專利名稱：：腫瘤免疫治療的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及產(chǎn)生反應(yīng)性樹突細(xì)胞的方法，尤其是涉及反應(yīng)性樹突細(xì)胞用于腫瘤疫苗接種的用途，來產(chǎn)生器官衰竭的動物模型和用于體外藥物篩選。
背景技術(shù)：
：目前感染和炎癥已經(jīng)成為心血管病1的重要風(fēng)險因素，西方社會死亡的主要原因。實際上，血清中炎性標(biāo)記物的升高預(yù)示著冠心病2和擴(kuò)張性心肌病3，4患者的預(yù)后。尤其是，擴(kuò)張性心肌病，年輕患者中心力衰竭的最常見原因5，6，7，已經(jīng)與感染親心臟病毒后的自體免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，因為這些患者中的許多人顯示了對抗心臟蛋白的自體抗體6，7，8。相似的自體免疫機(jī)理涉及感染原生動物Trypanozomacruzii后的心力衰竭7。通過多個傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)24來表征自體免疫，包括限定的自體抗原、器官特異性和自體反應(yīng)性T-細(xì)胞和/或可以轉(zhuǎn)移疾病的自體抗體。動物模型支持微生物感染可以引發(fā)對抗心臟組織的自體免疫應(yīng)答的意見7。在CoxsackieB37和Trypanozomacruzii9感染后，限定遺傳背景的小鼠產(chǎn)生了持續(xù)很久的心肌炎，伴隨自體反應(yīng)性T-細(xì)胞。相同的小鼠品系中，用心臟特異性α-肌球蛋白或十六氨基酸免疫，α-肌球蛋白重鏈抗原決定部位和強烈的佐劑一起誘導(dǎo)T-細(xì)胞介導(dǎo)的心肌炎7，10，11。重要地，已經(jīng)顯示正常小鼠的心臟含有大量組織駐留細(xì)胞呈遞內(nèi)源心臟特異性肽12。然而，還不知道樹突細(xì)胞呈遞內(nèi)源自體抗原是否有助于自體免疫心臟疾病和可能的心力衰竭。需要的是允許研究者來研究年輕患者中產(chǎn)生心肌病機(jī)理的動物模型，更重要地是，來鑒定干擾該疾病發(fā)展化合物的動物模型。樹突細(xì)胞在抗原特異性免疫應(yīng)答13，14，15以及免疫耐受性16，17的誘導(dǎo)中是關(guān)鍵性的參與者。不成熟的樹突細(xì)胞位于外周組織中，它們在其中通過胞吞作用和macropinocytosis從其環(huán)境中主動取樣。一旦遇到病原體，它們經(jīng)歷稱為樹突細(xì)胞成熟的發(fā)展程序，其包括共刺激活性的誘導(dǎo)、抗原加工、提高的MHC分子表達(dá)和至淋巴結(jié)的遷移，它們在其中引發(fā)天然抗原特異性T細(xì)胞13。樹突細(xì)胞還加工來自碎片和死細(xì)胞的內(nèi)源抗原13，15，16。因此提出如果適當(dāng)激活，樹突細(xì)胞可能引發(fā)自體反應(yīng)性T細(xì)胞13，17。存在增加的證據(jù)在合適刺激不存在下，垂死細(xì)胞和自體組織的加工給予了樹突細(xì)胞對CD8+T-細(xì)胞18和CD4+T-細(xì)胞19介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的致耐受性。因此目前的研究聚焦于樹突細(xì)胞在維持自體耐受性中的作用。一些研究已經(jīng)表明樹突細(xì)胞可以在病毒抗原表達(dá)的轉(zhuǎn)基因模型中誘導(dǎo)器官特異性炎癥20，但是仍然只有激活的樹突細(xì)胞可以誘導(dǎo)對自體抗原的自體免疫性的間接證據(jù)13，21。此外，從未顯示用自體蛋白脈沖的樹突細(xì)胞實際上能夠在“天然”小鼠中誘導(dǎo)自體免疫性。樹突細(xì)胞表達(dá)多個Toll-樣受體，因此這些細(xì)胞關(guān)鍵性地位于適應(yīng)免疫性和先天免疫性的界面上21。先天免疫系統(tǒng)是宿主防御感染的普遍而古老的形式21。樹突細(xì)胞是由遍布組織分布的異種細(xì)胞群構(gòu)成的。由于樹突細(xì)胞在外周血中的低出現(xiàn)率、淋巴器官的有限可達(dá)性和樹突細(xì)胞分化的終點狀態(tài)，樹突細(xì)胞用于研究和更多實踐應(yīng)用的用途受到限制。通過該方法激活所需要的樹突細(xì)胞數(shù)量大約為至少1×106個細(xì)胞。需要的是一種需要更少細(xì)胞來激活樹突細(xì)胞的方法，大約5×104個至2×105個細(xì)胞。研究已經(jīng)顯示一定程度上免疫系統(tǒng)能夠殺滅腫瘤細(xì)胞；然而腫瘤常常占優(yōu)勢。已經(jīng)提出了治療癌癥的各種免疫治療方法，但是還沒有實現(xiàn)成功地引起對靶腫瘤有效和特異性免疫治療響應(yīng)的治療方法。需要的是對體內(nèi)腫瘤持續(xù)并特異性產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，導(dǎo)致腫瘤的根除。在沒有與此不一致的程度上將在此涉及的所有出版物和專利申請全部引入作為參考。
發(fā)明內(nèi)容公開了激活樹突細(xì)胞使其變成對選定的抗原反應(yīng)性的方法。該方法中，將樹突細(xì)胞暴露于選定的抗原和Toll-樣受體(TLR)的刺激劑，TLR激活樹突細(xì)胞中的TLR途徑。當(dāng)樹突細(xì)胞暴露于其的選定抗原是自體抗原或組織特異性抗原時，將激活的樹突細(xì)胞再次引入其組織攜帶該抗原的動物中，導(dǎo)致動物中產(chǎn)生自體免疫疾病。這提供了產(chǎn)生自體免疫疾病或組織特異性自體免疫損傷的動物模型的方法。與自體免疫疾病相關(guān)的自體抗原的選擇使得可以模擬自體免疫疾病，如在此所述的。當(dāng)樹突細(xì)胞暴露于其的選定抗原是腫瘤抗原時，將激活的樹突細(xì)胞再次引入腫瘤患者中，提供了免疫治療的新方法，如在此所述的。根據(jù)本發(fā)明的一實施方案，提供了制造對抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞的方法，包括獲得樹突細(xì)胞的樣品；和使樹突細(xì)胞接觸抗原和接觸至少一種Toll-樣受體(TLR)刺激劑。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了治療動物中腫瘤的方法，包括獲得腫瘤表達(dá)的腫瘤抗原，從動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過上述的方法制得對腫瘤抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。根據(jù)本發(fā)明的再一實施方案，提供了制造自體免疫疾病動物模型的方法，包括獲得與自體免疫疾病相關(guān)的抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過上述方法制得對自體免疫疾病相關(guān)抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了制造器官衰竭動物模型的方法，包括獲得器官特異性自體抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過上述方法制得對自體抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。根據(jù)本發(fā)明的再一實施方案，提供了如上所述的方法，其中抗原是myhc-α肽。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了針對其調(diào)節(jié)動物自體免疫疾病發(fā)展的能力篩選候選化合物的方法，包括獲得與自體免疫疾病相關(guān)的自體抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過權(quán)利要求1至12任一項的方法制得對自體抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中，其中在選自接觸自體抗原之前、接觸自體抗原的過程中、接觸自體抗原之后接觸TLR刺激劑之前、接觸TLR刺激劑的過程中以及接觸TLR刺激劑之后的時間，使樹突細(xì)胞接觸候選化合物，并將動物的自體免疫反應(yīng)與用制得的對相同自體抗原反應(yīng)性的并未暴露于化合物的樹突細(xì)胞處理的動物的自體免疫反應(yīng)相比較。從以下本發(fā)明特定實施方案的詳述中將進(jìn)一步理解本發(fā)明，參照附圖，其中圖1顯示了0×放大倍數(shù)(畫面a和b)，140×放大倍數(shù)(畫面c和d)和560×放大倍數(shù)(畫面e和f)的小鼠心臟組織切片的顯微照相。畫面1a和1c顯示了正常的心臟組織，而畫面1b、1d、1e和1f顯示了在響應(yīng)肌球蛋白重鏈α(myhc-α)肽殘基614至629部分脈沖的激活樹突細(xì)胞中產(chǎn)生的發(fā)炎的心臟組織。圖2，畫面a，顯示了接種myhc-α或OVA脈沖的激活樹突細(xì)胞小鼠的CD4+T-細(xì)胞的INF-γ和IL-4產(chǎn)生，以pg/ml表示；畫面2b顯示了接種myhc-α或?qū)φ誳va-肽(OVA)脈沖的激活樹突細(xì)胞小鼠中自體IgG抗體的體內(nèi)產(chǎn)生；畫面2c顯示了心臟組織的切片，顯示了注射nyhc-α引發(fā)的CD4+T細(xì)胞的SCID小鼠中的心肌炎，但是在注射OVA引發(fā)的CD4+T細(xì)胞的小鼠中沒有心肌炎。圖3顯示了表明接種myhc-α脈沖的激活樹突細(xì)胞小鼠中收縮機(jī)能障礙和擴(kuò)張性心肌病發(fā)作的數(shù)據(jù)。圖3a顯示了心臟對體重的比例，圖3b顯示了左心室舒張期末直徑(LVEDD)，圖3c顯示了對照和測試小鼠的超聲心電圖。圖3d顯示了纖維鞘收縮速度(VCFC)和圖3e顯示了收縮分?jǐn)?shù)(FC)。圖4顯示了接種myhc-α脈沖的激活樹突細(xì)胞后，0×放大倍數(shù)和140×放大倍數(shù)的小鼠心臟組織橫截面。圖4a和4d顯示了將CD40-/-樹突細(xì)胞接種入CD40+/+宿主中時的心臟組織。圖4b和4e顯示了將CD40+/+樹突細(xì)胞接種入CD40-/-宿主中時的心臟組織。圖4c和4f顯示了將CD40+/+樹突細(xì)胞接種入CD40+/+宿主中時的心臟組織。圖5顯示了接種myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞10天后，560×放大倍數(shù)的小鼠心臟組織橫截面，樹突細(xì)胞是用以下物質(zhì)來激活的(畫面a)LPS/抗CD40；(畫面b)dsRNA/抗CD40；(畫面C)CpG/抗CD40；和(畫面d)PGN/抗CD40。圖6a、6b和6c顯示了用LPS/抗CD40刺激12小時后，共刺激分子在CD40+/+(藍(lán)色)和CD40-/-(紅色)樹突細(xì)胞上的表達(dá)。FACS柱狀圖控制于CD11c+CD11b+MHC類II+活細(xì)胞(ICAM，B7.1，B7.2)或CD11c+CD11b+活細(xì)胞上。圖7顯示了通過用所示的Toll-樣受體刺激劑(1μg/mlLPS、100μg/ml聚(IC)(dsRNA)或10μMCpG-ODN)刺激樹突細(xì)胞12小時細(xì)胞因子TNF-α、IL-12p70、IL6和IL-1β的產(chǎn)生，在刺激性的抗CD40抗體(αCD405μg/ml)不存在或存在下。數(shù)據(jù)表示為四個培養(yǎng)孔的平均(±SD)并代表具有相似數(shù)據(jù)的幾個實驗中的一個。圖8，畫面a，以示意圖的形式顯示了提出的自體免疫發(fā)病機(jī)理的模型，其中組織損傷釋放由樹突細(xì)胞捕獲和呈遞的自體抗原。如果Toll-樣受體激活發(fā)生，自體反應(yīng)性T細(xì)胞響應(yīng)上升，其通過CD40-CD40L的相互作用來擴(kuò)增。圖8b顯示了注射2×106凋亡的心肌細(xì)胞(i.p.)而沒有LPS的對照小鼠的心臟組織沒有誘導(dǎo)心肌炎(6只小鼠中為0)。圖8c顯示了一起注射2×106凋亡的心肌細(xì)胞(i.p.)和LPS(在第0、1、2天10μgi.p.)的小鼠心臟組織導(dǎo)致了8只小鼠中7只心臟炎癥(箭頭)。重要的是，單獨接種LPS沒有誘導(dǎo)心臟炎癥(5只小鼠中為0；未顯示)。LPS/心肌細(xì)胞對心肌細(xì)胞p＜0.0001(Fisher’s精確檢驗)。圖8d顯示了i.p.接種LPS和2×106凋亡的心肌細(xì)胞(LPS)或只接種了凋亡心肌細(xì)胞的對照10天后，抗myhc-αIgG抗體滴度。單獨接種心肌細(xì)胞沒有誘導(dǎo)相應(yīng)的抗體滴度(對照)。顯示了個體小鼠的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述一實施方案中，本發(fā)明提供了刺激樹突細(xì)胞使其變成對抗原反應(yīng)性的方法。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，“樹突細(xì)胞”是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，其吸收和呈遞自體抗原和外源抗原，且在成熟過程中形成樹突?？梢酝ㄟ^科學(xué)文獻(xiàn)中所述的各種方法獲得樹突細(xì)胞。合適的組織來源包括外周血、骨髓和淋巴組織如脾或淋巴結(jié)。例如，可以通過Lutz等所述的通過培養(yǎng)從骨髓獲得樹突細(xì)胞40，或通過用樹突細(xì)胞表面標(biāo)記例如CD11c+特異性的磁珠富集直接從脾或淋巴結(jié)細(xì)胞的懸浮液分離。發(fā)現(xiàn)通過Lutz等的方法從小鼠骨髓分離的樹突細(xì)胞群的大部分(～80％)為CD11c+CD11b+。本發(fā)明不受限于該樹突細(xì)胞的子集，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用至任何來源的任何樹突細(xì)胞群。優(yōu)選未成熟的樹突細(xì)胞。分離的樹突細(xì)胞可以任選地通過CD11c+陽性選擇來進(jìn)一步富集，例如使用磁珠(MACSTM，MiltenyiBiotech)。對于人的臨床使用優(yōu)選這樣更純的細(xì)胞群。本發(fā)明的一實施方案中，使分離的樹突細(xì)胞接觸選定的希望細(xì)胞變成反應(yīng)性的抗原和至少一種Toll-樣受體(TLR)刺激劑?？梢允狗蛛x的樹突細(xì)胞接觸選定的抗原一段合適的時間，接著使樹突細(xì)胞接觸至少一種Toll-樣受體(TLR)刺激劑再一段時間。對于是短肽而不需要樹突細(xì)胞加工的抗原，30至60分鐘的抗原暴露時間就足夠了。對于更復(fù)雜的抗原，如整個蛋白質(zhì)或粗制的細(xì)胞制劑，抗原暴露應(yīng)該約為12至24小時。通常，1至20μg/ml的抗原濃度是適于抗原暴露的。一些抗體的高含量對樹突細(xì)胞是毒性的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地決定最佳抗原濃度或范圍。用于TLR刺激劑激活TLR的時間段可以為1至4小時，優(yōu)選約1至2小時，尤其如果使用高濃度的TLR刺激劑，如在此所述的。刺激或激活TLR家族成員的材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并描述于科學(xué)文獻(xiàn)中。本發(fā)明方法中任何TLR配體可以用作TLR刺激劑來激活樹突細(xì)胞。合適的TLR包括，例如，脂多糖(LPS大腸桿菌0111B4Sigma)、聚(IC)(Amersham)、CpG-ODN或肽聚糖(PGN金黃色葡萄球菌Fluka)。如在此公開的數(shù)據(jù)所示的，通過本發(fā)明方法的樹突細(xì)胞激活不受限于一種特定TLR的刺激，因為已經(jīng)成功使用刺激不同TLR的刺激劑。本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案中，使樹突細(xì)胞同時接觸TLR刺激劑和抗CD40抗體?？笴D40抗體可以商業(yè)獲得。與單獨TLC刺激劑激活相比較，用TLR刺激劑和抗CD40抗體共激活樹突細(xì)胞同時提高了處理細(xì)胞的反應(yīng)性和壽命。3至5μg/ml的抗CD40抗體濃度獲得了良好的結(jié)果，但是也可以使用該范圍外的濃度。通過上述方法制備的反應(yīng)性樹突細(xì)胞是多個新方法的基礎(chǔ)。例如，如果樹突細(xì)胞暴露于其的選定抗原是腫瘤抗原，對該抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞可以用于衍生該抗原的腫瘤的免疫治療中。根據(jù)該實施方案，本發(fā)明提供了治療動物如人腫瘤的方法，通過獲得腫瘤表達(dá)的腫瘤抗原，從動物獲得樹突細(xì)胞的樣品；使樹突細(xì)胞接觸腫瘤抗原一段合適的時間；使樹突細(xì)胞接觸至少一種TLR刺激劑一段合適的時間，以及還任選地接觸抗CD40抗體一段合適的時間，如上所述；并將激活的樹突細(xì)胞再次引入動物中。最初，從腫瘤獲得活組織切片樣品使得可以鑒定一種或多種腫瘤表達(dá)的抗原。活組織切片樣品可以篩選已知的、特征性的腫瘤抗原。如果這些中的一種或多種得到了鑒定，相應(yīng)的合成抗原蛋白或肽可以用于接觸樹突細(xì)胞。如果沒有已知的腫瘤抗原得到鑒定，從腫瘤的活組織切片制得單細(xì)胞懸浮液，并通過已知的方法例如輻射或加入化合物使細(xì)胞懸浮液凋亡。將凋亡的細(xì)胞制劑用于接觸患者的樹突細(xì)胞并將該細(xì)胞暴露于腫瘤抗原。從帶有腫瘤的動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，例如從外周血或骨髓，如上所述。優(yōu)選，在細(xì)胞因子如IL-10的存在下培養(yǎng)樹突細(xì)胞來抑制成熟并使細(xì)胞體外接觸合成的腫瘤抗原或凋亡的細(xì)胞制劑12至24小時。帶有腫瘤的動物可以是人。如果使用了細(xì)胞因子，洗滌樹突細(xì)胞來除去細(xì)胞因子，并接觸至少一種TLR刺激劑和任選地抗CD40抗體，如上所述。洗滌處理過的細(xì)胞并再次引入帶有腫瘤的動物中，例如通過靜脈輸注或皮下注射。可能需要細(xì)胞的重復(fù)遞送來維持動物對腫瘤的免疫應(yīng)答。對于人的免疫治療，根據(jù)決定合適劑量的常規(guī)方法，通過治療醫(yī)師來決定合適的細(xì)胞劑量和重復(fù)遞送的時間選擇。可以通過本發(fā)明方法治療的腫瘤包括但不限于骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、白血病和淋巴瘤。本發(fā)明的方法還可以用于產(chǎn)生各種自體免疫疾病的動物模型，來幫助理解這些疾病的產(chǎn)生和提供測定候選化合物停止或干擾疾病進(jìn)展能力的篩選工具，提供疾病治療的潛在藥物化合物的鑒定。為了建立這樣的動物模型，通過在此所述的方法刺激從動物獲得的樹突細(xì)胞來使其變成自體免疫疾病相關(guān)自體抗原反應(yīng)性的，然后再次引入動物中使疾病產(chǎn)生。例如，為了建立自體免疫心臟病的動物模型，在本發(fā)明的方法中，使來自非人動物的樹突細(xì)胞接觸心臟特異性抗原，如在此所述的myhc-α肽，和TLR刺激劑，然后再次引入動物中來產(chǎn)生心肌炎，如在此所述的。相似地，可以建立其它疾病如哮喘或關(guān)節(jié)炎的動物模型。例如，構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的膠原或其它結(jié)構(gòu)蛋白可以用作產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎動物模型的抗原，胰島素原用作糖尿病模型的抗原，肌球蛋白肽用作自體免疫心肌炎模型的抗原，MOG和其它髓磷脂衍生的肽用于自體免疫腦脊髓炎，以及外源氣管抗原用于哮喘?？梢允褂酶鞣N哺乳動物來建立動物模型，包括小鼠、大鼠和豬。本發(fā)明的另一實施方案中，提供了激活樹突細(xì)胞來誘導(dǎo)可以用作研究器官衰竭模型的器官特異性自體免疫性的方法。使用如上所述的方法，改為用于脈沖樹突細(xì)胞的自體抗原是器官特異性的，將激活的樹突細(xì)胞再次引入動物中后，導(dǎo)致器官衰竭。鼠α-肌球蛋白重鏈肽(myhc-α614-629)[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH]11，23(myhc-α)用作自體抗原來誘導(dǎo)擴(kuò)張性心肌病以及隨后的心力衰竭。該模型系統(tǒng)可以用于闡明其中器官衰竭具有自體免疫成分的疾病中所涉及的機(jī)理，例如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、狼瘡，等。本發(fā)明的另一實施方案中，提供了激活樹突細(xì)胞并將這些細(xì)胞用作體外藥物篩選試驗來鑒定能夠影響器官特異性自體免疫發(fā)展的化合物的方法。使用如上所述的方法，例如使用自體免疫疾病的動物模型，并進(jìn)一步包括在抗原脈沖之前、脈沖的過程中、脈沖之后TLR激活之前、TLR激活的過程中或TLR激活之后，將測試化合物應(yīng)用至樹突細(xì)胞的步驟。所應(yīng)用的化合物可以影響靶器官中自體免疫性的發(fā)展或進(jìn)程，抑制或促進(jìn)。將激活的樹突細(xì)胞再次引入測試動物中后，進(jìn)行測定應(yīng)用的化合物是否已經(jīng)影響了動物中自體免疫性的發(fā)展或進(jìn)程。已經(jīng)顯示了接種心肌特異性自體肽脈沖的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)了CD4+T-細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫心肌炎。樹突細(xì)胞介導(dǎo)的心臟炎癥進(jìn)展并惡化成擴(kuò)張性心肌病，甚至在急性炎癥浸潤液消退后仍導(dǎo)致心力衰竭。重要地，樹突細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性和心臟疾病只在通過Toll-樣受體激活樹突細(xì)胞時發(fā)生。此外，疾病的發(fā)病機(jī)理依賴于CD40的共刺激。因此，先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的協(xié)調(diào)激活使樹突細(xì)胞變?yōu)樽泽w侵襲性。自體免疫性和心力衰竭用myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞免疫導(dǎo)致心室擴(kuò)張、收縮性削弱，并在急性炎癥浸潤液消退后導(dǎo)致纖維化改變。這些數(shù)據(jù)與感染后心肌病患者的外植心臟或活體切片不必定顯示炎癥浸潤液的事實一致，甚至在自體抗體存在下5。因此，結(jié)果反映出人感染后擴(kuò)張性心肌病的發(fā)病機(jī)理。小鼠樹突細(xì)胞免疫后，產(chǎn)生了對抗myhc-α抗原決定部位以及對抗其它肌球蛋白抗原決定部位的自體抗體。產(chǎn)生了是否這些自體抗體有助于或甚至介導(dǎo)了急性炎癥浸潤液消退后心力衰竭的問題。例如，對抗心肌細(xì)胞表面蛋白的自體抗體介導(dǎo)了缺失負(fù)向免疫調(diào)節(jié)PD-1受體的BALB/c小鼠中的心力衰竭31?；蛘撸呐K功能障礙可能反映出心臟應(yīng)付導(dǎo)致病理改變和纖維化的組織破壞的無能。感染和炎癥已經(jīng)成為心血管疾病的重要風(fēng)險因素1，西方社會死亡的主要原因。這些結(jié)果表明在樹突細(xì)胞上自體抗原呈遞與TLR刺激一起足以引發(fā)自體免疫心臟病可以解釋膿毒病患者的心臟功能障礙32和心肌梗塞后惡化進(jìn)程和全身炎癥響應(yīng)規(guī)模之間的臨床關(guān)聯(lián)1，2，3，4。此外，已經(jīng)提出感染原生動物Trypanozomacruzii后心力衰竭的自體免疫機(jī)理9。我們的實驗系統(tǒng)建立了新的體內(nèi)疾病模型來研究炎癥后心力衰竭的病理生理學(xué)和發(fā)展新的治療策略。重要地，我們的數(shù)據(jù)提供了自體免疫心臟疾病與擴(kuò)張性心肌病以及心力衰竭發(fā)展之間的直接因果關(guān)聯(lián)。先天免疫性、感染和自體免疫性自體免疫疾病影響高達(dá)總?cè)巳旱?0％。除了遺傳易感性外，環(huán)境觸發(fā)劑和感染劑已經(jīng)涉及多種自體免疫疾病的發(fā)病機(jī)理7，33。然而，大多數(shù)自體免疫疾病中，從來沒有鑒定過成因的感染劑，且不知道不同的病原體怎樣打破免疫耐受性并引發(fā)組織特異性自體免疫性。這些結(jié)果表明對誘導(dǎo)組織特異性自體免疫心臟病必需的TLR激活提供了自體免疫性發(fā)病機(jī)理的分子框架。在心臟損傷和微生物感染的范圍內(nèi)，自體肽脈沖的樹突細(xì)胞可以通過TLR3作用的病毒RNA來刺激，而細(xì)菌可以通過細(xì)胞壁產(chǎn)物如肽聚糖、LPS或未甲基化的DNA來誘導(dǎo)TLR2、4和921。此外，親心臟原生動物T.cruzii的產(chǎn)物最近已經(jīng)顯示可激活樹突細(xì)胞上的TLR234。因此，自體免疫性不必定需要微生物抗原和自體蛋白之間的抗原模擬33。相反地，與先天免疫系統(tǒng)激活相呼應(yīng)的組織損傷似乎引發(fā)了遺傳易感個體中的自體免疫性(圖7a)。相反，釋放的自體抗原在穩(wěn)定狀態(tài)條件下或只存在最小樹突細(xì)胞刺激時的攝取可以導(dǎo)致自體反應(yīng)性T-細(xì)胞的耐受性和下調(diào)17，18，19。人和實驗動物模型中的自體免疫性通常顯示復(fù)發(fā)疾病模式7，33。例如，擴(kuò)張性心肌病患者通常顯示任何原因感染后其心臟功能的快速惡化4。令人好奇地，myhc-α誘導(dǎo)的心肌炎消退后，小鼠的TLR體內(nèi)激活導(dǎo)致心臟浸潤的復(fù)發(fā)和心臟功能的快速惡化(U.Eriksson&JosefM.Penninger，未公開)。因此，先天免疫系統(tǒng)的非特異性體內(nèi)刺激可以快速誘導(dǎo)之前引發(fā)過動物中的組織特異性炎癥。因此，我們提出自體免疫疾病的惡化和復(fù)發(fā)可能發(fā)生在經(jīng)歷TLR體內(nèi)非特異性刺激的遺傳易感人群中。這些結(jié)果表明樹突細(xì)胞可以誘導(dǎo)快速發(fā)作，天然小鼠響應(yīng)內(nèi)源抗原的器官特異性自體免疫性。提出的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌炎的模型提供了誘導(dǎo)自體免疫性和心力衰竭的新實驗范例。自體抗原脈沖的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)大量自體免疫性的能力需要擴(kuò)展至其它系統(tǒng)如哮喘或關(guān)節(jié)炎。模型系統(tǒng)的使用將幫助選擇性作用于樹突細(xì)胞的自體免疫疾病的新治療策略的設(shè)計和發(fā)展以及最佳化基于組織特異性樹突細(xì)胞的癌癥疫苗接種實驗方案。由于兩者，樹突細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性和心臟病只在通過Toll-樣受體激活樹突細(xì)胞時發(fā)生，這些結(jié)果提供了關(guān)于組織損傷和多個感染引發(fā)劑怎樣誘導(dǎo)自體免疫疾病和慢性心肌病的統(tǒng)一理論。具體實施例方式為了說明的目的描述了實施例，并不是來限制本發(fā)明的范圍。本公開中涉及但沒有明確描述的化學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)和肽生化以及免疫學(xué)方法和實施例報道于科學(xué)文獻(xiàn)中且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。為了統(tǒng)計學(xué)分析，通過Fisher’s精確檢驗分析二分?jǐn)?shù)據(jù)。Mann-WhitneyU測試用于嚴(yán)重程度得分的評價。使用ANOVA和t-測驗比較增殖響應(yīng)和細(xì)胞因子水平。實施例1-自體抗原脈沖的、激活的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)心肌炎為了測定自體蛋白脈沖的DC是否可以引發(fā)內(nèi)源抗原的自體免疫性，將之前鑒定的心肌特異性α-肌球蛋白肽，殘基614至62911，23(myhc-α)用于接種小鼠。所有使用的小鼠是野生型小鼠、缺失B和T-細(xì)胞的SCID小鼠，或IL4Rα-/-小鼠，且所有的都是BALB/c背景和從JacksonLaboratories購買的。將小鼠飼養(yǎng)于特定的無病原體條件下。如Lutz等中所述的產(chǎn)生骨髓衍生的樹突細(xì)胞40。熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分析顯示超過80％的樹突細(xì)胞是CD11c+CD11b+樹突細(xì)胞，使用磁珠(MACSTM，MiltenyiBiotech)通過CD11c+陽性選擇來進(jìn)一步富集。用10μg/ml鼠α-肌球蛋白重鏈肽(myhc-α614-629[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH])脈沖過夜后11，23，用TLR刺激劑激活樹突細(xì)胞4小時，刺激劑包括1μg/ml的LPS(大腸桿菌0111B4；Sigma)，100μg/ml的聚(IC)(Amersham)，10μM的CpG-ODN，或10μgml的PGN(金黃色葡萄球菌；Fluka)，用或不用5μg/ml的抗CD40抗體(克隆3/23，Pharmingen)，或1μg/ml的RANK-L(R&DBiosystems)。為了一些實驗，在抗CD40抗體的存在或不存在下，用500U/ml的TNF-α或10ng/ml的IL-1β(兩者都來自PeproTech)刺激樹突細(xì)胞。給BALB/c(H2d單倍體)小鼠注射同源的、myhc-α脈沖的CD11c+CD11b+CD80+CD86+CD8-MHC類II+骨髓衍生的樹突細(xì)胞，樹突細(xì)胞用TLR-引發(fā)劑LPS和/或刺激性抗CD40抗體激活。給小鼠i.p.注射50,000至200,00個樹突細(xì)胞/小鼠。對照小鼠接受ova-肽(OVA)脈沖的激活的樹突細(xì)胞。將小鼠處死并在第一次DC接種后的不同時間點取出心臟。使用0至4的級別對心肌炎評分，其中0表示沒有炎癥浸潤液；1意味著肌細(xì)胞之間炎癥細(xì)胞的小轉(zhuǎn)化灶；2意味著多于100個炎癥細(xì)胞的較大轉(zhuǎn)化灶；3意味著涉及多于10％的橫截面；和4意味著涉及多于30％的橫截面。接種myhc-α或OVA肽脈沖的LPS/抗CD40激活的樹突細(xì)胞10天后小鼠的心臟切片顯示于圖1中。顯示用OVA脈沖的樹突細(xì)胞免疫的小鼠中不存在炎癥的對照心臟顯示于圖1a和1c中。圖1b和1d中，通過箭頭表示接種myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞后的大量炎癥。顯示了典型的整個心臟的圖像和較大的放大倍數(shù)(×140)(H&E染色)。為了冰凍心臟切片上的免疫組織化學(xué)，使用以下的抗體抗MHCII(生物素化的，Serotec，MCA46B)、抗CD3(KT3-1.1)、抗CD4(YTS191)、抗CD8(YTS169)和抗CD11c(2.5mg/ml，克隆HL3，Pharmingen)。圖1e和1f顯示了免疫組織化學(xué)染色的橫截面，說明了由少量CD8+細(xì)胞(1e，箭頭)和大量CD4+細(xì)胞(1f，箭頭)構(gòu)成了浸潤液。原始放大倍數(shù)×560。接種非特異性O(shè)VA肽脈沖的激活的樹突細(xì)胞或接種非激活的、myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞都沒有誘導(dǎo)心臟炎癥(圖1a、c，表1)。用抗CD40抗體單獨激活樹突細(xì)胞在誘導(dǎo)心肌炎中也是無效的。此外，使用之前建立的成熟實驗方案13，14接種myhc-α脈沖的、LPS和抗CD40激活24小時的樹突細(xì)胞沒有導(dǎo)致心臟炎癥(數(shù)據(jù)未顯示)。用myhc-α脈沖樹突細(xì)胞后接著用抗CD40和LPS非常短的體外激活4小時給予了樹突細(xì)胞反應(yīng)性。這些樹突細(xì)胞的接種誘導(dǎo)了Balb/c小鼠中的大量心肌炎(圖1b、d，表1)。樹突細(xì)胞免疫后5天開始疾病發(fā)作非常迅速并在10天達(dá)到峰值。重要的是，甚至單一接種myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞也誘導(dǎo)了疾病，但是與重復(fù)接種相比較，發(fā)病率較低。此外，用LPS單獨激活的myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞還誘導(dǎo)了較低發(fā)病率的中度心臟炎癥(表1)。這些結(jié)果提供了樹突細(xì)胞可以誘導(dǎo)天然小鼠響應(yīng)內(nèi)源抗原的器官特異性炎癥的快速發(fā)作的第一個實驗證據(jù)。表1.myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞引發(fā)自體免疫心臟病*P＜0.0001，P＜0.0005(Fisher’s精確檢驗)。P＜0.0028(Mann-WhitneyU測驗)。實施例2-樹突細(xì)胞免疫誘導(dǎo)了自體免疫性為了測定樹突細(xì)胞是否誘導(dǎo)了心肌炎和符合自體免疫性的標(biāo)準(zhǔn)，首先需要測定限定的自體抗原是否存在。使用磁珠從myhc-α脈沖的、LPS/抗CD40抗體激活的樹突細(xì)胞免疫的小鼠脾中純化CD4+T-細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞分離試劑盒；MiltenyiBiotechGmbH)。CD4+T-細(xì)胞在無血清AIM-V(Gibro)培養(yǎng)基中與照射的(2000rad)同源脾細(xì)胞和10μg/mlmyhc-α或卵清蛋白培養(yǎng)40小時。使用可購得的QuantikineELISA試劑盒(R&DBiosystems，Minneapolis，U.S.A.)測量細(xì)胞因子水平?；蛘撸囵B(yǎng)72小時后通過測量[3H]甲基-胸苷的摻入來測定增殖。為了細(xì)胞因子測量，將樹突細(xì)胞以1×106/ml涂布于24孔平板中并用包括1μg/mlLPS、100μg/ml聚(IC)、10μMCpG-ODN或10μg/mlPGN的各種TRL刺激劑孵育12小時，用或不用5μg/ml的抗CD40。使用QuantikineELISA試劑盒(R&DBiosystems，Minneapolis)測量細(xì)胞因子。為了FACS分析，在用合適的Pharmingen熒光染料標(biāo)記抗體染色之前，用Pharmingen染色緩沖液中的Fc-阻斷(Pharmingen)和1％大鼠血清將樹突細(xì)胞制劑在4℃預(yù)孵育30分鐘。40小時后測量IFN-γ和IL-4，數(shù)據(jù)顯示于圖2a中。數(shù)值表示為5只單個小鼠的平均(±SD)，其中與注射OVA脈沖樹突細(xì)胞的小鼠相比較，從注射myhc-α脈沖樹突細(xì)胞的小鼠分離的CD4+T-細(xì)胞，對于IL-4產(chǎn)生**p＜0.005，對于IFN-γ產(chǎn)生*p＜0.0001(ANOVA和未配對t-檢驗)(n.d.＝未檢測到)。樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌炎是抗原特異性的，因為非相關(guān)抗原脈沖的樹突細(xì)胞沒有誘導(dǎo)疾病(表1)。此外，其它器官中如骨骼肌、肺或腎臟沒有存在浸潤液(未顯示)，表明樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥是器官特異性的并限制于心臟。免疫組織化學(xué)揭示了浸潤患病動物心臟的大多數(shù)T-細(xì)胞是CD4+，僅有少數(shù)細(xì)胞對CD8+是陽性的(圖1e、f)。用myhc-α體外再刺激從注射DC小鼠純化的CD4+T-細(xì)胞導(dǎo)致增殖(未顯示)以及INF-γ和IL-4的產(chǎn)生(圖2a)。相反，用非特異性O(shè)VA肽再刺激的CD4+T-細(xì)胞沒有增殖且沒有產(chǎn)生IL-4，僅有少量的INF-γ。這些數(shù)據(jù)顯示樹突細(xì)胞體內(nèi)引發(fā)myhc-α特異性的CD4+T-細(xì)胞。為了測定樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌炎是否符合自體免疫性的標(biāo)準(zhǔn)，需要測定能轉(zhuǎn)移疾病的自體抗體是否存在。如所述的11通過ELISA測定對抗心臟特異性myhc-α和kk肽的抗體應(yīng)答，使用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(SouthernBiotechnologyAssociates)。在半最大OD405nm測定滴度。接種激活的、myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞10天后檢測抗myhc-α和抗-kkIgG的自體抗體，但在接種OVA脈沖的樹突細(xì)胞后沒有檢測到。個體小鼠的滴度顯示于圖2b中。樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌炎伴隨強烈的對抗心臟特異性myhc-α肽的IgG自體抗體應(yīng)答(圖2b)。還檢測了對抗心臟特異性肽的自體抗體，該心臟特異性肽稱為kk25，與免疫myhc-α肽無關(guān)(圖2b)，證實樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)心臟炎癥，該事件伴隨內(nèi)源心臟肽自體抗體的產(chǎn)生。重要地，體外再刺激并將myhc-α引發(fā)的，而不是OVA引發(fā)的CD4+T-細(xì)胞轉(zhuǎn)移至同源的、免疫缺失SCID小鼠中導(dǎo)致宿主動物的心肌炎(圖2c)。相反，CD8+T-細(xì)胞的轉(zhuǎn)移沒有誘導(dǎo)疾病(未顯示)。此外，IFN-γR-/-和IL-4Rα-/-小鼠接種myhc-α脈沖的野生型樹突細(xì)胞導(dǎo)致兩個品系中強烈的心肌炎(表1)。因此，通過樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的疾病似乎與Th1/Th2極化無關(guān)。因此，這個樹突細(xì)胞誘導(dǎo)心肌炎的模型符合CD4+T-細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病的所有標(biāo)準(zhǔn)并提供了誘導(dǎo)自體免疫性的新實驗范例。使用磁珠(MACSTM，MiltenyiBiotech)從myhc-α脈沖的和激活的樹突細(xì)胞免疫的小鼠脾中分離CD4+和CD8+T-細(xì)胞。在5μg/ml抗CD28mAb(Pharmingen)存在下，培養(yǎng)myhc-α脈沖、照射(1500Rad)的同源DC48小時后，將1×107CD4+細(xì)胞每只小鼠(＞98％CD4+細(xì)胞)i.p.轉(zhuǎn)移進(jìn)SCID(BALB/c)接受者小鼠中。10天后處死所有接受者小鼠。從用OVA脈沖樹突細(xì)胞免疫的小鼠分離的CD4+T-細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，沒有觀察到SCID小鼠的心肌炎(n＝5)。p＜0.05，F(xiàn)isher’s精確檢驗。實施例3-用myhc-α脈沖的、激活的樹突細(xì)胞免疫導(dǎo)致收縮功能障礙和擴(kuò)張性心肌病從未建立擴(kuò)張性心肌病和感染后自體免疫心肌炎之間的因果關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的小鼠模型中，樹突細(xì)胞接種后5至10天炎癥達(dá)到峰值并在最后樹突細(xì)胞接種后約第12天開始消散(結(jié)果未顯示)。重要的是測定樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌炎是否在炎癥浸潤消散后將發(fā)展為心肌病。如所述的41進(jìn)行心電圖測定。使用12-MHz探子(HewlettPackard)通過經(jīng)胸廓的心電圖測定異氟烷麻醉的小鼠。記錄射血速度，左心室收縮期末直徑(LVESD)，和舒張期末直徑(LVEDD)大小并根據(jù)以下公式計算收縮分?jǐn)?shù)百分比(FS)FS(％)＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD。VCFC計算為FS/校正心率的射血時間。圖3a顯示免疫后4周注射激活的myhc-α脈沖樹突細(xì)胞小鼠的心臟/體重比例(mg/g)和心臟的心電圖數(shù)據(jù)，與注射OVA脈沖樹突細(xì)胞的對照相比較。顯示了平均值±SD。心臟/體重比例，其中n＝8每組，*p＜0.005。圖3b顯示了注射myhc-α脈沖樹突細(xì)胞小鼠中提高的左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)，其中n＝8每組，**p＜0.05。圖3c顯示了myhc-α脈沖樹突細(xì)胞免疫小鼠的和OVA脈沖樹突細(xì)胞免疫對照動物的代表性心電圖。箭頭表示收縮(LVESD)和舒張(LVEDD)之間的距離。注意到myhc-α樹突細(xì)胞免疫動物中心臟直徑的大量擴(kuò)大，表現(xiàn)出擴(kuò)張性心肌病。圖3d顯示了纖維鞘收縮速度(VCFC)的降低(n＝5，**p＜0.05)，而圖3e顯示了myhc-α脈沖樹突細(xì)胞免疫小鼠中收縮分?jǐn)?shù)(％FS)的降低(n＝8，*p＜0.005)，作為削弱收縮性讀數(shù)的函數(shù)。與注射OVA脈沖樹突細(xì)胞的對照動物相反，注射myhc-α脈沖樹突細(xì)胞的小鼠中心臟/體重比例漸進(jìn)性提高(圖3a)。這些擴(kuò)大的心臟沒有炎癥浸潤液，但是顯示間質(zhì)性纖維化(未顯示)，其通常可以在心力衰竭中看到。令人感興趣地，樹突細(xì)胞免疫后4周小鼠的心電圖顯示提高的左心室舒張期末直徑(LVEDD)和左心室收縮期末直徑(LVESD)大小，表現(xiàn)為擴(kuò)張性心肌病(圖3b、c)此外，myhc-α脈沖樹突細(xì)胞免疫的小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的心臟功能障礙，如通過削弱的纖維鞘收縮速度(VCFC)(圖3d)和降低的收縮分?jǐn)?shù)(FS)(圖3e)測定的。因此，myhc-α脈沖樹突細(xì)胞的免疫導(dǎo)致纖維化改變、心室擴(kuò)張和收縮性削弱。這些數(shù)據(jù)提供了自體免疫心臟疾病與擴(kuò)張性心肌病和心力衰竭產(chǎn)生之間直接的因果關(guān)聯(lián)。實施例4-CD40在樹突細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性中的作用通過CD154-CD4026，27、4-1BB-4-1BB-L28，或RANK-RANK-L29配體-受體相互作用來激活樹突細(xì)胞對樹突細(xì)胞成熟和共刺激分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子產(chǎn)生是關(guān)鍵性的。需要測定這些分子相互作用中的哪一個涉及注射的樹突細(xì)胞啟動“自體侵略性”響應(yīng)的能力。為了體內(nèi)CD40-CD40L阻斷，將200μg抗CD40L阻斷抗體(MR-1)注射進(jìn)小鼠中30。如所述的28使用TKS-1單克隆抗體[200μg]來阻斷4-1BBL-4-1BB相互作用。對照接受了非特異性同型抗體(Pharmingen)。使用250μg/小鼠的人OPG融合蛋白來體內(nèi)阻斷RANK-RANKL相互作用39。每隔一天以200μ1PBS/小鼠將所有阻斷劑注射進(jìn)小鼠中。在LPS激活過程中將重組RANK-L加入myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有提高心肌炎易感性而超過用LPS單獨觀察到的(表1)。此外，通過誘餌受體(decoyreceptor)OPG體內(nèi)阻斷RNAK-RANK-L相互作用對樹突細(xì)胞介導(dǎo)疾病的嚴(yán)重程度或發(fā)病率沒有明顯影響(表2和數(shù)據(jù)未顯示)。與RANKL-RANK相似，使用阻斷TSK-1抗體28在體外樹突細(xì)胞培養(yǎng)物中(未顯示)或體內(nèi)(未顯示)抑制4-1BB，對疾病發(fā)病率或疾病嚴(yán)重程度沒有顯著影響。相反，用LPS和刺激抗CD-40抗體體外共刺激myhc-α樹突細(xì)胞顯著地提高了樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心臟炎癥(表1)。已知激活的樹突細(xì)胞在體內(nèi)與T-細(xì)胞表達(dá)CD40L相互作用，我們用CD40L阻斷抗體治療接種樹突細(xì)胞的小鼠30。體內(nèi)CD40-CD40L相互作用的阻斷幾乎完全防止了疾病(表2)。然后通過myhc-α脈沖的CD40-/-樹突細(xì)胞沒有誘導(dǎo)CD40+/+小鼠中心肌炎的事實在遺傳上證實了CD40共刺激的作用(表2，圖4a，d)。圖4a和4d表明將CD40+/+樹突細(xì)胞接種入野生型接受者小鼠中后心臟組織中心臟炎癥的不存在。重要地，將CD40+/+樹突細(xì)胞接種入CD40-/-小鼠(圖4b、e)中引發(fā)了心臟炎癥，與野生型接受者中的程度相似(圖4c、f和表2)。圖4b和4e表明將野生型樹突細(xì)胞接種入CD40-/-接受者中后的心臟炎癥(箭頭)。圖4c和4f表明將野生型樹突細(xì)胞接種入野生型接受者中后兩個心室中的炎癥浸潤液(箭頭)。顯示了代表性整個心臟的圖像和較大的放大倍數(shù)(×140)。H&E染色。接種myhc-α脈沖的LPS/抗-CD40處理的樹突細(xì)胞10天后從小鼠獲得數(shù)據(jù)。表2.樹突細(xì)胞介導(dǎo)的心臟炎癥中對CD40的選擇性需要*P＜0.0256，P＜0.0152(Fisher’s精確檢驗)實施例5-TLR刺激給予了樹突細(xì)胞自體侵略性盡管發(fā)現(xiàn)CD40刺激對自體免疫心臟疾病的產(chǎn)生是重要的，當(dāng)我們用刺激Toll-樣受體4(TLR4)的LPS共激活樹突細(xì)胞時，只引起了心臟炎癥。此外，用LPS單獨激活myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞可以誘導(dǎo)低發(fā)病率的中度心臟炎癥(表1)。不同種類的病原體涉及自體免疫性的發(fā)病機(jī)理，不同的感染引發(fā)劑能夠通過截然不同的TLR激活先天免疫系統(tǒng)21。因此我們測定了該作用是否對LPS是特異性的或其它TLR的激活是否也足以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫性。用LPS(TLR4)或肽聚糖(其刺激TLR1、TLR2和TLR6)或dsRNA(其刺激TLR3)或CpG(其刺激TLR9)參考文獻(xiàn)21刺激myhc-α脈沖的樹突細(xì)胞導(dǎo)致了嚴(yán)重的心肌炎(圖5a-e)。接種myhc-α脈沖樹突細(xì)胞10天后小鼠的心臟切片顯示于圖5a至5d中(放大倍數(shù)×560)，當(dāng)用以下物質(zhì)激活時LPS/抗CD40(圖5a)；dsRNA/抗CD40(圖5b)；CpG/抗CD40(圖5c)；和PGN/抗CD40(圖5d)。個體小鼠的疾病發(fā)病率和炎癥的嚴(yán)重程度顯示于圖5中，底部畫面。顯示了代表性心臟圖像(H&E染色)。由單核細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞和CD4+T-細(xì)胞、粒性白細(xì)胞和一些嗜曙紅細(xì)胞，構(gòu)成了炎癥浸潤液。對于所有測試的TLR，疾病誘導(dǎo)依賴CD40+T細(xì)胞，使用過繼轉(zhuǎn)移實驗(未顯示)。因此，TLR可以提供普通信號來給予樹突細(xì)胞“自體侵略性”。這些發(fā)現(xiàn)顯示三種分子事件必須與樹突細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫心肌炎發(fā)生一致遺傳上敏感背景中自體蛋白的攝取、通過CD40由宿主自體免疫系統(tǒng)的特異性共刺激，以及最重要的TLR激活。令人感興趣地，所有測試的TLR對樹突細(xì)胞的刺激足以引起自體侵略性響應(yīng)。實施例6-CD40和TLR通過樹突細(xì)胞在IL-1β和IL-12產(chǎn)生中的協(xié)作圖6a和6b顯示了用LPS/抗CD40刺激12小時后，共刺激分子在CD40+/+(6a)和CD40-/-(6b)樹突細(xì)胞上的表達(dá)。FACS直方圖控制于CD11c+CD11b+MHC類II+活細(xì)胞(ICAM，B7.1，B7.2)或CD11c+CD11b+活細(xì)胞。CD40共刺激的疾病促進(jìn)效果似乎不是由于共刺激分子提高的表達(dá)。如圖6c中所示的，用抗CD40加LPS刺激樹突細(xì)胞CD4+/+或CD40-/-后，激活標(biāo)記物如MHC類II分子、CD80、CD86和ICAM-1的上調(diào)沒有不同。此外，在CD40激活不存在或存在下，用各種TLR刺激劑刺激野生型樹突細(xì)胞后，TNF-α或IL-6產(chǎn)生不存在可觀察的差異(圖6c)。圖6c顯示了在刺激抗CD40抗體不存在或存在下(5μg/ml)，用所示的TLR刺激劑(1μg/mlLPS，100μg/ml聚(IC)，10μMCpG-ODN，或10μg/mlPGN)刺激12小時后，樹突細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平。數(shù)據(jù)表示為四個培養(yǎng)孔的平均(±SD)并表示具有相似數(shù)據(jù)的幾個實驗中的一個。相反，只通過CD40或TLR刺激的樹突細(xì)胞和TLR刺激劑加抗CD40激活的那些樹突細(xì)胞之間IL-1β和IL-12p70水平顯著不同，如圖6c中所示的。這些差異不是由于體外培養(yǎng)達(dá)24小時樹突細(xì)胞凋亡的改變(未顯示)。因此，CD40和TLR刺激在樹突細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β和IL-12p70的誘導(dǎo)中協(xié)同作用。為了論述IL-1β和IL-12p70是否對樹突細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥心臟疾病是重要的，我們用肽脈沖的、抗CD40和TLR激活的樹突細(xì)胞免疫了IL-1R1和IL-12β1-受體突變小鼠。所有情況中，發(fā)現(xiàn)通過IL-1受體1型和IL12-IL12R系統(tǒng)發(fā)出信號是引發(fā)自體免疫性需要的(表3)。然而，接種野生型樹突細(xì)胞誘導(dǎo)了IL-1R1-/-小鼠中的心肌炎和自體侵略性CD4+T細(xì)胞，但在IL-12Rβ1-/-小鼠中沒有誘導(dǎo)。相反，接種IL-12R1β-/-樹突細(xì)胞后，野生型接受者產(chǎn)生心肌炎，但在接種IL-1R1-/-樹突細(xì)胞后沒有產(chǎn)生(表3)。因此，誘發(fā)CD4+T-細(xì)胞介導(dǎo)的心肌炎需要樹突細(xì)胞上而不是CD4+T-細(xì)胞上的IL-1R1發(fā)出信號。相反，激活的、抗原脈沖樹突細(xì)胞上的IL-12信號對這些細(xì)胞引發(fā)自體免疫性的能力不是必需的。相反，IL-12受體信號對CD4+效應(yīng)物T-細(xì)胞是關(guān)鍵性的，因為從IL-12Rβ1+/+樹突細(xì)胞免疫的IL-12Rβ1-/-小鼠分離的體外再刺激IL-12Rβ1-/-CD4+T-細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移沒有在同源SCID小鼠中誘導(dǎo)疾病(未顯示)。本發(fā)明的新實驗系統(tǒng)第一次使選擇性地仔細(xì)分析體內(nèi)自體免疫疾病模型中樹突細(xì)胞對效應(yīng)物細(xì)胞上的細(xì)胞因子和/或共刺激分子的必要功能成為可能。表3.IL-12和IL-1信號在樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的心臟疾病中的作用*P＜0.005，P＜0.05，P＜0.01(Fisher’s精確檢驗)實施例7-組織損傷與先天免疫系統(tǒng)激活一起足以誘導(dǎo)體內(nèi)心臟炎癥除了遺傳敏感性，環(huán)境和感染引發(fā)劑已經(jīng)涉及動物模型和人中多個自體免疫疾病的發(fā)病機(jī)理7，33。然而，沒有確定地鑒定出這樣的感染引發(fā)劑并且從未闡明借此不同病原體引發(fā)自體免疫性的機(jī)理。上述的結(jié)果表明自體抗原脈沖的CD通過CD40和TLR的刺激給予了這些抗原呈遞細(xì)胞自體侵略性。由于所有測試的TLR的激活足以產(chǎn)生樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的自體免疫心臟疾病，且不受理論限制，假設(shè)組織損傷連同非特異性炎癥引發(fā)劑應(yīng)該導(dǎo)致體內(nèi)自體免疫性。圖7a中圖示的所提出的自體免疫發(fā)病機(jī)理的模型中，組織損傷釋放了由樹突細(xì)胞捕獲和呈遞的自體抗原。如果Toll-樣受體激活發(fā)生，自體反應(yīng)性T-細(xì)胞應(yīng)答升高，其通過CD40-CD40L相互作用來擴(kuò)增。為了測試該假設(shè)，給小鼠注射不同數(shù)量的成年鼠中純化的凋亡心肌細(xì)胞，用/或不用100μg/小鼠抗CD40以及10μgLPS/小鼠，連續(xù)三天。通過UVA(10J/m2)照射或?qū)?0μmol/LH2O2加入培養(yǎng)孔中來誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。然后將凋亡的心肌細(xì)胞注射進(jìn)同源Balb/c小鼠中，接著進(jìn)行TLR的體內(nèi)刺激。接種2×106個凋亡的心肌細(xì)胞(i.p.)自身而沒用LPS沒有導(dǎo)致任何疾病(6只小鼠中0只)，如圖7b中所示的。然而，僅i.p.接種2×106個凋亡的心肌細(xì)胞，接著用LPS體內(nèi)激活TLR4，導(dǎo)致心臟中炎癥轉(zhuǎn)移灶，如圖7c中所示的。一起接種2×106個凋亡的心肌細(xì)胞(i.p.)和LPS(第0、1、2天10μgi.p.)導(dǎo)致8只小鼠中7只心臟炎癥(圖7c中的箭頭)。重要的是，單獨接種LPS沒有誘導(dǎo)心臟炎癥(5只小鼠中0只；未顯示)，與只有心肌細(xì)胞的相比較，對于LPS和心肌細(xì)胞p＜0.0001(Fisher’s精確檢驗)。此外，i.p.接種UV-照射或H2O2處理的心肌細(xì)胞，接著用LPS體內(nèi)激活TLR4足以誘導(dǎo)心臟炎癥。重要地，該心臟炎癥伴隨對抗心臟特異性myhc-α肽的IgG自體抗體的產(chǎn)生，如圖7d中所示的。圖7d顯示了i.p.接種LPS和2×106個凋亡的心肌細(xì)胞(LPS)10天后抗myhc-αIgG自體抗體滴度。單獨接種心肌細(xì)胞沒有誘導(dǎo)相應(yīng)的抗體滴度(對照)。顯示了個體小鼠的數(shù)據(jù)。相反，在TLR激活不存在下，凋亡的心肌細(xì)胞的對照接種沒有誘導(dǎo)心臟自體抗體。應(yīng)該注意到體內(nèi)LPS或CpG接種，或CD40加LPS單獨接種沒有導(dǎo)致心肌炎(未顯示)。這些結(jié)果顯示損傷心肌細(xì)胞的全身釋放結(jié)合先天免疫系統(tǒng)的非特異性激活足以誘導(dǎo)心臟炎癥。本發(fā)明不受限于在此所述實施方案的特征，但是包括權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有改變和改進(jìn)。參考文獻(xiàn)1.Libby，P.，Ridker，P.M.，&Maseri，A.Inflammationandatherosclerosis.(炎癥和動脈粥樣硬化)Circulation.105，1135-1143(2002)。2.Liuzzo，G.，等，TheprognosticvalueofC-reactiveproteinandserumamyloidAproteininsevereunstableangina.(嚴(yán)重不穩(wěn)定心絞痛中C-反應(yīng)性蛋白和血清淀粉樣A蛋白的預(yù)示價值)N.Engl.J.Med.331，417-424(1994)。3.Roig，E.，等，Seruminterleukin-6incongestiveheartfailuresecondarytoidiopathicdilatedcardiomyopathy.(先天擴(kuò)張性心肌病繼發(fā)的充血性心力衰竭中的血清白細(xì)胞間介素-6)Am.J.Cardio.82，688-690，A8(1998)。4.Mann，D.L.Inflammatorymediatorsandthefailingheartpast，present，andtheforeseeablefuture.(炎癥介質(zhì)和衰竭的心臟過去、現(xiàn)在和可預(yù)見的未來)Circ.Res.91，988-998(2002)。5.Calabrese，F(xiàn).，等，Moleculardiagnosisofmyocarditisanddilatedcardiomyopathyinchildrenclinicopathologicfeaturesandprognosticimplications.(兒童中心肌炎和擴(kuò)張性心肌病的分子診斷臨床病理學(xué)特征和預(yù)示的含義)Diagn.Mol.Pathol.11，212-221(2002)。6.Caforio，A.L.，Mahon，N.J.，Tona，F(xiàn).，&McKenna，W.J.Circulatingcardiacautoantibodiesindilatedcardiomyopathyandmyocarditispathogeneticandclinicalsignificance.(擴(kuò)張性心肌病和心肌炎中的循環(huán)心臟自體抗體致病和臨床意義)Eur.J.HeartFail.4，411-417(2002)。7.Rose，N.R.，Herskowitz，A.，Neumann，D.A.，&Neu，N.Autoimmunemyocarditisaparadigmofpost-infectionautoimmunedisease.(自體免疫心肌炎感染后自體免疫疾病的范例)Immunol.Today.9，117-120(1988)。8.Feldman，A.M.，&McNamara，D.Myocarditis.N.Engl.J.Med.343，1388-1398(2000)。9.Pontes-de-Carvalho，L.，等，ExperimentalchronicChagas′diseasemyocarditisisanautoimmunediseasepreventablebyinductionofimmunologicaltolerancetomyocardialantigens.(實驗性慢性恰加斯病心肌炎是通過誘導(dǎo)心肌抗原免疫耐受性可預(yù)防的自體免疫疾病)J.Autoimmun.18，131-138(2002)。10.Neu，N.，等，Cardiacmyosininducesmyocarditisingeneticallypredisposedmice.(心臟肌球蛋白誘導(dǎo)了遺傳上預(yù)先安排小鼠的心肌炎)J.Immunol.139，3630-3636(1987)。11.Bachmaier，K.，等，Chlamydiainfectionsandheartdiseaselinkedthroughantigenicmimicry.(通過抗原模擬連接了衣原體感染和心臟疾病)Science283，1335-1339(1999)。12.Smith，S.C.，&Allen，P.M.Expressionofmyosin-classIImajorhistocompatibilitycomplexesinthenormalmyocardiumoccursbeforeinductionofautoimmunemyocarditis.(正常心肌中II類肌球蛋白主要組織相容性復(fù)合物的表達(dá)在自體免疫心肌炎誘導(dǎo)之前發(fā)生)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，9131-9135(1992)。13.Banchereau，J.，&Steinman，R.M.Dendriticcellsandthecontrolofimmunity.(樹突細(xì)胞和免疫性的控制)Nature392，245-252(1998)。14.Mellman，I.，&Steinman，R.M.Dendriticcellsspecializedandregulatedantigenprocessingmachines.(樹突細(xì)胞專門的和調(diào)節(jié)的抗原加工機(jī)器)Cell106，255-258(2001)。15.Pulendran，B.，Palucka，K.，&Banchereau，J.Sensingpathogensandtuningimmuneresponses.(感知病原體并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答)Science293，253-256(2001)。16.Steinman，R.M.，&Nussenzweig，M.C.AvoidinghorrorautotoxicustheimportanceofdendriticcellsinperipheralTcelltolerance.(避免恐怖的自體毒性樹突細(xì)胞在外周T細(xì)胞耐受性中的重要性)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，351-358(2001)。17.Turley，S.J.Dendriticcellsincitingandinhibitingautoimmunity.(樹突細(xì)胞刺激和抑制自體免疫性)Curr.Opin.Immunol.14，765-770(2002)。18.Liu，K.，等，Immunetoleranceafterdeliveryofdyingcellstodendriticcellsinsitu.(將垂死細(xì)胞原位遞送至樹突細(xì)胞后的免疫耐受性)J.Exp.Med.196，1091-1097(2002)。19.Menges，M.，S.等，Repetitiveinoculationsofdendriticcellsmaturedwithtumornecrosisfactoralphainduceantigen-specificprotectionofmicefromautoimmunity.(重復(fù)接種腫瘤壞死因子α促成熟的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠抗原特異性的保護(hù)以免于自體免疫性)J.Exp.Med.195，15-21(2002)。20.Ludewig，B.，Odermatt，B.，Landmann，S.，Hengartner，H.，&Zinkernagel，R.M.Dendriticcellsinduceautoimmunediabetesandmaintaindiseaseviadenovoformationoflocallymphoidtissue.(樹突細(xì)胞誘導(dǎo)自體免疫糖尿病并通過局部淋巴組織的重新合成來維持疾病)J.Exp.Med.188，1493-1501(1998)。21.Medzhitov，R.&Janeway，C.A.Jr.Decodingthepatternsofselfandnonselfbytheinnateimmunesystem.(先天免疫系統(tǒng)自體和非自體模式的解碼)Science296，298-300(2002)。22.Means，T.K.，等，HumanToll-LikeReceptorsMediateCellularActivationbyMycobacteriumtuberculosis(人Toll-樣受體介導(dǎo)了通過肺結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞激活)J.Immunol.163，3920-3927(1999)。23.Pummerer，C.L.，等，IdentificationofcardiacmyosinpeptidescapableofinducingautoimmunemyocarditisinBALB/cmice(能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠中自體免疫心肌炎的心臟肌球蛋白肽的鑒定)J.Clin.Invest.97，2057-2062.(1996)。24.Rose，N.R.&Bona，C.Definingcriteriaforautoimmunediseases(Witebskyspostulatesrevisited).(自體免疫疾病的限定標(biāo)準(zhǔn)(Witebskyspostulatesrevisited))Immunol.Today.14，426-430(1993)。25.Donermeyer，D.L.，Beisel，K.W.，Allen，P.M.，&Smith，S.C.Myocarditis-inducingepitopeofmyosinbindsconstitutivelyandstablytoI-Akonantigen-presentingcellsintheheart.(肌球蛋白誘導(dǎo)心肌炎的抗原決定部位組成型和穩(wěn)定地結(jié)合心臟中抗原呈遞細(xì)胞上的I-Ak)J.Exp.Med.182，1291-300(1995)。26.Grewal，I.S.，J.Xu，&Flavell，R.A.Impairmentofantigen-specificT-cellpriminginmicelackingCD40ligand.(引發(fā)缺乏CD40配體小鼠中抗原特異性T-細(xì)胞的損傷)Nature378，617-620(1995)。27.Cella，M.，等，LigationofCD40ondendriticcellstriggersproductionofhighlevelsofinterleukin-12andenhancesTcellstimulatorycapacityT-ThelpviaAPCactivation.(樹突細(xì)胞上CD40的連接引發(fā)了高含量白細(xì)胞間介素-12的產(chǎn)生和提高了T細(xì)胞刺激能力通過APC激活的T-T幫助)J.Exp.Med.184，747-752(1996)。28.Futagawa，T.等，Expressionandfunctionof4-1BBand4-1BBligandonmurinedendriticcells.(4-1BB和4-1BB配體在鼠樹突細(xì)胞上的表達(dá)和功能)Int.Immunol.14，275-286(2002)。29.Josien，R.，等，TRANCE，aTumorNecrosisFactorFamilyMember，EnhancestheLongevityandAdjuvantPropertiesofDendriticCeilsInVivo.(TRANCE，腫瘤壞死因子家族成員，提高了體內(nèi)樹突細(xì)胞的壽命和輔助特性)J.Exp.Med.191，495-502(2000)。30.Howard，L.M.，&Miller，S.D.AutoimmuneinterventionbyCD154blockadepreventsTcellretentionandeffectorfunctioninthetargetorgan.(CD154阻斷劑的自體免疫干涉防止了T細(xì)胞在靶器官中的保持力和效應(yīng)物功能)J.Immunol.166，1547-1553(2001)。31.Nishimura，H.，等，AutoimmunedilatedcardiomyopathyinPD-1receptor-deficientmice.(PD-1受體缺失小鼠中的自體免疫擴(kuò)張性心肌病)Science.291，319-322(2001)。32.Krishnagopalan，S.，Kumar，A.，Parillo，J.E.，&KumarA.Myocardialdysfunctioninthepatientwithsepsis.(膿毒病患者中的心肌功能障礙)Curr.Opin.Crit.Care.8，376-388(2002)。33.Benoist，C.&Mathis，D.AutoimmunityprovokedbyinfectionHowgoodisthecaseforT-cellepitopemimickry？(感染引起的自體免疫性對于T-細(xì)胞抗原決定部位mimickry是一種多么好情況？)Nat.Immunol.2，797-801(2001)。34.Campos，M.A.，等，ActivationofToll-likereceptor-2byglycosylphosphatidylinositolanchorsfromaprotozoanparasite.(通過原生動物寄生蟲的糖基磷脂酰肌醇錨激活Toll-樣受體2)J.Immunol.167，416-423(2001)。35.Kawabe，T.，等，TheimmuneresponsesinCD40-deficientmiceimpairedimmunoglobulinclassswitchingandgerminalcenterformation.(CD40缺失小鼠中的免疫應(yīng)答削弱的免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換和胚中心的形成)Immunity1，167-178(1994)。36.Magram，J.，等，IL-12-deficientmicearedefectiveinIFNγproductionandtype1cytokineresponses.(IL-12缺失小鼠在IFNγ產(chǎn)生和1型細(xì)胞因子響應(yīng)中是有缺陷的)Immunity4，471-4781(1996)。37.Labow，M.etal.AbsenceofIL-1signalingandreducedinflammatoryresponseinIL-1typeIreceptor-deficientmice.(IL-1信號的不存在并降低了IL-1I型受體缺失小鼠中的炎癥響應(yīng))J.Immunol.159，2452-2461(1997)。38.Eriksson，U.，Kurrer，M.O.，Sebald，W.，Brombacher，F(xiàn).，&Kopf，M.DualroleoftheIL-12/IFN-gammaaxisinthedevelopmentofautoimmunemyocarditisinductionbyIL-12andprotectionbyIFN-gamma.(IL-12/IFN-γ軸在自體免疫心肌炎發(fā)展中的雙重作用通過IL-12誘導(dǎo)和通過IFN-γ保護(hù))J.Immunol.167，5464-5469(2001)。39.Kong，Y.Y.等，ActivatedTcellsregulatebonelossandjointdestructioninadjuvantarthritisthroughosteoprotegerinligand.(激活的T細(xì)胞通過骨保護(hù)素配體調(diào)節(jié)佐劑關(guān)節(jié)炎中的骨丟失和關(guān)節(jié)損壞)Nature402，304-309(1999)。40.Lutz，M.B.，等，Anadvancedculturemethodforgeneratinglargequantitiesofhighlypuredendriticcellsfrommousebonemarrow.(從小鼠骨髓產(chǎn)生大量高純度樹突細(xì)胞的改進(jìn)培養(yǎng)方法)J.Immunol.Methods.223，77-92(1999)。41.Crackower，M.A.，等，Angiotensin-convertingenzyme2isanessentialregulatorofheartfunction.(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2是心臟功能必要的調(diào)節(jié)劑)Nature.417，822-828(2002)。權(quán)利要求1.制造對抗原反應(yīng)性樹突細(xì)胞的方法，包括獲得樹突細(xì)胞的樣品；和使樹突細(xì)胞接觸抗原和至少一種Toll-樣受體(TLR)刺激劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸抗原一段合適的時間，接著使樹突細(xì)胞接觸至少一種TLR刺激劑一段合適的時間。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中從動物的組織獲得樹突細(xì)胞，該組織選自外周血、骨髓、脾和淋巴結(jié)。4.權(quán)利要求1至3任一項的方法，其中TLR刺激劑選自脂多糖、聚(I:C)、CpG-ODN和肽聚糖。5.權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸抗原約30分鐘至約24小時。6.權(quán)利要求5的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸TLR刺激劑至多四小時。7.權(quán)利要求6的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸TLR刺激劑達(dá)兩小時。8.權(quán)利要求1至7任一項的方法，其中樹突細(xì)胞是CD11C+、CD11b+。9.權(quán)利要求8的方法，其中樹突細(xì)胞是CD11c+。10.權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸濃度約1至20μg/ml的抗原。11.權(quán)利要求1至10任一項的方法，其中使樹突細(xì)胞接觸抗CD40抗體。12.權(quán)利要求11的方法，其中抗CD40抗體的濃度為約3至5μg/ml。13.權(quán)利要求1至12任一項的方法，其中抗原是自體抗原或腫瘤抗原。14.治療動物腫瘤的方法，包括獲得腫瘤表達(dá)的腫瘤抗原，從動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過權(quán)利要求1至12任一項的方法制得腫瘤抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。15.權(quán)利要求14的方法，其中動物是人。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中通過靜脈內(nèi)灌輸或皮下注射將樹突細(xì)胞再次引入動物中。17.權(quán)利要求14至16任一項的方法，其中在與抗原接觸之前，在細(xì)胞因子的存在下培養(yǎng)樹突細(xì)胞。18.權(quán)利要求17的方法，其中細(xì)胞因子是IL-10。19.權(quán)利要求14至18任一項的方法，其中腫瘤選自黑素瘤、腎細(xì)胞癌、白血病和淋巴瘤。20.制造自體免疫疾病動物模型的方法，包括獲得與自體免疫疾病相關(guān)的抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過權(quán)利要求1至12任一項的方法制得對自體免疫疾病相關(guān)抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。21.權(quán)利要求20的方法，其中抗原是膠原或軟骨基質(zhì)蛋白，且自體免疫疾病是關(guān)節(jié)炎。22.權(quán)利要求20的方法，其中抗原是心臟特異性抗原，且自體免疫疾病是心肌炎。23.權(quán)利要求22的方法，其中抗原是myhc-α肽。24.權(quán)利要求20至23任一項的方法，其中動物選自小鼠、大鼠和豬。25.制造器官衰竭動物模型的方法，包括獲得器官特異性的自體抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過權(quán)利要求1至12任一項的方法制得對自體抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中。26.權(quán)利要求25的方法，其中抗原是myhc-α肽。27.通過權(quán)利要求20至26任一項的方法制得的自體免疫疾病動物模型。28.針對其調(diào)節(jié)動物中自體免疫疾病發(fā)展的能力篩選候選化合物的方法，包括獲得與自體免疫疾病相關(guān)的自體抗原，從非人動物獲得樹突細(xì)胞的樣品，通過權(quán)利要求1至12任一項的方法制得對自體抗原反應(yīng)性的樹突細(xì)胞，并將反應(yīng)性的樹突細(xì)胞再次引入動物中，其中在選自接觸自體抗原之前、接觸自體抗原的過程中、接觸自體抗原之后接觸TLR刺激劑之前、接觸TLR刺激劑的過程中和接觸TLR刺激劑之后的時間，使樹突細(xì)胞接觸候選化合物，并將動物的自體免疫反應(yīng)與用制得的對相同自體抗原反應(yīng)性的但未暴露于化合物的樹突細(xì)胞處理的動物中的自體免疫反應(yīng)相比較。全文摘要制造對抗原反應(yīng)性樹突細(xì)胞的方法，包括獲得樹突細(xì)胞的樣品，使細(xì)胞接觸抗原和至少一種Toll－樣受體刺激劑。通過該方法激活的樹突細(xì)胞提供了治療腫瘤和產(chǎn)生自體免疫疾病動物模型的手段。文檔編號A61K35/14GK1845988SQ200480025016公開日2006年10月11日申請日期2004年8月4日優(yōu)先權(quán)日2003年8月4日發(fā)明者J·派寧格,U·埃里克森申請人:分子生物技術(shù)院有限公司