專(zhuān)利名稱(chēng)：：包含篤斯越桔提取物的用于改善皮膚狀況的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于改善皮膚狀況的組合物，該組合物含有篤斯越桔(fecc/m'謹(jǐn)M/^"o^mL)提取物，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于改善皮膚狀況(皮膚老化)的組合物，該組合物可以預(yù)防和改善皮膚變色、雀斑、色素沉著等，以促進(jìn)皮膚變白，可以預(yù)防和去除皮膚皺紋，還可以提高皮膚的彈性。用于改善皮膚狀況的本發(fā)明組合物可以容易地以提取物或千燥的提取物粉末的形式制備，并且可以用作用于改善皮膚狀況的化妝品、功能性保健食品、藥物等的一個(gè)組分。
背景技術(shù)：
：近來(lái)，隨著平均壽命的延長(zhǎng)，老年人口增加，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和食品領(lǐng)域?qū)λダ系难芯恳苍谥鸩皆黾印Ｋ谢畹纳矬w都會(huì)因?yàn)槟挲g增長(zhǎng)而衰老，其中，衰老意味著隨著時(shí)間的推移，生物體適應(yīng)環(huán)境變化的能力逐漸減弱。同樣，皮膚也會(huì)衰老。由于皮膚的衰老，皮膚狀況會(huì)惡化，主要表現(xiàn)為皮膚皺紋和色素沉著的出現(xiàn)，以及皮膚彈性的下降等。皮膚內(nèi)外環(huán)境中出現(xiàn)的各種因素造成各種結(jié)構(gòu)變化，從而使皮膚經(jīng)歷老化過(guò)程。然而，現(xiàn)代人都希望讓皮膚變得更加清潔和漂亮，因此，人們正在積極地對(duì)用于改善皮膚狀況(防止皮膚衰老)的方法和材料進(jìn)行各種研究和實(shí)驗(yàn)。皮膚老化(主要表現(xiàn)為造成皮膚狀況惡化)的原因可以粗略地劃分為內(nèi)在老化和外在老化。內(nèi)在老化隨著年齡的增大而出現(xiàn)，而外在老化是由于外部因素(例如紫外線(xiàn)照射)造成的。具體地說(shuō)，外在老化也稱(chēng)為"光老化"，這是因?yàn)?，光老化主要因紫外線(xiàn)照射而進(jìn)展。在內(nèi)在的皮膚老化過(guò)程中，皮膚的特征性臨床表現(xiàn)包括細(xì)紋、真皮萎縮和皮下脂肪層的減少。在由于陽(yáng)光紫外線(xiàn)照射(這是外在老化的最主要原因)造成的光老化過(guò)程中，由于紫外線(xiàn)的照射，皮膚表皮中產(chǎn)生了大量的活性氧物質(zhì)(ROS)，其中，所述活性氧物質(zhì)導(dǎo)致黑色素增加，從而引起色素沉著，抑制了皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白的生物合成，并且引發(fā)對(duì)膠原蛋白和彈性蛋白分解的剌激，因而形成皺紋。本發(fā)明具體涉及對(duì)經(jīng)歷了光老化過(guò)程的皮膚狀況進(jìn)行改善(皮膚增白、除皺等)。盡管光老化的作用機(jī)制尚不明確，但是通過(guò)各種研究已經(jīng)知道，紫外線(xiàn)照射造成核酸和蛋白變異以及脂質(zhì)氧化，從而造成細(xì)胞染色體變異和細(xì)胞膜損傷，或者介導(dǎo)活性氧物質(zhì)而造成細(xì)胞變異。另外，來(lái)自太陽(yáng)的紫外線(xiàn)照射造成炎癥反應(yīng)(例如紅斑和水腫)和各種臨床變化(例如皮膚發(fā)黑和真皮細(xì)胞之間的物質(zhì)變異)。此外，目前正在進(jìn)行一些研究，以便判斷在如此之多的反應(yīng)中，是否有的反應(yīng)與皮膚鈹紋、皮膚彈性等有密切關(guān)系。由于紫外線(xiàn)照射所造成的光老化和自然老化等，皮膚狀況惡化，由此而可能出現(xiàn)的典型現(xiàn)象包括皮膚顏色變黑和變暗。與皮膚顏色有關(guān)的色素包括黑色素、類(lèi)黑素、胡蘿卜素、氧化的血色素和還原的血色素，最重要的是黑色素。黑色素具有用于自我保護(hù)的掩蔽功能，它可吸收或散射紫外線(xiàn)，以防止細(xì)胞或細(xì)胞中的組織受到紫外線(xiàn)照射引起損傷。黑色素沒(méi)有特征峰吸收波長(zhǎng)，其吸收全波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，而且還具有從皮膚除去活性氧物質(zhì)(例如過(guò)氧化物陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基和單線(xiàn)態(tài)氧)的優(yōu)良性能。然而，當(dāng)皮膚中存在過(guò)量的黑色素時(shí)，黑色素本身會(huì)產(chǎn)生活性氧，并且在某些情況中，會(huì)利用黑色素結(jié)構(gòu)中的兒茶酚或苯醌還原或氧化其他物質(zhì)。另外，已知黑色素本身顯示出自由基性能，使得它在人體上形成變色、雀斑等，從而使皮膚變黑變暗，加速皮膚老化，并且會(huì)誘發(fā)皮膚癌。已知的黑色素的生成途徑包括化學(xué)途徑，其中，利用酪氨酸酶由酪氨酸經(jīng)DOPA和DOPA-醌生成黑色素，或者包括通過(guò)黑素細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移而生成黑色素的途徑。通過(guò)抑制黑色素的生成而使皮膚增白的已知方法包括屏蔽紫外線(xiàn)的方法；抑制對(duì)于酪氨酸酶活性所必需的核碳水化合物合成的方法；抑制酪氨酸酶(它是與黑色素形成有關(guān)的酶)的活性的方法；使用對(duì)黑素細(xì)胞具有特異性的毒性物質(zhì)干擾黑素細(xì)胞的清除的方法；以及使用維生素C衍生物和胎盤(pán)提取物的方法。日本特開(kāi)平6-192062披露了作為增白物質(zhì)的氫醌。所披露的氫醌顯示出優(yōu)異的增白效果，但問(wèn)題是，它屬于致癌物質(zhì)而不適合用作化妝品等的原料。日本特開(kāi)昭56-7710披露了作為增白物質(zhì)的曲酸。曲酸顯示出抑制酪氨酸酶的良好性能，從而產(chǎn)生良好的增白效果，但問(wèn)題是，由于它有毒性而不適合用作化妝品、食品等的原料。日本特開(kāi)平4-9315披露了作為增白物質(zhì)的熊果苷，熊果苷從分布于高山地區(qū)的天然植物熊果提取或合成得到。然而，熊果苷存在造成皮膚刺激的問(wèn)題。另外，諸如薏苡和黃瓜等天然物質(zhì)很早就已經(jīng)使用，但是這些物質(zhì)對(duì)于黑色素的過(guò)量生成沒(méi)有作用。隨著皮膚狀況因光老化等而惡化，出現(xiàn)的典型現(xiàn)象有皮膚顏色變黑變暗，皮膚上皮受損并且出現(xiàn)皺紋。已知由于光老化在真皮變化中非常突出，所以皺紋的出現(xiàn)也歸因于真皮的變化。具體地說(shuō)，皮膚的真皮層的明顯變化是，無(wú)定形彈性組織在外部真皮中過(guò)度累積和真皮膠原纖維減少。盡管目前難以清楚地理解變皺的過(guò)程，但是已經(jīng)有很多與變鈹有關(guān)的結(jié)果，包括真皮膠原合成的下降、真皮膠原的分解活性增加、表皮基膜的損傷和表皮代謝活性的降低。另外，據(jù)信鈹紋的出現(xiàn)是由紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的各種生物化學(xué)和臨床變化的綜合作用造成的。在先前為解決皮膚皺紋問(wèn)題而進(jìn)行的嘗試中，有使化妝品中含有膠原的例子。然而，如果將膠原以化妝品的形式涂在皮膚表面，則存在的問(wèn)題是，難以透皮吸收聚合物膠原，使得不能充分預(yù)期其功能。此外，有的方法直接將膠原注入皮膚真皮中，但是該方法具有副作用，因而認(rèn)為不能作為去除皮膚皺紋的方案。己知剌激膠原合成的物質(zhì)包括視黃酸和來(lái)自動(dòng)物胎盤(pán)的蛋白(日本特開(kāi)平8-231370)。視黃酸需要復(fù)雜的配制技術(shù)，并且由于其導(dǎo)致例如皮膚刺激而具有使用安全方面的局限。來(lái)自動(dòng)物胎盤(pán)的蛋白存在致命的問(wèn)題，即，可能使用來(lái)自患有瘋牛病(牛海綿狀腦病)的牛的提取物。另6外，a-羥基酸(ABA)已證實(shí)對(duì)人體有效，各種維生素A衍生物(類(lèi)視黃醇)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)用于化妝品。然而，目前證明具有可靠臨床效果的只有這些物質(zhì)和紫外線(xiàn)掩蔽劑。在歐洲，從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，化妝品就標(biāo)明并宣稱(chēng)具有除皺效果，大約在1993年，用于改善皮膚狀況的組分，諸如神經(jīng)酰胺、AHA和視黃醇被引入化妝品中，并起了新的名稱(chēng)"功能性化妝品"。幾乎所有的化妝品公司都已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于皮膚增白或除皺的化妝品，但是這些產(chǎn)品僅限于化妝品，不能通過(guò)攝取來(lái)獲得去除皮膚皺紋的效果。另外，考慮到"食用化妝品"比"涂敷用化妝品"具有更快的效果，所以迫切需要研究和開(kāi)發(fā)用于改善皮膚狀況的"食用化妝品"以及用于改善皮膚狀況的"功能性食品"?，F(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道了一些具有通過(guò)攝取來(lái)改善皮膚狀況的效果的物質(zhì)，這些物質(zhì)包括很少數(shù)幾種皮膚增白物質(zhì)，例如維生素C、維生素E和番石榴提取物。即使在涂敷用化妝品的情況中，這類(lèi)物質(zhì)也僅限于氫醌和熊果苷的穩(wěn)定化衍生物、曲酸和維生素C(據(jù)認(rèn)為它們是氫醌的前體)以及天然物質(zhì)(與黑色素合成有關(guān)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑)。在涂敷用化妝品的情況中，這些化合物的效果已經(jīng)得到各種體外測(cè)試的驗(yàn)證，但是，由于這些化妝品不很令人滿(mǎn)意，例如其手感不及其他的除鮍和增濕產(chǎn)品，所以人們又合成了很多衍生物，并且檢驗(yàn)了一些新的天然物質(zhì)對(duì)皮膚狀況的改善效果。然而，距離例如供口服施用的新型產(chǎn)品的成功開(kāi)發(fā)仍然十分遙遠(yuǎn)。同時(shí)，在本發(fā)明中首次用作去除皮膚皺紋的組分的篤斯越桔是屬于杜鵑花(Rhododendron)科的落葉灌木，該植物自然生長(zhǎng)在朝鮮半島的漢拿山(Halla)、金剛山(Geumgang)和白頭山(Baekdu)等地，在67月開(kāi)花，在8月結(jié)果。篤斯越桔所含成分包括糖類(lèi)(8%11.8%)、果酸(2%2.25%)、鞣酸(0.15%0.25%)和纖維素。篤斯越桔目前已知的藥理學(xué)作用包括脈管保護(hù)、痢疾治療、抗?jié)儭⒖拱?、糖尿病視網(wǎng)膜癥的治療、老年病的預(yù)防、產(chǎn)后恢復(fù)、血液凈化、排尿和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。然而，篤斯越桔對(duì)皮膚除皺和皮膚增白的效果尚不為人所知。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于改善皮膚狀況的組合物及其制備方法，所述組合物含有作為活性組分的篤斯越桔提取物，并用于皮膚增白和除皺。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有篤斯越桔提取物的化妝品組合物、食品組合物和藥物組合物，及其作為試劑在改善皮膚狀況中的應(yīng)用。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即，篤斯越桔提取物具有抑制活性氧物質(zhì)的生成或清除活性氧物質(zhì)的抗氧化作用，所述活性氧物質(zhì)是導(dǎo)致光老化的重要因素。當(dāng)皮膚暴露于紫外線(xiàn)時(shí)，在角質(zhì)細(xì)胞中將生成高濃度的諸如過(guò)氧化物自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫和單線(xiàn)態(tài)氧自由基等活性氧物質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將本發(fā)明的篤斯越桔提取物施用于受到紫外線(xiàn)照射的皮膚組織時(shí)，將顯著降低活性氧物質(zhì)的生成。另外，本發(fā)明人新近發(fā)現(xiàn)，篤斯越桔提取物顯示出通過(guò)抑制介導(dǎo)黑色素合成的酪氨酸酶的活性來(lái)抑制黑色素生成的效果，而且還顯示出增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞中膠原的合成、抑制膠原的分解和抑制角質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的效果。在所述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人提出了篤斯越桔提取物在皮膚增白和除皺中的新用途。篤斯越桔提取物是一種在本發(fā)明中用作皮膚改善劑的天然物質(zhì)，它沒(méi)有特別的副作用，因此非常適合于預(yù)防和去除皮膚皺紋以及增強(qiáng)皮膚彈性。另外，篤斯越桔提取物甚至在涂敷于皮膚上或者內(nèi)服時(shí)，也能夠充分地獲得增白皮膚和改善皮膚狀況(例如皺紋)的效果。以下，本發(fā)明將就改善皮膚狀況的組合物及其制備方法和具體應(yīng)用實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。用于改善皮膚狀況的本發(fā)明組合物含有作為活性組分的篤斯越桔提取物。除了篤斯越桔提取物之外，根據(jù)所需制劑的不同，本發(fā)明組合物還可以進(jìn)一步包含例如各種添加劑和穩(wěn)定劑。篤斯越桔提取物從篤斯越桔的果實(shí)、葉子或莖皮提取獲得，其中優(yōu)選使用諸如水或醇等提取溶劑。盡管對(duì)用作本發(fā)明主要組分的篤斯越桔提取物的制備方法沒(méi)有具體限制，但是根據(jù)本發(fā)明，制備所述篤斯越桔提取物的一個(gè)優(yōu)選方法如下。首先，洗滌篤斯越桔的果實(shí)和/或葉子，并用水作為溶劑對(duì)其進(jìn)行提取，獲得未稀釋的提取物(第一步驟)。更具體地說(shuō)，相對(duì)于100g的篤斯越桔果實(shí)，優(yōu)選使用800ml1200ml的水溶劑，優(yōu)選通過(guò)在4(TC100。C溫度的水浴中加熱所述植物1015小時(shí)來(lái)進(jìn)行提取。然后，對(duì)在第一步驟中獲得的篤斯越桔提取物進(jìn)行過(guò)濾并收集上清液(第二步驟)。例如，優(yōu)選通過(guò)多層紗布過(guò)濾所述篤斯越桔提取物，從而獲得已經(jīng)從中除去異物的上清液。盡管僅使用第一步驟或第二步驟獲得的篤斯越桔提取物也可以充分地獲得本發(fā)明的改善皮膚狀況的效果，但是優(yōu)選進(jìn)行如下的額外歩驟。在下一個(gè)步驟中，蒸發(fā)出第二步驟中獲得的上清液所含有的溶劑，以濃縮所述篤斯越桔提取物，由此獲得高度濃縮的篤斯越桔提取物(第三步驟)。優(yōu)選將通過(guò)重復(fù)所述第一步驟和第二步驟3次而獲得的上清液合并在一起，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀完全蒸發(fā)出經(jīng)合并的上清液所含有的水，以便濃縮所述篤斯越桔提取物。另外，在第三步驟之后，將所述經(jīng)濃縮的篤斯越桔提取物溶解在少量蒸餾水中，然后對(duì)其進(jìn)行凍干或噴霧干燥，如此可以以粉末的形式使用所述篤斯越桔提取物。作為在第一步驟中用于提取篤斯越桔的溶劑，除了水以外，還可以使用諸如甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇等醇。在這種情況中，將篤斯越桔的果實(shí)或葉子在2crc9or溫度的醇中進(jìn)行提取，或者進(jìn)行超聲處理。另外，也可以通過(guò)在室溫或4'C通過(guò)滲濾法進(jìn)行提取。本發(fā)明的篤斯越桔提取物的具體應(yīng)用實(shí)施方式包括用于改善皮膚狀況的化妝品組合物、食品或功能性保健食品以及藥物組合物，下文將對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明的篤斯越桔提取物可以在現(xiàn)有化妝品中用作改善皮膚狀況(例如增白和除皺)的試劑，并且對(duì)所述化妝品制劑沒(méi)有具體限制。當(dāng)使用篤斯越桔提取物來(lái)制備化妝品時(shí)，除了篤斯越桔提取物之外，還可以使用常用于化妝品的組分，例如常規(guī)的佐劑和載體組分，如抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、色素和芳香劑等?；瘖y品制劑的實(shí)例包括溶液、懸浮液、乳液、糊狀物、凝膠、乳膏、洗液、粉末、皂、含有表面活性劑的清潔油、粉底、乳液型粉底(emulsionfoundation)和噴霧劑，并且任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可根據(jù)制劑類(lèi)型選擇使用適當(dāng)?shù)妮d體。就增白效果而言?xún)?yōu)選的是，所述化妝品組合物應(yīng)包含選自由熊果苷、曲酸、構(gòu)樹(shù)(^r^M朋幼'")提取物、3-乙氧基抗壞血酸、甘草提取物以及它們的混合物組成的組中的至少一種組分。此外，所述化妝品組合物可以另外包含選自由視黃醇、棕櫚酸視黃醇、聚乙氧基化視黃酰胺、腺苷、激動(dòng)素、蠶繭提取物、異黃酮以及它們的混合物組成的組中的至少一種添加劑。基于所述化妝品組合物的總重量，篤斯越桔提取物的干含量?jī)?yōu)選為0.0001重量％10重量％。如果篤斯越桔提取物的含量小于0.0001重量％，除皺效果會(huì)不足，而如果該含量大于10重量％，篤斯越桔提取物會(huì)不易溶解。另外，增加篤斯越桔提取物含量時(shí)，預(yù)計(jì)并不能由此而使抑制酪氨酸酶活性和提高膠原合成的效果得到增強(qiáng)，而且還會(huì)造成原料成本的增加。在篤斯越桔提取物的另一個(gè)應(yīng)用實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于改善皮膚狀況(例如，增白和除皺)的食品，該食品含有篤斯越桔提取物和食品添加劑。在此使用的短語(yǔ)"用于改善皮膚狀況的食品"不僅包括普通食品，而且還包括"增補(bǔ)性保健食品"或"功能性保健食品"。術(shù)語(yǔ)"功能性保健食品"是指這樣的食品，該食品能夠符合食品的要求，采用例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、液體和丸劑等形式，由具有對(duì)人體有用的功能的原料或組分加工制備(韓國(guó)法律編號(hào)為No.7428的功能性保健食品法第3條第(l)款)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"功能性"是指獲得對(duì)保健用途有用的效果，例如控制與人體的結(jié)構(gòu)和機(jī)能有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)，或生理活動(dòng)。即，該術(shù)語(yǔ)是指食品對(duì)健康的人或亞健康的人的保健有用。甚至在攝取含有篤斯越桔提取物的食品或?qū)⑵渫糠笤谄つw上時(shí)，都可以充分地獲得改善皮膚狀況的效果。然而，就方便施用而言，本發(fā)明的提取物優(yōu)選以功能性食品形式使用，這些食品的劑型為諸如片劑、糖衣片劑、膠囊和飲品等。用于改善皮膚狀況的所述食品的其他形式包括飲料、含酒精的飲品、泡菜、酸奶、乳品、冰淇淋、面包、米糕和面條。在此使用的術(shù)語(yǔ)"食品添加劑"是指在制備、加工和保存食品時(shí)通過(guò)例如添加、混合和滲透等用于所述食品的添加劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于改善皮膚狀況的藥物組合物，該藥物組合物包含篤斯越桔提取物和藥用載體。所述篤斯越桔提取物具有抗氧化劑的功能，并顯示出以下效果，它不僅能夠消除由紫外線(xiàn)引起的皮膚皺紋(例如通過(guò)刺激膠原的合成和抑制膠原的分解)，而且還能夠抑制酪氨酸酶活性。根據(jù)下述實(shí)施例，將會(huì)清楚地理解這一點(diǎn)。所述藥物組合物的適當(dāng)制劑包括但不限于片劑、糖衣片劑、硬膠囊或軟膠囊、溶液、懸浮液、乳液、注射液和栓劑。所述載體的類(lèi)型可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)該藥物組合物制劑的不同而容易地加以選擇，并且可以含有能夠用作稀釋劑、芳香劑、增溶劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、粘合劑和崩解劑的至少一種組分。用于刺激膠原合成的所述提取物(含有篤斯越桔提取物)的劑量可以根據(jù)患者的需要、待處理的狀況以及使用的化合物類(lèi)型而改變，并且本發(fā)明的提取物即使在施用過(guò)量時(shí)也不會(huì)導(dǎo)致副作用的問(wèn)題。通常優(yōu)選的是，基于干粉，篤斯越桔提取物的劑量為0.0010.10g/kg患者體重。下文將首先結(jié)合本發(fā)明采用的篤斯越桔提取物的皮膚狀況改善效果來(lái)說(shuō)明皮膚增白過(guò)程和皺紋形成過(guò)程，然后將通過(guò)以下實(shí)施例和測(cè)試?yán)齺?lái)說(shuō)明在使用篤斯越桔提取物時(shí)會(huì)出現(xiàn)的與皮膚皺紋有關(guān)的因子的任何變化。當(dāng)來(lái)自陽(yáng)光的紫外光(這是皮膚老化的主要原因)照射到皮膚上時(shí)，在皮膚的表皮組織中將會(huì)生成活性氧物質(zhì)。所生成的活性氧物質(zhì)造成表皮組織的損傷并刺激表皮組織中的角質(zhì)細(xì)胞，從而不僅分泌白介素(例如IL-louIL-lp和IL-6)，而且還分泌細(xì)胞因子(例如集落刺激因子和腫瘤壞死因子(TNF)-(x)，其中所分泌的白介素或細(xì)胞因子影響皮膚細(xì)胞，從而誘導(dǎo)復(fù)雜的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)。另外，活性氧物質(zhì)還促進(jìn)黑素體從黑素細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并提高黑色素在黑素細(xì)胞中的生成，而且還抑制膠原在真皮成纖維細(xì)胞中的合成。這些現(xiàn)象對(duì)于光老化過(guò)程是非常重要的。當(dāng)角質(zhì)細(xì)胞受到外部紫外線(xiàn)刺激時(shí)，它們會(huì)分泌炎性細(xì)胞因子等來(lái)促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和黑色素的生物合成，從而調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)和形成以及黑色素的分泌和分化中的各種因子。另外，照射到皮膚組織中的紫外線(xiàn)刺激皮膚中的黑素細(xì)胞分泌IL-l(x，而所分泌的IL-la又刺激黑素細(xì)胞分泌ET(內(nèi)皮素)-1。所分泌的ET-1激活蛋白激酶C和腺苷環(huán)化酶系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)酪氨酸酶的活性，從而導(dǎo)致色素沉著。此外，上述在角質(zhì)細(xì)胞中生成并分泌的白介素剌激諸如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-l(膠原酶)、MMP-3(基質(zhì)溶素-l)和MMP-9(92-kd明膠酶)等基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)從而促進(jìn)MMP的生成，而且它們還抑制原膠原的表達(dá)從而降低原膠原的生物合成。所述MMP-1(膠原酶)起到促進(jìn)轉(zhuǎn)化自I型原膠原的膠原分解的作用。S口，當(dāng)紫外線(xiàn)照射到皮膚時(shí)，所述MMP-1將降低I型原膠原的生成，并引起所生成的膠原的分解，從而減少皮膚上膠原的量。由于這一過(guò)程，皮膚上會(huì)形成皺紋。通過(guò)以下測(cè)試?yán)?，并結(jié)合與皮膚增白和皺紋有關(guān)的上述因素，由此來(lái)對(duì)施用篤斯越桔提取物所產(chǎn)生的效果進(jìn)行說(shuō)明。包含篤斯越桔提取物的用于改善皮膚狀況的本發(fā)明組合物抑制并清除活性氧物質(zhì)，該活性氧物質(zhì)在皮膚受到紫外線(xiàn)照射時(shí)在皮膚組織中生成。另外，本發(fā)明的組合物能夠有效地抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制黑素細(xì)胞中黑色素的生成，并抑制角質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)原膠原的生成，并抑制膠原的分解。因此，本發(fā)明組合物可用于防止由紫外線(xiàn)引起的皮膚光老化，并促進(jìn)皮膚增白和改善皺紋狀況。圖1是顯示篤斯越桔提取物的DPPH自由基清除活性的圖表。圖2是顯示篤斯越桔提取物在黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)中的過(guò)氧化物自由基清除活性的圖表。圖3是顯示篤斯越桔提取物在NADH/PMS系統(tǒng)中的過(guò)氧化物自由基清除活性的圖表。圖4是顯示篤斯越桔提取物的羥基自由基清除活性的圖表。圖5是顯示篤斯越桔提取物的單線(xiàn)態(tài)氧自由基清除活性的圖表。圖6是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的過(guò)氧化物自由基的圖表。圖7是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的羥基自由基的圖表。圖8是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的過(guò)氧化氫自由基的圖表。圖9是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的單線(xiàn)態(tài)氧自由基的圖表。圖IO是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的IL-1(3釋放的圖表。圖11是顯示在紫外線(xiàn)B照射之后來(lái)自經(jīng)篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞的IL-6釋放的圖表。圖12顯示了經(jīng)IL-1卩和篤斯越桔提取物處理的人真皮成纖維細(xì)胞的I型原膠原濃度。圖13顯示了經(jīng)IL-ip和篤斯越桔提取物處理的人真皮成纖維細(xì)胞的MMP-1濃度。圖14是顯示經(jīng)過(guò)用紫外線(xiàn)照射皮膚并施用篤斯越桔提取物的無(wú)毛小鼠的皮膚復(fù)制品的照片。圖15(a)15(d)顯示由經(jīng)過(guò)用紫外線(xiàn)照射皮膚并施用篤斯越桔提取物的無(wú)毛小鼠測(cè)得的H—R值。圖16顯示當(dāng)對(duì)皮膚分別施用篤斯越桔提取物和曲酸后，皮膚組織的B16黑素瘤細(xì)胞中的黑色素濃度。圖17顯示在紫外線(xiàn)B照射后，對(duì)皮膚分別施用篤斯越桔提取物和曲酸后的皮膚組織的黑素瘤細(xì)胞中的黑色素濃度。具體實(shí)施例方式制備例l:篤斯越桔提取物的制備在50。C水浴中，將100g從韓國(guó)北漢山(Bukhan)采集到的篤斯越桔果實(shí)和500ml的80%的水一起加熱12小時(shí)，獲得篤斯越桔提取物。用多層紗布過(guò)濾所述篤斯越桔提取物并收集上清液。將通過(guò)重復(fù)所述提取和過(guò)濾過(guò)程3次獲得的上清液合并在一起，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下完全蒸發(fā)掉所合并的上清液中含有的水，獲得經(jīng)濃縮的熱水提取物。制備例2:篤斯越桔提取物粉末的制備將經(jīng)濃縮的所述篤斯越桔提取物溶解在蒸餾水中，然后對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥，從而制得粉末形式的最終的篤斯越桔提取物。制備例3:篤斯越桔提取物的制備將100g篤斯越桔果實(shí)加入到500ml的80。/。的甲醇(甲醇水=4:1)中，并在室溫進(jìn)行4次超聲處理，獲得提取物。將用紗布過(guò)濾該提取物，然后收集上清液。將通過(guò)重復(fù)所述提取和過(guò)濾過(guò)程3次獲得的上清液合并在一起，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下蒸發(fā)出所合并的上清液中含有的甲醇。將殘留的提取物溶解在少量的蒸餾水中，獲得篤斯越桔的醇提取物。實(shí)施例1:用于改善皮膚狀況的皮膚洗液的制備使用制備例1中制得的篤斯越桔提取物(液相)，以常規(guī)方法制備皮膚洗液。該皮膚洗液的組分和含量如下表1所示。(表l)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2:用于改善皮膚狀況的洗液的制備使用制備例1中制得的篤斯越桔提取物(液相)，以常規(guī)方法制備洗液。該洗液的組分和含量如下表2所示。(表2)__<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例3:用于改善皮膚狀況的功能性食品(片劑)的制備將5mg在制備例2中制得的篤斯越桔提取物(粉末)與150mg乳糖BP、30mg淀粉和15mg預(yù)凝膠化的玉米淀粉BP混合。然后，向其中加入適當(dāng)量的純凈水，并將該混合物粒化成粉末。干燥該顆粒，并將其與1mg的硬脂酸鎂混合，經(jīng)壓縮獲得片劑。實(shí)施例4:用于改善皮膚狀況的功能性食品(飲料)的制備向包含功能性飲料基料的組合物中加入純凈水，從而制得飲料，所述功能性飲料基料含有2mg在制備例1中制得的篤斯越桔提取物、5mg食品著色劑、5mg橙精、700mg果糖、10mg檸檬酸和5mg維生素。實(shí)施例5:用于改善皮膚狀況的功能性食品(糖漿)的制備將637.5g白糖溶解在500ml的純凈水中。在另外的容器中，將2.0g羧甲基纖維素鈉溶解在400ml純凈溶液中，然后將其與白糖溶液混合。向該混合溶液中加入0.28g對(duì)羥基苯甲酸甲酯和0.12g對(duì)羥基苯甲酸丙二醇酯并溶解，向其中加入20ml乙醇，并向其中加入純凈水使得溶液總體積為1000ml。將過(guò)篩的制備例1中制得的篤斯越桔提取物懸浮在該溶液中而獲得糖漿。實(shí)施例6:軟膏的制備將5g制備例1中制得的篤斯越桔提取物與20g棕櫚酸十六垸基酯、40g的十六烷醇、40g硬脂醇、80g肉豆蔻酸異丙酯、20g失水山梨醇單硬脂酸酯、60g聚山梨醇酯、lg對(duì)羥基苯甲酸丙酯、lg對(duì)羥基苯甲酸酯和適量的純凈水混合，從而制得軟膏。實(shí)施例7:含酒精的功能性飲品的制備以40重量％的濃度將經(jīng)去臭并純化的酒精稀釋在蒸餾水中，然后，基于100重量份經(jīng)稀釋的酒精溶液，以0.05重量份的量向其中加入在制備例3中制得的篤斯越桔提取物。向該溶液中加入適量的甜菊苷、高果糖、氨基酸、檸檬酸和鹽，從而制得含有篤斯越桔提取物的含酒精的功能性飲品。測(cè)試?yán)?:活性氧物質(zhì)(ROS)清除活性1.DPPH自由基清除活性的測(cè)定將0.8ml在乙醇中的1mMDPPH(2,2-二苯基-l-苦基偕腙肼)與0.2ml在制備例1中制得的篤斯越桔提取物混合，并將該混合物在37。C靜置30分鐘，然后測(cè)定517nm處的吸光率。使用抗壞血酸(維生素C)作為對(duì)照藥物。結(jié)果以相對(duì)于未處理樣品組的百分比來(lái)表示。在測(cè)試結(jié)果中，篤斯越桔提取物在10mg/mL濃度時(shí)的DPPH自由基清除活性比100的維生素C的高3倍，在1mg/mL濃度時(shí)比100的維生素C的高約2倍(見(jiàn)圖1)。圖1顯示制備例1中制得的篤斯越桔提取物的DPPH自由基清除活性。圖1上部所示的按照字母次序示出的字母顯示通過(guò)鄧氏多重范圍檢驗(yàn)(Duncan'smultiplerangetest),各組中在pO.05時(shí)顯著不同的值。2.過(guò)氧化物自由基清除活性的測(cè)定2-1.黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)在24孔板中，將600(al的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)、各50pl的具有不同提取物濃度的篤斯越桔提取物溶液和50]Lil黃嘌呤氧化酶(0.068pg/mL)相互混合，并在25。C靜置30分鐘。向該混合物中加入lOOpl的1MHC1以終止反應(yīng)，然后測(cè)定295nm處的吸光率。作為對(duì)照藥物，使用已知具有抑制黃嘌呤氧化酶的藥物別嘌呤醇。結(jié)果以相對(duì)于未處理樣品組的百分比來(lái)表示。如圖2所示，篤斯越桔提取物在0.01mg/mL濃度時(shí)清除黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)(其為酶促過(guò)氧化物自由基生成系統(tǒng))中的過(guò)氧化物自由基的活性與10pM維生素A的相同，并對(duì)應(yīng)于lpM別嘌呤醇和10)iM別嘌呤醇之間的清除活性。2-2.NADH-PMS系統(tǒng)在24孔板中，分別按73|iM、15和50的濃度將NADH、吩嗪硫酸二甲酯和NBT加入到20mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中，制得1.8mL的溶液。按不同濃度，向該溶液中加入0.2ml在制備例1中制得的篤斯越桔提取物。將該混合物在37"C靜置20分鐘，然后測(cè)定560nm處的吸光率。使用抗壞血酸(維生素C)作為對(duì)照藥物。結(jié)果以相對(duì)于未處理樣品組的百分比來(lái)表示。如圖3所示，篤斯越桔提取物在0.1mg/mL的提取物濃度時(shí)清除NADH/PMS系統(tǒng)(其為非酶促過(guò)氧化物自由基生成系統(tǒng))中的過(guò)氧化物自由基的活性與100^M維生素C的相等。3.羥基自由基清除活性的測(cè)定在24孔板中，將0.8ml的5.94mMH202和0.8ml的含有26.4mMFeS04的乙醇溶液加入到0.2ml的(3-胡蘿卜素乙醇溶液中，向其中加入0.2ml在制備例1制得的篤斯越桔提取物。測(cè)定該混合物在436nm處的吸光率。使用抗壞血酸(維生素C)作為對(duì)照藥物。結(jié)果以相對(duì)于未處理樣品組的百分比來(lái)表示。測(cè)試結(jié)果顯示，篤斯越桔提取物在0.05mg/mL的提取物濃度時(shí)的羥基自由基清除活性與100)iM維生素C的近似(見(jiàn)圖4)。4.單線(xiàn)態(tài)氧清除活性的測(cè)定向1.9ml在45mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.1)中的10mM精氨酸、10mMNaOCl、10mMH202fn50mMN,N-二甲基-對(duì)硝基苯胺的混合溶液中，按不同濃度加入0.1ml的篤斯越桔提取物。將所得溶液在3(TC靜置40分鐘，然后測(cè)定440nm處的吸光率。使用oi-生育酚(維生素E)作為對(duì)照藥物。結(jié)果以相對(duì)于未處理樣品組的百分比來(lái)表示。測(cè)試結(jié)果顯示，篤斯越桔提取物濃度在0.1mg/mL和0.01mg/mL之間時(shí)的單線(xiàn)態(tài)氧清除活性沒(méi)有差異，并與100pM維生素E的相等(見(jiàn)圖5)。測(cè)試?yán)?:抑制角質(zhì)細(xì)胞中ROS生成的能力一人角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)通過(guò)活檢從13歲男性的皮膚組織中收集人角質(zhì)細(xì)胞，并在37'C和5.0%的C02的條件下在C02培養(yǎng)箱中，將該人角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在角質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(改進(jìn)的MCDB153培養(yǎng)基)中，該培養(yǎng)基含有100ng/mL的人重組表皮生長(zhǎng)因子、70mg/mL的牛垂體提取物、0.5mg/mL的氫化可的松、5mg/mL的胰島素、0.3mg/mL的慶大霉素和2.5mg/mL的兩性霉素-B。為了在測(cè)試中使用，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)。一抑制角質(zhì)細(xì)胞中自由基生成的能力的測(cè)定為了測(cè)定當(dāng)皮膚受到紫外線(xiàn)照射時(shí)角質(zhì)細(xì)胞中生成的ROS，將角質(zhì)細(xì)胞按105個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種在24孔板的各個(gè)孔中并靜置17小時(shí)，并且確認(rèn)細(xì)胞貼壁。然后，去掉培養(yǎng)基，并將篤斯越桔提取物溶液各2ml分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中并靜置24小時(shí)，所述篤斯越桔提取物溶液通過(guò)將該提取物按不同濃度溶解在培養(yǎng)基中而制得。靜置結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基，并將400pl的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。接著，以45mJ/cm2的劑量用紫外線(xiàn)B照射培養(yǎng)板各個(gè)孔中的溶液，然后在60分鐘內(nèi)以10分鐘的間隔測(cè)定ROS的生成量。1.抑制過(guò)氧化物自由基生成的能力的測(cè)定在24孔板中，將73(iM的NADH、15的吩嗪硫酸二甲酯和50)iM的NBT相互混合在20mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中，制得1.8mL的溶液，然后向其中加入0.2ml在制備例1中制得的篤斯越桔提取物。在不同時(shí)間點(diǎn)收集0.2ml的上清液，并在37。C靜置20分鐘，然后測(cè)定560nm處的吸光率。測(cè)定結(jié)果顯示，在10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘，在用2mg/ml的篤斯越桔提取物處理的組的情況中，相對(duì)于對(duì)照組，紫外線(xiàn)照射后角質(zhì)細(xì)胞中的過(guò)氧化物自由基的生成量分別為31%、55%、42%、37%、45%和65%，而在用0.2mg/ml的篤斯越桔提取物處理的組的情況中，相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)氧化物自由基的生成量分別為79%、86%、87%、89%、94%和94%。在10分鐘40分鐘的時(shí)間段內(nèi)，過(guò)氧化物自由基的生成量隨濃度呈統(tǒng)計(jì)顯著性下降，然后，該生成量在用2mg/ml的篤斯越桔提取物處理的組的情況中顯著下降(見(jiàn)圖6)。2.抑制羥基自由基生成的能力的測(cè)定在24孔板中，將0.8ml的5.94mM11202和0.8ml含有26.4mMFeS04的乙醇溶液和0.2ml從各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集到的上清液相互混合在0.2ml的2.5mMP-角蛋白乙醇溶液中。測(cè)定所得溶液在436nm處的吸光率。測(cè)定結(jié)果顯示，在用2mg/ml的篤斯越桔提取物處理的組的情況中，紫外線(xiàn)B照射后角質(zhì)細(xì)胞中的羥基自由基的生成量在10分鐘50分鐘的時(shí)段內(nèi)下降，并且相對(duì)于對(duì)照組，羥基自由基的生成量百分比在IO分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘時(shí)分別為46%、46%、42%、24%和37%(見(jiàn)圖7)。3.抑制過(guò)氧化氫生成的能力的測(cè)定將1ml的3X10—6M東莨菪苷、400pi的10—2M疊氮化鈉和0.5mL在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集到的上清液相互混合并靜置5分鐘。向該混合物中加入100(il的150U/mLHPO(辣根過(guò)氧化物酶)和600^的KRP(KrepsRinger磷酸鹽緩沖液)，使用分光熒光計(jì)在360nm激發(fā)且在450nm發(fā)射的條件下測(cè)量所得溶液的吸光率。結(jié)果顯示在圖8中。如圖8所示，在用2mg/ml的篤斯越桔提取物處理的組的情況中，相對(duì)于未用篤斯越桔提取物處理的對(duì)照組，紫外線(xiàn)照射后角質(zhì)細(xì)胞中的過(guò)氧化氫生成量顯著下降，其中相對(duì)于對(duì)照組，過(guò)氧化氫的生成量百分比在20分鐘、30分鐘、40分鐘和50分鐘時(shí)分別為61%、61%、39%和62%。4.抑制單線(xiàn)態(tài)氧生成的能力的測(cè)定將0.2ml在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集到的上清液與在45mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.1)中的10mM精氨酸、10mMNaOCl、10mMH2O^B50mMN，N-二甲基-對(duì)硝基苯胺的溶液混合，并在3(TC靜置40分鐘，然后測(cè)定440nm處的吸光率。結(jié)果如圖9所示。在篤斯越桔提取物處理的組的情況中，紫外線(xiàn)B照射后角質(zhì)細(xì)胞中的單線(xiàn)態(tài)氧自由基的生成量從20分鐘開(kāi)始隨濃度下降。相對(duì)于對(duì)照組(UV-C)，用2mg/mL的篤斯越桔提取物(V2)處理的組的生成量在20分鐘時(shí)顯示為98%、在30分鐘時(shí)顯示為96%、在40分鐘60分鐘時(shí)顯示為93%,而用0.2mg/mL的篤斯越桔提取物(V0.2)處理的組顯示為99%的生成量。測(cè)試?yán)?:抑制角質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的能力為了測(cè)量在皮膚受到紫外線(xiàn)照射時(shí)角質(zhì)細(xì)胞中生成的細(xì)胞因子的量，將角質(zhì)細(xì)胞按105個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種在24孔板上并靜置17小時(shí)，并且確認(rèn)細(xì)胞貼壁。然后，去掉培養(yǎng)基，并將篤斯越桔提取物溶液各2ml分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中并靜置24小時(shí)，所述篤斯越桔提取物溶液通過(guò)將該提取物按不同濃度溶解在培養(yǎng)基中而制得。靜置結(jié)束后，去掉培養(yǎng)基，并將400pl的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。接著，以40mJ/ci^的劑量用紫外線(xiàn)B照射培養(yǎng)板各個(gè)孔中的溶液。然后，計(jì)算在24小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)各溶液中生成的細(xì)胞因子的量。1.抑制IL-1(3分泌的能力的測(cè)定用40mJ/cr^的紫外線(xiàn)B照射角質(zhì)細(xì)胞，并在O小時(shí)、30分鐘、l小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)之后收集上清液，使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)分析試劑盒測(cè)定IL-1(3的量。測(cè)定結(jié)果顯示，在用2mg/mL的篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞中的IL-ip生成量與對(duì)照組相比有顯著的降低，其中，相對(duì)于對(duì)照組，IL-1(3的生成量在1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)時(shí)的生成量百分比分別為約37%、28%、29%和26%。另外，相對(duì)于對(duì)照組，用0.2mg/mL的篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞中的IL-1(3的生成量為約85%、88%、89%和73%(見(jiàn)圖10)。2.抑制IL-6分泌的能力的測(cè)定用40mJ/cn^的紫外線(xiàn)B照射角質(zhì)細(xì)胞，并在0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)之后收集上清液，使用ELISA分析試劑盒測(cè)定IL-6的量。測(cè)試結(jié)果顯示，在用2mg/mL的篤斯越桔提取物處理的角質(zhì)細(xì)胞中的IL-6生成量從3小時(shí)開(kāi)始有顯著下降，并且相對(duì)于對(duì)照組，IL-6的生成量百分比在3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)時(shí)分別為43%、61%和33%。另外，用0.2mg/mL的篤斯越桔提取物處理的組在6小時(shí)時(shí)的IL-6生成量顯示出顯著的下降，其中相對(duì)于對(duì)照組，該生成量百分比為約81%(見(jiàn)圖11)。測(cè)試?yán)?:除皺效果的測(cè)試一人的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)通過(guò)活檢從13歲男性的皮膚組織中收集人的成纖維細(xì)胞，并在37°C和5.0%的C02的條件下在培養(yǎng)箱中，將該成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基)中，該培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、100IU/mL的青霉素和50pg/mL的鏈霉素。一除皺效果的測(cè)試，將人的成纖維細(xì)胞按105個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種在24孔板中并靜置17小時(shí)，并且確認(rèn)細(xì)胞貼壁。然后，去掉培養(yǎng)基，并將篤斯越桔提取物溶液各2ml分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中，所述篤斯越桔提取物溶液通過(guò)將制備例1中制得的提取物按不同濃度溶解在培養(yǎng)基中而制備。將孔板在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，然后去掉培養(yǎng)基并測(cè)定人的成纖維細(xì)胞中的I型原膠原(MMP-1)。1.對(duì)人的成纖維細(xì)胞中的I型原膠原的促進(jìn)作用用不同濃度的篤斯越桔提取物溶液處理人的成纖維細(xì)胞，并在48小時(shí)之后收集上清液，然后使用I型原膠原C-肽(PIP)EIA(酶免疫測(cè)定)試劑盒測(cè)定人的成纖維細(xì)胞中生成的I型原膠原的量。演3)樣品濃度(mg/ml)原膠原濃度(ng/ml)對(duì)照149.6±25.4')0.001144.9±21.80.005155.1±20.10.01179.2±31.3"平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)試結(jié)果顯示，與未用本發(fā)明提取物處理的對(duì)照組的149.6ng/mL相比，用篤斯越桔提取物處理的人的成纖維細(xì)胞中的I型原膠原生成量在0.005mg/mL濃度時(shí)為155.1ng/mL(103%)，而在0.01mg/mL時(shí)為179.2ng/mL(l19%)。這表明，用本發(fā)明提取物處理的人的成纖維細(xì)胞中的I型原膠原生成量隨濃度上升。膠原纖維的形成過(guò)程是，原膠原在成纖維細(xì)胞中合成，并分泌至細(xì)胞外，然后經(jīng)歷酶促作用、纖維形成和交聯(lián)。因此，發(fā)現(xiàn)篤斯越桔提取物可以增加原膠原(膠原前體)的量，從而增強(qiáng)皮膚彈性并除皺。2.抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-l(MMP-l)的生成按下表4所示，用不同提取物濃度的篤斯越桔提取物溶液處理人的成纖維細(xì)胞。在48小時(shí)之后，收集上清液，并使用MMP-1EIA試劑盒測(cè)定成纖維細(xì)胞中生成的基質(zhì)金屬蛋白酶-l(MMP-l)的量。(表4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>"平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差在測(cè)試結(jié)果中，未用本發(fā)明提取物處理的對(duì)照組中的MMP-1的生物合成量為37.2mg/mL，而用篤斯越桔提取物處理的組中的MMP-1的生成量在O.Olmg/mL時(shí)為25.5ng/mL(68%),并隨濃度下降。己知MMP-1通過(guò)重復(fù)暴露于紫外線(xiàn)而在角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)，并且是分解膠原的酶。因此，發(fā)現(xiàn)篤斯越桔提取物可以抑制MMP-1的活性以抑制皮膚膠原的分解，從而提高皮膚彈性并除皺。3.將IL-ip加入到人的成纖維細(xì)胞中后I型原膠原生成量的變化可以看出，將白介素(IL)-1(3加入到人的成纖維細(xì)胞中后1型原膠原生成量低于不加IL-1(3時(shí)的生成量，特別是I型原膠原的生成量隨IL-ip的濃度而下降。然而，可以看出，當(dāng)加入篤斯越桔提取物時(shí)，I型原膠原的生成量隨篤斯越桔提取物的濃度而上升。圖12顯示了作為IL-lf3濃度(10ng/mL和20ng/mL)和篤斯越桔提取物濃度(0.2mg/mL和2mg/mL)的函數(shù)的人的成纖維細(xì)胞中I型原膠原的生成量。4.將IL-ip加入到人的成纖維細(xì)胞中后MMP-l生成量的變化由圖13可以看出，向人的成纖維細(xì)胞中加入白介素(IL)-ip后生成的MMP-1的量高于沒(méi)有加入IL-1(3時(shí)所生成的量，并且MMP-1的生成量隨IL-ip的濃度而上升。然而，即使在這種情況中也可以看出，當(dāng)加入篤斯越桔提取物時(shí)，MMP-1的濃度將隨篤斯越桔提取物的濃度而下降。測(cè)試?yán)?:抑制皺紋形成的能力的體內(nèi)測(cè)試一無(wú)毛小鼠、紫外線(xiàn)照射和樣品施用購(gòu)買(mǎi)6周齡的無(wú)毛雌性小鼠(Skh-l)，并在到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行3天的適應(yīng)，然后用于測(cè)試。讓動(dòng)物任意進(jìn)食和飲水并在24土2。C的溫度、50±10%的濕度和12小時(shí)/12小時(shí)的光暗周期的條件下飼養(yǎng)。將動(dòng)物分為受到紫外線(xiàn)照射組、不受紫外線(xiàn)照射組和受到紫外線(xiàn)照射并施用樣品組。對(duì)受到紫外線(xiàn)照射并施用樣品的組施用劑量各為10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的篤斯越桔提取物。在18周內(nèi)，按每周3次用紫外線(xiàn)照射每只小鼠的背部，其中紫外線(xiàn)劑量如下第1周為1MED(最小紅斑劑量；60mJ/cm2)，第2禾卩3周為2MED(120mJ/cm2)，第46周為3MED(l80mJ/cm2)，第718周為4MED(240mJ/cm2)。將作為樣品的篤斯越桔提取物溶解在蒸餾水中并分別以10mg/kg/天、20mg/kg/天和40mg/kg/天的劑量施用于動(dòng)物。一皮膚復(fù)制品的制作為了測(cè)量由將所述樣品施用于小鼠而引起的除皺作用，每隔3周用50mg/kg的戊巴比妥溶液進(jìn)行腹膜內(nèi)注射來(lái)麻醉小鼠，將具有孔徑為8mm的復(fù)制品模型貼在每只小鼠的背部。然后，將Silflo的各組分(即，硅橡膠、沖淡劑和催化劑)適當(dāng)混合并涂在所述模型的內(nèi)側(cè)，讓其自然干燥。然后，揭下所述模型，從而制得復(fù)制品。通過(guò)計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)以恒定的角度照射所述復(fù)制品，使用所得反射面積來(lái)量化皺紋的深度或數(shù)量，由此來(lái)測(cè)定皺紋的程度。一皮膚復(fù)制品分析的結(jié)果紫外線(xiàn)照射后，經(jīng)肉眼觀察可以清楚地看到，與正常組(N)相比，UV對(duì)照組(C)中皮膚皺紋增加。然而，在施用篤斯越桔提取物的皮膚的情況中，施用9周后可以清楚地看到深皺紋減少(見(jiàn)圖14)。在施用后3周，與UV對(duì)照組(C)相比，以20mg/kg(V20)和40mg/kg(V40)的量施用篤斯越桔提取物的組顯示出H一R1、H一R4和H一R5值的顯著下降。在施用后6周，與UV對(duì)照組相比，除了施用20mg/kg的篤斯越桔提取物的組顯示出H—R2和H一R3值的下降以外，所有施用本發(fā)明提取物的組的所有值都顯著地下降。在施用后9周，施用篤斯越桔提取物的各組的H—R值全都顯著下降。圖15(a)15(d)顯示了在紫外線(xiàn)照射后第0、3、6、9周時(shí)的H—R值。此處的"H"是指基線(xiàn)，"R1"代表最高峰與最低值之間的距離，"R2"代表所述5個(gè)最大距離的最大值，"R3"代表5個(gè)最大距離Rl的平均值，"R4"代表平滑深度，而"R5"代表算術(shù)平均粗糙度。圖15的標(biāo)在上邊的不同文字(字母)表示在鄧氏多重范圍檢驗(yàn)(Duncan'smultiplerangetest)中pO.05時(shí)是顯著差異的。測(cè)試?yán)?:對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果向96孔板(Coming，USA)依次加入220)ul的0.1MPBS(pH6.5)、20pi各具有不同提取物濃度的篤斯越桔提取物溶液和20的2,000U/mL酪氨酸酶溶液。向該溶液中加入40iil的1.5mM酪氨酸溶液，然后在37。C靜置10分鐘。然后，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)判讀儀(Bio-Tek,USA)測(cè)量該溶液在490nm處的吸光率。在測(cè)試中，使用20)dl的0.1MPBS(pH6.5)作為空白樣品。使用以曲酸處理的組作為對(duì)照組。根據(jù)下式計(jì)算酪氨酸酶活性的抑制比率。酪氨酸酶活性的抑制比率(％)=100—{(b-b')/(a-a')}X100其中a:空白樣品反應(yīng)后的吸光率；b:樣品反應(yīng)后的吸光率；a'和b':在各樣品反應(yīng)中使用緩沖液代替酪氨酸酶測(cè)得的吸光率。在測(cè)試結(jié)果中，針對(duì)酪氨酸酶活性，篤斯越桔提取物顯示出約0.41mg/mL的IC5Q，而曲酸顯示出約10的高IC5。。針對(duì)酪氨酸酶活性，篤斯越桔提取物在lmg/mL時(shí)顯示出72.8o/。的抑制比率，這樣的抑制比率處于10^iM曲酸的50.8。/o到100^iM曲酸的84.8。/。之間。另外，篤斯越桔提取物在0.1mg/mL的低濃度顯示出11.4%的抑制比率，而這一抑制比率近似于1曲酸的14.4%的抑制比率(見(jiàn)表5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>U平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；2)抑制比率(％)盡管由于濃度的差異而無(wú)法對(duì)所述兩種物質(zhì)進(jìn)行直接比較，但是由測(cè)試結(jié)果可以看出，0.5mg/mL的篤斯越桔提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制比率高于用10曲酸處理的組的抑制比率，這表明篤斯越桔提取物顯著地抑制了酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶起到使酪氨酸(一種氨基酸)氧化而生成黑色素的作用，上述測(cè)試結(jié)果顯示，篤斯越桔提取物抑制了酪氨酸酶的活性，可以看出篤斯越桔提取物能夠促進(jìn)皮膚增白。測(cè)試?yán)?:使用B16黑素瘤F10細(xì)胞來(lái)測(cè)試對(duì)黑色素生成的抑制效果一B16黑素瘤F10的培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中，在37。C和5.0%的C02的條件下，將B16黑素瘤F10細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM(Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基)中，該培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、100IU/mL的青霉素和50pg/mL的鏈霉素。一對(duì)黑色素生成的抑制效果的測(cè)試將B16黑素瘤F10細(xì)胞按104個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種在24孔板的每個(gè)孔中。17小時(shí)后，確認(rèn)細(xì)胞貼壁并去掉培養(yǎng)基。然后，以不同濃度，將2ml在制備例1中制得的篤斯越桔提取物溶液分加到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。將孔板在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，然后去掉培養(yǎng)基。接著，將2ml的NaOH加入到培養(yǎng)板的各個(gè)孔中，然后在6(TC靜置30分鐘。之后，測(cè)定該細(xì)胞溶液在450nm處的吸光率。比較黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算黑色素的濃度。在測(cè)試結(jié)果中，在以濃度范圍為O.Olmg/mL0.5mg/mL的篤斯越桔提取物處理的B16黑素瘤F10細(xì)胞中，黑色素總生成量隨濃度顯著下降。當(dāng)篤斯越桔提取物的濃度為0.05mg/mL時(shí)，黑色素的生成量為16.66(ag/mL，而當(dāng)曲酸為10(aM時(shí)，黑色素生成量為16.54嗎/mL，表明0.05mg/mL的篤斯越桔提取物對(duì)黑色素生成的抑制效果與10的曲酸的抑制效果相同。另外，篤斯越桔提取物的濃度為0.5mg/mL時(shí)黑色素的生成量低于曲酸為100pM時(shí)黑色素的生成量(見(jiàn)圖16)。在圖16中，"V"代表用篤斯越桔提取物處理的測(cè)試組，而"K"代表用曲酸處理的測(cè)試組。一紫外線(xiàn)照射后對(duì)黑色素生成總量的抑制效果的測(cè)試用提取物濃度為0.2mg/mL和2mg/mL的篤斯越桔提取物溶液處理的B16黑素瘤F10細(xì)胞的組中的黑色素生成量為20.80(xg/mL和17.47嗎/mL，這低于對(duì)照組的生成量(27.96pg/mL)，并且黑色素生成量隨篤斯越桔提取物的濃度而下降。另外，篤斯越桔提取物為0.2mg/mL時(shí)黑色素生成量低于0.2曲酸時(shí)的生成量(22.72pg/mL)，而篤斯越桔提取物為2mg/mL時(shí)黑色素生成量低于2)liM曲酸時(shí)的生成量(19.22pg/mL)(見(jiàn)圖17)。在圖17中，"C"代表未經(jīng)紫外線(xiàn)照射的測(cè)試組，"UV-C"代表用紫外線(xiàn)照射的對(duì)照組，而"V"和"K"分別代表用篤斯越桔提取物和曲酸處理的測(cè)試組。在測(cè)試結(jié)果中，與未用樣品進(jìn)行處理的對(duì)照組相比，用篤斯越桔提取物處理的組和用曲酸處理的組均顯示出黑色素生成量的下降。皮膚上的色素沉著(例如變色和雀斑)歸因于表皮中黑色素色素的異常增高。盡管篤斯越桔提取物和曲酸均顯示出黑色素生成量的顯著下降，但是曲酸存在毒性問(wèn)題?？紤]到這一問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)篤斯越桔提取物可用作曲酸的替代物。盡管為說(shuō)明目的，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行了說(shuō)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在未脫離如所附權(quán)利要求披露的本發(fā)明的范圍和精神的情況下，各種改變、增加和替代方式都是可能的。工業(yè)實(shí)用性如上所述，用于改善皮膚狀況的本發(fā)明組合物能夠容易地以提取物或干燥的提取物粉末的形式制備，并且能夠用于促進(jìn)皮膚增白、消除皺紋、防止皺紋產(chǎn)生和增強(qiáng)皮膚彈性。另外，本發(fā)明組合物基于天然提取物，因此對(duì)本發(fā)明組合物的工業(yè)應(yīng)用范圍沒(méi)有特別限制。而且，篤斯越桔提取物適合在化妝品、食品和藥物中用作去除皮膚皺紋的組分，因?yàn)樯踔潦峭糠笤谄つw上或者內(nèi)用時(shí)，篤斯越桔提取物也可以獲得改善皮膚狀況的效果。權(quán)利要求1.一種用于改善皮膚狀況的組合物，該組合物包含作為活性組分的篤斯越桔提取物，并具有使皮膚增白和除皺的效果。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述篤斯越桔提取物通過(guò)向篤斯越桔的果實(shí)或葉子中添加水或醇作為提取溶劑進(jìn)行提取而獲得。3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述篤斯越桔提取物通過(guò)以下方法獲得在4(TC10(TC溫度的水浴中加熱篤斯越桔的果實(shí)或葉子以獲得熱水提取物，對(duì)該熱水提取物進(jìn)行過(guò)濾，從經(jīng)過(guò)濾的熱水提取物中分離出上清液，并在減壓下濃縮經(jīng)分離的上清液。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述篤斯越桔提取物通過(guò)以下方法獲得在2(TC9(TC溫度的醇中對(duì)篤斯越桔的果實(shí)或葉子進(jìn)行提取，對(duì)該提取物進(jìn)行過(guò)濾，從經(jīng)過(guò)濾的提取物中分離出上清液，并在減壓下濃縮經(jīng)分離的上清液。5.—種用于改善皮膚狀況的化妝品組合物，該化妝品組合物包含權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的組合物和化妝品添加劑，并具有使皮膚增白和除皺的效果。6.如權(quán)利要求5所述的化妝品組合物，其中，基于所述化妝品組合物的總重量，所述篤斯越桔提取物的含量為0.0001干重％10干重％。7.如權(quán)利要求5所述的化妝品組合物，其中，所述化妝品組合物還另外包含選自由熊果苷、曲酸、構(gòu)樹(shù)提取物、3-乙氧基抗壞血酸、甘草提取物以及它們的混合物組成的組中的至少一種組分。8.—種食品組合物，該食品組合物包含權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的組合物和可食用的食品添加劑。9.一種藥物組合物，該藥物組合物包含權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的組合物和藥用載體，并具有促進(jìn)膠原合成和抑制酪氨酸酶活性的效果。10.—種制備用于改善皮膚狀況的篤斯越桔提取物的方法，該方法包括第一步驟，將水或醇作為溶劑加入到篤斯越桔的果實(shí)或葉子中以獲得篤斯越桔提取物；第二步驟，對(duì)所述第一步驟中獲得的所述篤斯越桔提取物進(jìn)行過(guò)濾并從濾液中分離出上清液；和第三步驟，濃縮所述第二步驟中所分離的所述上清液。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，該方法在所述第三步驟之后進(jìn)一步包括第四步驟將經(jīng)濃縮的所述篤斯越桔提取物溶解在少量的蒸餾水中，凍干或干燥該溶液，以獲得粉狀的篤斯越桔提取物。全文摘要本發(fā)明涉及包含篤斯越桔提取物的用于改善皮膚狀況的組合物及其制備方法，其中所述篤斯越桔提取物作為活性組分。所述篤斯越桔提取物可抑制和清除因皮膚受到紫外線(xiàn)照射而在皮膚組織中生成的活性氧物質(zhì)，有效地抑制酪氨酸酶活性以抑制黑色素在黑素細(xì)胞中的生成，抑制細(xì)胞因子在角質(zhì)細(xì)胞中的分泌，促進(jìn)原膠原的生成并抑制膠原的分解。因此，所述提取物可用于防止由紫外線(xiàn)照射造成的皮膚光老化，促進(jìn)皮膚增白和除皺。另外，篤斯越桔提取物適合在化妝品、食品和藥物中用作去除皮膚皺紋的組分，因?yàn)樯踔潦峭糠笤谄つw上或者內(nèi)用時(shí)，篤斯越桔提取物也可以獲得改善皮膚狀況的效果。文檔編號(hào)A61Q19/08GK101102746SQ200680002128公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2006年1月11日優(yōu)先權(quán)日2005年1月11日發(fā)明者丁世榮申請(qǐng)人:丁世榮