專利名稱：血管成熟化、正常化或穩(wěn)定化劑以及皺紋防止和/或改善劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供包含來(lái)源于樟(Cinnamomum)屬植物、特別是肉桂(Cinnamomum cassia Blume)種植物的提取物的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑、Tie2(含Ig和EGF同源結(jié)構(gòu)域 的酪氨酸激酶，Tyrosine Kinase with Ig and EGF Homology Domain 2)活化劑(Tie2 磷 酸化劑)以及皺紋防止和/或改善劑。
背景技術(shù)：
在血管中，來(lái)自血管內(nèi)皮細(xì)胞的外腔面的總稱為血管壁細(xì)胞的血管平滑肌細(xì)胞和 /或周細(xì)胞介由細(xì)胞外基質(zhì)或直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘著。根據(jù)血管直徑大小不同，內(nèi)皮細(xì) 胞與壁細(xì)胞的粘著比率也不同，在大血管系統(tǒng)中，1層內(nèi)皮細(xì)胞附著有多層壁細(xì)胞，在中、小 血管中，1個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞往往附著1個(gè)壁細(xì)胞，此外，在直徑更細(xì)的血管中，1個(gè)壁細(xì)胞與多個(gè) 內(nèi)皮細(xì)胞粘著。因此，壁細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的附著對(duì)于血管在結(jié)構(gòu)上的“成熟化”過(guò)程是 重要的。此外，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此粘著，形成了使得血管內(nèi)環(huán)境因子(細(xì)胞和體液因 子)不容易漏出到血管外的內(nèi)皮細(xì)胞間的粘著斑，這對(duì)于功能性血管的“成熟化”過(guò)程是重 要的。而且，根據(jù)組織的氧和/或營(yíng)養(yǎng)成分需要，特別是在它們不足時(shí)，血管通過(guò)擴(kuò)大管腔 進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便增加血流，并將氧、養(yǎng)分充分輸送到組織中。即，“血管成熟化”的定義如下 通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此形成粘著斑來(lái)控制滲透性，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞與壁細(xì)胞的附著而使 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，將血管腔控制為大中小。此外，在各種病態(tài)下，構(gòu)建了血管結(jié)構(gòu)紊亂的血管，內(nèi)皮細(xì)胞彼此的粘著被抑制、 和/或形成了壁細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘著缺損的不成熟的血管。由于這會(huì)導(dǎo)致血管滲透性無(wú) 秩序地增強(qiáng)，因此組織內(nèi)與血管內(nèi)的體液因子和/或細(xì)胞的運(yùn)輸變得異常。如果滲透性增 強(qiáng)，則會(huì)發(fā)生組織浮腫，并造成組織功能不全，而且由于炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)無(wú)秩序地發(fā)生而會(huì) 導(dǎo)致炎癥。此外，由于壁細(xì)胞會(huì)抑制由現(xiàn)存血管芽生出血管，因此由沒(méi)有壁細(xì)胞的血管過(guò)量 地芽生出血管，而誘導(dǎo)出無(wú)秩序的血管芽生，從而導(dǎo)致病態(tài)惡化。這樣的現(xiàn)象可在以糖尿病 性視網(wǎng)膜病變和/或腫瘤、炎癥為代表的病態(tài)中觀察到。即，“血管正?；钡亩x如下通 過(guò)提高內(nèi)皮細(xì)胞彼此的粘著，促進(jìn)壁細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的附著，將血管滲透性被破壞了的血 管和/或?qū)е卵軣o(wú)秩序增生那樣的異常血管變成正常狀態(tài)。此外，上述那樣的異常血管 可由于如下原因觸發(fā)糖尿病、高血脂癥、高血壓等造成的血流內(nèi)外環(huán)境因子的變化對(duì)內(nèi)皮 細(xì)胞和/或壁細(xì)胞產(chǎn)生損傷(細(xì)胞死亡等)；或者癌癥和/或炎癥造成血管新生促進(jìn)因子 過(guò)度產(chǎn)生?！把芊€(wěn)定化”的定義如下當(dāng)發(fā)生上述的病態(tài)時(shí)，抑制對(duì)現(xiàn)存血管的損傷并抑制 內(nèi)皮細(xì)胞彼此解離、抑制內(nèi)皮細(xì)胞與壁細(xì)胞解離。此外，該穩(wěn)定化還包括抑制內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì) 胞死亡的機(jī)制。血管新生是指由現(xiàn)存血管形成新血管網(wǎng)的現(xiàn)象，其與腫瘤、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、高血脂癥、高血壓等以血管病變?yōu)橹黧w的疾病密切相關(guān)。以 VEGF(vascular endothelial growth factor 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的分子克隆為開(kāi)
3端，作為特異性地在血管形成中發(fā)揮作用的因子，已經(jīng)相繼鑒別出了 VEGF家族和促血管生 成素(angiopoietir^Ang)家族的分子。VEGF及其受體參與從被稱為脈管形成的從血管初 生到后來(lái)的血管新生的非常廣范圍的血管形成。另一方面，Ang在脈管形成后，在伴有血管 內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、分枝、嵌入、萎縮等細(xì)胞現(xiàn)象的管腔形成中發(fā)揮作用。Ang介由在血管內(nèi) 皮細(xì)胞中表達(dá)的受體型酪氨酸激酶Tie (含Ig和EGF同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶，tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain)_2來(lái)控制血管內(nèi)皮細(xì)胞與周皮細(xì)胞(周細(xì)胞) 和/或血管平滑肌細(xì)胞等血管壁細(xì)胞的粘著，在血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化中發(fā)揮作用(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) Vol. 20，No. 8 (2002) pp. 52-57 非專利文獻(xiàn) 1)。迄今為止，已知Ang-1 4這4個(gè)異構(gòu)體，Ang_l、Ang-2在人、小鼠中均存在，而 Ang-3在小鼠中存在，Ang-4在人中存在。從壁細(xì)胞分泌出的Ang-1、Ang_4刺激Tie_2， 引起細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化，隨著整聯(lián)蛋白的活化、粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的活化、PI3K/Akt (phosphatidylinositol-3-kinase (磷脂酰肌 醇-3-激酶)，PI3K ；serine-threonine kinase (絲氨酸-蘇氨酸激酶):Akt)的活化，誘 導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與壁細(xì)胞粘著。在正氧狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)壁細(xì)胞正常分泌的Ang-1、Ang-4 來(lái)維持內(nèi)皮細(xì)胞-壁細(xì)胞之間的粘著，但是如果局部產(chǎn)生低氧狀態(tài)，則作為Ang-l、Ang-4的 拮抗物的Ang-2、Ang-3的產(chǎn)生會(huì)提高，暫時(shí)抑制Tie2活化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞與附著于該內(nèi)皮 細(xì)胞的壁細(xì)胞粘著。而且，由于壁細(xì)胞的解離，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并開(kāi)始芽生式血管新生，從而 形成新血管網(wǎng)。Tie2活化通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與壁細(xì)胞粘著，有助于血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，而且 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞彼此粘著并控制血管滲透性。此外，已知Tie2活化可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞 死亡(Cho CH, Kammerer RA, Lee HJ, Yasunaga K, Kim KT, Choi HH, Kim ff, Kim SH, Park SK, Lee GM, Koh GY. Designed angiopoietin-1variant, COMP—Angl, protects against radiation-induced endothelial cell apoptosis (設(shè)計(jì)白勺i^ifl管生成素 $異體 COMP-Angl，保護(hù)細(xì)胞不受輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡).Proc Natl Acad Sci U S A. 2004Apr 13 ；101 (15) =5553-8.非專利文獻(xiàn)2)，因此針對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的各種破壞血管結(jié)構(gòu)的環(huán)境因 子，可以誘導(dǎo)Tie2活化，抑制血管的不穩(wěn)定化，從而使血管穩(wěn)定化和正常化。此外，在血管 再生醫(yī)療中，可以對(duì)由血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建而得的血管，通過(guò)誘導(dǎo)Tie2活化來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 與壁細(xì)胞粘著，從而使血管成熟化。此外，在腫瘤和/或糖尿病性視網(wǎng)膜病變等中觀察到 的、由于壁細(xì)胞不粘著于內(nèi)皮細(xì)胞而導(dǎo)致無(wú)秩序的血管增生那樣的疾病中，通過(guò)Tie2活化 可以使壁細(xì)胞粘著于內(nèi)皮細(xì)胞，使血管正?；?。此外，根據(jù)文獻(xiàn)(Thurston G，Suri C, Smith K,McClain J, Sato TN,Yancopoulos GD,McDonald DM. Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin_l (轉(zhuǎn)基因過(guò)度表達(dá)促血管生 成素-1的小鼠中的抗?jié)B漏血管).Science. 1999Dec 24 ；286 (5449) :2511_4.非專利文獻(xiàn) 3)，已經(jīng)報(bào)告了 Tie2活化可擴(kuò)大血管腔，在血管狹窄化或血管擴(kuò)大化被抑制而導(dǎo)致的缺血 性疾病中，可以通過(guò)Tie2活化來(lái)擴(kuò)大血管腔，從而改善病態(tài)。此外，最近發(fā)現(xiàn)了具有作為Ang的結(jié)構(gòu)上的特征的卷曲螺旋(coiled-coiled)結(jié) 構(gòu)域和纖維蛋白原樣(fibrinogen-like)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)分子。這些分子均不顯示與Tie_l 受體、Tie-2受體的結(jié)合能力，因此被認(rèn)為是與現(xiàn)存Ang家族不同的分子群，被命名為促血 管生成素樣因子(Angiopoietin -like protein, Angptl),才艮告了 Angptl—1、Angptl—2、 Angptl-3、Angptl-4、Angptl-5、Angptl-6、Angptl-7。所有 Angptl 都是目前未鑒定出受體的孤兒配體，對(duì)它們也可期待顯示多種作用。 已知在除了血管內(nèi)皮細(xì)胞以外的細(xì)胞中，Tie2活化誘導(dǎo)細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)。根 據(jù)迄今為止的報(bào)告，報(bào)告了造血干細(xì)胞上的Tie2活化誘導(dǎo)造血干細(xì)胞靜止(Arai F， Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, I to K, Koh GY, Suda T. Tie2/ angiopoietin-lsignaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche (Tie2/促血管生成素-1信號(hào)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞在骨髓龕中靜 止).Cell.2004Jul 23 ；118(2) 149-61.非專利文獻(xiàn)4)。即，通過(guò)誘導(dǎo)Tie2活化，可以 維持造血干細(xì)胞長(zhǎng)期在體外生存。此外，根據(jù)迄今為止的報(bào)告，可知Tie2活化通過(guò)活化 整聯(lián)蛋白等粘著因子來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)等粘著(Takakura N, Huang XL, Naruse T, Hamaguchi I, Dumont DJ, Yancopoulos GD, Suda T. Critical role of the TIE2 endothelial cell receptor in the development of definitive hematopoiesis (TIE2 內(nèi)皮細(xì)胞受體在永久造血中的關(guān)鍵作用).Immunity. 1998Nov ;9 (5) =677-86.非專利文獻(xiàn) 5)。認(rèn)為通過(guò)這樣誘導(dǎo)細(xì)胞粘著，可以利用Tie2活化而在生物體內(nèi)外誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的 貼壁依賴性生存維持。此外，根據(jù)近年來(lái)的報(bào)告，暗示Tie2在存在于癌組織中的被認(rèn)為惡 性度最高、與癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)的癌干細(xì)胞中表達(dá)(Lee OH, Xu J, Fueyo J, Fuller GN，Aldape KD, Alonso MM, Piao Y, Liu TJ, Lang FF, Bekele BN, Gomez-Manzano C. Expression of the receptor tyrosine kinase Tie2 in neoplastic glial cells is associated with integrin betal-dependent adhesion to the extracellular matrix(受體酷M酸—Bl Tie2在腫瘤性膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)同整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)的0-1依賴性粘著相關(guān)).Mol Cancer Res. 2006 Dec ；4(12) =915-26.非專利文獻(xiàn)6)。正如Tie2活化可以使造血干細(xì)胞 的細(xì)胞周期進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)那樣，通過(guò)活化在癌干細(xì)胞中表達(dá)的Tie2，也可以抑制癌干細(xì)胞 的增殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是提供新的血管成熟化、正?；?、穩(wěn)定化劑，以及Tie2活化(磷酸 化)劑。本發(fā)明者詳細(xì)研究了受到紫外線B照射后的皮膚組織中的行為。由于紫外線B的 照射而顯著地引起了表皮肥厚和皮膚血管形成，并引起了皺紋形成。發(fā)現(xiàn)在這樣的受到了 光老化的皮膚組織中Ang-1的表達(dá)顯著降低，Ang-2的表達(dá)相對(duì)于Ang_l增加。此外，由皮 膚組織切片觀察到了由于紫外線照射而壁細(xì)胞從血管內(nèi)皮細(xì)胞剝離的狀態(tài)。這些認(rèn)識(shí)暗示 了 通過(guò)紫外線照射可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與壁細(xì)胞的粘著被抑制、Tie2磷酸化被抑制即Tie2活 化被抑制的狀態(tài)。并且，由采用強(qiáng)制表達(dá)Tie2的Baf3造血細(xì)胞和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 HUVEC、使各種生藥提取物發(fā)揮作用而進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于樟(Cirmamomum)屬植 物的提取物具有活化Tie2的作用。此外，在由于紫外線B的照射而引起了光老化的小鼠皮 膚上涂布桂枝提取物，結(jié)果是通過(guò)涂布該提取物而具體地表現(xiàn)出改善作用。因此，發(fā)現(xiàn)了該 提取物通過(guò)Tie2磷酸化來(lái)改善、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞-壁細(xì)胞之間的粘著，并形成穩(wěn)定的血管結(jié) 構(gòu)，進(jìn)而恢復(fù)UVB誘導(dǎo)性的皮膚損傷和皺紋形成，從而完成了本發(fā)明。因此，本申請(qǐng)包含下述發(fā)明(1) 一種血管成熟化、正常化或穩(wěn)定化劑，包含來(lái)源于樟屬植物的提取物。
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(2)根據(jù)(1)所述的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，所述提取物來(lái)源于肉桂種植 物。(3)根據(jù)(2)所述的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，所述提取物來(lái)源于桂枝或桂皮。(4)根據(jù)⑴ (3)的任一項(xiàng)所述的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，所述提取物 是水提取物。(5) 一種Tie2活化(磷酸化)劑，包含來(lái)源于樟屬植物的提取物。(6)根據(jù)(5)所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物來(lái)源于肉桂種植物。(7)根據(jù)(6)所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物來(lái)源于桂枝或桂皮。(8)根據(jù)(5) (7)的任一項(xiàng)所述的Tie2活化(磷酸化)劑，所述提取物是水提 取物。(9) 一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有(1) (4)的任一項(xiàng)所述的血管成熟 化、正?；蚍€(wěn)定化劑。(10) 一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有(5) (8)的任一項(xiàng)所述的Tie2活化 (磷酸化)齊U。


圖1顯示Baf3細(xì)胞中由桂枝提取物和Angl產(chǎn)生的Tie2磷酸化的結(jié)果。圖2顯示由桂枝提取物和桂皮提取物產(chǎn)生的Tie2磷酸化的結(jié)果。圖3顯示HUVEC細(xì)胞中由桂枝提取物和Angl產(chǎn)生的Tie2磷酸化的結(jié)果。圖4顯示管腔形成的染色圖像。圖5以管腔形成的長(zhǎng)度為指標(biāo)顯示桂皮提取物的血管新生抑制作用。圖6以管腔形成的面積為指標(biāo)顯示桂皮提取物的血管新生抑制作用。
具體實(shí)施例方式樟屬是樟目(Lauraceae)、樟科(Lauraceae)的植物，存在300以上種，已知例如 肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、樟(C. camphora)、圓葉肉桂(C. daphnoides)、柴肉桂 (C. doederleinii)、天竺桂(C. japonicum)、圓葉藪肉桂(C. pseudo-pedunculatum)、日本 肉桂(C. sieboldii)、錫蘭肉桂(C. verum)、錫蘭肉桂(C. zeylanicum)。作為本發(fā)明中的血 管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑、Tie2活化劑(磷酸化劑)和/或血管新生抑制劑，優(yōu)選使用 來(lái)源于肉桂(Cinnamomum cassia Blume)，特別是肉桂嫩枝的桂枝(肉桂枝)或桂皮(肉桂 皮)的提取物。已知來(lái)源于作為肉桂的樹(shù)皮的桂皮的提取物作為例如生發(fā)劑的有效成分是 有用的(特開(kāi)平10-265350號(hào)公報(bào))，但是完全不知道該提取物具有血管成熟化、正常化、穩(wěn) 定化和/或Tie2活化(磷酸化)活性、血管新生抑制活性等。上述提取物可以通過(guò)常規(guī)方法來(lái)獲得，例如可以將作為其來(lái)源的植物與提取溶劑 一起在常溫或加熱下浸漬或加熱回流，然后進(jìn)行過(guò)濾、濃縮而獲得。作為提取溶劑，只要是 通常提取中使用的溶劑就可以任意使用，可列舉例如，水性溶劑，例如水、生理鹽水、磷酸緩 沖液、硼酸緩沖液，或有機(jī)溶劑，例如乙醇、丙二醇、1，3_ 丁二醇、甘油等醇類，含水醇類、氯 仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等，這些溶劑可以分別單獨(dú)使用或組合使用。優(yōu)選使用水作為溶劑。用上述溶劑提取得到的提取物可以直接使用，或使用通過(guò)例如冷凍 干燥等使其濃縮后的提取物，還可以根據(jù)需要使用采用吸附法、例如離子交換樹(shù)脂除去雜 質(zhì)后的提取物，和/或用多孔聚合物(例如7、"一’ ^卜XAD-2)的柱進(jìn)行吸附、然后用 所需溶劑溶出、再濃縮后的提取物。Tie2活化是指可以通過(guò)使Tie2磷酸化而將其轉(zhuǎn)化成活性體(磷酸化Tie2)的能 力。作為Tie2活化劑，已知促血管生成素1等作為活化Tie2的物質(zhì)。本發(fā)明的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑和/或Tie2活化(磷酸化)劑可以作為 對(duì)預(yù)防、改善血管的結(jié)構(gòu)變化所致的各種疾病和老化有效的藥品或化妝品來(lái)利用。本發(fā)明 的Tie2磷酸化劑通過(guò)誘導(dǎo)血管的正常化、穩(wěn)定化而在各種炎癥性疾病和/或免疫疾病、成 人病等疾病中作為能夠改善伴隨血管新生和/或血管損傷的全身的病變部位的藥品來(lái)利 用，所述疾病例如，各種傳染病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈硬化癥、 特應(yīng)性皮炎等。此外，可以通過(guò)抑制血管滲透性，而作為改善下述癥狀的藥品或化妝品來(lái)利 用，所述癥狀有包括皮膚的臟器、器官、各種組織內(nèi)的浮腫，例如炎癥性疾病和/或免疫疾 病、成人病引起的血管浮腫，和/或紫外線暴露和/或蟲(chóng)叮咬、變態(tài)反應(yīng)等引起的血管滲透 性增強(qiáng)所導(dǎo)致的浮腫和/或發(fā)癢等。Tie2磷酸化劑還可以作為能夠抑制由各種原因誘導(dǎo) 的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡、并抑制血管不穩(wěn)定化的藥品或化妝品來(lái)利用，所述細(xì)胞死亡例如， 炎癥性疾病和/或免疫疾病、成人病等例如各種傳染病、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、高血 壓、糖尿病、動(dòng)脈硬化癥、或放射線損傷、各種藥劑和/或紫外線引起的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死 亡。Tie2磷酸化劑可以通過(guò)血管成熟化和/或血管腔擴(kuò)大化，來(lái)促進(jìn)外傷、褥瘡等創(chuàng)傷治 愈，使血管再生醫(yī)療中的血管成熟化，作為缺血性疾病、例如腦梗塞和/或心肌梗塞的改善 劑，從而在藥品中利用，此外還可以利用血流改善效果而作為針對(duì)腰痛癥、凍傷、脫發(fā)癥等 的內(nèi)服和外用藥品來(lái)利用。在增大腦血流方面，也可以應(yīng)用于癡呆癥。針對(duì)脫發(fā)癥，也可以 作為化妝品使用。此外，對(duì)于癌癥，可以作為誘導(dǎo)癌細(xì)胞靜止的治療藥使用，對(duì)于干細(xì)胞，可 以作為其在生物體內(nèi)外的維持藥使用。光老化一般是指作為反復(fù)曝露于日光的結(jié)果而觀察到的皮膚的外觀和功能的變 化。作為日光的構(gòu)成要素的紫外線(UV)，特別是其中的UV (稱為UVB，波長(zhǎng)為290-320nm)主 要引起光老化。引起光老化所需的UVB的曝露量現(xiàn)在還未知。然而，反復(fù)曝露于引起紅斑 和/或曬斑的水平的UVB，通常與光老化相關(guān)。在臨床上，光老化可以作為肌膚粗糙、皺紋形 成、斑著色、蒼白化、松弛形成、毛細(xì)管擴(kuò)張癥發(fā)作、黑痣產(chǎn)生、紫癜病發(fā)作、容易受傷、萎縮、 纖維化病的色素去除區(qū)域產(chǎn)生、前期惡性腫瘤和惡性腫瘤的發(fā)作等來(lái)特定。光老化通常在 臉、耳、頭、頸和手等經(jīng)常曝露于日光的皮膚上發(fā)生。在皮膚的老化中，對(duì)皮膚病和/或暴露 于紫外線所引起的光老化是主要原因，本Tie2磷酸化劑可以通過(guò)抑制造成光老化的血管 疾病來(lái)用于改善光老化。本發(fā)明的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑或者Tie2磷酸化劑可以根據(jù)其使用目 的來(lái)適當(dāng)決定用量、用法、劑型。例如，本發(fā)明的血管新生抑制劑或Tie2磷酸化劑的給藥形 態(tài)可以為口服、非口服、外用等。作為劑型，可以列舉例如，片劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、浸 膏劑、糖漿劑等口服給藥劑，或注射劑、點(diǎn)滴劑或栓劑等非口服給藥劑，軟膏、乳膏、乳液、洗 劑、面膜()、y ” )、浴用劑等外用劑。在本發(fā)明的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑或者Tie2活化(磷酸化)劑中，用于抑制血管新生的、來(lái)源于樟屬植物的提取物的配合量可以根據(jù)用途來(lái)適當(dāng)決定，一般在抑 制劑總量中作為干燥物為0. 0001 20. 0質(zhì)量％，優(yōu)選為0. 0001 10. 0質(zhì)量％。此外，在本發(fā)明的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑或者Tie2活化(磷酸化)劑中， 除了上述來(lái)源于樟屬植物的提取物以外，可以根據(jù)需要適當(dāng)配合例如，通常在食品和/或 藥品中使用的賦形劑、防潮劑、防腐劑、增強(qiáng)劑、增稠劑、乳化劑、抗氧化劑、甜味料、酸味料、 調(diào)味料、著色料、香料等，通常在化妝品等中使用的美白劑、保濕劑、油性成分、紫外線吸收 劑、表面活性劑、增稠劑、醇類、粉末成分、著色劑、水性成分、水、各種皮膚營(yíng)養(yǎng)劑等。此外，在使用本發(fā)明的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑或者Tie2活化(磷酸化) 劑作為皮膚外用劑時(shí)，也可以適當(dāng)配合在皮膚外用劑中常用的助劑，例如乙二胺四乙酸二 鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬螯合劑，咖啡因、單 寧、維拉帕米(Verapamil)、凝血酸(Tranexamic Acid)及其衍生物、甘草提取物、光甘草定 (Glabridin)、木瓜果實(shí)的熱水提取物、各種生藥、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等 藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑，葡萄糖、果糖、甘 露糖、蔗糖、海藻糖等糖類，視黃酸、視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等維生素A類寸。實(shí)施例接下來(lái)，根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。另外，本發(fā)明不限于此。配合量以質(zhì)
量％表示。桂枝熱水提取干燥殘余成分的調(diào)制在400. 7g桂枝(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的枝部分)中加入2L水，加熱 提取3小時(shí)，過(guò)濾。在所得的殘?jiān)屑尤?L水，重復(fù)同樣的操作，再進(jìn)行2次加熱提取。將 所得的濾液冷凍干燥，從而獲得39. 7g熱水提取干燥殘余成分。將該樣品作為桂枝熱水提 取物。桂枝提取物HP-20柱處理將上述獲得的熱水提取物10g進(jìn)樣到義^ ^ > HP_20(三菱化學(xué)制)柱中，用 含水乙醇體系使其溶出，獲得50%乙醇溶出流分作為目標(biāo)溶出流分。桂皮熱水提取干燥殘余成分的調(diào)制在20. 12g桂皮(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的樹(shù)皮部分)中加入200ml水， 加熱提取3小時(shí)，過(guò)濾，在所得的殘?jiān)屑尤?00ml水，重復(fù)同樣的操作，再進(jìn)行2次加熱提 取。將所得的濾液冷凍干燥，從而獲得1.35g的熱水提取物干燥殘余成分。將該樣品作為 桂皮熱水提取物。Tie2磷酸化評(píng)價(jià)方法將強(qiáng)制表達(dá)野生型(WT) Tie2的Baf3造血細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中、在 IL-3 (BI0S0URCE,PMC0034)U0% FCS存在下進(jìn)行孵育。在細(xì)胞刺激的前一天，在除去了 FCS 的狀態(tài)下，采用6孔板以2X 106個(gè)細(xì)胞/l. 5mL/孔來(lái)接種并孵育一晚。將上述熱水提取干 燥殘余成分的DMS0溶液、作為陽(yáng)性對(duì)照的促血管生成素-1 (R&D system, 923-AN)或作為陰 性對(duì)照的DMS0分別添加至孔中使得各自的最終濃度為100ppm、0. 5ppm、lOOOppm，孵育10 分鐘，然后將細(xì)胞在冰上冷卻，用冷PBS洗滌。在包含蛋白酶抑制劑(LeUpeptin(亮抑酶 肽)、Aprotinin(抑肽酶)、P印statin (抑胃肽)、PMSF、Na3V04)的RIPA緩沖液中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎。加入樣品緩沖液(0. 2M Tris-HCl(pH6. 8)，4% SDS，20%甘油，5mM EDTA， 0. 01% BPB)，在以下條件下進(jìn)行SDS-PAGE(7. 5%聚丙烯酰胺凝膠，12孔，NPU-7. 5L，了卜一 (株))凝膠7. 5%丙烯酰胺凝膠(NPU-7. 5L T卜一株式會(huì)社制)電泳條件40mA (75分鐘，凝膠2片)Tie2 抗體sc_324(Santa Cruz Biotechnology 制)磷酸化Tie2 抗體#4221 (Cell Signaling 制)接下來(lái)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting，20V，4°C，過(guò)夜)向PVDF膜進(jìn)行 轉(zhuǎn)印。通過(guò)5%脫脂奶粉/TBST進(jìn)行封閉(1小時(shí))，然后加入Tie-2(Santa Cruz,sc-324) 或磷酸化Tie2(Cell Signaling，#4221)，在4°C下放置過(guò)夜。接著，加入山羊抗兔Ig’ s HRP(BI0S0URCE ALI3404)，在室溫下放置1小時(shí)。通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(ECL)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì) 條帶。圖1顯示桂枝熱水提取物的Tie2磷酸化的評(píng)價(jià)結(jié)果。觀察到桂枝提取物與Ang-1 同樣地引起Tie2磷酸化。因此，桂枝熱水提取物顯示Tie2磷酸化效果，暗示其有助于血管 成熟化、正?；?、穩(wěn)定化，其結(jié)果可以抑制血管新生。圖2顯示桂枝熱水提取物和桂皮熱水 提取物兩者的Tie2磷酸化的評(píng)價(jià)結(jié)果。觀察到與桂枝熱水提取物同樣地，桂皮熱水提取物 也引起Tie2的磷酸化。2)采用正常人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，同樣地評(píng)價(jià)Tie2磷酸化評(píng)價(jià)。在 細(xì)胞刺激前3小時(shí)，將培養(yǎng)基由Humedia換成RPMI1640，接下來(lái)與Baf3細(xì)胞同樣地進(jìn)行評(píng) 價(jià)。其結(jié)果示于圖3。與Baf3的結(jié)果相同，桂枝熱水提取物與Ang-1同樣地引起Tie2磷酸 化。另外，在添加了作為陰性對(duì)照的DMS0體系中，未觀察到顯著的Tie2磷酸化(圖中未示 出)。皺紋防止和/或改善效果試驗(yàn)光老化皺紋改善試驗(yàn)采用Hr-1 (Skh-1)無(wú)毛小鼠(星野實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；6周齡 10周齡)，將Schwarz等人 的方法(Haratake A. et al.，J. Invest. Dermatol.，108，769-775，1997)部分改變,依據(jù)反 復(fù)照射 UVB 的方法(Naganuma M. et al. , J. Dermatol. Sci.，25，29-35，2001，Schwartz E.， J. Invest.，Dermatol.，91，158-161，1988)來(lái)形成皺紋。即，對(duì)個(gè)體背部照射UVB (光源東 芝二 >々卜U 7々制東芝FL-20SE熒光燈)，每周3次，照射10周。開(kāi)始后的照射量為36mJ/ cm2/次，第2周以后逐漸增加，第10周為216mJ/Cm2/次?？傉丈淞繛?. 6J/cm2。紫外劑量 采用以UV輻射計(jì)(UVR-305/365D(II)，株式會(huì)社卜” 二 >制)測(cè)定得到的值。停止紫外線照 射，拍攝背部照片，利用將Bissett等人的方法(Bissett DL. et al.，Photochemistry and Photobiology 46,367-378,1987)部分改變而得的方法，依據(jù)下述所示判定基準(zhǔn)對(duì)皺紋的 產(chǎn)生程度進(jìn)行評(píng)分，僅使用形成了評(píng)分為7以上的皺紋的個(gè)體，涂布實(shí)施例1(配合桂枝提 取物、即上述熱水提取物干燥殘余成分)或?qū)嵤├? (配合桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇 溶出流分)。皺紋的評(píng)分操作由3名測(cè)定者分別進(jìn)行，通過(guò)協(xié)商來(lái)決定評(píng)分。另外，在評(píng)價(jià)時(shí)，遵守動(dòng)物愛(ài)護(hù)管理法及其相關(guān)條例，基于獲得公司內(nèi)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 審議會(huì)承認(rèn)的計(jì)劃來(lái)實(shí)施。實(shí)施例1的組合物；
9
(成分)桂枝提取物化妝品用乙醇純化水實(shí)施例2的組合物；(成分)桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇溶出流分化妝品用乙醇純化水
1. 0 30. 0
1. 0 30. 0
配合量(質(zhì)量％)
配合量(質(zhì)量％)評(píng)分判定基準(zhǔn)0 未觀察到皺紋。1 與評(píng)分2相比，皺紋更淺、更短或數(shù)量更少。2 觀察到淺皺紋。3 與評(píng)分2相比，皺紋更深或更長(zhǎng)。且與評(píng)分4相比，皺紋更淺、更短或數(shù)量更少。4 整體觀察到淺皺紋。5 與評(píng)分4相比，皺紋更深或更長(zhǎng)。且與評(píng)分6相比，皺紋更淺或更短。6 觀察到深且長(zhǎng)的皺紋。7 與評(píng)分6相比，深且長(zhǎng)的皺紋增加。且與評(píng)分8相比，皺紋更淺或更短。8 整體觀察到深且長(zhǎng)的皺紋。將評(píng)分為7以上的無(wú)毛小鼠分成2組，每組5只，且使兩組的評(píng)分相同，在各組個(gè) 體的整個(gè)背部皮膚上分別按照100 i!l、l天1次、一周5次、連續(xù)6周的方式涂布顯示上述 組成的實(shí)施例1和實(shí)施例2處方。涂布結(jié)束后，拍攝背部的照片，根據(jù)上述所示的判定基準(zhǔn)，在隱藏動(dòng)物組名的狀態(tài) 下由3名測(cè)定者分別對(duì)皺紋的程度進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)協(xié)商來(lái)決定評(píng)分。此外，用在實(shí)施例1的組合物中除去了桂枝提取物的比較例1進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。比較例1的組合物；(成分)配合量(質(zhì)量％)化妝品用乙醇30.0純化水殘余皺紋的改善度如下求出。即，按照“皺紋的改善度”=“樣品溶液涂布前的評(píng)分”"“涂布樣品溶液6周后的評(píng)分”的式子來(lái)計(jì)算。在下述表中作為各組的平均值顯示按照上述式得到的皺紋改善度(皺紋改善變 化量)。[表 1]
權(quán)利要求
一種血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，包含來(lái)源于樟屬植物的提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管成熟化、正常化或穩(wěn)定化劑，所述提取物來(lái)源于肉桂種 植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，所述提取物來(lái)源于桂枝或桂皮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3的任一項(xiàng)所述的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，所述提取物是 水提取物。
5.一種Tie2活化劑，包含來(lái)源于樟屬植物的提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Tie2活化劑，所述提取物來(lái)源于肉桂種植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的Tie2活化劑，所述提取物來(lái)源于桂枝或桂皮。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7的任一項(xiàng)所述的Tie2活化劑，所述提取物是水提取物。
9.一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的血管成熟化、 正常化或穩(wěn)定化劑。
10.一種皺紋防止和/或改善劑，其配合有權(quán)利要求5 8的任一項(xiàng)所述的Tie2活化劑。
全文摘要
本發(fā)明提供包含來(lái)源于樟(Cinnamomum)屬植物的提取物的血管成熟化、正?；蚍€(wěn)定化劑，或Tie2活化劑。
文檔編號(hào)A61Q19/08GK101980716SQ20098011175
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者大田正弘, 小林孝次, 常長(zhǎng)誠(chéng), 草苅健, 高倉(cāng)伸幸 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂