)進(jìn)行提取。例如，將camu camu種子浸漬于提取溶劑中，或不浸漬，而是與提取溶劑一起攪拌、振蕩，進(jìn)行提取處理，通過過濾、離心分離或潷析等將處理液分離為提取液和提取殘余物，由此進(jìn)行提取處理，提取殘余物可進(jìn)一步進(jìn)行同樣的提取處理。所得提取液可直接使用，也可以根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行濃縮處理和/或分級、提純處理。
對于上述濃縮處理并沒有特別限定，例如有除去溶劑；利用與水和/或有機(jī)溶劑的溶解性進(jìn)行的可溶解組分的回收處理；不溶解組分的回收處理；通過水-疏水性有機(jī)溶劑進(jìn)行的液液分配處理；重結(jié)晶處理；再沉淀處理；回收因冷卻而產(chǎn)生的析出物的處理等，或者將選自上述處理的2種以上的處理組合的方法等。
對于上述分級、提純處理并沒有特別限定，例如通過正相和/或反相色譜進(jìn)行的處理等。
優(yōu)選作為本發(fā)明美白劑以及抗氧化劑的有效成分的camu camu種子提取物含有沒食子酸和/或其鹽。另外，使用camu camu種子提取物作為膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑的有效成分時，該提取物也可以含有沒食子酸和/或其鹽。
本發(fā)明的美白劑以及抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑和透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑中，有效成分camu camu種子提取物的用量可根據(jù)使用形式等適當(dāng)選擇。
本發(fā)明的皮膚外用劑和化妝品含有上述本發(fā)明的美白劑。本發(fā)明還可提供含有上述美白劑、抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑、抗老化劑中的至少一種的皮膚外用劑和化妝品。
對于上述化妝品的種類沒有特別限定，例如有化妝水、乳液、霜膏、面膜、洗凈劑等皮膚護(hù)理化妝品；口紅、粉底等彩妝化妝品；發(fā)用化妝品等，對其劑型沒有特別限定，可以是任意的。另外，皮膚外用劑有軟膏、各種皮膚用藥等。
本發(fā)明的皮膚外用劑和化妝品中，本發(fā)明的美白劑、抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑的混合比例可根據(jù)其種類和混合的其它成分的種類或量、形態(tài)等適當(dāng)選擇，通常，相對于皮膚外用劑或化妝品總量，換算為camu camu種子提取物的干燥物，為0.001-20％重量，優(yōu)選0.01-10％重量。
在不損害本發(fā)明所希望的效果的范圍內(nèi)，本發(fā)明的皮膚外用劑或化妝品中可以混合通常作為化妝品原料使用的各種其它成分。其它成分例如有水、油劑、表面活性劑、潤滑劑、醇類、水溶性高分子劑、凝膠化劑、保濕劑、緩沖劑、防腐劑、抗炎劑、增稠劑、香料、維生素類、本發(fā)明的美白劑、抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑以外的美白劑、抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑或抗老化劑等。使用時，可以根據(jù)皮膚外用劑、化妝品的種類或其它目的、以及其形態(tài)等從其中適當(dāng)選擇進(jìn)行混合。
本發(fā)明還可提供混合有以上述camu camu種子提取物作為有效成分的抗氧化劑，從而具有抗氧化作用的食品。該食品只要含有上述抗氧化劑即可。對食品的種類并沒有特別限定，例如可以是糖、飲料、果醬、口香糖等。對其劑型并沒有特別限制，可以是任意的。
上述食品中，上述抗氧化劑的混合比例可根據(jù)食品種類和該食品中混合的其它成分的種類或量適當(dāng)選擇，通常，相對于食品總量，換算為camu camu種子提取物的干燥物，為0.001-10％重量，優(yōu)選0.01-8％重量。
在不損害本發(fā)明所希望的效果的范圍內(nèi)，上述食品中可以混合通常作為食品原料使用的各種其它成分。其它成分例如有水、醇類、甜味劑、酸味劑、著色劑、防腐劑、香料、賦型劑等。使用時，可以根據(jù)食品的種類或其它目的以及其形態(tài)等，從其中適當(dāng)選擇進(jìn)行混合。
本發(fā)明的美白劑以及抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質(zhì)酸酶活性抑制劑和抗老化劑是以camu camu種子提取物為有效成分，顯示強(qiáng)力的抗氧化活性、黑色素形成抑制作用、膠原酶活性抑制作用、透明質(zhì)酸酶活性抑制作用和抗老化作用，同時安全性優(yōu)異。因此，有望具有美白效果、抗老化作用，可用于皮膚外用劑、化妝品，另外有望具有源自活性氧的食品品質(zhì)保持或防止氧化的作用，可用于食品中。除此之外還可以將以往作為工業(yè)廢棄物的camu camu種子有效利用。
實施例以下通過參考例、實施例和配方例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些。
參考例1在粉碎后的camu camu種子中加入甲醇，在25℃攪拌過夜進(jìn)行提取。在5℃、4000rpm下離心分離45分鐘，粗濾后用0.22μm濾器過濾。將所得camu camu種子的甲醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，蒸發(fā)干燥固化，將干燥固化物用純凈水溶解。向其中加入正己烷，振蕩5分鐘，靜置，如此反復(fù)進(jìn)行，分為正己烷和水溶性組分，直至正己烷組分無著色。向所得水溶性組分中加入乙酸乙酯，按照加入正己烷時同樣的方法進(jìn)行分級，分為乙酸乙酯組分和水溶性組分。將乙酸乙酯組分通過減壓蒸餾進(jìn)行濃縮，將其通過硅膠柱進(jìn)行分級。用濃度比例調(diào)節(jié)為11級(10∶0-0∶10)的氯仿/甲醇混合液進(jìn)行洗脫。收集用濃度比例為5∶5-0∶10的氯仿/甲醇混合液洗脫的組分，通過減壓蒸餾進(jìn)行蒸發(fā)干燥固化，將干燥固化物用純凈水溶解。
接著，將該水溶解物通過C18柱純化。純化如下進(jìn)行將由上述方法得到的水溶解物加入到C18柱中，再用純凈水洗滌柱，使所得的未吸附組分進(jìn)行蒸發(fā)干燥固化。關(guān)于未吸附組分可得到兩種形式的組分，開始得到著色的組分，接著得到透明的組分。分別通過減壓蒸餾進(jìn)行蒸發(fā)干燥固化，得到易溶于水的樣品(A)和難溶于水的樣品(B)。
LCMS分析采用LCT質(zhì)譜分析儀(micromass公司制造)、通過離子化法(EST)進(jìn)行測定。NMR分析使用UNITY plus 500型(Varian公司制造)，觀測頻率設(shè)為1H:500.2MHz、13C:125.8MHz，樣品(A)的溶劑采用D2O，樣品(B)的溶劑采用CD3OD。
樣品(A)的LCMS分析結(jié)果表明在m/z169觀測到可能是去質(zhì)子化分子((M-H)-)的離子，推測分子量為170。另外NMR分析的結(jié)果表明1H-NMR譜中，在7.062ppm處觀測到單峰、在3.5-3.9ppm處觀測到多種峰；13C-NMR譜中，在110-146ppm處觀測到四種雙鍵碳、在175.8ppm處觀測到羰基碳。將其與沒食子酸(Gallic acid)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜進(jìn)行比較，結(jié)果分子量一致，但COOH和COOH結(jié)合的碳的化學(xué)位移不同，由此鑒定該物質(zhì)為沒食子酸鹽。
另一方面，對樣品(B)的LCMS分析結(jié)果表明在m/z169觀測到可能是去質(zhì)子化分子((M-H)-)的離子，推測分子量為170。另外NMR分析的結(jié)果表明1H-NMR譜中，在7.060ppm處觀測到單峰；13C-NMR譜中觀測到五種峰。將其與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的譜進(jìn)行比較，結(jié)果化學(xué)位移一致，分子量也一致，由此鑒定該物質(zhì)為沒食子酸。
按照以下方法測定所得提取物(B)的抗氧化活性。
<DPPH自由基清除能力測試>
在試管中加入400μl提取物(B)、1200μl 99.5％乙醇、1600μl 0.25M乙酸緩沖液(pH5.5)，在30℃預(yù)溫育5分鐘。在該試管中加入800μl500μM DPPH溶液，使其在30℃反應(yīng)30分鐘，30分鐘后以蒸餾水為對照準(zhǔn)確測定517nm的吸光度。由測定值計算DPPH自由基清除率，求出50％自由基清除能力(IC50)。另外對已知的抗氧化成分α-生育酚也同樣進(jìn)行DPPH自由基清除能力測定。結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知由蒸發(fā)殘余物換算，camu camu種子提取物的50％DPPH自由基清除能力(以下稱為IC50)為IC50＝0.06mg/g，與已知的抗氧化成分α-生育酚的IC50＝0.13mg/g比較，具有高的DPPH自由基清除能力。
參考例2將1kg camu camu種子破碎，加入4kg水，在室溫下攪拌提取一夜以上。攪拌提取后進(jìn)行離心分離，分離為上清液和粗殘余物，去除殘余物，只收集上清液。為了進(jìn)一步澄清，進(jìn)行分階段的濾器過濾，去除細(xì)的殘余物。通過以上順序，得到約4kg(固態(tài)部分為1％)的澄清的水溶性camu camu種子提取物。以該提取物作為提取物(C)。
與參考例1同樣，對所得提取物(C)進(jìn)行DPPH自由基清除能力測試。另外對已知的抗氧化成分α-生育酚也同樣進(jìn)行DPPH自由基清除能力測定。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知提取物(C)的IC50為0.10mg/g。α-生育酚的IC50為0.13mg/g。
參考例3將1kg camu camu種子破碎，加入1.17kg水和0.5kg 1，3-丁二醇的混合溶劑，在室溫下攪拌提取一夜以上。攪拌提取后進(jìn)行離心分離，分離為上清液和粗殘余物，去除殘余物，只收集上清液。為了進(jìn)一步澄清，進(jìn)行分階段的濾器過濾，去除細(xì)的殘余物。通過以上順序，得到約1.3kg(固態(tài)部分為3％)由30％的1，3-丁二醇提取的澄清的camu camu種子提取物。以該提取物作為提取物(D)。
與參考例1同樣，對所得提取物(D)進(jìn)行DPPH自由基清除能力測試。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知提取物(D)的IC50為0.07mg/g。
參考例4將200g camu camu種子破碎，加入2kg乙醇，在室溫下攪拌提取一夜以上。攪拌提取后用濾器進(jìn)行粗濾，去除殘余物，只收集上清液。接著進(jìn)行減壓蒸餾，去除乙醇。向蒸發(fā)干燥固后所得物質(zhì)中加入500g水進(jìn)行溶解，為了澄清，進(jìn)行分階段的濾器過濾。通過以上順序，得到約500g(固態(tài)部分為2.5％)由乙醇提取的水溶性的澄清的camu camu種子提取物。以該提取物作為提取物(E)。
與參考例1同樣，對所得提取物(E)進(jìn)行DPPH自由基清除能力測試。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知提取物(E)的IC50為0.10mg/g。
參考例5使用參考例3中制備的提取物(D)，進(jìn)行以下所示的亞油酸自氧化抑制能力測試。
<亞油酸自氧化抑制能力測試>
將2ml含有2.5％(w/v)亞油酸的乙醇和4ml 0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)混合，制成反應(yīng)液。接著，用2ml 99.5％乙醇和2ml蒸餾水進(jìn)行稀釋調(diào)節(jié)，使其含有任意量的提取物(D)。將調(diào)節(jié)后的稀釋物添加到上述反應(yīng)液中，使總量為10ml，混合后，裝入褐色螺口瓶，以此作為樣品。
另外使用不添加任何被測物，只在反應(yīng)液中添加2ml 99.5％乙醇和2ml蒸餾水的樣品作為陰性對照。使用α-生育酚和BHA，按照同樣的操作方法制備成與提取物(D)同濃度的樣品，以此作為陽性對照。為了進(jìn)一步驗證提取物(D)的抗氧化作用不僅僅是由上述camucamu種子提取物中所含的沒食子酸引起的，還使用了按照與提取物(D)同樣的操作方法將沒食子酸制成以下所示濃度的樣品。
沒食子酸的濃度采用提取物(D)中可能含有的最大量進(jìn)行。即，通過Folin-Denis法測定提取物(D)中的多酚含量。得到了相對于提取物(D)，多酚所占比例約為20％的結(jié)果。沒食子酸是多酚的一種，因此，例如假設(shè)提取物(D)中的多酚全部都為沒食子酸，則其在提取物(D)中所占的最大值為約20％，可以說含有該濃度以上的沒食子酸的可能性非常小。因此推定提取物(D)中所含的沒食子酸的濃度為20％。
將制備的各樣品置于暗處，在40℃保存，以此作為樣品，將在4℃暗處保存的作為背景，隔一段時間取出被檢物，測定7天。
測定方法如下將0.1ml樣品、9.7ml 75％乙醇和0.1ml 30％硫氰酸銨溶液混合，加入0.1ml 2×10-2M的氯化亞鐵(3.5％鹽酸溶液)，3分鐘后準(zhǔn)確測定500nm的吸光度。由測定值求出吸光度差和第7天的自氧化率。對于背景也同樣測定，Δ吸光度＝(樣品的吸光度)-(背景的吸光度)。結(jié)果如圖3所示。
樣品開始氧化，則吸光度上升，達(dá)到最高點后，隨著要被氧化的樣品的減少，吸光度減小。因此，吸光度的峰越早開始，則可以判斷抗氧化活性越弱。
用所測定的氧化率對各樣品的抗氧化活性進(jìn)行比較。氧化率是以從試驗開始經(jīng)過7天時的對照的氧化(Δ吸光度)為100％，通過以下的式子求出。結(jié)果如圖4所示。
亞油酸自氧化率(％)＝([樣品的Δ吸光度]/[對照的Δ吸光度])×100圖4中，數(shù)值越高則可判斷抗氧化活性越低，因此可以得出結(jié)論提取物(D)具有非常高的抗氧化活性。
實施例1使用參考例3中制備的提取物(D)，使用來自小鼠的B16黑素瘤細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞水平的美白效果確認(rèn)試驗。該試驗方法通過使用動物細(xì)胞，可以確認(rèn)在更接近生物體內(nèi)的環(huán)境下對于黑色素生成抑制作用和細(xì)胞增殖的影響。
在培養(yǎng)皿中以1×105細(xì)胞/皿接種來自小鼠的B16黑素瘤細(xì)胞，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)2天。除去培養(yǎng)液后，分別加入10ml/皿的各試驗培養(yǎng)基(空白培養(yǎng)基(10％FBS/DME)、以已知的美白成分作為比較對照的曲酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基、camu camu種子提取物的提取物(D)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基)，再在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)3天。除去培養(yǎng)液后，用胰蛋白酶溶液剝離細(xì)胞進(jìn)行離心分離，懸浮于PBS，然后再次進(jìn)行離心分離。在除去了上清液的細(xì)胞沉淀片中加入氫氧化鈉溶液，進(jìn)行加熱處理，使黑色素溶解，再過濾除去來自細(xì)胞的纖維狀物質(zhì)。用吸光度儀測定溶解的黑色素和使用BIO-RAD公司制造的DC-蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白量的測定。
使用空白培養(yǎng)基作為對照，以該黑色素生成抑制率為0％時，各樣品的黑色素生成抑制率通過下式計算。結(jié)果如圖5所示。
黑色素生成抑制率(％)＝100-([1mg樣品的總蛋白中黑素量的平均值]÷[1mg對照的總蛋白中黑素量的平均值])×100圖5中，黑色素生成抑制率數(shù)值越高，則可以說美白活性越高，因此可判斷作為camu camu種子提取物的提取物(D)具有非常高的美白活性。
另外，總蛋白量與細(xì)胞數(shù)成比例，因此，測定各試驗培養(yǎng)基的總蛋白重量，進(jìn)行了對細(xì)胞增殖的影響的確認(rèn)。結(jié)果如圖6所示。
由圖6可知未見各樣品對細(xì)胞增殖的影響有任何問題。并且顯微鏡觀察下也未見問題。
實施例2按照1997年3月26日日本厚生省令第21號“關(guān)于藥品安全性的非臨床試驗實施基準(zhǔn)的省令(部頒標(biāo)準(zhǔn))”進(jìn)行參考例3中制備的camu camu種子提取物(D)的安全性試驗。結(jié)果如表1所示。
使用大鼠的單次經(jīng)口給予毒性試驗2組大鼠(對照組、給予組)，雌雄各5只/組，進(jìn)行試驗，給予組按照2g/kg體重給予。
使用豚鼠的皮膚單次刺激性試驗在3只豚鼠的健康皮膚上進(jìn)行24小時密封貼用，在給予后24小時、48小時和72小時，分別觀察皮膚的狀態(tài)進(jìn)行判定。
使用豚鼠的14天皮膚累積刺激性試驗在3只豚鼠的健康皮膚上，在開放體系下，每天涂布一次，連續(xù)14天，在試驗期間，每天在涂布前和涂布后24小時分別觀察皮膚的狀態(tài)進(jìn)行判定。
使用豚鼠的皮膚致敏性試驗3組豚鼠(對照組、涂布組、DNCB組)，5只/組，按照佐劑和膚斑試驗法(Adjuvant and Patch Test)進(jìn)行試驗，涂布后24小時和48小時，分別觀察皮膚的狀態(tài)進(jìn)行判定。
使用豚鼠的皮膚光毒性試驗按照森川藤凰等人的方法，在10只豚鼠的背部皮膚上進(jìn)行試驗，紫外線照射后24小時、48小時和72小時，分別觀察皮膚的狀態(tài)進(jìn)行判定。
使用豚鼠的皮膚光致敏性試驗3組豚鼠(對照組、涂布組、TCSA組)，5只/組，按照Adjuvant andStrip法進(jìn)行試驗，紫外線照射后24小時和48小時，分別觀察皮膚的狀態(tài)進(jìn)行判定。
使用兔的眼粘膜刺激性試驗以2組兔(非洗眼組、洗眼組)，3只/組進(jìn)行試驗。滴眼后，對非洗眼組不進(jìn)行處理，用微溫的生理鹽水對洗眼組清洗約1分鐘，然后在1小時、24小時、48小時和72小時后觀察角膜、虹膜和結(jié)膜的狀態(tài)，由AFNOR區(qū)分進(jìn)行判定。
使用細(xì)菌的回復(fù)突變試驗按照預(yù)溫育法，對未添加S9mix和添加S9mix的情況進(jìn)行測定。
·使用菌株鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA100、TA98、TA1535、TA1537·使用菌株大腸桿菌(Escherichia coli)WP2uvrA使用哺乳類的培養(yǎng)細(xì)胞的染色體異常試驗使用哺乳類的培養(yǎng)細(xì)胞(CHL/IU細(xì)胞)，采取短時間處理法(6小時處理未添加S9mix和添加S9mix)和連續(xù)處理組(處理24小時和48小時)對3組(陰性對照組、受檢物質(zhì)組、陽性對照組)進(jìn)行研究。
表1

參考例6使用參考例2制備的提取物(C)、參考例3制備的提取物(D)和參考例4制備的提取物(E)，以及比較對照沒食子酸一水合物，按照以下方法測定膠原酶活性抑制作用。
<膠原酶活性抑制作用試驗> 底物溶液將0.39mg Pz-肽(BACHEM公司制造)溶解于1ml0.1M Tris鹽酸緩沖液(pH7.1、含20mM氯化鈣)中使用(相當(dāng)于0.5mM)。
酶溶液將5mg膠原酶(IV型、SIGMA公司制造)溶解于1ml蒸餾水，分別取100μl，在-20℃下保管，使用時用蒸餾水稀釋為50倍，用于反應(yīng)。
提取物(C)、提取物(D)和提取物(E)都是溶液，分別用提取溶劑(蒸餾水、30％重量1，3-丁二醇)進(jìn)行稀釋，使camu camu種子提取物按照干燥固態(tài)物質(zhì)計算的濃度為100μg/ml，制成樣品。在50μl該樣品中混合50μl酶溶液和400μl底物溶液，在37℃反應(yīng)30分鐘。接著，用1ml 25mM檸檬酸溶液使反應(yīng)終止，用5ml乙酸乙酯提取。離心分離(3000rpm、10分鐘)后，取乙酸乙酯層。以乙酸乙酯作為對照，測定波長320nm下的吸光度。
使用各提取溶劑代替樣品，以此作為對照，另外使用蒸餾水代替酶溶液，以此作為空白，進(jìn)行同樣的操作。
此時，為了證實camu camu種子提取物的膠原酶活性抑制作用并不僅僅是由camu camu種子提取物中所含的沒食子酸引起的，將沒食子酸一水合物用蒸餾水進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)，使其達(dá)到與各提取物一樣的100μg/ml的濃度，制成樣品。
通過下式，從這些值計算膠原酶活性抑制率。結(jié)果如圖7所示。
膠原酶活性抑制率(％)＝[1-(樣品的吸光度-樣品空白的吸光度)÷(對照的吸光度-對照空白的吸光度)]×100參考例7使用沒食子酸一水合物作為比較對照，按照以下方法對參考例3中制備的提取物(D)的透明質(zhì)酸酶活性抑制作用進(jìn)行測定。透明質(zhì)酸酶活性抑制的測定通過應(yīng)用了Morgan-Elson法的前田有美惠等人的方法(食衛(wèi)志、31卷、233-237、1990年)進(jìn)行。
<透明質(zhì)酸酶活性抑制作用試驗> 酶溶液將牛睪丸透明質(zhì)酸酶(和光純藥工業(yè)(株))溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調(diào)節(jié)至最終酶活性為400單位/ml。
酶活化溶液將compound 48/80(SIGMA)溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調(diào)節(jié)至最終濃度為0.1mg/ml。
底物溶液將透明質(zhì)酸鉀(和光純藥工業(yè)(株))溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調(diào)節(jié)至最終濃度為0.4mg/ml。
硼酸溶液在4.95g硼酸中加入50ml水，用1N氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH＝9.1，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)為100ml。
對二甲基氨基苯甲醛(p-DAB)試劑在12.5ml 10N鹽酸和87.5ml乙酸的混合液中溶解10g p-DAB(和光純藥工業(yè)(株))，冷藏保存。臨使用前用乙酸稀釋10倍使用。
參考例3的提取物(D)是溶液，因此用作為提取溶劑的30％重量1，3-丁二醇水溶液稀釋，使camu camu種子提取物按照固態(tài)物質(zhì)計算的濃度為1mg/ml，以此為上限，進(jìn)一步用提取溶劑稀釋，進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)。制成樣品。向0.2ml該樣品中加入0.1ml酶溶液，在37℃加熱20分鐘。接著加入0.2ml酶活化溶液，在37℃加熱20分鐘，再加入0.5ml底物溶液，在37℃反應(yīng)40分鐘，然后加入0.2ml 0.4N的氫氧化鈉水溶液，同時冰冷卻，使反應(yīng)終止。加入0.2ml硼酸溶液，通過熱浴(TOYO SEISAKUSHO、型號TPB-32)加熱5分鐘，然后冰冷卻，加入6ml p-DAB試劑，在37℃加熱20分鐘，使其顯色，以蒸餾水作為對照，測定585nm下的吸光度。
使用提取溶劑代替樣品，此作為對照，另外加入0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)代替酶溶液，以此作為空白，進(jìn)行同樣的操作。
此時，為了證實提取物(D)的透明質(zhì)酸酶活性作用抑制并不僅僅是由camu camu種子提取物中所含的沒食子酸引起的，按照與處理提取物(D)同樣的方法，對沒食子酸一水合物進(jìn)行濃度調(diào)節(jié)。此時沒食子酸一水合物的濃度與實施例5同樣，推定為camu camu種子提取物的干燥固態(tài)物質(zhì)量的20％。
通過下式，從這些值計算透明質(zhì)酸酶活性抑制率。結(jié)果如圖8所示。
透明質(zhì)酸酶活性抑制率(％)＝[1-(樣品的吸光度-樣品空白的吸光度)÷(對照的吸光度-對照空白的吸光度)]×100由圖8可以判斷提取物(D)具有與濃度相關(guān)的抑制透明質(zhì)酸酶活性的能力。
配方例1將0.20重量份甘草酸二鉀、0.10重量份檸檬酸、0.30重量份檸檬酸鈉、5.00重量份參考例3中制備的提取物(D)和5.00重量份1，3-丁二醇混合，加入純凈水，使總量為80.0重量份，在50℃下一邊攪拌一邊溶解，制成含有提取物(D)的水溶液。
接著，將0.90重量份POE(60)山梨醇四油酸酯、0.10重量份失水山梨醇一油酸酯、適量的防腐劑和10.00重量份乙醇混合，在50℃下一邊攪拌一邊溶解。接著，將所得溶液一點點加入到最初制備的含提取物(D)的水溶液中，在50℃混合攪拌。均勻混合后進(jìn)一步攪拌，同時將液溫由50℃下降到30℃，在到達(dá)30℃時停止攪拌，加入適量的香料和純凈水，使總量為100.00重量份。再次混合攪拌，均勻混合，制成化妝水。
配方例2將10.00重量份角鯊烯和適量的防腐劑混合，加入純凈水，調(diào)節(jié)至總量為70.00重量份，加熱至80℃，制成溶液(1)。另外，將0.10重量份羧基乙烯基聚合物和0.20重量份黃原酸膠加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(2)。再將0.10重量份三乙醇胺和5.00重量份1，3-丁二醇加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(3)。又將2.00重量份透明質(zhì)酸鈉和5.00重量份參考例3中制備的提取物(D)加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(4)。
接著，向適量的純凈水中一點點加入溶液(1)，在80℃混合攪拌，并一邊攪拌一邊加入溶液(2)，接著加入溶液(3)。均勻混合后，一邊攪拌一邊將溶液降溫至50℃，在到達(dá)50℃時加入溶液(4)，再加入純凈水，將總量調(diào)節(jié)至100重量份。再次攪拌，直至溶液為30℃，在到達(dá)30℃時停止攪拌，制成均勻混合的乳液。
配方例3將2.00重量份POE(20)失水山梨醇一硬脂酸酯、0.50重量份POE失水山梨醇四油酸酯、0.50重量份一硬脂酸甘油酯、7.00重量份硬脂酸、3.00重量份鯨蠟醇、3.00重量份棕櫚酸鯨蠟醇酯、7.00重量份霍霍巴油、3.00重量份石蠟和適量的防腐劑混合，在80℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(1)。另一方面，將5.00重量份參考例3中制備的提取物(D)、7.00重量份1，3-丁二醇和62重量份純凈水混合，在80℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(2)。
接著，向溶液(2)中一點點加入溶液(1)，乳化，邊攪拌邊冷卻，降溫至40℃時停止攪拌，制成均勻混合的霜膏。
配方例4將54.00重量份粒狀糖溶解于適量的純凈水中，接著將該溶解物與41.70重量份液體糖漿混合，加熱并煮熟。接著，一邊均勻混合攪拌，一邊一點點加入1.00重量份檸檬酸和0.3重量份香料，邊攪拌邊冷卻至90℃，然后加入3.00重量份參考例2中制備的提取物(C)進(jìn)行攪拌。按照常規(guī)方法將所得均勻混合物成型，制成糖。
配方例5在65.00重量份草莓果實中一點點加入32.00重量份砂糖，一邊攪拌一邊加熱，煮熟。在糖濃度達(dá)到65％以上時停止加熱，加入2.50重量份參考例2中制備的提取物(C)、0.15重量份檸檬酸和適量的香料，均勻混合。趁熱時將所得濃縮液裝瓶并滅菌，迅速冷卻，制成果醬。
實施例3將0.1重量份檸檬酸鈉、1.0重量份吡咯烷酮羧酸鈉和3.5重量份1，3-丁二醇混合，加入純凈水，使總量為50.0重量份，在50℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(1)。接著將0.6重量份POE(30)POP(6)癸基十四烷基醚、10.0重量份乙醇和0.1重量份對羥基苯甲酸甲酯混合，在50℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(2)。
將溶液(1)一點點加入到溶液(2)中，同時在50℃混合攪拌，再一邊攪拌一邊將溫度降至30℃，到達(dá)30℃時，加入5.0重量份參考例3中制備的camu camu種子提取物(D)，混合。向其中加入純凈水，將總量調(diào)節(jié)至100重量份，均勻混合攪拌，制成5％重量配比的化妝水。
用同樣的方法，使1，3-丁二醇為4.7重量份、camu camu種子提取物(D)為1.0重量份，制成1％重量配比的化妝水。
用同樣的方法，使1，3-丁二醇為5.0重量份、不添加camu camu種子提取物(D)，制成空白化妝水。
對于所得化妝水制劑，用DPPH自由基清除能力測試，對混合有camu camu種子提取物的化妝水的抗氧化活性進(jìn)行評價。
<DPPH自由基清除能力測試>
(試驗方法)以空白化妝水作為對照，以參考例1為基準(zhǔn)，對混合有1％重量和5％重量上述制備的camu camu種子提取物(D)的化妝水制劑的抗氧化活性進(jìn)行測定，由其測定值計算DPPH自由基清除率。
(試驗結(jié)果)關(guān)于混合有camu camu種子提取物(D)的化妝水制劑的DPPH自由基清除率，5％重量配比的化妝水為87.2％，1％重量配比的化妝水為26.8％。由此表明camu camu種子提取物的混合濃度越高的化妝水制劑，越顯示優(yōu)異的抗氧化活性。
權(quán)利要求
1.含有camu camu種子提取物作為有效成分的美白劑。
2.權(quán)利要求1的美白劑，其中所述camu camu種子提取物含有沒食子酸及其鹽的至少一種。
3.皮膚外用劑，該皮膚外用劑含有權(quán)利要求1的美白劑。
4.化妝品，該化妝品含有權(quán)利要求1的美白劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種美白劑，該美白劑可以有效利用以往做廢棄處理的camu camu種子，安全性優(yōu)異，可用于化妝品等，具有美白作用；本發(fā)明還提供混合有該美白劑等的皮膚外用劑和化妝品。本發(fā)明的美白劑含有camu camu種子的提取物作為有效成分，本發(fā)明的皮膚外用劑或化妝品含有上述美白劑等。
文檔編號A61Q1/00GK1744879SQ20038010959
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者永峰賢一, 林美希, K·山崎 申請人:株式會社日冷生物科學(xué)