專利名稱：具有改變的凈電荷、在去污劑中使用的多點(diǎn)置換的蛋白酶變體的制作方法
具有改變的凈電荷、在去污劑中使用的多點(diǎn)置換的蛋白酶
變體相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是1998年10月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/956,323、1998年10月23 日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/956,564和1998年10月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/956,324 的部分繼續(xù)申請(qǐng)，所有這些申請(qǐng)?jiān)诖硕纪暾谩?br> 背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一個(gè)亞組。其包括多種類別的具有廣泛特性和生 物功能的酶。Stroud，R.，科學(xué)美國(guó)人(Sci.Amer.) 131 : 74-88。盡管其功能的多樣性， 但絲氨酸蛋白酶的催化機(jī)制至少由兩種遺傳分離的酶家族來完成1)枯草桿菌蛋白酶和 2)哺乳動(dòng)物胰凝乳蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶及同源細(xì)菌絲氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶 和灰色鏈霉菌(S.gresius)胰蛋白酶)。這兩個(gè)絲氨酸蛋白酶家族顯示非常相似的催化機(jī) 理。Kraut，J. (1977)，生物化學(xué)年述(Annu.Rev.Biochem.)，46: 331-358。此外，盡管 一級(jí)結(jié)構(gòu)不相關(guān)，但這兩個(gè)酶家族的三級(jí)結(jié)構(gòu)存在由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸組成的 氨基酸保守催化三聯(lián)體。枯草桿菌蛋白酶是由多種芽孢桿菌屬的種及其它微生物大量分泌的絲氨酸蛋白 酶(分子量約為27,500)。已經(jīng)測(cè)定了芽孢桿菌屬至少九個(gè)不同種的枯草桿菌蛋白酶的 蛋白質(zhì)序列。Markland，F(xiàn).S.等人(1983)，Hooppe-Seyler' s Z.Physiol.Chem., 364 1537-1540。 曾經(jīng)報(bào)道了來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢 桿菌(Bacillus licheniformis)和遲緩芽孢桿菌(B.lentus)幾種天然變體的枯草桿菌蛋白酶 的三維晶體結(jié)構(gòu)。這些研究表明，盡管枯草桿菌蛋白酶與哺乳動(dòng)物絲氨酸蛋白酶在遺傳 上是不相關(guān)的，但它具有相似的活性部位結(jié)構(gòu)。含有共價(jià)結(jié)合的肽抑制劑的枯草桿菌 蛋白酶(Robertus，J.D.等人(1972)，生物化學(xué)(Biochemistry)，11 239-2449)或產(chǎn)物 復(fù)合物(Robertus，J.D.等人(1976)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，251 1097-1103) 的χ-射線晶體結(jié)構(gòu)也提供了關(guān)于枯草桿菌蛋白酶的活性部位和推斷的底物結(jié)合裂隙的信 息。另外，曾經(jīng)報(bào)道了關(guān)于枯草桿菌蛋白酶的大量動(dòng)力學(xué)和化學(xué)修飾研究(Svendsen， B. (1976)，Carlsberg 研究通訊(Carlsberg Res.Commun.)，41 237-291 ； Markland, F.S.，同前)，并且至少有一條報(bào)道，其中枯草桿菌蛋白酶殘基222的甲硫氨酸的側(cè)鏈 被過氧化氫轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸_亞砜(Stauffer，D.C.等人(1965)，生物化學(xué)雜志，244 5333-5338)，并進(jìn)行了廣泛的位點(diǎn)專一誘變(Wells 和 Estell (1988) TIBS 13 291-297)。在用于去污劑制劑的蛋白酶變體的開發(fā)中，一個(gè)常見的問題是洗滌條件的多樣 性，包括可在其中使用蛋白酶變體的不同去污劑制劑。例如，在不同領(lǐng)域中使用的去污 劑配方在洗滌用水(wash water)中含有不同濃度的有關(guān)成分。例如，歐洲去污劑體系一 般在洗滌用水中含有大約4500-5000ppm的去污劑成分，而日本去污劑體系一般在洗滌用 水中含有大約667ppm的去污劑成分。在北美洲，尤其在美國(guó)，去污劑體系一般在洗滌用 水中含有約975ppm的去污劑成分。令人驚奇地，發(fā)展了一種可用于 低去污劑濃度體系、 高去污劑濃度體系和/或中去污劑濃度體系以及可用于所有這三種去污劑濃度體系的蛋白酶變體的合理設(shè)計(jì)方法。發(fā)明概述 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白酶 變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更 弱，因此該蛋白酶變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種低去污劑濃度 體系是在洗滌用水中存在少于約SOOppm的去污劑成分的洗滌體系。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白 酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性 更弱，因此該蛋白酶變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種高去污劑濃 度體系是在洗滌用水中存在超過約2000ppm的去污劑成分的洗滌體系。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白 酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性 更弱，因此該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種中去污劑濃 度體系是在洗滌用水中存在約SOOppm到約2000ppm的去污劑成分的體系。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換的蛋白 酶變體，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性 更弱，因此該蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。一種中去污劑濃 度體系是在洗滌用水中存在約SOOppm到約2000ppm的去污劑成分的洗滌體系。本發(fā)明另外一個(gè)目的在于提供編碼這些蛋白酶變體的DNA序列，以及含有這些 變異體DNA序列的表達(dá)載體。更進(jìn)一步，本發(fā)明的另一目的在于提供用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及能夠 表達(dá)這種DNA而在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生蛋白酶變體的宿主細(xì)胞。進(jìn)一步提供一種含有本發(fā)明的蛋白酶變體的清潔用組合物。另外，也提供一種含有本發(fā)明的蛋白酶變體的動(dòng)物飼料。進(jìn)一步提供一種產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中都比前體蛋白酶更有效的 蛋白酶變體的方法，包括a)置換一個(gè)或多個(gè)殘基位置處的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使 得其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱；b)置換一個(gè)或多個(gè)殘基位置處的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使 得其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱；C)檢測(cè)該變體，以測(cè)定它在高、中及低去污劑濃度體系中與前體蛋白酶相比的 有效性；及d)必要時(shí)重復(fù)步驟a)-C)，以產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶 更有效的蛋白酶變體，其中步驟a)和b)能以任意順序進(jìn)行。附圖簡(jiǎn)述圖IA-B描述解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的DNA及氨基酸序列，和該基因 的部分限制酶切圖譜。圖2描述解淀粉芽孢桿菌(BPN)，和遲緩芽孢桿菌(野生型)枯草桿菌蛋白酶 之間的保守氨基酸殘基。
圖3A和3B描述四種枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。最上一行代表來源于解淀 粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(有時(shí)也稱為枯草桿菌蛋白酶BPN’ )的枯草桿菌蛋白酶的 氨基酸序列。第二行描述來源于枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。第三行 描述來源于地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。第四行描述來源于遲緩芽孢 桿菌的枯草桿菌蛋白酶(在PCTW089/06276中也稱為枯草桿菌蛋白酶309)的氨基酸序 列。符號(hào)*表示與枯草桿菌蛋白酶BPN’相比特定氨基酸殘基缺如。發(fā)明詳述如上所述，特定地區(qū)具有特定的洗滌條件，因而使用不同類型的去污劑。例 如，日本使用低去污劑濃度體系，而歐洲使用高去污劑濃度體系。如前所述，美國(guó)使用 中去污劑濃度體系。我們發(fā)現(xiàn)，在這些不同的去污劑制劑中表現(xiàn)最佳的蛋白酶變體各不 相同。然而，由這些觀察的結(jié)果可以預(yù)料，發(fā)現(xiàn)一種適用于所有這三種去污劑類型中的 蛋白酶是不可能的。令人驚奇地，情況并非如此。已經(jīng)發(fā)展了一種方法，用于合理設(shè) 計(jì)可在低去污劑濃度體系或高去污劑濃度體系乃至中去污劑濃度體系中使用的蛋白酶變 體，以及在所有這三種去污劑濃度體系都適用的蛋白酶變體。我們發(fā)現(xiàn)，為了產(chǎn)生在低去污劑濃度體系中更有效的蛋白酶變體，用帶負(fù)電荷 殘基或中性殘基替換帶正電殘基和/或用帶負(fù)電殘基替換中性殘基是必要的。相反，我 們注意到，為了產(chǎn)生在高去污劑濃度體系中更有效的蛋白酶變體，用帶正電殘基或中性 殘基替換帶負(fù)電殘基和/或用帶正電殘基替換中性殘基是必要的。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在 低去污劑濃度體系和/或高去污劑濃度體系中有用的許多蛋白酶變體在中去污劑濃度體 系中也有效。通過平衡這些變化，可能產(chǎn)生在低去污劑濃度體系、低及中去污劑濃度體 系、中及高去污劑濃度體系、高去污劑濃度體系或所有這三種去污劑濃度體系中有出色 表現(xiàn)的蛋白酶變體。假定在水溶液中具有酸性或堿性功能的任何離子化氨基酸側(cè)鏈的靜電電荷是pH 的函數(shù)。酸性殘基Glu和Asp在平衡過程中由于在pH3-6之間解離而失去一個(gè)質(zhì)子，由 此得到一個(gè)負(fù)電荷。His、Lys和Arg分別在pH5-8、pH8.5_11.5和pHll-14之間以相 似的方式逐步去質(zhì)子化，由此失去一個(gè)正電荷。TyrOH的質(zhì)子在pH8.5-11.5之間逐漸解 離，Tyr由此得到一個(gè)負(fù)電荷。羧基端的解離范圍是pHl-4，產(chǎn)生一個(gè)負(fù)電荷，對(duì)于氨基 端是PH8-11，伴隨著一個(gè)正電荷的丟失。對(duì)于此處列出的氨基酸側(cè)鏈，解離范圍是多種 蛋白質(zhì)的平均值，但公知在某些蛋白質(zhì)中它受異常結(jié)構(gòu)構(gòu)型的影響。
所有電荷的累積效應(yīng)決定了一種蛋白質(zhì)在特定的pH時(shí)是具有凈正電荷還是凈負(fù) 電荷。正電荷和負(fù)電荷等效并使蛋白質(zhì)處于靜電中性狀態(tài)時(shí)的pH稱為等電點(diǎn)(pi)。當(dāng) pH改變或者添加或去除含有離子化側(cè)鏈殘基的氨基酸時(shí)，蛋白質(zhì)將失去或得到電荷。通 過將在特定pH時(shí)帶負(fù)電的殘基替換為不帶電的或帶正電的殘基，分別導(dǎo)致+1及+2的形 式電荷改變，能實(shí)現(xiàn)凈正電荷的增加。通過將不帶電側(cè)鏈殘基替換為在特定pH時(shí)質(zhì)子化 的殘基，形式電荷改變將為+1。同樣，將在觀測(cè)pH時(shí)帶正電及不帶電的側(cè)鏈替換為帶 負(fù)電的側(cè)鏈，能增加凈負(fù)電荷，并分別得到-1和_2的負(fù)電荷形式增加。低去污劑濃度體系包括在洗滌用水中存在低于大約SOOppm的去污劑成分的去 污劑。日本去污劑一般被認(rèn)為是低去污劑濃度體系，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟写嬖诖蠹s 667ppm的去污劑成分。
中去污劑濃度包括在洗滌用水中存在大約800ppm到約2000ppm的去污劑成分的去污劑。北美去污劑一般被認(rèn)為是中去污劑濃度體系，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟写嬖诖?約975ppm的去污劑成分。巴西的體系一般在洗滌用水中存在大約1500ppm的去污劑成 分。高去污劑濃度體系包括在洗滌用水中存在高于大約2000ppm的去污劑成分的去 污劑。歐洲去污劑一般被認(rèn)為是高去污劑濃度體系，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈煊盟写嬖诖蠹s 4500-5000ppm的去污劑成分。拉丁美洲去污劑一般是高泡沫磷酸鹽助洗去污劑，在拉丁美洲使用的去污劑范 圍可能處于中及高去污劑濃度，因?yàn)樵谙礈煊盟兴鼈冇?500ppm到6000ppm的去污劑 成分。如上所述，巴西的體系一般在洗滌用水中含有大約1500ppm的去污劑成分。然 而，其它高泡沫磷酸鹽助洗去污劑地區(qū)，不限于其它拉丁美洲國(guó)家，可能有在洗滌用水 中存在可達(dá)大約6000ppm的去污劑成分的高去污劑濃度體系。根據(jù)前述，顯然典型洗滌溶液中去污劑組合物的濃度在全世界范圍內(nèi)各不相 同，從低于大約SOOppm的去污劑組合物(“低去污劑濃度地區(qū)”)，例如在日本為大約 667ppm，到約800ppm_約2000ppm( “中去污劑濃度地區(qū)”)，例如在美國(guó)約為975ppm、 在巴西約為1500ppm，到高于大約2000ppm( “高去污劑濃度地區(qū)”)，例如在歐洲為大 約4500ppm_約5000ppm，在高泡沫助洗劑地區(qū)約為6000ppm。典型洗滌溶液的濃度由經(jīng)驗(yàn)確定。例如，在美國(guó)，一種典型的洗滌機(jī)可容納大 約64.4升體積的洗滌溶液。因此，為了獲得在洗滌溶液中大約975ppm去污劑的濃度， 必須向64.4升洗滌溶液中加入大約62.79克去污劑組合物。這種量是由消費(fèi)者用去污劑 所帶量杯測(cè)量的加入洗滌用水中的典型量。蛋白酶是通常用來切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的羰基水解酶。在此使用時(shí)，“蛋白 酶”意思是天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括α-氨酰肽水解酶、 肽酰氨基酸水解酶、?；被饷?、絲氨酸羧基肽酶、金屬羧基肽酶、巰基蛋白酶、 羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。包括絲氨酸、金屬、巰基和酸性蛋白酶，以及內(nèi)切蛋白酶和 外切蛋白酶。本發(fā)明包括非天然存在的羰基水解酶變體的蛋白酶(蛋白酶變體)，與衍生出該 變體氨基酸序列的前體羰基水解酶相比，其具有不同的蛋白水解活性、穩(wěn)定性、底物特 異性、ρΗ分布曲線和/或性能特征。特別是，這些蛋白酶變體具有自然界中未知的氨基 酸序列，它是由于前體蛋白酶的大多數(shù)氨基酸殘基被替換為不同氨基酸而產(chǎn)生的。前體 蛋白酶可以是天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。此處有用的蛋白酶變體包含19種天然存在的L-氨基酸中任一種在指定氨基酸殘 基位置處的置換。這些置換能在任何前體枯草桿菌蛋白酶(原核、真核、哺乳動(dòng)物等) 中進(jìn)行。在整個(gè)申請(qǐng)中，以常用的單字母及三字母密碼的形式提及不同的氨基酸。這些 密碼由 Dale，M.W.(1989),《細(xì)菌分子遺傳學(xué)》(Molecular Genetics of Bacteria)，John Wiley & Sons，Ltd.,附錄 B 確定。此處有用的蛋白酶變體優(yōu)選地來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。更優(yōu)選 地，蛋白酶變體來源于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和/或枯草桿菌蛋白酶309?？莶輻U菌蛋白酶是一般用來切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的細(xì)菌或真菌蛋白酶。在此使用時(shí)，“枯草桿菌蛋白酶”意思是天然存在的枯草桿菌蛋白酶或重組枯草桿菌蛋白 酶。已知一系列天然存在的枯草桿菌蛋白酶是由不同微生物種產(chǎn)生且常常為分泌的。該 系列成員的氨基酸序列不是完全同源的。然而，該系列中的枯草桿菌蛋白酶顯示相同或 相似類型的蛋白水解活性。該類絲氨酸蛋白酶具有一種共同的氨基酸序列，該序列定義 了有別于胰凝乳蛋白酶相關(guān)種類絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體。枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳 蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶都含有包括天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯(lián)體。在 枯草桿菌蛋白酶相關(guān)蛋白酶中，這些氨基酸從氨基端向羧基端閱讀的相對(duì)順序是天冬氨 酸-組氨酸-絲氨酸。但是，在胰凝乳蛋白酶相關(guān)蛋白酶中相對(duì)順序?yàn)榻M氨酸-天冬氨 酸-絲氨酸。因此，枯草桿菌蛋白酶在此是指含有枯草桿菌蛋白酶相關(guān)蛋白酶的催化三 聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。實(shí)例包括但不限于此處圖3中所確定的枯草桿菌蛋白酶。一般而 言，并且對(duì)于本發(fā)明，蛋白酶中氨基酸的編號(hào)對(duì)應(yīng)于分配給

圖1所示成熟解淀粉芽孢桿 菌枯草桿菌蛋白酶序列的編號(hào)?！爸亟M枯草桿菌蛋白酶”或“重組蛋白酶”是指一種枯草桿菌蛋白酶或蛋白 酶，其中編碼枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列受到修飾，產(chǎn)生一種變異(或突變) DNA序列，該序列編碼天然存在的氨基酸序列中一種或多種氨基酸的置換、缺失或插 入。產(chǎn)生這種修飾、并且可與此處公開的方法結(jié)合的適當(dāng)方法包括美國(guó)專利RE34,606、 美國(guó)專禾IJ 5,204,015和美國(guó)專利5,185,258、美國(guó)專利5,700,676、美國(guó)專利5,801,038和美 國(guó)專利5,763,257中公開的方法。“非人類的枯草桿菌蛋白酶”及其編碼DNA可以從多種原核及真核生物中獲 得。原核生物的合適實(shí)例包括革蘭氏陰性生物如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)、 革蘭氏陽性菌如微球菌(Micrococcus)或芽孢桿菌?？蓮闹蝎@得枯草桿菌蛋白酶及其 基因的真核生物的實(shí)例包括酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真菌如曲霉 (Aspergillus)屬的種?！暗鞍酌缸凅w”具有由“前體蛋白酶”的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。前體 蛋白酶包括天然存在的蛋白酶和重組蛋白酶。蛋白酶變體的氨基酸序列通過前體氨基酸 序列中一種或多種氨基酸的置換、缺失或插入而由前體蛋白酶氨基酸序列“衍生”。這 種修飾是編碼前體蛋白酶氨基酸序列的“前體DNA序列”的修飾，而不是前體蛋白酶自 身的操作。對(duì)前體DNA序列進(jìn)行這種操作的適當(dāng)方法包括此處公開的方法，以及本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的方法(參見，例如，EP 0 328299、W089/06279和已經(jīng)在此引用的美國(guó) 專利及申請(qǐng))。這些氨基酸位置編號(hào)是指那些分配給圖1所示成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋 白酶序列的編號(hào)。然而，本發(fā)明不限于該特定枯草桿菌蛋白酶的突變，而是擴(kuò)展到在一 定位置處含有這樣的氨基酸殘基的前體蛋白酶，該殘基“等同”于解淀粉芽孢桿菌枯草 桿菌蛋白酶中特別確定的殘基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，前體蛋白酶是遲緩芽 孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，并在遲緩芽孢桿菌中對(duì)應(yīng)于以上所列位點(diǎn)的等同氨基酸殘基位 置處進(jìn)行置換。如果前體蛋白酶的殘基(氨基酸)位置與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的特定殘基或該殘基的一部分同源(即，在一級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)中位置相對(duì)應(yīng))或類似(即，具有 相同或相似的化學(xué)結(jié)合、反應(yīng)或相互作用的功能能力)，則它相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基。為了建立與一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，將前體蛋白酶的氨基酸序列直接與解淀粉芽孢 桿菌枯草桿菌蛋白酶一級(jí)序列相比較，特別與公知在序列已知的枯草桿菌蛋白酶中不變 的一組殘基相比較。例如，在此圖2顯示解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶與遲緩芽孢桿 菌枯草桿菌蛋白酶之間的保守殘基。對(duì)比保守殘基，為維持序列對(duì)比進(jìn)行必要的插入和 缺失(即，避免保守殘基由于任意缺失和插入而消除)之后，確定等同于解淀粉芽孢桿菌 枯草桿菌蛋白酶一級(jí)序列中特定氨基酸的殘基。保守殘基的對(duì)比優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)保持100%的 這些殘基。然而，超過75%或低至50%的保守殘基的對(duì)比也足以確定等同的殘基。催化 三聯(lián)體Asp32/His64/Ser221的保守性應(yīng)當(dāng)保持。Siezen等人(1991)蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.)4(7) 719-737顯示了大量絲氨酸蛋白酶的序列對(duì)比。Siezen等人將此分組稱為枯 草桿菌酶(Subtilase)或枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。例如，圖3中，排列對(duì)比了解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌 (carlsbergensis)和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶之氨基酸序列，以提供氨基酸序列之 間最大量的同源性。這些序列的比較顯示，在每種序列中含有許多保守殘基。圖2中確 定了這些保守殘基(BPN’與遲緩芽孢桿菌之間)。因此，可用這些保守殘基確定其它枯草桿菌蛋白酶，諸如遲緩芽孢桿菌枯草桿 菌蛋白酶(1989年7月13日公布的PCT公開文本W(wǎng)089/06279)、此處優(yōu)選的蛋白酶前 體酶或被稱為PB92的枯草桿菌蛋白酶(EP 0 328 299，它與優(yōu)選的遲緩芽孢桿菌枯草桿菌 蛋白酶高度同源)中與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相應(yīng)的等同氨基酸殘基。在圖3A 和3B中將這些枯草桿菌蛋白酶中某些氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的序 列相對(duì)比，產(chǎn)生保守殘基的最大同源性。如所能看到的，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋 白酶相比，遲緩芽孢桿菌序列中存在大量缺失。因此，例如，在其它枯草桿菌蛋白酶中 與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的Vall65等同的氨基酸對(duì)于遲緩芽孢桿菌和地衣芽 孢桿菌而言是異亮氨酸。也可以通過測(cè)定已經(jīng)通過χ-射線晶體分析法確定三級(jí)結(jié)構(gòu)的前體蛋白酶在三級(jí) 結(jié)構(gòu)水平上的同源性，來確定“等同的殘基”。等同的殘基被定義為前體蛋白酶和解淀 粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對(duì)N、 CA對(duì)CA、C對(duì)C和O對(duì)O)經(jīng)對(duì)比后在0.13nm優(yōu)選地O.lnm之內(nèi)的殘基。在定向并 定位最佳模型之后完成對(duì)比，得到所述蛋白酶與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的非氫 蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊。最佳模型是在可獲得的最高分辨力時(shí)對(duì)于實(shí)驗(yàn)衍射 數(shù)據(jù)可得到最低R因子的晶體模型。
R 因子=U\Fo(h)\-\Fc(h)\ Σ H\ Fofh)\與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定殘基功能類似的等同殘基被定義為前體 蛋白酶的如下氨基酸，它們可采取一種構(gòu)象，使得它們以一種確定的方式改變、修飾或 貢獻(xiàn)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化，且其歸因于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特 定殘基。此外，它們是前體蛋白酶的那類殘基(通過X-射線晶體分析法已獲得其三級(jí) 結(jié)構(gòu))，其占據(jù)了類似位點(diǎn)，使得盡管基于占據(jù)同源位點(diǎn)，特定殘基的主鏈原子也許不能滿足等同的標(biāo)準(zhǔn)，但該殘基的至少兩個(gè)側(cè)鏈原子之原子坐標(biāo)位于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相應(yīng)側(cè)鏈原子的0.13nm內(nèi)。在EPO公開文本O 251 446(相當(dāng)于美國(guó)專利 5,182,204，其公開內(nèi)容在此引用作為參考)中闡述了解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的 三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)，并能如上所述用來在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上確定等同的殘基。為了置換所確定的某些殘基是保守殘基，而其它的則不是。對(duì)于不保守的殘 基而言，一種或多種氨基酸的置換限于產(chǎn)生這樣一種變體的置換，該變體具有一種與自 然中所發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不對(duì)應(yīng)的序列。對(duì)于保守殘基而言，這些置換不能產(chǎn)生天然存 在的序列。本發(fā)明的蛋白酶變體包括蛋白酶變體的成熟形式，以及這些蛋白酶變體的 原-形式和前原-形式。前原-形式是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠溆欣诘鞍酌缸凅w的表達(dá)、 分泌和成熟。“原序列”是指與蛋白酶成熟形式的N端部分結(jié)合的氨基酸序列，當(dāng)它被去除 后，導(dǎo)致該蛋白酶“成熟”形式的出現(xiàn)。實(shí)質(zhì)上發(fā)現(xiàn)許多蛋白水解酶為翻譯酶原產(chǎn)物， 在不存在翻譯后加工的情況下以該方式表達(dá)。用于產(chǎn)生蛋白酶變體的一種優(yōu)選原序列是 解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的推定的原序列，盡管也可使用其它蛋白酶原序列?！靶盘?hào)序列”或“前序列”是指與蛋白酶N端部分結(jié)合或與原蛋白酶N端部分 結(jié)合的任何氨基酸序列，它們可能參與蛋白酶成熟形式或原形式的分泌。信號(hào)序列的這 種定義是一種功能性定義，意為包括蛋白酶基因N端部分所編碼的所有氨基酸序列，其 在天然條件下參與蛋白酶分泌的實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明利用這些序列實(shí)現(xiàn)此處所述蛋白酶變體的 分泌。一種可能的信號(hào)序列包含枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號(hào)序列的前7個(gè)氨基酸 殘基，這些殘基與遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號(hào)序列(ATCC21536)的剩余部分相融
合O蛋白酶變體的“前原”形式由含有與蛋白酶氨基端有效連接的原序列的蛋白酶 成熟形式和與原序列氨基端有效連接的“前”序列或“信號(hào)”序列組成?！氨磉_(dá)載體”是指一種DNA構(gòu)建體，其含有與能實(shí)現(xiàn)該DNA在適當(dāng)宿主中表 達(dá)的適當(dāng)控制序列有效連接的DNA序列。這類控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制這 種轉(zhuǎn)錄的任意操縱子序列、編碼適當(dāng)mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄與翻譯終 止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒，或者僅僅是有效的基因組插入片段。一旦轉(zhuǎn) 化到適當(dāng)宿主中，載體可不依賴于宿主基因組復(fù)制并起作用，或者在某些情況中可能整 合到基因組自身中。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時(shí)交換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是目 前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意在包括表達(dá)載體的其它形式，它們具有等同的功 能，并且是或者可成為本領(lǐng)域所公知的。本發(fā)明中所用的“宿主細(xì)胞”通常是原核或真核宿主，它們優(yōu)選地用美國(guó)專利 RE 34,606中公開的方法操作，以使其不能分泌酶促活性的內(nèi)切蛋白酶。表達(dá)蛋白酶的一 種優(yōu)選宿主細(xì)胞是芽孢桿菌株BG2036，它缺乏具有有酶活性的中性蛋白酶和堿性蛋白酶 (枯草桿菌蛋白酶)。美國(guó)專利5,264,366中詳述了菌株BG2036的構(gòu)建。表達(dá)蛋白酶的 其它宿主細(xì)胞包括枯草芽孢桿菌1168 (在美國(guó)專利RE 34,606和美國(guó)專利5,264,366中也 有描述，其公開內(nèi)容在此引用作為參考)，以及任何合適的芽孢桿菌屬的菌株，如地衣芽 孢桿菌、遲緩芽孢桿菌等。用以重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能復(fù)制編碼蛋白酶 變體的載體或表達(dá)希望的蛋白酶變體。對(duì)于編碼蛋白酶變體前-形式或前 原-形式的載體而言，這些變體當(dāng)表達(dá)時(shí)一般由宿主細(xì)胞向宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌。當(dāng)描述兩個(gè)DNA區(qū)域之間的關(guān)系時(shí)，“有效連接”僅意味著它們?cè)诠δ苌媳舜?相關(guān)。例如，如果一種前序列作為信號(hào)序列參與蛋白質(zhì)成熟形式的分泌，最可能的是參 與信號(hào)序列的切割，則該前序列與肽有效連接。如果一種啟動(dòng)子控制一種編碼序列的轉(zhuǎn) 錄，則該啟動(dòng)子與該序列有效連接；如果一種核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于一定位置使得翻譯成 為可能，則它與編碼序列有效連接。編碼天然存在的前體蛋白酶的基因可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的通用方法獲 得。這些方法一般包括合成含有編碼目標(biāo)蛋白酶區(qū)推定序列的標(biāo)記探針、由表達(dá)該蛋 白酶的生物制備基因組文庫，以及通過與該探針雜交為了獲得目標(biāo)基因篩選該文庫。然 后對(duì)陽性雜交克隆作圖并測(cè)定。然后用克隆的蛋白酶轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以表達(dá)該蛋白酶。然后將蛋白酶基因連接 于高拷貝數(shù)質(zhì)粒中。該質(zhì)粒在宿主中復(fù)制，在此意義上它含有質(zhì)粒復(fù)制所必需的眾所周 知的元件與所述基因有效連接的啟動(dòng)子(如果它可被宿主識(shí)別，即轉(zhuǎn)錄，則可作為基 因本身的同源啟動(dòng)子)、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和聚腺苷酸化區(qū)(在某些真核宿主細(xì)胞中，它對(duì)于由 宿主從蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性是必需的)，它是外源的或由蛋白酶基因的內(nèi)源 終止區(qū)所提供的，質(zhì)粒中還期望含有選擇性基因，如抗生素抗性基因，它使得質(zhì)粒感染 的宿主細(xì)胞通過在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以維持連續(xù)培養(yǎng)成為可能。高拷貝數(shù)質(zhì)粒 也含有宿主的復(fù)制起點(diǎn)，從而能在細(xì)胞質(zhì)中不受染色體限制地產(chǎn)生大量質(zhì)粒。然而，宿 主基因組中整合多拷貝的蛋白酶基因也處于本發(fā)明之內(nèi)。利用對(duì)同源重組特別敏感的原 核和真核生物利于此過程。該基因可能是天然遲緩芽孢桿菌基因。此外，也可以產(chǎn)生編碼天然存在的或突 變的前體蛋白酶的合成基因。這種方法中，測(cè)定前體蛋白酶的DNA和/或氨基酸序列。 之后合成多個(gè)、重疊的合成單鏈DNA片段，雜交并連接后產(chǎn)生編碼前體蛋白酶的合成 DNA。在美國(guó)專利5,204,015的實(shí)施例3中描述了合成的基因構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)例，其公開 內(nèi)容在此引用作為參考。一旦克隆了天然存在的或合成的前體蛋白酶基因，即進(jìn)行大量修飾，以增強(qiáng)天 然存在的前體蛋白酶合成之外的基因用途。這些修飾包括如美國(guó)專利RE 34,606和EPO 公布號(hào)0 251 446所公開的重組蛋白酶的產(chǎn)生和此處所述的蛋白酶變體的產(chǎn)生。可用下列盒式誘變法促進(jìn)本發(fā)明的蛋白酶變體的構(gòu)建，盡管也可使用其它方 法。首先，獲得天然存在的編碼蛋白酶的基因，并全部或部分測(cè)序。然后為了尋找希望 在編碼的酶中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(缺失、插入或置換)的位點(diǎn)，掃描該序列。評(píng) 價(jià)側(cè)翼于該位點(diǎn)的序列是否存在估計(jì)限制酶切位點(diǎn)的存在，用于將基因的短片段替換為 表達(dá)時(shí)編碼不同突變體的寡核苷酸集合體。這些限制酶切位點(diǎn)優(yōu)選地是蛋白酶基因內(nèi)的 唯一位點(diǎn)，以便于基因片段的置換。然而，可使用在蛋白酶基因中不過度豐余的任何適 宜的限制酶切位點(diǎn)，只要限制酶切消化產(chǎn)生的基因片段能夠在適當(dāng)?shù)男蛄兄兄匦卵b配即 可。如果在與所選位點(diǎn)適當(dāng)距離內(nèi)(10-15個(gè)核苷酸)的位置處不存在限制酶切位點(diǎn)，則 可通過以在最終構(gòu)建中不改變讀框也不改變所編碼氨基酸的方式置換基因中的核苷酸來 產(chǎn)生這些位點(diǎn)。為了改變其序列以符合目標(biāo)序列，基因突變依照公知的方法通過M13引物延伸來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)遺傳密碼的豐余性、基因的限制酶圖譜和大量不同的限制酶，常規(guī) 進(jìn)行定位適當(dāng)側(cè)翼區(qū)并估計(jì)所需改變以得到兩種適宜的限制酶切位點(diǎn)序列的工作。注意 到如果可獲得適宜的側(cè)翼限制酶切位點(diǎn)，則上述方法需要僅僅與不含該位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)結(jié) 合應(yīng)用。
一旦克隆了天然存在的DNA或合成的DNA，即用同源的限制酶消化側(cè)翼于待突 變位點(diǎn)的限制酶切位點(diǎn)，并將多數(shù)末端互補(bǔ)的寡核苷酸盒連接于該基因中。該方法簡(jiǎn)化 了誘變，因?yàn)槟芎铣伤泄押塑账崾蛊渚哂邢嗤南拗泼盖形稽c(diǎn)，且合成的接頭不是產(chǎn) 生限制酶切位點(diǎn)所必需的。在此使用時(shí)，蛋白水解活性被定義為每毫克活性酶的肽鍵水解率。測(cè)定蛋白水 解活性有許多眾所周知的方法(K.M.KaliSZ，“微生物蛋白酶”《生物化學(xué)工程/生物技 術(shù)進(jìn)展》(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，A.Fiechter 編，1988)。 除了改進(jìn)的蛋白水解活性之外，或者作為一種備擇，本發(fā)明的變異蛋白酶可能具有其它 改進(jìn)的性質(zhì)，如Km、kcat或k。at/Km比值和/或改進(jìn)的底物特異性和/或改進(jìn)的pH活性分 布曲線。這些酶能量身定做般地用于例如預(yù)計(jì)在肽制劑中存在的特定底物，或適于水解 過程如洗衣用途。本發(fā)明的一個(gè)方面，目的在于獲得一種與前體蛋白酶相比具有改變的蛋白水解 活性的變異蛋白酶，因?yàn)樘岣哌@種活性(數(shù)字上的變大)使得酶更有效地作用于靶底物的 用途成為可能。同樣需要的是與前體相比具有改變的熱穩(wěn)定性和/或改變的底物特異性 的變異酶。在有些情況中，可能希望較低的蛋白水解活性，例如，在需要蛋白酶合成活 性時(shí)(對(duì)于合成肽)蛋白水解活性的降低可能是有用的。人們可希望降低該蛋白水解活 性，該活性能破壞這種合成的產(chǎn)物。相反，在某些情況中，可能希望提高變異酶與其前 體相比的蛋白水解活性。此外，變體穩(wěn)定性-堿穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性_的提高或降低(改 變)可能是所希望的。k。at、Km或！^/Km的增加或降低對(duì)于用來測(cè)定這些動(dòng)力學(xué)參數(shù)的 底物是特異性的。本發(fā)明的另一方面，發(fā)現(xiàn)如下的蛋白酶變體在低去污劑濃度中比前體蛋白酶更 有效，該蛋白酶變體在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置的 電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱。本發(fā)明的再另一方面，發(fā)現(xiàn)如下的蛋白酶變體在高去污劑濃度中比前體蛋白酶 更有效，該蛋白酶變體在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置 的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在低去污劑濃度體系和/或高去污劑濃度體系中有用的許多 蛋白酶變體在中去污劑濃度體系中也是有效的。這些置換優(yōu)選地在遲緩芽孢桿菌(重組的或天然型)枯草桿菌蛋白酶中進(jìn)行， 盡管該置換也可在任何芽孢桿菌蛋白酶，優(yōu)選地在芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中進(jìn)行。根據(jù)用變異蛋白酶獲得的篩選結(jié)果，解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的顯著 突變對(duì)于這些酶的蛋白水解活性、性能和/或穩(wěn)定性以及這些變異酶的清潔或洗滌能力
至關(guān)重要。本發(fā)明的許多蛋白酶變體可用于配制不同的去污劑組合物或個(gè)人護(hù)理制劑如洗 發(fā)劑或洗滌劑。許多公知的化合物是在含有本發(fā)明之蛋白酶突變體的組合物中有用的適當(dāng)表面活性劑。其包括非離子、陰離子、陽離子或兩性離子去污劑，如Barry IAnderson 的US 4,404,128和Jiri Flora等人的US 4,261,868中所公開的。一種合適的去污劑制劑是 美國(guó)專利5,204,015(前文引用作為參考)的實(shí)施例7中所述的制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉 能用作清潔用組合物的不同制劑。除了典型的清潔用組合物之外，易于理解本發(fā)明的蛋 白酶變體也可用于使用天然或野生型蛋白酶的任何目的。因此，例如，這些變體能用于 固體肥皂或液體肥皂的用途、餐具清潔(dishcare)劑、隱形眼鏡清潔液或產(chǎn)品、肽水解、 廢物處理、紡織品用途、用作蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的融合-切割酶，等等。本發(fā)明的變體可在 去污劑組合物中具有增強(qiáng)的性能(與前體相比)。在此使用時(shí)，在去污劑中的增強(qiáng)性能定 義為某些酶敏感性污跡如草或血液的清除加強(qiáng)，如在標(biāo)準(zhǔn)洗滌循環(huán)后通過通用評(píng)估所測(cè) 定的。本發(fā)明的蛋白酶能以大約0.01%到大約5% (優(yōu)選地0.1%-0.5%)的重量百分比 水平配制于已知的pH6.5-12.0的粉末及液體去污劑中。這些去污劑清潔用組合物也能包 含其它的酶如已知的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶或糖苷內(nèi)切酶，以及助洗劑和 穩(wěn)定劑。本發(fā)明的蛋白酶向常規(guī)清潔用組合物中的添加不產(chǎn)生任何特殊的應(yīng)用限制。換句話說，適合于去污劑的任何溫度和pH也適合于該組合物，只要pH位于上述范圍之 內(nèi)，而溫度低于所述蛋白酶的變性溫度。另外，本發(fā)明的蛋白酶也能在不含去污劑的清 潔用組合物中使用，單獨(dú)或與助洗劑和穩(wěn)定劑結(jié)合使用。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的蛋白酶變體的清潔用組合物。清潔用組合物另外也 可含有常用于清潔用組合物的添加劑。其能選自但不限于漂白劑、表面活性劑、助洗 齊U、酶和漂白催化劑。本領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員可容易地理解何種添加劑適合包含于 組合物中。此處提供的列表絕不是完全的，而只是作為適當(dāng)添加劑的實(shí)例。本領(lǐng)域的一 名普通技術(shù)人員可容易地理解，應(yīng)當(dāng)只使用那些與該組合物中的酶及其它成分如表面活 性劑相適合的添加劑。制成后，清潔用組合物中存在的添加劑的量為大約0.01%-約99.9%，優(yōu)選地約 1%-約95%，更優(yōu)選地約-約80%。本發(fā)明的變異蛋白酶能包含于動(dòng)物飼料中，如作為動(dòng)物飼料添加劑部分，例 如，如 US 5,612,055、US 5,314,692 和 US 5,147,642 所述。本發(fā)明的一個(gè)方面是含有本發(fā)明的變異蛋白酶的用于紡織品處理的組合物。如 出版物如RD 216,034、EP 134,267、US 4,533,359和EP 344,259中所述，能用該組合物處 理如絲綢或毛。以下以實(shí)施例的方式描述，而不應(yīng)理解為對(duì)權(quán)利要求書范圍的限制。此處引用的所有出版物和專利在此都完全引入作為參考。實(shí)施例1用本領(lǐng)域眾所周知的方法生產(chǎn)并純化大量蛋白酶變體。所有突變都在遲緩芽孢 桿菌GG36枯草桿菌蛋白酶中進(jìn)行。用美國(guó)系列號(hào)60/068,796 “一種測(cè)定優(yōu)選的酶和/或優(yōu)選的去污劑組合物的改 進(jìn)方法”中所述的微觀(microswatch)測(cè)定法檢測(cè)產(chǎn)生的蛋白酶變體在兩種去污劑及洗滌 條件中的表現(xiàn)。
表1-13列出了所測(cè)定的變異蛋白酶和在兩種不同去污劑中檢測(cè)的結(jié)果。所有數(shù) 值都是與表中所示第一種蛋白酶比較而得出的(即，1.32的值表示，與表中第一種變體的 100%相比釋放132%的污物的能力)。A欄顯示變體的電荷差異。對(duì)于B欄，去污劑是0.67g/l過濾的Ariel Ultra(Procter& Gamble，Cincinnati, OH,美國(guó))，溶于每加侖含有 3 格令混合 Ca2+/Mg2+ 硬度的溶液中，25°C下每孔使用0.3ppm的酶(低濃度去污劑體系)。對(duì)于C欄，去污劑 是 3.38g/l 過濾的 Ariel Futur(Procter & Gamble，Cincinnati, OH,美國(guó))，溶于每加侖含
有15格令混合Ca27Mg2+硬度的溶液中，40°C下每孔使用0.3ppm的酶(高濃度去污劑體 系)。表 權(quán)利要求
1.一種蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變 了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱，并且該蛋白酶 變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
2.權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其中該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的蛋白酶變體，其來源于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶。
5.一種編碼權(quán)利要求1的蛋白酶變體的DNA。
6.一種編碼權(quán)利要求5的DNA的表達(dá)載體。
7.一種用權(quán)利要求6的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的清潔用組合物。
9.一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的動(dòng)物飼料。
10.一種含有權(quán)利要求1的蛋白酶變體的用于處理紡織品的組合物。
11.一種蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變 了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱，并且該蛋白酶 變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
12.權(quán)利要求11的蛋白酶變體，其中該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的蛋白酶變體，其來源于芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的蛋白酶變體，其來源于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶。
15.一種編碼權(quán)利要求11的蛋白酶變體的DNA。
16.一種編碼權(quán)利要求15的DNA的表達(dá)載體。
17.一種用權(quán)利要求16的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
18.一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的清潔用組合物。
19.一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的動(dòng)物飼料。
20.一種含有權(quán)利要求11的蛋白酶變體的用于處理紡織品的組合物。
21.權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其中高去污劑濃度高于洗滌用水中2000ppm的濃度。
22.一種產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效的蛋白酶變體的方 法，包括a)置換一個(gè)或多個(gè)殘基位置的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷 與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱；b)置換一個(gè)或多個(gè)殘基位置的氨基酸，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷 與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱；C)檢測(cè)該變體，測(cè)定它在高、中及低去污劑濃度體系中與前體蛋白酶相比的有效 性；及d)必要時(shí)重復(fù)步驟a)-c)，產(chǎn)生在低、中及高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效 的蛋白酶變體。
23.—種蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變 了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱，并且該蛋白酶 變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
24.—種蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，其中該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱，并且該蛋白酶 變體在中去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
全文摘要
公開了具有改變的凈電荷、在去污劑中使用的多點(diǎn)置換的蛋白酶變體。變異蛋白酶的獲得方法通常是，對(duì)編碼天然存在的或重組的蛋白酶的前體DNA序列進(jìn)行體外修飾，在前體蛋白酶的氨基酸序列中引起多處氨基酸殘基的置換。提供了如下蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比負(fù)電性更強(qiáng)或正電性更弱，因此該蛋白酶變體在低去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。也提供了如下蛋白酶變體，其在一個(gè)或多個(gè)殘基位置處含有氨基酸置換，該置換改變了該位置的電荷，使其電荷與前體蛋白酶相比正電性更強(qiáng)或負(fù)電性更弱，因此該蛋白酶變體在高去污劑濃度體系中比前體蛋白酶更有效。
文檔編號(hào)C11D3/395GK102021159SQ20101054362
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月23日
發(fā)明者A·J·寶露斯, C·培馳, D·P·納奇, J·T·小凱利斯, J·納德尼, K·D·科里爾, R·M·卡爾德威爾, V·夏蘭伯格 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司