專利名稱：用于毛發(fā)增粗的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過促進毛囊細(xì)胞優(yōu)選地毛乳頭細(xì)胞中角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(FGF-7)的表達增加而維持和促進毛發(fā)增粗的方法，并涉及促進FGF-7表達增加的組合物，尤其是用于維持和促進毛發(fā)增粗的頭皮外用劑。
背景技術(shù)：
在稱為高齡化社會、壓力社會的現(xiàn)代社會，由于多種原因引起頭發(fā)暴露在脫毛危機的機會越來越多。為了對付這些情況，提供更好的“育毛料”，進行了多種嘗試。作為育毛料，對毛發(fā)的效果主要包括1)發(fā)毛誘導(dǎo)效果(發(fā)毛促進效果、成長期誘導(dǎo)效果)；2)維持毛發(fā)的粗度或促進所述粗度增粗，即增粗效果；3)延長毛發(fā)成長期的效果；4)阻礙5α-還原酶的效果(抑制向早期退化期移動的效果)；5)促進血液循環(huán)的效果；6)殺菌效果；7)防止頭皮的效果；8)保濕效果；9)抗氧化效果等。
男性型脫發(fā)普遍的特性為毛發(fā)成長期縮短而致毛囊矮小化、毛發(fā)徑逐漸減小，變化為柔毛。在男性型脫毛者中，發(fā)現(xiàn)基本上觀察不到毛發(fā)密度(每單位面積的毛發(fā)數(shù))的減少，然而毛發(fā)徑極劇減小的事實(特開2002-322094號公報)?；诖耸聦?，注意到不僅誘導(dǎo)發(fā)毛具有重要性，而且上述增粗效果也具有重要性。
然而，至今為止尚未在生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平解明毛發(fā)增粗與何種機制相關(guān)，因此，研究和開發(fā)含有對維持和促進毛發(fā)增粗有效的藥物的育發(fā)物質(zhì)尚處于探索階段。如果能充分解明毛發(fā)增粗的機制，則可提供與現(xiàn)有的育發(fā)物質(zhì)相比具有更顯著效果的育發(fā)物質(zhì)。
發(fā)明公開本發(fā)明的課題是在生物學(xué)水平解明毛發(fā)增粗的機制、提供維持和促進毛發(fā)增粗的方法以及用于此目的的皮膚外用組合物。
FGF-7為由194個氨基酸組成的糖蛋白，為屬于成纖維細(xì)胞增殖因子家族的一種生長因子。熟知的事實是其由間葉系細(xì)胞的皮膚成纖維細(xì)胞等分泌，與表皮細(xì)胞上存在的特異性受體FGFR2 IIIb結(jié)合，通過旁分泌促進其增殖(Rubin J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86802-806；Marchese C等，J.Cell Physiol.1990，144326-332等)。此外，已顯示FGF-7不僅促進表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，還促進肝實質(zhì)細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞(Houseley R.M等，J.Clin.Invest.1994，941764-1777)等大范圍的上皮系細(xì)胞增殖以及促進毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖(Pierce G.F.等，J.Exp.Med.1994，179831-840)。而且，小鼠實驗顯示成長期的毛乳頭細(xì)胞表達FGF-7，而表現(xiàn)其功能所需的受體FGFR2在毛乳頭附近的毛母細(xì)胞上表達(Dev.Dyn.1996；205(4)379-386)，教導(dǎo)了FGF-7與毛生長相關(guān)。但是，對于FGF-7在毛生長中究竟起到何種作用尚未解明。本說明書中，我們建立了以下作用假說如果促進毛乳頭細(xì)胞中的FGF-7表達增加，其介導(dǎo)認(rèn)為是其靶細(xì)胞的毛母細(xì)胞等的增殖，通過對毛發(fā)生長期的延長作用而與毛發(fā)增粗相關(guān)。
首先，在探索將多種藥劑作用于毛乳頭細(xì)胞等而使FGF-7表達上升時，發(fā)現(xiàn)腺苷及其衍生物可促進FGF-7基因的表達增加。接下來，在對腺苷進行臨床試驗時，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)了其具有毛發(fā)增粗的效果。根據(jù)特開2002-322094號公報所記載，認(rèn)為為了維持和促進毛發(fā)增粗，至少以下三種成分即通過延長毛發(fā)生長期而發(fā)揮毛生長作用的成分(如苦參屬植物提取物)、通過抑制早期移向退化期而發(fā)揮防止脫毛效果的成分(如睪酮)、以及發(fā)揮誘導(dǎo)自休止期向生長期作用效果的成分(如氧化癸基四癸基胺)是必要的，因此單一化合物具有如此效果是令人吃驚的。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了毛乳頭細(xì)胞等中FGF-7的表達增加，并且更不用說也首次發(fā)現(xiàn)了FGF-7的表達增加與毛發(fā)增粗有關(guān)。
因此，本發(fā)明提供了維持和促進毛發(fā)增粗的方法，其特征在于促進毛囊細(xì)胞優(yōu)選地毛乳頭細(xì)胞中角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(FGF-7)的表達增加。
毛囊細(xì)胞中FGF-7的表達增加可通過在頭皮涂抹含有這樣的促進毛囊細(xì)胞中的FGF-7的表達增加的一種或多種藥劑(下文中有時稱為“FGF-7表達增加劑”)的皮膚外用劑而實現(xiàn)，其中所述一種或多種藥劑選自腺苷及其衍生物如腺苷-5’-磷酸、腺苷-5’-磷酸鹽、以及CCPA(2-氯-N6-環(huán)戊基腺苷)、Cl-IB-MECA(2-氯-N6-(3-碘芐基)-9-[5-(甲基氨甲?；?-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤)和NECA(N-乙基羧基酰胺腺苷)之中。優(yōu)選地，所述藥劑為腺苷。
另一方面，本發(fā)明提供了含有以這樣的藥劑為活性成分的促進FGF-7表達增加的組合物，所述藥劑選自腺苷及其衍生物如腺苷-5’-磷酸、腺苷-5’-磷酸鹽、以及CCPA、Cl-IB-MECA和NECA之中。
在合適的實施方案中，F(xiàn)GF-7的表達得到增加的細(xì)胞為毛乳頭細(xì)胞或外毛根鞘細(xì)胞。
在合適的實施方案中，上述藥劑為腺苷。
在合適的實施方案中，上述組合物為通過涂抹頭皮而使毛發(fā)增粗得以維持和促進的皮膚外用劑。
進一步在其它的方面，本發(fā)明提供了篩選維持和促進毛發(fā)增粗的藥劑的方法，其特征在于將候選藥劑應(yīng)用于細(xì)胞，優(yōu)選地應(yīng)用于毛囊細(xì)胞，更優(yōu)選地應(yīng)用于毛乳頭細(xì)胞或外毛根鞘細(xì)胞，選擇促進所述細(xì)胞的FGF-7表達增加的藥劑。優(yōu)選地，毛乳頭細(xì)胞為永生化毛乳頭細(xì)胞。
在合適的實施方案中，上述細(xì)胞的FGF-7的表達增加是通過測定細(xì)胞中FGF-7的量而確定的。
在更合適的實施方案中，上述測定是使用FGF-7的特異性抗體通過ELISA法或RIA法進行的。
在更合適的實施方案中，上述細(xì)胞的FGF-7的表達增加是通過測定自細(xì)胞提取的編碼FGF-7的mRNA量而確定的。
在更合適的實施方案中，上述mRNA的測定是通過RT-PCR法(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法)進行的。
本發(fā)明提供了可有效維持和促進毛發(fā)增粗的方法及用于此目的的組合物。
附圖簡述

圖1為將腺苷對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以FGF-7表達量(相對值)顯示。
圖2為將腺苷對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加3小時后FGF-7的相對表達量顯示。
圖3為將腺苷相關(guān)物質(zhì)對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加2小時后FGF-7的相對表達量顯示(實時PCRn＝4)。
圖4為將雙氫黃酮對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加2小時后FGF-7的相對表達量顯示(實時PCRn＝4)。
圖5為將3，4’-二甲基雙氫黃酮對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加2小時后FGF-7的相對表達量顯示(實時PCRn＝3)。
圖6為將3-甲基雙氫黃酮對毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加2小時后FGF-7的相對表達量顯示(實時PCRn＝4)。
圖7顯示含有腺苷的育毛料的毛發(fā)增粗效果(80μm或以上的增粗率)。
圖8為將腺苷對人永生化毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加2小時后FGF-7的相對表達量顯示。
圖9為將腺苷對外毛根鞘細(xì)胞中FGF-7表達增加的效果以藥劑添加3小時后FGF-7的相對表達量顯示。
實施發(fā)明的最佳方案下文中，對本發(fā)明的實施方案進行說明。
本發(fā)明提供了維持和促進毛發(fā)增粗的方法，其特征在于促進毛囊細(xì)胞優(yōu)選地毛乳頭細(xì)胞中角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(FGF-7)的表達增加。
本發(fā)明中所稱的毛發(fā)增粗通常是指抑制通過毛根的矮小化而產(chǎn)生的柔毛化、維持毛發(fā)的粗度或使之變粗。對于判斷有無毛發(fā)增粗的效果而言，由于毛發(fā)的粗度和質(zhì)存在個體差異，故優(yōu)選根據(jù)個人來確定。一般對于頭部一定面積的區(qū)域如1cm2、2cm2、5cm2中一定直徑的毛發(fā)如直徑40μm、60μm、80μm或100μm或以上的毛發(fā)根數(shù)，當(dāng)將本發(fā)明的FGF-7表達增加劑應(yīng)用至頭皮如連續(xù)應(yīng)用1個月、3個月或6個月或以上后基本上沒有減少時，如該減少率不到10％，優(yōu)選地不到5％時，判斷為維持毛發(fā)粗度；如直徑40μm、60μm、80μm或100μm的毛發(fā)根數(shù)實質(zhì)上增加時，如該增加率為5％或以上，優(yōu)選地10％或以上，更優(yōu)選地20％或以上時，判斷為促進毛發(fā)增粗。
毛囊細(xì)胞優(yōu)選地毛乳頭細(xì)胞中FGF-7表達增加是通過將含有促進毛囊細(xì)胞中FGF-7表達增加的一種或多種這樣的藥劑的皮膚外用劑涂抹頭皮而實現(xiàn)的，所述藥劑選自腺苷及其衍生物如腺苷-5’-磷酸、腺苷-5’-磷酸鹽、以及CCPA、Cl-IB-MECA和NECA之中。
腺苷為一種核苷，包括堿基部分為嘌呤衍生物的腺嘌呤。腺苷-5’-磷酸也稱為5’-腺苷酸，為腺苷中核糖的5’位羥基結(jié)合了1分子磷酸的核苷酸。
另外，腺苷-5’-磷酸鹽中，作為形成鹽的反荷離子，可為任一與酸形成反荷離子的物質(zhì)，包括如鈉、鉀、鈣等。此外作為腺苷-5’-磷酸鹽，也可使用其水合物。
CCPA、Cl-IB-MECA、NECA為腺苷相關(guān)物質(zhì)。CCPA、Cl-IB-MECA、NECA可自Sigma公司獲得。
上述腺苷、腺苷-5’-磷酸和腺苷-5’-磷酸鹽、CCPA、Cl-IB-MECA和NECA可使用作為試劑而市售的腺苷、腺苷-5’-磷酸和腺苷-5’-磷酸鹽、CCPA、Cl-IB-MECA和NECA。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物可為皮膚外用劑，優(yōu)選地為頭皮外用劑，如為育毛料或養(yǎng)毛料。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物中包含占總量如0.01～20.0質(zhì)量％的上述FGF-7表達增加劑，優(yōu)選地0.1～10.0質(zhì)量％的上述FGF-7表達增加劑。由于該混合量不足所述組合物總量的0.01質(zhì)量％時，上述成分不能充分發(fā)揮增粗效果，所以不優(yōu)選，此外，該混合量超過所述組合物總量的20.0質(zhì)量％時，給調(diào)劑帶來障礙的傾向顯著，有時不優(yōu)選。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物尤其是皮膚外用劑可通過直接涂抹或散布至皮膚而經(jīng)皮施用。另外，由于其施用量隨外用劑的具體形式、使用者的年齡、癥狀等變化，故不可明確限定，但當(dāng)施與人時，對于體重1Kg和1天，上述FGF-7表達增加劑通常以0.01～100.0mg，優(yōu)選地0.1～10.0mg的施用量施用，優(yōu)選地將所述量1日1次或分為2～4次施用。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物尤其是皮膚外用劑對于以人為首的哺乳動物顯示良好的維持和促進毛發(fā)增粗作用，作為護發(fā)用藥品、準(zhǔn)藥品或化妝品是有用的。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物尤其是皮膚外用劑所采用的劑型優(yōu)選地為可應(yīng)用至表皮的外用劑劑型，可選擇如液體狀、乳液狀、膏狀、氣溶膠狀等劑型。此外，本發(fā)明的組合物的形態(tài)可為任一形態(tài)，可采用如營養(yǎng)水、發(fā)膏、摩絲、洗發(fā)香波、染發(fā)劑、乳液、化妝水、面膜、氣溶膠等形態(tài)。特別優(yōu)選將本發(fā)明的組合物涂抹表皮而使用。對涂抹方法無特別的限制，優(yōu)選如對頭皮1日涂抹1次或1次以上，如1日1至3次，根據(jù)涂抹的皮膚面積適量涂抹如涂抹1～5ml。
本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物尤其是皮膚外用劑中，除了必需成分的上述香料外，根據(jù)需要且只要不影響本發(fā)明的預(yù)期效果，可混合在化妝品、準(zhǔn)藥品、藥品等中通常使用的多種油性或水性成分、保濕劑、增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、香料、著色劑、多種藥劑等。
可混合例如高級脂肪酸、固態(tài)石蠟、流動石蠟、硅油、角鯊?fù)?、單油酸甘油酯、橄欖油、肉豆蔻酸異丙酯、高級醇等油分；甘油、透明質(zhì)酸、丙二醇、麥芽糖醇、端膠原(atelocollagen)、乳酸鈉等保濕劑；榅桲粘質(zhì)物、羧基乙烯基聚合物、黃原酸膠等增稠劑；煙酰胺、芐基煙酸酯、維生素E乙酸酯、當(dāng)藥提取物、卡普氯銨、乙酰膽堿衍生物等血管擴張劑；絲氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等氨基酸類；維生素B6、維生素E類、生物素、泛酸等維生素類；煙酸、甲基煙酸酯、生育酚煙酸酯等煙酸酯類；千金藤素(cepharanthine)等皮膚功能亢進劑；雌二醇等的女性激素劑；甘草次酸、甘草酸、甘菊色素等消炎劑；扁柏硫醇、六氯苯酚、苯扎氯銨、十六烷基氯化吡啶、十一碳烯酸、三氯碳酰苯胺、硫氯酚等抗菌劑；薄荷醇等清涼劑；水楊酸、鋅類、乳酸類等；檸檬酸等有機酸類。
可期待本發(fā)明的FGF-7表達增加組合物尤其是皮膚外用劑進一步通過加入除上述FGF-7表達增加劑以外的、認(rèn)為具有育毛作用的已知育毛成分如敏樂定、環(huán)孢菌素等而具有更有效的育毛效果。
本發(fā)明還提供了篩選維持和促進毛發(fā)增粗的藥劑的方法。所述方法的特征在于將候選藥劑應(yīng)用至細(xì)胞，優(yōu)選地應(yīng)用至毛囊細(xì)胞，更優(yōu)選地應(yīng)用至毛乳頭細(xì)胞或外毛根鞘細(xì)胞，選擇使所述細(xì)胞的FGF-7表達增加的藥劑。
作為毛乳頭細(xì)胞，可使用來自人的正常毛乳頭細(xì)胞，或可使用容易獲得的而且增殖速度快的有利的永生化毛乳頭細(xì)胞，如特開平11-89565號公報所記載的通過使用SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)化而獲得的永生化毛乳頭細(xì)胞等。另外，在篩選時，除了可使用毛乳頭細(xì)胞外，還可使用產(chǎn)生FGF-7的間葉系細(xì)胞如自人分離的皮膚成纖維細(xì)胞、其它的來自毛囊的細(xì)胞如外毛根鞘細(xì)胞等。
細(xì)胞中FGF-7的表達增加可通過例如測定細(xì)胞中FGF-7的量而確定。優(yōu)選地，所述測定可使用人FGF-7特異的抗體，通過本領(lǐng)域公知的方法如利用熒光物質(zhì)、色素、酶等的免疫染色法、Western印跡法、免疫測定法如ELISA法、RIA法等多種方法實施。此外，可通過自細(xì)胞提取RNA，測定編碼人FGF-7的mRNA量而確定。mRNA的提取、其量的測定也是本領(lǐng)域公知的，例如RNA的定量可通過逆轉(zhuǎn)錄后的定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)進行。例如，可使用以下的引物組合實施定量PCR。
組合1正向引物5’-CATGAACACCCGGAGCACTAC-3’(NM_002009419-439)(序列編號1)反向引物5’-CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC-3’(NM_002009669-646)(序列編號2)PCR產(chǎn)物大小251bp組合2正向引物5’-CACAAATGGATACTGACATGGA-3’(NM_002009449-470)(序列編號3)反向引物5’-TCACTCTTATATCCCCTCCTTC-3’(NM_002009644-623)(序列編號4)PCR產(chǎn)物大小196bp(J Clin Endocrinol Metab 88(2)，773-，2003)組合3正向引物5’-CTTTGCTCTACAGATCATGCTTTC-3’(NM_002009480-503)(序列編號5)反向引物5’-TTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCTG-3’(NM_0020091022-999)(序列編號6)PCR產(chǎn)物大小543bp(J Clin Invest 92，2408-，1993)以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但所述實施例不應(yīng)解釋為對本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。另外，在以下的實施例等中，如果沒有特別指出，所示混合量的值均表示相對于被混合的對象總體而言的質(zhì)量％。
實施例實驗1通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(1)1)細(xì)胞培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞(dermal papillae cell；DPC)使用來自34歲女性的、自作為整形手術(shù)的副產(chǎn)物而產(chǎn)生的人頭皮分離并培養(yǎng)后凍結(jié)保存的DPC。以使細(xì)胞密度成為1.0～1.5×104個/cm2的細(xì)胞密度播種，在MEM(GIBCO)+10％FBS中，37℃ 5％CO2的條件下培養(yǎng)。每周2次更換培養(yǎng)基，至細(xì)胞密集(自播種10天～20天后)，使用0.25％胰蛋白酶將細(xì)胞自培養(yǎng)皿剝離并回收，然后再以1.0～1.5×104個/cm2的密度播種。
2)培養(yǎng)細(xì)胞的藥劑處理解凍后經(jīng)傳代1-3次培養(yǎng)的DPC以4.0×104個/孔的密度播種至24孔板，4天后，向亞密集的細(xì)胞更換溶解有100μM濃度腺苷的MEM(未添加血清)。對照細(xì)胞僅使用MEM(未添加血清)并進行同樣的處理。
3)RT-PCR添加腺苷2、4、8、24小時后，使用MagNAPureLC(Roche Diagnos-tics公司)自培養(yǎng)細(xì)胞提取mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II(Invitrogen)的試劑盒合成cDNA。以所述cDNA為模板，通過LightCycler(RocheDiagnos-tics公司)使用與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光色素CyberGreen I進行實時PCR，進行表達量的比較。具體而言，使用LightCycler-FastStartDNA Master SYBR Green I試劑盒(Roche Diagnos-tics公司)，根據(jù)所附的手冊制備總量20μl的反應(yīng)液(MgCl22mM，正向引物和反向引物各0.25μM)，使用LightCycler進行PCR反應(yīng)(酶活化95℃10分鐘，熱變性95℃/15秒、退火58℃/5秒、延伸反應(yīng)72℃/10秒，熱變性至延伸反應(yīng)循環(huán)40次)，檢測每一循環(huán)延伸反應(yīng)結(jié)束時的熒光強度。所述熒光強度反映在所述時間點的PCR產(chǎn)物量。在PCR產(chǎn)物呈指數(shù)函數(shù)的擴增期，假設(shè)初始模板量A的PCR產(chǎn)物Y對于PCR循環(huán)數(shù)X滿足Y＝A×2X，從直至獲得一定量PCR產(chǎn)物的循環(huán)數(shù)算出基因表達量的相對值。以下為本研究所用的FGF-7擴增用引物。
正向引物5’-CATGAACACCCGGAGCACTAC-3’(NM_002009419-439)(序列編號1)反向引物5’-CACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTC-3’(NM_002009669-646)(序列編號2)PCR產(chǎn)物大小為251bp。
圖1顯示了該結(jié)果。如圖1所示，觀察到經(jīng)腺苷處理的毛乳頭細(xì)胞中FGF-7的表達顯著增加。
實驗2通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(2)與實驗1同樣，但腺苷濃度為10μM和100μM兩種，腺苷處理時間為3小時，實施RT-PCR實驗。結(jié)果如圖2所示。由圖2，可確認(rèn)經(jīng)腺苷處理的毛乳頭細(xì)胞中FGF-7的表達增加為腺苷濃度依賴性的。
實驗3-1通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(3)與實驗1同樣，但不使用腺苷，而使用腺苷相關(guān)物質(zhì)CCPA(2-氯-N6-環(huán)戊基腺苷)(100μM)、Cl-IB-MECA(2-氯-N6-(3-碘芐基)-9-[5-(甲基氨甲?；?-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤)(50μM)或NECA(N-乙基羧基酰胺腺苷)(10μM)，藥劑處理時間為3小時，實施RT-PCR實驗。(此外，當(dāng)藥劑的溶解度低時，也可在包含未添加藥物的對照的所有待加入藥物的培養(yǎng)基中將DMSO的終濃度制備為0.1％。)結(jié)果如圖3所示。由圖3，可確認(rèn)經(jīng)CCPA、Cl-IB-MECA或NECA處理的毛乳頭細(xì)胞中FGF-7的表達顯著增加。
實驗3-2通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(4)與實驗1同樣，但不使用腺苷，而分別使用雙氫黃酮、3，4’-二甲基雙氫黃酮(YGU427)、3-甲基雙氫黃酮(YGU429)100μM，藥物處理時間為2小時，實施RT-PCR實驗。結(jié)果分別如圖4、5、6所示。雖然顯示任一藥物均具有FGF-7表達增加結(jié)果，但由于沒觀察到腺苷受體阻斷劑8-SPT(8-磺酰茶堿)引起的阻斷，表明FGF-7的表達增加不是必須要腺苷受體。
實驗4研究腺苷對毛發(fā)增粗的效果在以上發(fā)現(xiàn)的具有FGF-7增加效果的多種藥物中，采用以下的方法研究腺苷對毛發(fā)的增粗效果。
將具有下述組分1的含有腺苷的育毛料以及作為對照的具有下述組分2的含有煙酰胺的育毛料于呈現(xiàn)男性型脫毛的30-50歲男性受試者(每組51名)的頭發(fā)以1日2次，適量(約2-3ml)涂抹使用6個月，通過與使用開始時比較而研究腺苷的毛發(fā)增粗效果。在本實驗中，將柔毛定為具有直徑不到40μm的毛發(fā)，直徑60μm或以上的毛發(fā)定為粗毛，直徑80μm或以上的毛發(fā)定為相當(dāng)粗化的毛發(fā)。使用含有腺苷的育毛料后的第6個月時，與使用開始時比較，柔毛減少7％或以上，另外，直徑60μm或以上的粗毛增加10％或以上。進一步地，直徑80μm或以上的粗毛增加5％或以上。繼續(xù)使用含有腺苷的育毛料，與使用含有煙酰胺的育毛料相比較，前者的粗毛增加量顯著提高。結(jié)果如圖7所示。
此外，在研究含有腺苷的育毛料和含有煙酰胺的育毛料對毛發(fā)密度的效果時，沒有觀察到兩者之間具有統(tǒng)計學(xué)上的有意義差(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，明確了在培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞中顯示FGF-7表達增加效果的腺苷對毛發(fā)增粗的維持和促進是特別有效的。
含有腺苷的育毛料(組成1)


含有煙酰胺的育毛料(組成2)

實驗5通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(4)與實驗1同樣，但使用人永生化毛乳頭細(xì)胞(特開平11-89565號公報所記載的通過使用SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)化而獲得的人永生化毛乳頭細(xì)胞)作為DPC，藥物處理時間為2小時，實施RT-PCR實驗。
結(jié)果如圖8所示。由該圖可見，即使使用人永生化毛乳頭細(xì)胞作為毛乳頭細(xì)胞，也可確認(rèn)由腺苷所致的FGF-7表達增加。因此，明確了在篩選FGF-7表達增加劑時，可使用人永生化毛乳頭細(xì)胞。
實驗6通過定量PCR實驗研究FGF-7的表達增加(5)1)細(xì)胞培養(yǎng)人外毛根鞘細(xì)胞(outer root sheath cellORS)使用來自40歲女性的、自作為整形手術(shù)的副產(chǎn)物而產(chǎn)生的人頭皮分離并培養(yǎng)后凍結(jié)保存的ORS。以使細(xì)胞密度成為1.0～1.5×104個/cm2的密度播種，在K-SFM培養(yǎng)基(GIBCO)中，37℃5％CO2的條件下培養(yǎng)。以2.0×104個/孔的密度將P3的ORS播種至24孔板，3天后，向亞密集的細(xì)胞替換溶解有10或100μM濃度腺苷的KBM培養(yǎng)基(クラボゥ)。對照細(xì)胞僅使用KBM培養(yǎng)基，并進行同樣的處理。與實驗1同樣的方式進行RT-PCR。
結(jié)果如圖9所示。由該圖可見，即使為經(jīng)腺苷處理的外毛根鞘細(xì)胞，也觀察到與毛乳頭細(xì)胞同樣的FGF-7表達的顯著增加。
工業(yè)可利用性本發(fā)明使得提供有效維持和促進毛發(fā)增粗的方法和用于此目的的組合物成為可能。
序列表<110>株式會社資生堂<120>用于毛發(fā)增粗的方法和組合物<130>P907<150>JP2003-381470<151>2003-11-11<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>1catgaacacc cggagcacta c 21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>2cactgtgttc gacagaagag tcttc 25<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>3cacaaatgga tactgacatg ga 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>4tcactcttat atcccctcct tc 22<210>5
<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物<400>5ctttgctcta cagatcatgc tttc24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>反向引物<400>6ttgccatagg aagaaagtgg gctg2權(quán)利要求
1.維持和促進毛發(fā)增粗的方法，其特征在于，促進毛囊細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(FGF-7)的表達增加。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過在頭皮上涂抹含有以下記載的一種或多種促進毛囊細(xì)胞中的FGF-7的表達增加的藥劑的皮膚外用劑，從而使所述FGF-7的表達增加，上述促進毛囊細(xì)胞中的FGF-7的表達增加的藥劑選自腺苷、腺苷-5’-磷酸、腺苷-5’-磷酸鹽、CCPA(2-氯-N6-環(huán)戊基腺苷)、Cl-IB-MECA(2-氯-N6-(3-碘芐基)-9-[5-(甲基氨甲?；?-β-D-呋喃核糖基]腺嘌呤)和NECA(N-乙基羧基酰胺腺苷)之中。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述促進毛囊細(xì)胞中的FGF-7的表達增加的藥劑中至少一種為腺苷。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述毛囊細(xì)胞為毛乳頭細(xì)胞或外毛根鞘細(xì)胞。
5.促進FGF-7的表達增加的組合物，其特征在于，所述組合物中包含作為活性成分的、選自腺苷、腺苷-5’-磷酸、腺苷-5’-磷酸鹽、CCPA、Cl-IB-MECA和NECA之中的藥劑。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述藥劑中至少一種藥劑為腺苷。
7.如權(quán)利要求5或6所述的組合物，其為涂抹在頭皮上而維持和促進毛發(fā)增粗的皮膚外用劑。
8.篩選維持和促進毛發(fā)增粗的藥劑的方法，其特征在于，將候選藥劑應(yīng)用于細(xì)胞，選擇促進所述細(xì)胞的FGF-7的表達增加的藥劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，通過測定由細(xì)胞提取的編碼FGF-7的mRNA的量來確定所述細(xì)胞的FGF-7的表達增加。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，所述細(xì)胞為毛乳頭細(xì)胞、永生化毛乳頭細(xì)胞或外毛根鞘細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過促進毛囊細(xì)胞優(yōu)選地毛乳頭細(xì)胞中角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(FGF－7)的表達增加而維持和促進毛發(fā)增粗的方法，并提供了含有腺苷和/或其衍生物的促進FGF－7表達增加的組合物，尤其是提供了用于維持和促進毛發(fā)增粗的頭皮外用劑。
文檔編號A61Q7/00GK1878530SQ20048003327
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者江浜律子, 飯野雅人, 中澤陽介, 田島正裕, 尾鄉(xiāng)正志, 荒瀨誠治 申請人:株式會社資生堂