專利名稱：去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在使皮膚脫色素和/或亮白中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在化妝品或藥物組合物中的應(yīng)用以使皮膚脫色素和/或亮白從而保護(hù)以及再生表皮。
本發(fā)明涉及至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在化妝品或藥物組合物中的應(yīng)用以使表皮脫色素和/或亮白連同具有保護(hù)以及再生效果。此外，本發(fā)明的主題是包括至少一種這樣的凍干粉劑的表皮施用的化妝品或藥物組合物。
皮膚是構(gòu)成外界環(huán)境和內(nèi)臟之間界面的保護(hù)包層。然而，皮膚不是密閉的并且作為吸收器官，可以使溶解的物質(zhì)通過(guò)毛孔和毛囊滲透。
皮膚可以御寒，熱，射線；抗壓力，摩擦；抗化學(xué)制品引起的損害；抗微生物的侵入，水分以及熱的損耗。
皮膚抗紫外線的天然保護(hù)效果通過(guò)褐色素，黑色素進(jìn)行。黑色素存在于表皮的基底細(xì)胞層的黑色素細(xì)胞中。它合成自氨基酸，酪氨酸，所述酪氨酸由酪氨酸酶改性。黑色素的合成由紫外線誘導(dǎo)。皮膚的暗色是抵抗陽(yáng)光的第一天然保護(hù)，但是對(duì)于非常白晰皮膚是非常不足的。棕褐色皮膚是UV作用，黑色素合成中黑色素細(xì)胞活性的增加以及角質(zhì)細(xì)胞中黑色素儲(chǔ)存的結(jié)果。
黑色素的量以及黑色素細(xì)胞的數(shù)目是決定皮膚顏色的遺傳決定因素。
過(guò)量以及表皮產(chǎn)生黑色素產(chǎn)生如下斑點(diǎn)雀斑，黃褐斑，曬斑或老年斑。的確，根據(jù)最近的命名法，老化斑點(diǎn)是老年斑，其它斑點(diǎn)是曬斑。
“老化斑點(diǎn)”較小，淡褐色，扁平，通常是圓點(diǎn)。它們最常出現(xiàn)在臉部，手背，頸部(décolleté)以及前臂。它們由陽(yáng)光以及老化相結(jié)合的原因所引起。數(shù)目隨年齡增加。在UV線的反復(fù)作用下，黑色素細(xì)胞終止黑色素的產(chǎn)量的增加。
斑點(diǎn)是褐色“雀斑”，在冬季不會(huì)消失，很小并且很多，彼此之間非常接近。它們最常出現(xiàn)在臉部，肩部以及頸部。它們應(yīng)歸于過(guò)量紫外線并且可以在非常年輕的時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)。
“黃褐斑”表現(xiàn)為大的褐斑，具有不規(guī)則的輪廓，最常出現(xiàn)在臉上，有時(shí)為面具的形狀。當(dāng)這些斑點(diǎn)出現(xiàn)在懷孕期間，我們稱作黃褐斑，否則稱作黑斑病。它們由激素刺激(懷孕，內(nèi)分泌治療)連同暴露于UV線所引起。
所有這些類型的斑點(diǎn)也與遺傳有關(guān)，因此可以遺傳。
由于這種過(guò)度沉著的黑色素難看的表現(xiàn)，用于阻止和/或緩和其表現(xiàn)的表皮制劑的有效性是非常重要的。
化妝品以及藥物制劑的生產(chǎn)商正在持續(xù)尋找非侵蝕性的活性成分，可以抑制或直接或間接阻斷黑色素的合成，或抑制或阻斷黑色素體向角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此使這些斑點(diǎn)亮白，同時(shí)保護(hù)這些區(qū)域?qū)固?yáng)引起的色素形成。同樣化妝品制劑的生產(chǎn)商正在試圖發(fā)現(xiàn)用于脫色素的非侵蝕性的活性成分以便滿足黑人或亞洲人群對(duì)通過(guò)提供護(hù)膚品使其皮膚顏色亮白的日益增長(zhǎng)的需求。
為了克服其它現(xiàn)有的繁瑣和/或腐蝕性脫色素處理(激光，冷凍療法)的缺點(diǎn)，這些活性成分應(yīng)該可以同時(shí)保護(hù)皮膚和/或刺激構(gòu)成皮膚的細(xì)胞的再生。
的確，皮膚防護(hù)和/或皮膚細(xì)胞再生的刺激可以同時(shí)對(duì)抗加重斑點(diǎn)的因素由于多種原因引起的皮膚老化。
皮膚老化的首要原因是“程序性”老化，可以由于壓力，煙癮以及某些疾病而加速。長(zhǎng)年累月，皮膚喪失彈性，因?yàn)檎嫫ぎa(chǎn)生越來(lái)越少的骨膠原以及彈性蛋白纖維。因此結(jié)締組織逐漸削弱并且皮膚松弛。由于新陳代謝的改變，表皮的更新能力也趨向降低，變得很干燥以及稀薄。日積月累，皮膚也失去光澤，導(dǎo)致面色暗淡并且也可以通過(guò)利用亮白處理對(duì)抗。
老化的第二原因是激素產(chǎn)量的降低，其導(dǎo)致組織，細(xì)胞以及有機(jī)機(jī)能的累進(jìn)遞減。激素，諸如生長(zhǎng)激素(HGH)，睪丸激素，DHEA以及褪黑素在低于20歲的年齡高產(chǎn)量生成，它們有利于細(xì)胞更新。
這些不同的老化原因連同環(huán)境影響(各種污染尾氣，煙熏，工業(yè)煙塵，化學(xué)產(chǎn)品，等)導(dǎo)致自由基的過(guò)量產(chǎn)生，所述自由基靶向不同的細(xì)胞組分蛋白，脂類，糖以及DNA，并且是皮膚老化進(jìn)一步的原因。由某些外界影響的驅(qū)動(dòng)，所述自由基不斷地尋找其它分子以便形成鍵合。然后攻擊皮膚的膠原纖維，細(xì)胞膜以及脂肪層。他們改變細(xì)胞的遺傳，因此新的皮膚細(xì)胞的特性削弱。
身體通過(guò)對(duì)抗這些氧化反應(yīng)(抗-氧化劑)的不同酶系保護(hù)自身對(duì)抗這些侵略者。但是從20歲開始，天然防護(hù)機(jī)制逐漸削弱，在某種意義上單獨(dú)皮膚不再能防護(hù)其自身。
本申請(qǐng)人令人驚訝并料想不到的發(fā)現(xiàn)去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑可以實(shí)現(xiàn)這種組合的預(yù)定效果表皮脫色素和/或亮白，完全無(wú)害，同時(shí)保護(hù)以及再生表皮。
去分化細(xì)胞如干細(xì)胞一樣保留全部的細(xì)胞潛能。他們表達(dá)其基因組的全部基因，因此表達(dá)能夠使每種特化細(xì)胞保護(hù)其本身對(duì)抗外部環(huán)境的全部蛋白。
因此，本發(fā)明的第一方面是至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在生產(chǎn)化妝品或藥物組合物中的應(yīng)用，所述凍干粉劑可以使表皮脫色素和/或亮白從而保護(hù)以及再生表皮。
“去分化植物細(xì)胞”是指不存在特化特性并且本身可以再生產(chǎn)生其的植物的完整幼苗的任意植物細(xì)胞。這個(gè)細(xì)胞可以分離自完整植物或植物器官的任意樣品，諸如葉子，莖，根，種子，花朵，花瓣，花藥，果實(shí)等等，稱作外植體。
優(yōu)選地，使用葉子或種子的碎片作為外植體。
非常特別優(yōu)選的是外植體的體外培養(yǎng)。通過(guò)“體外培養(yǎng)”是指利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)的全部技術(shù)，在受完好控制的條件下可以從培養(yǎng)在限制培養(yǎng)基中或之上的外植體再生器官或整個(gè)植株。這些受完好控制的條件可以實(shí)現(xiàn)幼苗的完好再現(xiàn)性以及均一性。尤其是，這種培養(yǎng)方法提供了無(wú)限相同的克隆。在體外培養(yǎng)法中，可以列舉的現(xiàn)有技術(shù)描述的培養(yǎng)基有Gamborg(1968)，Murashige以及Skoog(1962)，Morel(1970)等的培養(yǎng)基，在E.F.George，DJM Puttock以及H.J.George(Exegetics Ltd 1987)的“Plant Culture Mediaformulationsand uses”中描述的制劑。
尤其是，優(yōu)選利用嗜鹽植物的去分化植物細(xì)胞，諸如Sa；icorniaramossisima(Salicorne)，Sueda vera，Beta maritima，Obioneportulacoides，海石竹，深海茴香(Crithmum maritimum)(地中海小蘭花(Criste Marine))，Ophrys sphegodes，Artemia vulgaris，Muscariscomosum，刺芫荽(Eryngium maritimum)，地榆(Sanguisorba minor)，辣根菜，藍(lán)堇，Vincetoxicum fullonum，起絨草，Heracleum spondylium，Inula crithmoides，歐亞旋覆花(Inula brittanica)，Inula viscosa，最優(yōu)選地中海小蘭花(深海茴香)的去分化植物細(xì)胞。嗜鹽植物是耐受高鹽量土壤的植物。他們發(fā)展了對(duì)抗其所定殖的腐蝕性的外部培養(yǎng)基的防御系統(tǒng)。尤其是，嗜鹽植物是能夠經(jīng)受高鹽量土壤，濕度以及風(fēng)的海濱植物。他們?yōu)榫S持細(xì)胞中的滲透壓力，防止水穿過(guò)原生質(zhì)膜流向具有高鈉含量的胞外區(qū)室而持續(xù)抗?fàn)帯?br> 當(dāng)使用嗜鹽植物時(shí)，尤其重要的是發(fā)展體外細(xì)胞培養(yǎng)，提供無(wú)限以及可重復(fù)的生物量以便保護(hù)這些物種，嗜鹽植物正處于海洋污染的危險(xiǎn)之中。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，也可以改變某些培養(yǎng)條件(pH，溫度，周圍環(huán)境氣體組成，培養(yǎng)基組成，光亮度)。去分化細(xì)胞趨向產(chǎn)生或更多或更少的某些胞內(nèi)物質(zhì)。
本發(fā)明的第二方面是表皮施用的化妝品或藥物組合物，其中組合物在生理可以接受的基質(zhì)中包括從0.05至2％，優(yōu)選從0.1到1％，最優(yōu)選0.5％的至少一種在這里描述的凍干粉劑。
實(shí)際上，這種凍干粉劑可以用作本發(fā)明的組合物的唯一活性成分。然而，可以將幾種凍干粉劑添加到本發(fā)明組合物的基質(zhì)中。
在本發(fā)明第一特定實(shí)施方案中，至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑被用于生產(chǎn)預(yù)計(jì)可以皮膚外表嫩化的化妝品或藥物組合物。
在本發(fā)明第二特定實(shí)施方案中，至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑被用于生產(chǎn)預(yù)計(jì)可處理稱作痣的斑點(diǎn)的化妝品或藥物組合物。
在本發(fā)明第三特定實(shí)施方案中，至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑被用于生產(chǎn)預(yù)計(jì)可亮白黑人或亞洲人皮膚的化妝品或藥物組合物。
下列實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)其范圍進(jìn)行限制。


圖1在簡(jiǎn)單重建的表皮SKINETHIC(角質(zhì)細(xì)胞)上用蘇木精/曙紅(HES)染色的一般形態(tài)。
圖2用蘇木精/曙紅(HES)在簡(jiǎn)單重建的包含黑色素細(xì)胞的表皮SKINETHIC上染色的一般形態(tài)。
圖3標(biāo)記聚角蛋白微絲蛋白。
圖4標(biāo)記KI-67(評(píng)價(jià)有絲分裂的指數(shù))。
實(shí)施例1從植物組織體外培養(yǎng)去分化的地中海小蘭花細(xì)胞1-獲得最初的愈傷組織利用一把剪刀在所選擇的區(qū)域(最小3cm)將莖、葉子等切割組織碎片。從此操作階段開始，必須在層流凈化罩的無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行全部操作。
為了對(duì)植物材料滅菌，將所述組織浸入乙醇30秒，然后除去溶劑，用3×100ml的無(wú)菌H2O沖洗組織，浸入次氯酸鈉中15分鐘，同時(shí)添加幾滴吐溫20并用3×100ml無(wú)菌H2O沖洗。
為了進(jìn)行組織培養(yǎng)，將組織碎片置入無(wú)菌平皿(125mm)中，切割組織碎片(2至3mm)，處理除去被次氯酸鈉漂白的部分。將由此獲得的外植體稍微切割，并取出半埋在瓊脂培養(yǎng)基(表1)中。
2-愈傷組織再植在此操作階段，必須在層流凈化罩的無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行全部操作。用刮鏟從新鮮的培養(yǎng)基取出2至3細(xì)胞簇(1至2cm)的愈傷組織。
將這些細(xì)胞簇取出并分散在新鮮的培養(yǎng)基上。
固體培養(yǎng)基的配方表1

3-在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增愈傷組織培養(yǎng)種子將愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移到等同于不含瓊脂的固體培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基(表1)中。在攪拌(110rpm/分鐘)條件下，于25℃，持續(xù)白光(3500lux，熒光燈管“日光”)在250mL錐形瓶中每一錐形瓶50mL的比率進(jìn)行培養(yǎng)。
每10-11天對(duì)其進(jìn)行稀釋以1∶4的比例進(jìn)行擴(kuò)增，即將100mL稀釋成400mL。
產(chǎn)生干燥物質(zhì)在5L錐形瓶中，以每錐形瓶2L，在攪拌條件下(110rpm/min)，于25℃在持續(xù)的白光(3500lux，熒光燈管“日光”)下培養(yǎng)細(xì)胞以1∶4稀釋度擴(kuò)增培養(yǎng)的種子12到13天。
應(yīng)當(dāng)指出，2，4-二氯-苯氧乙酸是完全代謝的并且在最終產(chǎn)品中不存在。
實(shí)施例2制備去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑將懸浮中的液體細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行離心以便使細(xì)胞沉淀。
將細(xì)胞通過(guò)150-200μm的篩子，冷凍，然后在平板冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。
實(shí)施例3在重建的表皮SKINETHIC上在含有去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑的化妝品制劑不具有毒性重建的表皮SKINETHIC是人表皮模型，由SkinEthic實(shí)驗(yàn)室公司(Nice，F(xiàn)rance)開發(fā)以及銷售。
1-在重建的簡(jiǎn)單表皮SKINETHIC(僅由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成)上將人源的角質(zhì)細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體培養(yǎng)基界面培養(yǎng)細(xì)胞14天，每隔一天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)第17天起開始將由此形成的表皮用于進(jìn)行研究。
進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以便確定接觸時(shí)間以及施用于重建表皮的產(chǎn)品的非-細(xì)胞毒性誘導(dǎo)量。
全部的試驗(yàn)一式兩份進(jìn)行批次1不接受任何產(chǎn)品的對(duì)照表皮批次2接受乳膏PXTS+0.1％AK205處理的表皮批次3接受乳膏PXTS+0.5％AK205處理的表皮批次4接受細(xì)胞凍干粉劑(AK 205)產(chǎn)品處理的表皮(AK 205)＝獲自實(shí)施例1和2的去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑PXTS＝對(duì)于非常干燥的皮膚將固定于10％甲醛溶液中的表皮包埋在石蠟塊中。用蘇木精/曙紅對(duì)4微米的縱剖面進(jìn)行染色病通過(guò)光學(xué)顯微鏡所代的照相機(jī)進(jìn)行拍照。
培養(yǎng)物應(yīng)該呈現(xiàn)出基底，刺狀，粒狀和完整的角膜細(xì)胞層，顯示直角化癥，并且表皮分層應(yīng)該是規(guī)則且正常的。基礎(chǔ)層細(xì)胞應(yīng)該呈垂直極化。在角膜層以下的粒層中剛好可見(jiàn)大量透明角質(zhì)顆粒(紫色)。
以每cm22μL的比率在處理24小時(shí)的重建的表皮上施加乳膏PXTS+0.1％ AK205以及乳膏PXTS+0.5％ AK205，與對(duì)照表皮相比并未誘導(dǎo)任何毒性。用蘇木精/曙紅染色后，所處理的表皮的組織學(xué)照片與那些對(duì)照表皮相當(dāng)(參見(jiàn)圖2)。
2-在包括黑色素細(xì)胞的重建的表皮SKINETHIC上
將人源的角質(zhì)細(xì)胞核黑色素細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體培養(yǎng)基界面培養(yǎng)細(xì)胞14天，每隔一天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)第10天起開始使用由此形成的IV型表皮(＝具有黑人特征的)。
進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以便確定接觸時(shí)間以及施用于重建表皮的產(chǎn)品的非-細(xì)胞毒性誘導(dǎo)量。
全部的試驗(yàn)一式兩份進(jìn)行批次1不接受任何產(chǎn)品的對(duì)照表皮批次2接受2％曲酸的陽(yáng)性對(duì)照表皮批次3接受乳膏PXTS+0.1％ AK205處理的表皮批次4接受乳膏PXTS+0.5％ AK205處理的表皮(AK 205)＝獲自實(shí)施例1和2的去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑將固定于10％甲醛溶液中的表皮包埋在石蠟塊中。用蘇木精/曙紅對(duì)4微米的縱剖面進(jìn)行染色病通過(guò)光學(xué)顯微鏡所代的照相機(jī)進(jìn)行拍照。
培養(yǎng)物應(yīng)該呈現(xiàn)出基底，刺狀，粒狀和完整的角膜細(xì)胞層，顯示直角化癥，并且表皮分層應(yīng)該是規(guī)則且正常的。基礎(chǔ)層細(xì)胞應(yīng)該呈垂直極化。在角膜層以下的粒層中剛好可見(jiàn)大量透明角質(zhì)顆粒(紫色)。
以每cm22μL的比率在處理24小時(shí)的重建的表皮上施加乳膏PXTS+0.1％ AK205以及乳膏PXTS+0.5％ AK205，與對(duì)照表皮相比并未誘導(dǎo)任何毒性。用蘇木精/曙紅染色后，所處理的表皮的組織學(xué)照片與那些對(duì)照表皮相當(dāng)(參見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例4在重建的含有黑色素細(xì)胞的表皮SKINETHIC上分析含有去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑的化妝品制劑的去色素效果。
1-試驗(yàn)方案將人源的角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體界面培養(yǎng)細(xì)胞10天，每天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)的第10天開始使用由此形成的IV型表皮(具有黑人特征的)。
所有試驗(yàn)一式兩份進(jìn)行批次1不接受任何產(chǎn)品的對(duì)照表皮批次2接受2％曲酸的陽(yáng)性對(duì)照表皮批次3接受乳膏PXTS+0.1％ AK205處理的表皮批次4接受乳膏PXTS+0.5％ AK205處理的表皮AK 205＝獲自實(shí)施例1和2的去分化地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑。
通過(guò)分光光度計(jì)在475nm處測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成(定性)，然后懸浮細(xì)胞，并溶解在NaOH(1N)和二甲基亞砜中30分鐘。
在培養(yǎng)階段末期，回收培養(yǎng)基，用PBS(磷酸緩沖鹽水)沖洗表皮并與1％的Triton X-100(Sigma，法國(guó))接觸，然后培養(yǎng)10分鐘。通過(guò)添加10mM Ca2+-以及不含Mg2+-的L-多巴胺(Sigma，法國(guó))的PBS溶液誘導(dǎo)酶促反應(yīng)。
黑暗條件下在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，通過(guò)由分光光度計(jì)在475nm處測(cè)定吸光度評(píng)價(jià)酪氨酸酶的活性。
2-結(jié)果a)黑色素的分析所獲的的結(jié)果概括在下表中

獲得的結(jié)果顯示乳膏PXTS+0.5％ AK205誘導(dǎo)整合黑色素細(xì)胞的重建表皮黑色素水平顯著的降低(-37％)。乳膏PXTS+0.1％ AK205與陽(yáng)性對(duì)照2％曲酸相比(-44％)該比率只略微降低(-13％)。
b)酪氨酸酶活性的分析獲得的結(jié)果概括在下表中

所獲的結(jié)果揭示產(chǎn)品乳膏PXTS+0.5％AK205與陽(yáng)性對(duì)照(-38％)相比誘導(dǎo)整合黑色素細(xì)胞的重建表皮酪氨酸酶活性顯著的降低(-32％)。用乳膏PXTS+0.1％ AK205產(chǎn)品處理后只觀察到略微的降低(-19％)。
總之，在所應(yīng)用的試驗(yàn)條件下，乳膏PXTS+0.5％AK205在整合黑色素細(xì)胞的重建表皮上顯示凈去色素活性。用乳膏PXTS+0.1％AK205只觀察到更加有限但確實(shí)存在的活性。
實(shí)施例5在重建的表皮SKINETHIC上檢測(cè)含有去分化的地中海小蘭花細(xì)胞凍干粉劑的抗輻射效果。
1-為什么分析丙醛？在生物系統(tǒng)中，分子氧穩(wěn)定存在并具有較低的反應(yīng)活性。其作為電子受體，并且以產(chǎn)生水作為還原的終止。但是O2的不完全還原誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基和諸如超氧陰離子O2-，毒性過(guò)氫氧化物自由基HO2-(在亞鐵的存在下，上述反應(yīng)可以產(chǎn)生高度侵蝕性的OH-)或者過(guò)氧化氫H2O2的代謝產(chǎn)物。
超氧化物歧化酶(SOD)通過(guò)將O2-非常迅速地歧化為H2O2保護(hù)細(xì)胞膜。相對(duì)穩(wěn)定的H2O2通過(guò)觸酶以及過(guò)氧化物酶還原為水(H2O)。由O2的不完全還原產(chǎn)生的這些自由基對(duì)于雙鍵非常敏感，所述雙鍵通過(guò)電子的非定域作用有助于其它自由基的出現(xiàn)。自由基鏈反應(yīng)的起始發(fā)生在聚不飽和脂肪酸上。然后在細(xì)胞膜內(nèi)觸發(fā)鏈反應(yīng)引起作為分解產(chǎn)品的丙醛(MDA)及其它醛和烷的釋放?？梢酝ㄟ^(guò)與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)進(jìn)行確定。
由于氧化過(guò)程和脅迫，作為主要細(xì)胞毒性標(biāo)記物之一的MDA的分析提供了指示給定物質(zhì)具有抗自由基活性的指示物。
2-試驗(yàn)方案將人源的角質(zhì)細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體界面培養(yǎng)細(xì)胞14天，每隔一天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)的第17天開始使用由此形成的表皮進(jìn)行研究。
將產(chǎn)品與表皮接觸24小時(shí)后一式三份進(jìn)行分析
批次1不接受任何產(chǎn)品的陰性對(duì)照表皮批次2接受乳膏PXTS+0.1％ AK205處理的表皮批次3接受乳膏PXTS+0.5％ AK205處理的表皮批次4接受細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)處理的表皮。
將所檢驗(yàn)的產(chǎn)品施用到以2μL/cm2的比率處理的每一表皮的表面上。
丙醛萃取產(chǎn)品與表皮接觸24小時(shí)后，將它們懸浮于含有如下成分的液體中-含有0.1NaCl；20mM EDTA的250μL Tris 50mM緩沖液，pH8-25μL的7％ SDS-300μL HCl(0.1N)-38μL的1％磷鎢酸的水溶液-300μL的0.67％的硫代巴比妥酸的水溶液在黑暗條件下50℃培養(yǎng)1小時(shí)并在冰水中冷卻后，將300ml的正-丁醇添加到每一個(gè)管中。在10000g，0℃離心10分鐘?；厥丈锨逡悍治鯩DA。
丙醛分析通過(guò)用HPLC(高壓液相色譜)分離MDA-TBA復(fù)合物后通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度分析MDA。
-泵Bischoff Model 2.200-自動(dòng)注射器Alcoot Model 788自動(dòng)上樣儀-Ultrasep CIS柱(30cm×0.18cm)孔隙6mm-熒光檢測(cè)器，jasco 821-FI利用在515nm的激發(fā)以及553nm的發(fā)射進(jìn)行熒光檢測(cè)。所使用的洗脫液包含甲醇∶水，40/60(V/V)，利用1M的KOH調(diào)節(jié)其pH。
利用計(jì)算機(jī)程序ICS(Pic 3)(Instrumentation，Consumable，Service)與作為樣品處理的標(biāo)準(zhǔn)(0.125；0.25；0.5和1mM)相比進(jìn)行定量。
蛋白分析根據(jù)如下BRADFORD的方法進(jìn)行蛋白分析。在595nm處吸光度的增加與由分光光度計(jì)UNI CAM 8625測(cè)定的蛋白的濃度成正比。
3-結(jié)果a)生理脂過(guò)氧化所獲得的結(jié)果概括在下表中

ns不顯著結(jié)果顯示所檢驗(yàn)的產(chǎn)品在生理?xiàng)l件下與未處理的對(duì)照相比未誘導(dǎo)任何MDA的釋放。
b)由UVB誘導(dǎo)的脂過(guò)氧化所獲得的結(jié)果概括在下表中

*與陰性對(duì)照相比**與UVB照射的陽(yáng)性對(duì)照相比所獲得的結(jié)果顯示施用到重建的表皮SKINETHIC上的產(chǎn)品乳膏PXTS+0.1％ AK205和乳膏PXTS+0.5％ AK205以及細(xì)胞凍干粉劑對(duì)由紫外線B(150mj/cm2)誘導(dǎo)的脂過(guò)氧化提供了顯著的保護(hù)作用。
乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％ AK205以及細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)與輻射的表皮相比MDA的產(chǎn)量分別減少-21，-25和-28％。
用UVB輻射(陽(yáng)性對(duì)照)誘導(dǎo)MDA產(chǎn)量增加+28％，曝光之前施用乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％ AK205以及細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)可以將MDA產(chǎn)量保持在其生理水平。
實(shí)例6在重建的表皮SKINETHIC上確定含有去分化的地中海小蘭花細(xì)胞的凍干粉劑的化妝品制劑的刺激效果1-刺激的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)人角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物可以更詳細(xì)地描述維生素A衍生物對(duì)表皮逐漸分化的如下標(biāo)記的具體效果
上述基底層中KI-67的表達(dá)被激發(fā)，典型用于表皮增殖的角蛋白(K19，K13)的表達(dá)被誘導(dǎo)，觀察到基底細(xì)胞層極性的喪失，然而聚角蛋白微絲蛋白(filaggrine)，負(fù)責(zé)角蛋白在角質(zhì)層中的包裝的蛋白的合成被抑制。在培養(yǎng)基中0.05％視黃酸(維生素A酸)存在下24h內(nèi)，位于顆粒層中并具有高含量聚角蛋白微絲蛋白的透明角質(zhì)顆粒消失。因此類視色素誘導(dǎo)增殖的全面刺激以及表皮分化的抑制(Rosdy，M.等，InVitro Toxicology，Vol.10n°1，p.39-47，1997，″Retinoic acid inhibitsepidermal differentiation when applied topically on the stratum corneum ofepidermis formed in vitro by human keratinocytes grown on definedmedium″)。
因此聚角蛋白微絲蛋白和蛋白KI-67可用作表皮分化的標(biāo)記物。
2-表皮分化研究方案將人源化的角質(zhì)細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體界面培養(yǎng)細(xì)胞14天，每隔一天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)的第17天將由此形成的表皮用于進(jìn)行研究。
產(chǎn)品與表皮接觸24小時(shí)之后一式三份進(jìn)行分析批次1不接受任何產(chǎn)品的陰性對(duì)照表皮批次2接受乳膏PXTS+0.1％ AK205處理的表皮批次3接受乳膏PXTS+0.5％ AK205處理的表皮批次4接受細(xì)胞凍干粉劑處理(地中海小蘭花)的表皮。
將在24小時(shí)接觸的時(shí)間內(nèi)不接受任何產(chǎn)品的對(duì)照表皮以及接受所研究的產(chǎn)品的處理的表皮在-80℃冷凍。包埋在石蠟塊中后，切割這些表皮，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
利用聚角蛋白微絲蛋白重組的單克隆抗體進(jìn)行所述反應(yīng)。
結(jié)果抑制表皮細(xì)胞的分化重建的對(duì)照表皮和用乳膏PXTS+0.1％ AK205，乳膏PXTS+0.5％AK205和細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)處理的表皮的比較觀測(cè)顯示了聚角蛋白微絲蛋白在顆粒層標(biāo)記強(qiáng)度的差異(參見(jiàn)圖3)。
實(shí)際上，在生理?xiàng)l件下，用如下制劑處理獲得如下結(jié)果-乳膏PXTS+0.1％ AK205誘導(dǎo)表皮分化的凈減少，與未處理的對(duì)照相比顯示標(biāo)記的聚角蛋白微絲蛋白的凈減少，-乳膏PXTS+0.5％ AK205誘導(dǎo)表皮分化的凈減少，與未處理的對(duì)照相比顯示標(biāo)記的聚角蛋白微絲蛋白的凈減少，-細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)誘導(dǎo)表皮分化的凈減少，與未處理的對(duì)照相比顯示標(biāo)記的聚角蛋白微絲蛋白的凈減少。
3.表皮基底細(xì)胞層細(xì)胞增殖活性的研究方案將人源化的角質(zhì)細(xì)胞接種在限定(改性的MCDB 153)以及補(bǔ)料培養(yǎng)基中的0.63cm2的聚碳酸酯濾膜上。在空氣/液體界面培養(yǎng)細(xì)胞14天，每隔一天更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)的第17天將由此形成的表皮用于進(jìn)行研究。
通過(guò)免疫組化標(biāo)記揭示產(chǎn)品的活性產(chǎn)品與表皮接觸24小時(shí)之后一式三份進(jìn)行分析批次1不接受任何產(chǎn)品的陰性對(duì)照表皮批次2接受乳膏PXTS+0.1％ AK205處理的表皮批次3接受乳膏PXTS+0.5％ AK205處理的表皮批次4接受細(xì)胞凍干粉劑處理(地中海小蘭花)的表皮。
將不接受任何產(chǎn)品的對(duì)照表皮和接受所檢驗(yàn)的產(chǎn)品24小時(shí)接觸時(shí)間的處理的表皮固定在10％的甲醛中。在石蠟塊中包埋后，切割這些表皮并通過(guò)免疫組織化學(xué)處理。
利用核抗原KI-67的重組肽，抗體MIB1(Immunotech)進(jìn)行反應(yīng)。
由熱預(yù)處理對(duì)抗原解掩蔽后由過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶方法進(jìn)行所述的揭示。
用色蛋白DAB標(biāo)記顯示在下列各細(xì)胞周期的時(shí)期表達(dá)的生長(zhǎng)的細(xì)胞級(jí)分核位點(diǎn)KI-67的褐色＝＞G1和S＝潛伏期和細(xì)胞合成期＝＞G2＝細(xì)胞組分的兩分期＝＞M＝有絲分裂期通過(guò)計(jì)算著色的核位點(diǎn)，通過(guò)放大×250的光學(xué)顯微鏡與對(duì)照表皮載玻片相比每載玻片10個(gè)視野的比率，有絲分裂指數(shù)被評(píng)價(jià)為6。
結(jié)果表皮細(xì)胞增殖的刺激。
結(jié)果概括在下表中

免疫組化處理后，所有樣品的褐色核位點(diǎn)的計(jì)數(shù)顯示-乳膏PXTS+0.1％ AK205誘導(dǎo)基底層細(xì)胞較不顯著的增殖。著色的核位點(diǎn)的數(shù)目與未處理的對(duì)照相當(dāng)(參見(jiàn)圖4)。
-乳膏PXTS+0.5％ AK205與未處理的對(duì)照相比誘導(dǎo)基底層細(xì)胞較不顯著的增殖。著色的核位點(diǎn)的數(shù)目比未處理的對(duì)照要多(參見(jiàn)圖4)。
-細(xì)胞凍干粉劑(地中海小蘭花)與未處理的對(duì)照相比誘導(dǎo)基底層細(xì)胞顯著的增殖。著色的核位點(diǎn)的數(shù)目比未處理的對(duì)照要多得多(參見(jiàn)圖4)。
權(quán)利要求
1.至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在化妝品或藥物組合物中的應(yīng)用，所述凍干粉劑可以脫色素和/或亮白從而保護(hù)以及再生表皮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中去分化的植物細(xì)胞獲自體外培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中由體外培養(yǎng)獲得的去分化的植物細(xì)胞是細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中去分化的植物細(xì)胞是嗜鹽植物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中的嗜鹽植物是地中海小蘭花(Criste Marine)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中凍干粉劑通過(guò)阻斷酪氨酸酶活性使表皮脫色素和/或亮白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中凍干粉劑通過(guò)抗-自由基作用保護(hù)表皮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中凍干粉劑通過(guò)對(duì)表皮基底層細(xì)胞增殖的刺激作用使表皮再生。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中凍干粉劑通過(guò)對(duì)表皮分化的抑制作用再生表皮。
10.表皮施用的化妝品或藥物組合物，其中在生理可以接受的基質(zhì)中含有至少一種權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的凍干粉劑。
11.表皮施用的化妝品或藥物組合物，其中在生理可以接受的基質(zhì)中含有0.05％至2％的至少一種權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的凍干粉劑。
12.表皮施用的化妝品或藥物組合物，其中在生理可以接受的基質(zhì)中含有0.1％至1％的至少一種權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的凍干粉劑。
13.表皮施用的化妝品或藥物組合物，其中在生理可以接受的基質(zhì)中含有0.5％的至少一種權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的凍干粉劑。
14.權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的組合物，用于皮膚外表的嫩化。
15.權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的組合物，用于色素斑點(diǎn)的處理。
16.權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的組合物，用于黑人或亞洲人皮膚的亮白。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種去分化植物細(xì)胞的凍干粉劑在化妝品或藥物組合物中的應(yīng)用以使表皮脫色素和/或亮白連同具有保護(hù)以及再生效果。此外，本發(fā)明的主題是包括至少一種這樣的凍干粉劑的表皮施用的化妝品或藥物組合物。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1921827SQ200480041078
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月29日
發(fā)明者妮科爾·梅基德謝 申請(qǐng)人:海洋生物技術(shù)公司