專利名稱：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼新型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的多核苷酸及其利用方法。
背景技術(shù)：
作為貯藏脂質(zhì)的三酰甘油通過向二酰甘油轉(zhuǎn)移?；?。向二酰甘油轉(zhuǎn)移?；拿副环Q為二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase DGAT),已知將?；鵆oA作為?；w(酰基給予體)的類型的?；鵆oA: 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase) (EC :2· 3. I. 20)，將憐脂作為酸基供體的類型的憐脂二酸甘油酸基轉(zhuǎn)移酶(phospholipids:diacylglycerolacyltransferase:憐脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)) (EC :2. 3. I. 158)。將?；鵆oA作為?；w的DGAT由于一級結(jié)構(gòu)不同，可分為DGATl和DGAT2的2·個家族。(非專利文獻(xiàn)I及2)。此外，有關(guān)磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)基因，已知從酵母及植物等中克隆(專利文獻(xiàn)I、非專利文獻(xiàn)3及4)，其中，有關(guān)來自擬南芥的磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)，已知有可將磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等各種磷脂作為酰基給予體，且可轉(zhuǎn)移Cltl-C22的?；?非專利文獻(xiàn)5)。菌類中研究較多的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作為編碼DGAT的基因，已知有屬于DGAT2家族的DGAl (Y0R245C)(非專利文獻(xiàn)6)及作為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的LROl (YNR008W)。雖然由于由此2個基因編碼的酶占據(jù)了酵母的DGAT活性的大部分，但即使同時破壞這些基因，DGAT活性也不會完全喪失。已知有關(guān)該殘留DGAT活性，由作為?；鵆oA:甾醇?；D(zhuǎn)移酶基因的AREl基因和ARE2基因編碼的酶的DGAT活性決定(非專利文獻(xiàn)7)。作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的高山被孢霉(Mortierella alpina:M. alpina)中，至今為止已報(bào)道的有將?；鵆oA作為?；w的4種DGAT及其基因(2種DGATl家族基因和2種DGAT2家族基因)(專利文獻(xiàn)2及3、非專利文獻(xiàn)8)。但在高山被孢霉(M. alpina)中，將磷脂作為酰基供體的磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的同源物還不為人所知。已知Λ5脂肪酸去飽和酶為氧化二高-Y-亞麻酸(DGLA)并催化花生四烯酸(ARA)生成的酶，但在高山被孢霉(M. alpina)中，因?yàn)橹饕饔糜谧鳛榱字Ｄ憠A的?；嬖诘亩?Y -亞麻酸(DGLA)，所以，花生四烯酸作為磷脂酰膽堿的?；?非專利文獻(xiàn)9)。因此，為了促進(jìn)高山被孢霉(M. alpina)中含有花生四烯酸的三酰甘油的生成，需要從作為磷脂酰膽堿等磷脂的酰基而存在的花生四烯酸中生成含有花生四烯酸的三酰甘油的酶?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本特表2002-541783公報(bào)專利文獻(xiàn)2美國專利申請公開第2006/0094086號說明書專利文獻(xiàn)3美國專利申請公開第2006/0091087號說明書
非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Proc. Natul. Acad. Sci. USA，95，13018-13023，1998非專利文獻(xiàn)2 J. B. C.，276 (42)，38862-38869，2001非專利文獻(xiàn)3 J. B. C.，275 (21)，15609-15612,2000非專利文獻(xiàn)4 Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 97(12)，6487-6492非專利文獻(xiàn)5 Plant Physiology，135，1324-1335非專利文獻(xiàn)6 J. Bacteriol.，184，519-524，2002非專利文獻(xiàn)7 J. B. C. ,277(8) ,6478-6482，2002 非專利文獻(xiàn)8日本2003年農(nóng)藝化學(xué)會大會要旨集非專利文獻(xiàn)9 J. B. C. ,278(37) ,35115-35126，200
發(fā)明內(nèi)容
在如上所述的情況下，為了在高山被孢霉(M. alpina)中生成含有花生四烯酸的三酰甘油，期望有用的新型的酶。本發(fā)明者深入研究的結(jié)果，成功地克隆了編碼作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(M. alpina)的磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的同源物(MaLROl)的基因，從而完成了本發(fā)明。即本發(fā)明提供以下多核苷酸、蛋白質(zhì)、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的脂質(zhì)或脂肪酸組合物及食品等的制造方法以及根據(jù)該制造方法制造的食品等。即本發(fā)明如下。[I] 一種多核苷酸，其特征在于，為選自以下(a) (e)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有序列號I或4的堿基序列；(b)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中I 100個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì) '及(e)多核苷酸，其為與由序列號I或4的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。[2]根據(jù)上述[I]中所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(f)或(g)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(f)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中I 10個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì) '及(g)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有75%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。[3]根據(jù)上述[I]中所述的多核苷酸，其特征在于，含有序列號I或4的堿基序列。[4]根據(jù)上述[I]中所述的多核苷酸，其特征在于，編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。[5]根據(jù)上述[I] [4]中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其特征在于,為DNA。
[6] 一種蛋白質(zhì),其特征在于，由上述[I] [5]中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。[7] 一種載體，其特征在于，含有上述[I] [5]中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。[8] 一種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了上述[I] [5]中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。[9] 一種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了上述[7]中所述的載體。[10]根據(jù)上述[8]或[9]中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體為脂質(zhì)生產(chǎn)菌。[11]根據(jù)上述[10]中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述脂質(zhì)生產(chǎn)菌為高山被孢霉 (Mortierella alpina)。[12] 一種脂質(zhì)或脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從上述[8] [11]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取脂質(zhì)或脂肪酸組合物。[13]上述[12]中所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)為三酰甘油。[14]根據(jù)上述[12]中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸為花生四烯酸或二I^-Y-亞麻酸。[15] 一種食品、醫(yī)藥品、化妝品或肥皂，其特征在于，含有通過上述[12]中所述的制造方法提取的脂質(zhì)或脂肪酸組合物。本發(fā)明的多核苷酸可用于脂質(zhì)生產(chǎn)菌(例如高山被孢霉(M. alpina))、酵母、植物等的轉(zhuǎn)化。即將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞內(nèi)，制成轉(zhuǎn)化體，通過在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)所述多核苷酸，可高效生成大量含有二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的三酰甘油。如此得到的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)化脂質(zhì)生產(chǎn)菌、轉(zhuǎn)化酵母或轉(zhuǎn)化植物等)可用于制造脂肪酸組合物、食品、化妝品、醫(yī)藥、肥皂等。更加具體地說，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)脂質(zhì)及脂肪酸的效率極高。因此，本發(fā)明可有效用于制造需要大量脂質(zhì)或脂肪酸的醫(yī)藥品或健康食品。


圖IA是表不MaLROl的基因組序列和⑶S序列的比對圖。圖IB是接續(xù)圖IA表示MaLROl的基因組序列和⑶S序列的比對圖。 圖2A是表示MaLROl的⑶S序列和推定氨基酸序列的圖。圖2B是接續(xù)圖2A表示MaLROl的⑶S序列和推定氨基酸序列的圖。圖3是表示來自各種菌類的磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)同源物蛋白質(zhì)的氨基酸序列的比對圖。磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)活性中重要的氨基酸殘基(*印)超越菌種被保留下來。圖4是表示從酵母菌體中提取的脂質(zhì)組分中的脂肪酸量的圖。圖5是表示從酵母菌體中提取的脂質(zhì)組分中的脂肪酸組成的圖。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。以下的實(shí)施方式是用于說明本發(fā)明的例示，并不意味著將本發(fā)明只局限于該實(shí)施方式。本發(fā)明在不脫離其主旨的前提下，可以以各種方式實(shí)施。另外，在本說明書中引用的所有文獻(xiàn)以及公開公報(bào)、專利公報(bào)等其他專利文獻(xiàn)，均作為參照列入本說明書中。且本說明書包含2009年12月21日申請的作為本申請優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的日本國專利申請(日本特愿2009-289287號)的說明書和附圖中記載的內(nèi)容。本發(fā)明者如后述實(shí)施例中所詳細(xì)記載，首次成功地克隆了來自作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(M. alpina)的磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)同源物的基因(MaLROl)的全長cDNA。且本發(fā)明者鑒定了來自高山被孢霉(M. alpina)的MaL ROl的基因組DNA的堿基序列及推定氨基酸序列。MaLROl的ORF序列、MaLROl的推定氨基酸序列、MaLROl的⑶S序列、MaLROl的cDNA序列及MaLROl的基因組序列分別為序列號I、序列號2、序列號3、序列號4及序列號5。這些多核苷酸及酶可通過后述實(shí)施例中 所述的方法、公知的基因工程的方法、公知的合成方法等獲得。I.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供一種多核苷酸，其特征在于，為選自以下(a) (e)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其含有序列號I或4的堿基序列；(b)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中I 100個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì) '及(e)多核苷酸，其為與由序列號I或4的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。本說明書中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。本說明書中，“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸”是指，例如將由序列號I或4的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸、或由編碼序列號2的氨基酸序列的堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分作為探針，采用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸。關(guān)于雜交的方法，例如可以利用在“Sambrook & Russell, MolecularCloning A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001，，以及“Ausubel, Current Protoco Is in Molecular Biology, John Wiley & Sons1987-1997”等中記載的方法。本說明書中，“嚴(yán)謹(jǐn)條件”可以是低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件以及高嚴(yán)謹(jǐn)條件中的任一種?！暗蛧?yán)謹(jǐn)條件”例如為5 X SSC, 5 X Denhardt溶液、0. 5% SDS、50 %甲酰胺、32 °C的條件?！爸袊?yán)謹(jǐn)條件”例如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SD S、50%甲酰胺、42°C或5XSSCU% SDS、50mM Tris_HCL(pH7. 5)、50%甲酰胺、42°C的條件?！案邍?yán)謹(jǐn)條件”例如為5XSSC,5XDenhardt 溶液、0. 5% SDS、50% 甲酰胺、50°C或 0. 2XSSC、0. 1% SDS、65°C 的條件。在這些條件中，溫度越高越能期待高效地得到具有高同一性的DNA。但是，作為影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度的因素，有溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過適當(dāng)選擇這些因素來實(shí)現(xiàn)同樣的嚴(yán)謹(jǐn)度。另外，當(dāng)雜交使用市售的試劑盒時，例如可以使用Alkphos Direct Labell ingand Detection System (GE Healthcare)。此時,按照試劑盒中附帶的操作指南,與標(biāo)記的探針孵育過夜后，在55°C的條件下使用含有0. I % (w/v) SDS的最初的洗滌緩沖液將膜洗滌后，即可檢測出雜交的DNA?；蚧谛蛄刑朓或4的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列、或編碼序列號2的氨基酸序列的堿基序列的全部或一部分制備探針時，使用市售的試劑(例如，PCR標(biāo)記混合物(Roche Diagnostics公司)等)將該探針進(jìn)行地高辛(DIG)標(biāo)記的情況下,可使用DIG核酸檢測試劑盒(Roche Diagnostics公司)來檢測雜交。作為上述以外可進(jìn)行雜交的多核苷酸，可以列舉通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件，使用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算時，與序列號I或4的DNA或者編碼序列號2的氨基酸序列的DNA有50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. I %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5 %以上、99. 6 %以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的DNA。
另夕卜，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可以用FASTA(ScienCe 227(4693)1435-1441，(1985) )、Karlin-Altschul 的算法 BLAST (Basic Local Alignme nt SearchTool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990 ；Proc Natl Acad Sci USA 90 :5873,1993)來確定。開發(fā)出了基于BLAST算法的被稱為blastn、blastx、blastp、tblastn和tblastx 的程序(Altschul SF, et al J Mol Biol 215 :403,1990)。使用 blastn 分析喊基序列時，參數(shù)例如為score = 100、wordlength = 12。此外使用blastp分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score = 50、wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。上述本發(fā)明的多核苷酸可以通過公知的基因工程的方法或公知的合成方法獲得。2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明提供如下所示的蛋白質(zhì)。(i)由上述(a) (e)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。(ii)含有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(iii)含有序列號2的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(iv)具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。上述(iii)或(iv)所述的蛋白質(zhì)，代表性的有天然存在的序列號2的蛋白質(zhì)的突變體，但也包括可使用例如 “Sambrook & Russell, Molecular Cloning A LaboratoryManual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001，，“Ausubel, CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987_1997”、“Nuc. Acids. Res.,10,6487 (1982) ”“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,6409 (1982) ”“Gene，34，315 (1985) ”、“Nuc.Acids. Res.，13,4431 (1985) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，488 (1985) ”等中記載的定點(diǎn)突變法來人工獲得的蛋白質(zhì)。本說明書中，作為“由序列號2的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)”，可以列舉由序列號2的氛基酸序列中例如I 100個、I 90個、I 80個、I 70個、I 60個、I 50個、I 40個、I 39個、I 38個、I 37個、I 36個、I 35個、I 34個、I 33個、I 32個、I 31個、I 30個、I 29個、I 28個、I 27個、I 26個、I 25個、I 24個、I 23個、I 22個、I 21個、I 20個、I 19個、I 18個、I 17個、I 16個、I 15個、I 14個、I 13個、I 12個、I 11個、I 10個、I 9個(I 數(shù)個)、1 8個、I 7個、I 6個、I 5個、I 4個、I 3個、I 2個或I個氛基酸殘基發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加后的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或附加的數(shù)量通常越少越好。且作為此種蛋白質(zhì)，還可以列舉具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. I %以上、99. 2 %以上、99. 3 %以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。上述同一性的數(shù)值通常越大越好。且二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性可根據(jù) Stahl et al. ,Plant Physiology，135，1324-1335 (2004)中所述的方法測定。此外，作為確認(rèn)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，可以列舉使用了三酰甘油的生成量顯著降低的酵母的Adgal、ΔΙγοΙ株的實(shí)驗(yàn)。使編碼該酶的多核苷酸在Adgal、 Alrol株中表達(dá)時，如三酰甘油生成量增加，則由該多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)或肽可具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明者在實(shí)施例中，使用薄層色譜法將脂質(zhì)分離成三酰甘油(TG)組分和磷脂(PL)組分，可確認(rèn)出三酰甘油生成量增大，但未發(fā)現(xiàn)磷脂生成量的變化(圖 4)。本發(fā)明中，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性可以為?；鵆oA: 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性或磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性中的任一種，優(yōu)選為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中I個或多個氨基酸殘基發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中的任意且I個或多個氨基酸序列中的位置上有I個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或附加，缺失、取代、插入及附加中的2種以上也可同時發(fā)生。以下所示為能相互取代的氨基酸殘基的例子。在同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸出組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸出組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸^組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸而組苯丙氨酸、酪氨酸。另外,本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以通過Fmoc法(9_荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成方法來制造。此外，也可以利用Advanced Automation Peptide ProteinTechnologies 公司制、拍金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies 公司制、PerSeptive公司制、Applied Biosystems公司制、SHIMADZU公司等制的多肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。3.本發(fā)明的載體和導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化體本發(fā)明還在另一實(shí)施方式中提供含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的載體通常包含如下表達(dá)盒而構(gòu)成，該表達(dá)盒包含(i)可在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的啟動子；(ii)與該啟動子連接的上述(a) (g)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸；以及(iii)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化相關(guān)、在宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的信號 作為構(gòu)成要素。如此構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞。作為本發(fā)明中使用的適合的宿主細(xì)胞的例子，可以列舉脂質(zhì)生產(chǎn)菌、酵母等。作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌，例如可以使用在MYC0TAX0N，Vol.XLIV，No. 2, pp. 257-265(1992)中記載的菌株，具體而言可以列舉屬于被孢霉屬(Mortierell a)的微生物、例如長孢被孢霉(Mortierella elongata) IF08570、微小被抱霉(Mortierella exigua) IF08571、喜濕被抱霉(Mortierella hygrophila) IF05941、高山被抱霉(Mortierella alpina) IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219. 35、CBS224. 37、CBS250. 53、CBS343. 66、CBS527. 72、CBS528. 72、CBS529. 72、CBS608. 70、CBS754. 68 等被孢霉亞屬(subgenusMortierella)的微生物、或深黃被抱霉(Mortierella isabellina)CBS 194.28、IF06336、IF07824、 IF07873、 IF07874、 IF08286、 IF08308、 IF07884、矮被孢霉(Mortierellanana) IF08190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana) IF05426、IF08186、CBS112. 08、CBS212. 72、IF07825、IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236. 82等Micromucor亞屬(subgenus Micromucor)的微生物等。特別優(yōu)選高山被抱霉(Mortierella alpina)。此外，作為酵母的例子，還可以列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954 等。且在酵母內(nèi)導(dǎo)入本發(fā)明的載體，分析該載體編碼的蛋白質(zhì)的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性時，若作為宿主細(xì)胞使用的酵母的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因(DGA1及LR01)缺損，則可以只評價該蛋白質(zhì)的酶活性。因此，在本發(fā)明的一個方式中，作為宿主細(xì)胞的酵母優(yōu)選缺損DGAl基因及LROl基因。由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化后的這些宿主細(xì)胞，與未由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞相t匕，生成更多的脂質(zhì)，優(yōu)選為三酰甘油(也被稱為“甘油三酯”)，更優(yōu)選為含有花生四烯酸或二高-Y-亞麻酸(DGLA)的三酰甘油，最優(yōu)選為含有花生四烯酸的三酰甘油。作為在脂質(zhì)生產(chǎn)菌中導(dǎo)入時使用的載體，例如可以利用pDura5(Appl. Microbiol.Biotechnol.，65，419-425，(2004))，但不限于此。作為在酵母中導(dǎo)入時使用的載體，只要是具有在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)插入片段的活性的載體即可，無特另1J限定，作為例子，可以列舉pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem.，59,1221-1228,1995)。作為在高山被孢霉中導(dǎo)入時使用的載體，只要是具有在高山被孢霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)插入片段的活性的載體，無特別限定，作為例子，可列舉高山被孢霉(M. alpina)表達(dá)用載體pDuraMCS。
作為調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)的啟動子/終止子，只要在宿主細(xì)胞中起作用即可，可以是任意的組合。例如，在脂質(zhì)生產(chǎn)菌中利用時，可以利用histon H4. I基因的啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子等。作為轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記，可以利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記(ura5、niaD)、抗藥性標(biāo)記(潮霉素、Zeocin)、Geneticin 抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUPl) (Marin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81,3371984)、淺藍(lán)菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分別來自豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64,660,1992 ;Hussain et et al. , gene, 101,149,1991)等。作為宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，可以利用常用的公知方法。例如為脂質(zhì)生產(chǎn)菌時，可以利用電穿孔法(Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol. , 66,4655-4661, 2000) >粒子轟擊(Particle Delivery)法(日本特開2005-287403 “脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法”(日語原名脂質(zhì)生産菌O育種方法)中記載的方法)。另外，為酵母時，可以采用電穿孔法、原生質(zhì)球法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978))、醋酸鋰法(J. Bacteriology, 153,pl63 (1983)) > Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、Methods in yeast genetics,2000 Edition A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 等中記載的方法來實(shí)施，但不限于這些。·此外，有關(guān)通常的克隆技術(shù)，可參照“Sambrook & Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001'“Methodsin Yeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor, NY)，，等。4.本發(fā)明的脂質(zhì)或脂肪酸組合物的制造方法本發(fā)明還在另一實(shí)施方式中提供使用上述轉(zhuǎn)化脂質(zhì)生產(chǎn)菌或酵母的脂質(zhì)或脂肪酸組合物的制造方法。本說明書中，“脂質(zhì)”是指包括由脂肪酸和醇通過酯鍵形成的化合物(例如甘油酯)或其類似物(例如膽固醇酯)等的單純脂質(zhì)、在單純脂質(zhì)的一部分上進(jìn)一步結(jié)合磷酸、氨基酸、糖等而得到的復(fù)合脂質(zhì)以及脂質(zhì)的水解產(chǎn)物中不溶于水的衍生脂質(zhì)。本說明書中，“油脂”是指甘油和脂肪酸的酯(甘油酯)。本說明書中，“脂肪酸”是指由通式RC00H(R為烷基)表示的脂肪族一元羧酸(具有I個羧基、碳原子呈鏈狀連接的羧酸)。脂肪酸包括烴鏈中不含雙鍵的飽和脂肪酸和含有雙鍵的不飽和脂肪酸。本發(fā)明的脂質(zhì)或脂肪酸組合物，可以從根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中按以下操作來提取。對于生物(例如脂質(zhì)生產(chǎn)菌或酵母)的轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)結(jié)束后，可以按照離心分離法、過濾等常用方法得到培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞充分水洗，優(yōu)選進(jìn)行干燥。干燥可以通過冷凍干燥、風(fēng)干等來進(jìn)行。將干燥細(xì)胞根據(jù)需要采用Dyno Mill或超聲波等破碎后，優(yōu)選在氮?dú)饬飨率褂糜袡C(jī)溶劑進(jìn)行提取處理。作為有機(jī)溶劑，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或者通過甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的單相溶劑的提取，也能得到良好的結(jié)果。通過在減壓下從提取物中餾去有機(jī)溶劑，可以得到含有脂肪酸的脂質(zhì)。提取的脂肪酸也可以采用鹽酸甲醇法等進(jìn)行甲酯化。另外，關(guān)于從上述含有脂肪酸的脂質(zhì)中分離脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯的狀態(tài)下，采用常用方法(例如尿素附加法、冷卻分離法、柱色譜法等)濃縮分離來進(jìn)行。通過本發(fā)明的方法制造的脂質(zhì)優(yōu)選為三酰甘油，更優(yōu)選為含有花生四烯酸或二高-Y -亞麻酸的三酰甘油，最優(yōu)選為含有花生四烯酸的三酰甘油。此外，通過本發(fā)明的方法制造的脂肪酸優(yōu)選為花生四烯酸或二高-Y-亞麻酸，最優(yōu)選為花生四烯酸。且通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的脂質(zhì)及該脂質(zhì)中含有的脂肪酸的組成可根據(jù)上述脂質(zhì)的提取方法、脂肪酸的分離方法或這些的組合確認(rèn)。使用本發(fā)明的制造方法得到的脂質(zhì)或脂肪酸組合物，可以按照常用方法用于例如含有油脂的食品、醫(yī)藥品、工業(yè)原料(化妝品、肥皂等的原料)的制造等用途。本發(fā)明還在另一實(shí)施方式中提供使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化脂質(zhì)生產(chǎn)菌或轉(zhuǎn)化酵母的食品、化妝品、醫(yī)藥、肥皂等的制造方法。該方法包含使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化脂質(zhì)生產(chǎn)菌或轉(zhuǎn)化酵母來生成脂質(zhì)或脂肪酸的工序。含有生成的脂質(zhì)或脂肪酸的食品、化妝品、醫(yī)藥、肥皂等的制備采用常用方法。如上所述，使用本發(fā)明的制造方法制造的食品、化妝品、醫(yī)藥、肥皂等， 含有使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化脂質(zhì)生產(chǎn)菌或轉(zhuǎn)化酵母所生成的脂質(zhì)或脂肪酸。本發(fā)明還提供使用上述方法制造的食品、化妝品、醫(yī)藥、肥皂等。本發(fā)明的化妝品(組合物)或醫(yī)藥品(組合物)的劑型無特別限定，可以采用溶液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意的劑型。另外，本發(fā)明的化妝品組合物或醫(yī)藥組合物不僅可以用于油、化妝水、乳霜、乳液、凝膠、洗發(fā)液、潤絲、護(hù)發(fā)素、指甲油、粉底、口紅、香粉、面膜、軟膏、香水、粉餅、花露水、牙膏、肥皂、氣霧劑、潔面膏等化妝品或皮膚外用藥，還可以用于皮膚老化防止改善劑、皮膚炎癥防止改善劑、沐浴用劑、生發(fā)劑、皮膚美容液、防曬劑或因外傷、皸裂、龜裂等引起的皮膚粗糙的防止改善劑等。本發(fā)明的化妝品組合物還可以根據(jù)需要進(jìn)一步適當(dāng)配合其他油脂及/或色素、香料、防腐劑、表面活性劑、顏料、抗氧化劑等。關(guān)于它們的配合比例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)目的適當(dāng)決定(例如油脂，在組合物中可以含有I 99. 99重量％，優(yōu)選為5 99. 99重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為10 99. 95重量％ )。此外，本發(fā)明的藥品組合物也可以根據(jù)需要進(jìn)一步含有其他醫(yī)藥活性成分(例如消炎成分)或輔助成分(例如潤滑成分、載體成分)。例如，作為化妝品或皮膚外用藥中的其他常用成分，可以列舉粉刺用藥、頭屑 瘙癢防止劑、止汗防臭劑、燙傷用藥、防螨 虱劑、角質(zhì)軟化劑、干皮癥用藥、抗病毒劑、經(jīng)皮吸收促進(jìn)劑等。作為本發(fā)明的食品的例子，可以列舉營養(yǎng)輔助食品、保健食品、功能性食品、幼兒用食品、嬰兒用配方奶、早產(chǎn)兒用配方奶、老人用食品等。在本說明書中，食品是固體、流體、液體以及它們的混合物，是可攝取食用的物質(zhì)的總稱。營養(yǎng)輔助食品是指強(qiáng)化了特定營養(yǎng)成分的食品。保健食品是指被認(rèn)為是健康的或?qū)】涤幸娴氖称?，包括營養(yǎng)輔助食品、天然食品、減肥食品等。功能性食品是指用來補(bǔ)充具有身體調(diào)節(jié)功能的營養(yǎng)成分的食品，與特定保健用食品同義。幼兒用食品是指供給約6歲以下的兒童用的食品。老人用食品是指處理成比未處理食品易消化和吸收的食品。嬰兒用配方奶是指供給約I歲以下的兒童用的配方奶。早產(chǎn)兒用配方奶是指供給早產(chǎn)兒出生后到約6個月為止所用的配方奶。作為這些食品的形態(tài)的例子，可以列舉肉、魚、堅(jiān)果等天然食品(用油脂處理過的食品)、中國菜、拉面、湯等在制作時加入油脂的食品、天婦羅、油炸食品、油炸豆腐、炒飯、甜甜圈、花林糖等用油脂作為熱介質(zhì)的食品、黃油、人造黃油、蛋黃醬、調(diào)味汁、巧克力、方便面、奶糖、餅干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工時添加了油脂的加工食品、(烤)年糕片、硬餅干、豆沙面包等在加工完成時用油脂噴霧或涂布的食品等。但是，并不限于含有油脂的食品，例如還可以是面包、面條類、米飯、點(diǎn)心類(糖果、口香糖、橡皮糖、壓片糖、日式點(diǎn)心)、豆腐及其加工品等農(nóng)產(chǎn)品、清酒、藥酒、甜料酒、食醋、醬油、黃醬等發(fā)酵食品、酸奶、火腿、培根、香腸等畜產(chǎn)食品、魚糕、炸魚糕、魚肉山芋餅等水產(chǎn)食品、果汁飲料、清涼飲料、運(yùn)動飲料、酒精飲料、茶等。本發(fā)明的食品還可以是膠囊等醫(yī)藥制劑的形態(tài)，或是在蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、微量元素、維生素類、乳化劑、香料等中配合了本發(fā)明的油脂得到的自然流食、半酶切態(tài)營養(yǎng)食品以及成分營養(yǎng)食品、保健飲料、經(jīng)腸營養(yǎng)劑等加工形態(tài)。如上所述，通過使本發(fā)明的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，能高效地生成脂質(zhì)，特別是三酰甘油。而且，還可以將該基因的表達(dá)量作為指標(biāo)，應(yīng)用于高效地進(jìn)行脂質(zhì)、特別是三酰甘 油的生產(chǎn)的培養(yǎng)條件的探討、培養(yǎng)管理等。
實(shí)施例以下用實(shí)施例來更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。高山被孢霉(M. alpina)的基因組分析將M.alpina 1S_4株接種到IOOml的GY2 I培養(yǎng)基(2 %葡萄糖、I %酵母膏PH6. O)中，在28°C下振蕩培養(yǎng)2天。通過過濾收集菌體，使用DNeasy (QIAGEN)制備基因組DNA。使用Roche 454GS FLX Standard來確定上述基因組DNA的堿基序列。此時，片段文庫的堿基序列的確定進(jìn)行2個run，末端配對文庫的堿基序列的確定進(jìn)行3個run。通過將得到的堿基序列拼接，得到300個超級重疊群(supercontig)。來自酉良酒酵母(S. cerevisiae)的LROl (ScLROl)同源物的探索將來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)基因(ScLROl)編碼的推定氨基酸序列(GenBank accession No. P40345)作為查詢序列，相對于M. alpina 1S-4株的基因組喊基序列進(jìn)彳丁 tblastn檢索的結(jié)果,包含序列號5所不的序列的超級重疊群(supercontig)匹配(hit)。將具有序列號5的堿基序列的基因作為MaLROl,如下克隆cDNA。cDNA文庫的構(gòu)津?qū).alpina 1S-4株接種到IOOml的培養(yǎng)基(I. 8%葡萄糖、I %酵母膏、ρΗ6· O)中，在28°C下預(yù)培養(yǎng)3天。在IOL培養(yǎng)槽(Abl e Co.，東京)中加入5L培養(yǎng)基(I. 8 %葡萄糖、I % 大豆粉、O. I %橄欖油、O. 01%增稠劑(ADEKAN0L)、0. 3% KH2P04、0. 1% Na2SO4,O. 05% CaCl2. 2Η20、0· 05% MgCl2. 6Η20、ρΗ6· O)，接種全部預(yù)培養(yǎng)物，在 300rpm、lvvm、26°C的條件下通氣攪拌培養(yǎng)8天。培養(yǎng)第1、2及3天時，分別添加相當(dāng)于2%、2%R I. 5%的葡萄糖。培養(yǎng)第1、2、3、6及8天時，回收各階段的菌體，用鹽酸胍/CsCl法制備total RNA。使用 01igotex-dT30〈Super>mRNA Purification Kit (TaKaRa Bio)從 total RNA 中進(jìn)行poly(A)+RNA 的純化。使用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE)制備各階段的cDNA文庫。
cDNA 克降為克隆MaLROl的cDNA，基于序列號5制備以下引物。MaLROl-IF :5’ -CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3’(序列號 6)MaLR01-3R :5，-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’(序列號 7)以上述構(gòu)建的cDNA文庫為模板，使用引物MaLROl-IF和引物MaLR01_3R、ExTaq (TaKaRa Bio)，用以下循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[94°C 2 分鐘]Xl 循環(huán)，[940C I 分鐘、55°C I 分鐘、72°C I 分鐘]X30 循環(huán)
[72 0C 10 分鐘]X I 循環(huán)純化經(jīng)過擴(kuò)增的約O. 7kb的DNA片段,通過TOPO-TA克隆試劑盒(invitrogen)進(jìn)行克隆。將插入片段的堿基序列通過DNA測序儀確認(rèn)，將具有序列號4的第814-第1485位的堿基序列的質(zhì)粒作為pCR-MaLROl-Ρ。而后以該質(zhì)粒為模板,使用上述引物進(jìn)行PCR。在PCR反應(yīng)中，使用ExTaq (TaKaRa Bio)，替換附帶的dNTP混合物，使用PCR標(biāo)記混合物(RocheDiagnostics公司)，制備將經(jīng)過擴(kuò)增的DNA進(jìn)行地高辛(DIG)標(biāo)記的探針。使用上述探針，篩選cDNA文庫。雜交的條件如下。緩沖液5xSSC, I % SDS,50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)，50% 甲酰胺；溫度42°C(—夜)；洗滌條件在O. 2x SSC,0. 1% SDS溶液中(65°C )中，20分鐘X3次;使用DIG核酸檢測試劑盒(Roche Diagnostics公司)進(jìn)行檢測。從通過篩選得到的噬菌體克隆中，使用體內(nèi)切割技術(shù)切割質(zhì)粒，得到各質(zhì)粒DNA。將篩選后得到的質(zhì)粒中插入片段長度最長的作為質(zhì)粒pB-MaLR01-Pl。將質(zhì)粒pB-MaLROl-Pl的插入片段的序列與基因組序列比較。圖I朝上的箭頭所示之處為質(zhì)粒PB-MaLROl-Pl的插入片段的5'末端。將基因組序列中朝上的箭頭處的5'側(cè)的序列從MaLROl-Pl的插入片段序列開始往回分析時，在與推定為編碼MaLROl的開放閱讀框(frame)相同的開放閱讀框(frame)上，與最初出現(xiàn)的終止密碼子相比，3’側(cè)存在2個起始密碼子ATG。因此，制備包含5’側(cè)的起始密碼子的5’引物MaLR01-6F，進(jìn)而作為3’引物也制備MaLR01-5R。MaLR01-5R :5，-CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’(序列號 8)MaLR01-6F :5，-ATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3，(序列號 9)以由M.alpina 1S-4株制備的cDNA為模板,使用ExTaq (TaKaRa Bio)通過引物MaLROI-6F和MaLR01_5R進(jìn)行PCR。將所得到的約0. 75kbp的DNA片段使用Τ0Ρ0-ΤΑ克隆試劑盒進(jìn)行克隆，以確定插入片段的堿基序列。插入片段包含序列號4的第I-第762位的堿基序列。即示意出序列號4的第I位的起始密碼子ATG已被轉(zhuǎn)錄。連接如此得到的堿基序列和質(zhì)粒PB-MaLROl-Pl的插入片段的堿基序列時形成序列號4的堿基序列，認(rèn)為該堿基序列為MaLROl的cDNA的喊基序列。序列分析序列號4的序列具有第I-第2400位的堿基序列的⑶S (序列號3)、第I位-第2397位的堿基序列的ORF(序列號I)。由序列號I推出的氨基酸序列如圖2及序列號2所示。比較MaLROl的基因組序列(序列號5)和MaLROl的cDNA序列(序列號4)(圖I)。其結(jié)果，表明MaLROl基因的基因組序列包含5個內(nèi)含子，由6個外顯子構(gòu)成。將序列號2所示的MaLROl的氨基酸序列相對于GenBank中注冊的氨基酸序列進(jìn)行blastp檢索的結(jié)果，表示與來自菌類的LROl同源物有一定的同源性。同源性最高的是來自作為擔(dān)子菌的玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)的功能未知的推定蛋白質(zhì)(EAK81307),同一性為35.7%。且表示了 MaLROl與來自解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)的LROl (XP_504038)有 31. 7%的同源性，與來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的 LROl 有 28. 9%的同源性。比較序列號2與來自上述菌類的LROl同源物的氨基酸序列(圖3)。認(rèn)為構(gòu)成活性中心的3個氨基酸殘基在任一同源物中均被保留。表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建具有用于使來自高山被孢霉(M. alpina)的LROl基因在釀酒酵母(S. cerevisiae)中高表達(dá)的構(gòu)成的表達(dá)載體。 首先制備引物Bam-MaLR01-F。Bam-MaLROl-F :5’ -GGATCCATGGCTTGGCGAGGGCAACTCAC-3’ (序列號 10)以由M.alpina 1S-4株制備的cDNA為模板,使用KOD-plus (東洋紡)通過引物Bam-MaLROl-F 和 MaLR01_5R 進(jìn)行 PCR。將所得到的約 O. 75kbp 的 DNA 片段用 Zero BluntTOPO-克隆試劑盒(invitrogen)克隆，確認(rèn)堿基序列。將與MaLROl的cDNA序列比較具有重復(fù)的堿基序列部分的質(zhì)粒作為pCR-MaLR01-5’。將用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI酶切該質(zhì)粒pCR-MaLR01-5’而得到的約O. 35kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI酶切質(zhì)粒pB-MaLROl-Pl而得到的約2. 05kbp的DNA片段、與用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI酶切酵母表達(dá)用載體pYE22m而得到的約8. 3kbp的DNA片段使用快速連接試劑盒(Quickligation Kit) (NEW ENGLAND BioLabs)連接，將所得到的質(zhì)粒作為 pYEMaLROl。在酵母 S. cerevisiae A dRal、A Irol 株中的表達(dá)(I)酵母 S. cerevisiae A dRal、A Irol 株的擊!I備(1-1)來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的DGAl基因和LROl基因的克降為了克隆來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的DGAl基因(Y0R245C，以下記為ScDGAl)和LROl基因(YNR008W，以下記為ScLROl)的全長，制備了以下引物。ScDGAl-Fl :5，-GAATTCatgtcaggaacattcaatgatata-3，(序列號 11)ScDGAI-RI :5’ -GTCGACTTACCCAACTATCTTCAATTCTGC-3’(序列號 12)ScLROl-Fl :5，-GAATTCatgggcacactgtttcgaagaaat-3，(序列號 13)ScLROI-RI :5，-GTCGACTTACATTGGGAAGGGCATCTGAGA-3’(序列號 14)將I白金耳酵母S. cerevisiae S288C株接種到IOml YPD(DIFCO)液體培養(yǎng)基中，30°C下振蕩培養(yǎng)I天。通過離心分離集菌，使用Dr. GenTLE-酵母用(TaKaRa Bio)提取DNA。以該DNA為模板，通過弓丨物ScDGAI-FI和引物ScDGAI-Rl的組合或弓I物ScLROI-FI和引物ScLROI-RI的組合使用ExTaq(TaKaRa Bio)進(jìn)行PCR。將各組合中得到的約I. 3kbp的DNA片段和約2kbp的DNA片段使用TA克隆試劑盒(TA-cloning Kit) (invitrogen)進(jìn)行克隆，確認(rèn)堿基序列。將具有正確的堿基序列的質(zhì)粒分別作為質(zhì)粒pCR-ScDGAl和質(zhì)粒pCR-ScLR01。
(1-2)質(zhì)粒 DCR-Adgal :URA3_I 的構(gòu)律將用限制性內(nèi)切酶HpaI和AatI酶切質(zhì)粒pCR-ScDGAl而得到的約4. 5kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切質(zhì)粒pURA34(日本特開2001-120276)后通過DNABlunting Kit (TaKaRa Bio)進(jìn)行末端平滑化而得到的約I. 2kbp的DNA片段通過Ligationhigh (東洋紡)連接，將URA3基因與ScDGAl基因同向插入的質(zhì)粒作為pCR- Δ dgal: URA3-1。(1-3)質(zhì)粒 dUC-Λ lrol:LEU2_l 的構(gòu)律將用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI酶切質(zhì)粒pCR-ScLROl而得到的約2kbp的DNA片段、和用相同限制性內(nèi)切酶酶切PUC18后的產(chǎn)物通過Ligation high(東洋紡)連接，得到質(zhì)粒pUC-ScLROl。將用限制性內(nèi)切酶XbaI和ApaI酶切該質(zhì)粒后并通過DNA BluntingKit (TaKaRa Bio)進(jìn)行末端平滑化而得到的約3. 8kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶SalI 和 XhoI 酶切質(zhì)粒 YEp 13 (GenBank accession No. U03498)后并通過 DNA BluntingKit (TaKaRa Bio)進(jìn)行末端平滑化而得到的約2. 2kbp的DNA片段通過Ligation high (東 洋紡)連接，將LEU2基因與ScLROl基因同向插入的質(zhì)粒作為pUC-Λ Irol: LEU2-1。(1-4)轉(zhuǎn)化株的獲得將S. cerevisiae YPH499 株(ura3-521ys2_801amber ade2-101ochretrpl-Δ 63his3-Δ 2001eu2-Δ la) (STARATAGENE)作為宿主如下制備轉(zhuǎn)化株。即以質(zhì)粒PCR- Δ dgal:URA3-l為模板，使用將用引物ScDGAI-FI和引物ScDGAI-Rl的組合通過PCR擴(kuò)增的DNA片段、和以質(zhì)粒pUC-Λ lrol:LEU2-l為模板用引物ScLROI-FI和引物ScLROI-RI的組合通過PCR擴(kuò)增的DNA片段,通過醋酸鋰法進(jìn)行共轉(zhuǎn)化(co-transformation)。轉(zhuǎn)化株以在 SC-Leu, Ura (每 IL 中，無氛基酸酵母氣源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO) 6. 7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸O. 6g、賴氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、絲氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、纈氨酸4. 5g、蘇氨酸6g、色氨酸I. 2g的混合物)I. 3g)瓊脂培養(yǎng)基(2%瓊脂)中生長繁殖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。在所得到的轉(zhuǎn)化株中，從任意2株菌體中使用Dr. GenTLE-酵母用(TaKaRaBio)提取DNA。以這些DNA為模板，使用以下⑴ ⑷引物的組合進(jìn)行PCR。(I)ScDGAI-FI和 ScDGAl-Rl(2) ScDGAI-FI 和 ScDGAl_R2(3) ScLROI-FI 和 ScLROl-Rl(4) ScLROI-FI 和 ScLR01_R2ScDGAI-R2 :5，-GACCAGTGTCATCAGAGAAATAGG-3’(序列號 15)ScLROI-R2 :5’ -GAGCTGGAACTGCCTTTGGAGC-3，(序列號 16)其結(jié)果，在任一菌株中，(I)的組合中有1.8kbp的DNA片段被擴(kuò)增，(3)的組合中有3. 3kbp的DNA片段被擴(kuò)增，(2)、(4)的組合中DNA片段未被擴(kuò)增。由此可確認(rèn)，這些菌株是Adgal、Alrol株。將其中的任意I株作為以下轉(zhuǎn)化的宿主使用。(2)向酵母S. cerevisiae Δ dRal、Δ Irol株的基因?qū)牒头治?2-1)轉(zhuǎn)化株的獲得將Adgal、Δ Irol株作為宿主，用質(zhì)粒pYE22m、pYE_MaLR01分別通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株以在SC-Trp,Leu,Ura(每IL中，無氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base w/oamino acids) (DIFCO) 6. 7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸O. 6g、賴氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、絲氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、纈氨酸4. 5g、蘇氨酸6g的混合物)I. 3g)瓊脂培養(yǎng)基(2%瓊脂)中生長繁殖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。從各個質(zhì)粒導(dǎo)入株中，將任意的2株用于以下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。即用pYE22m轉(zhuǎn)化的菌株為C/ADG#1、2，用pYE-MaLROl轉(zhuǎn)化的菌株為MaLROl/ΛDG#1、2。(2-2)轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)將I 白金耳(/八06#1，2、]\&11^01/八06#1，2 的 4 株分別接種到 SC-Trp，Leu，Ura 液體培養(yǎng)基IOml中，30°C下整夜振蕩培養(yǎng)。將所得到的培養(yǎng)液Iml接種到Y(jié)PDA(酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%,腺嘌呤硫酸鹽(1-adenine hemisulfate salt) O. 0075% )液體培養(yǎng)基IOml中，30°C下振蕩培養(yǎng)24小時。通過離心分離收集菌體，水洗后冷凍干燥。將冷凍干燥菌體用玻璃珠破碎，用8ml的氯仿甲醇2 I提取脂質(zhì)。在硅膠60板(Merck)、展開溶劑己烷乙醚醋酸70 : 30 : I的條件下進(jìn)行薄層色譜(TLC)，分離脂質(zhì)。噴霧 . 015%櫻草靈、80%丙酮水溶液(櫻草靈溶液)，通過UV照射使脂質(zhì)可視化，用鉛筆在三酰甘油(TG)組分及磷脂(PL)組分處做標(biāo)記，將硅膠分別刮取并收集到試管中。用鹽酸甲醇法將脂肪酸衍生為甲酯，通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸分析。即加入二氯甲烷lml、10%鹽酸甲醇2ml，50°C下反應(yīng)3小時，將脂肪酸衍生為甲酯。而后添加己烷4ml、水1ml，劇烈攪拌后，離心分離，分取上層。用離心濃縮儀(Speed Vac)餾去溶劑，溶解于乙腈中后用于氣相色譜，進(jìn)行脂肪酸分析。且在進(jìn)行上述甲基化反應(yīng)時，添加二十三烷酸作為內(nèi)標(biāo)，對脂肪酸量進(jìn)行定量。結(jié)果如圖4所示。使來自高山被孢霉(M. alpina)的作為磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)的同源物的MaLROl表達(dá)的MaLROl/ Λ DG#1、2株與作為對照的C/ Λ DG#1、2株相比，三酰甘油(TG)量為約10倍，示意出MaLROl具有三酰甘油(TG)合成活性。在花牛四烯酸牛產(chǎn)酵母中的表汰(I)花生四烯酸酵母的育種為了將花生四烯酸生產(chǎn)酵母(釀酒酵母(S. cerevisiae))育種，構(gòu)建以下質(zhì)粒。首先，以由M.alpina 1S-4株制備的cDNA為模板，通過Λ 12_f和Λ 12_r、Λ 6_f和Λ 6-r、GLELO-f和GLELO-r或Λ 5-f和Λ 5_r的引物的組合，使用ExTaq進(jìn)行PCR，擴(kuò)增 M.alpina 1S-4 株的 Δ 12 脂肪酸去飽和酶基因(GenBank accession No. AB020033)、Δ 6脂肪酸去飽和酶基因(GenBank accession No. AB020032)、GLELO脂肪酸鏈延長酶基因(GenBank accession No. AB 193123)及 Δ 5 脂肪酸去飽和基因(GenBank accessionNo.AB188307)。Δ 12-f :TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列號 17)Δ 12-r AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列號 18)Δ 6-f :TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag (序列號 I9)Δ 6-r :AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG (序列號 20)GLEL0-f :TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc (序列號 2I)GLELO-r GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC (序列號 22)Δ 5-f TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc (序列號 23)Δ 5-r :AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC (序列號 24)將這些使用Τ0Ρ0-ΤΑ-克隆試劑盒(TOPO-TA-cloning Kit)克隆。確認(rèn)堿基序列，將包含Λ 12基因、Λ 6基因、GLELO基因及Λ 5基因的堿基序列的克隆分別作為質(zhì)粒pCR-ΜΑ Δ 12DS(包含Λ 12基因的堿基序列)、pCR-ΜΑ Δ 6DS(包含Λ6基因的堿基序列)、pCR_MAGLEL0(包含GLELO基因的堿基序列)、pCR-ΜΑ Δ 5DS (包含Λ 5基因的堿基序列)。另一方面，將用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切質(zhì)粒pURA34(日本特開2001-120276)而得到的約I. 2kb的DNA片段插入到用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SphI酶切載體pUC18后進(jìn)行末端平滑化并進(jìn)行自我連接而得到的載體的HindIII位點(diǎn)，將載體的EcoRI位點(diǎn)側(cè)為URA3的5’側(cè)的克隆作為pUC_URA3。此外，將用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切YEp13而得到的約2. 2kb的DNA片段插入到載體pUC18的SalI位點(diǎn)，將載體的EcoRI側(cè)為LUE2的5’側(cè)的克隆作為pUC_LEU2。而后，將用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切質(zhì)粒pCR-ΜΑ Λ 12DS后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶XbaI酶切而得到的約I. 2kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶SacI酶切載體·pESC-URA(STRATAGENE)后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切的約6. 6kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pESC-U- Δ I2。將用限制性內(nèi)切酶XbaI酶切質(zhì)粒pCR_MAA6DS后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切而得到的約1.6kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶Sail酶切質(zhì)粒pESC-U-Λ 12后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切的約8kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒PESC-U-Λ 12: Λ6。將用限制性內(nèi)切酶PvuII部分酶切該質(zhì)粒而得到的約
4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pUC-URA-Λ 12: Λ 6。另外，將用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI酶切質(zhì)粒pCR-MAGLELO而得到的約O. 95kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI酶切載體pESC- LEU (STRATAGENE)而得到的約7. 7kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pESC-L-GLELO。將用限制性內(nèi)切酶XbaI酶切質(zhì)粒pCR-ΜΑΛ 5DS后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切而得到的約I. 3kbp的DNA片段和用限制性內(nèi)切酶ApaI酶切質(zhì)粒pESC-L-GLELO后進(jìn)行末端平滑化再用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切而得到的約8. 7kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pESC-L-GLELO: Λ 5。將用限制性內(nèi)切酶PvuII酶切該質(zhì)粒而得到的約3. 2kbp片段插入pUC-LEU2的SmaI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 pUC-LEU-GLELO: Λ5。將 Saccharomyces cerevisiae YPH499 株(STRATAGENE)用質(zhì)粒pUC-URA- Δ 12: Δ 6 和質(zhì)粒 pUC-LEU-GLELO: Δ5 進(jìn)行共轉(zhuǎn)化(co-transformation)。轉(zhuǎn)化株以在SC-LeU，Ura瓊脂培養(yǎng)基中生長繁殖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。如此得到的菌株中，將任意一株作為ARA3-1株。該菌株通過在含有半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可從GAL1/10啟動子開始表達(dá)Λ12脂肪酸去飽和酶基因、Λ 6脂肪酸去飽和酶基因、GLELO基因、Λ5脂肪酸去飽和酶基因。(2)向花生四烯酸生產(chǎn)酵母中的轉(zhuǎn)化和分析將ARA3-1株用質(zhì)粒pYE22m，pYE-MaLROI分別轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株用在SC-Trp，Leu,Ura (每 IL 中,無氛基酸酵母氣源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFCO) 6. 7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸O. 6g、賴氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、絲氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、繳氨酸4. 5g、蘇氨酸6g的混合物)1.3g)瓊脂培養(yǎng)基(2%瓊脂)中生長繁殖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。從各個質(zhì)粒導(dǎo)入株中任選4株用于以下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
將這些菌株在上述SC-Trp，Leu, Ura液體培養(yǎng)基IOml中30°C下培養(yǎng)I天，將其中Iml在添加了 50 μ g/ml的Y亞麻酸的SG-Trp, Leu, Ura (每IL中，無氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids) (DIFCO) 6. 7g、半乳糖 20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽I. 25g、精氨酸O. 6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸O. 6g、賴氨酸O. 9g、蛋氨酸O. 6g、苯丙氨酸I. 5g、絲氨酸11. 25g、酪氨酸O. 9g、繳氨酸4. 5g、蘇氨酸6g的混合物)I. 3g)液體培養(yǎng)基IOml中用2管在15°C下培養(yǎng)6天。集菌，水洗后冷凍干燥。在干燥菌體中添加4ml的氯仿甲醇2 1，70°C下保持I小時后，離心分離回收上清。進(jìn)而在殘留的菌體中再加入4ml的氯仿甲醇(2 : 1)，將離心分離的上清與之前回收的上清一同回收。使用離心濃縮儀(SpeedVac)懼去溶劑,將殘洛溶于少量氯仿中。在娃膠60板(Merck)、展開溶劑己烷乙醚醋酸70 : 30 : I的條件下進(jìn)行薄層色譜，分離脂質(zhì)。通過噴霧櫻草靈溶液、照射紫外線來檢測脂質(zhì)。將三酰甘油(TG)組分和磷脂(PL)組分分別刮取并收集到試管中，用鹽酸甲醇法將脂肪酸衍生為甲酯，通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸分析。三酰甘油(TG)組分和磷脂(PL)組分的多不飽和脂肪酸(PUFA)的組成比分別如圖5所示。在MaLROl表達(dá)株中，三酰甘油(TG)的二高-Y-亞麻酸(DGLA)和花生四烯酸 (ARA)的組成比與對照相比提高了(圖5Α)。上述實(shí)施例中使用的酵母可以說通過導(dǎo)入來自高山被孢霉(M. alpina)的Λ 12脂肪酸去飽和酶、Λ 6脂肪酸去飽和酶、GLELO及Λ5脂肪酸去飽和酶的基因而賦予了花生四烯酸生產(chǎn)能力，具有與高山被孢霉(M. alpina)同樣的花生四烯酸生成體系。在高山被孢霉(M.alpina)中，由GLELO與CoA結(jié)合的、亞麻酸(GLA)生成二高-Y-亞麻酸(DGLA)，其后，二高-Y-亞麻酸(DGLA)摻入脂質(zhì)，接著Λ 5脂肪酸去飽和酶作用于主要作為磷脂酰膽堿的?；嬖诘亩?Y -亞麻酸(DGLA)，生成花生四烯酸(ARA)。因此，認(rèn)為在上述實(shí)施例中使用的酵母的細(xì)胞內(nèi)，除了與高山被孢霉(Μ. alpina)同樣，二高亞麻酸(DGLA)以與CoA結(jié)合的狀態(tài)存在或存在于其他脂質(zhì)中，還作為磷脂酰膽堿的?；嬖凇４送?，還認(rèn)為花生四烯酸(ARA)主要作為磷脂酰膽堿的?；伞Ｒ虼?，認(rèn)為MaLROl基因編碼以磷脂為底物的“磷脂二酰甘油基轉(zhuǎn)移酶”。另一方面，觀察磷脂的脂肪酸組成比時，二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的比率在對照和MaLROl表達(dá)株中無變化(圖5Β)。由上可示意出如下可能性，MaLROl相對于二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的特異性高，通過使用MaLROl，可高效生成大量含有二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的三酰甘油(TG)。高山IfcF包霉(M. alpina)表達(dá)用載體的構(gòu)I聿作為高山被孢霉(M.alpina)表達(dá)用載體,使用從組蛋白啟動子開始表達(dá)目的基因的 pDuraMCS。為使MaLROl基因在高山被孢霉(M. alpina)中表達(dá)，如下構(gòu)建了載體。將用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI酶切質(zhì)粒pCR-MaLR01_5’而得到的約O. 35kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI酶切質(zhì)粒pB-MaLROl-Pl而得到的約2. 05kbp的DNA片段、和用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI酶切高山被孢霉(M. alpina)表達(dá)用載體pDuraMCS而得到的約
8.3kbp 的 DNA片段使用快速連接試劑盒(Quick ligation Kit) (NEW ENGLAND BioLabs)連接，將所得到的質(zhì)粒作為PDuraMCS-MaLROl。高山IfcF包霉(M. alpina)轉(zhuǎn)化株的獲得
使用該質(zhì)粒，將從M. alpina 1S_4株中根據(jù)國際公開公報(bào)WO 2005019437中所記載的“脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法”誘變的尿嘧啶缺陷型株作為宿主，使用粒子轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株的選擇中，使用SC瓊脂培養(yǎng)基(無氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogenbase w/o amino acids) and Ammonium Sulfate (Difco) 0. 5%、硫酸銨 0. 17%、葡萄糖 2%、腺嘌呤0. 002 %、酪氨酸O. 003 %、蛋氨酸O. 0001%,精氨酸O. 0002 %、組氨酸O. 0002 %、賴氨酸O. 0004%、色氨酸O. 0004%、蘇氨酸O. 0005%、異亮氨酸O. 0006%、亮氨酸O. 0006%,苯丙氨酸O. 0006%、瓊脂2% )。轉(zhuǎn)化高山被孢霍(MalDina)的評價將所得到的轉(zhuǎn)化13株接種到GY培養(yǎng)基(葡萄糖2%、酵母膏l(xiāng)%)10ml中，28°C、300rpm培養(yǎng)10天，篩選花生四烯酸的生產(chǎn)率高的菌株，作為LR01-1株。將LR01-1株接種到GY培養(yǎng)基4ml中，28°C下進(jìn)行2天振蕩培養(yǎng)。通過過濾回收菌體，使用RNeasy plant kit (QIAGEN)提取RNA。通過用于RT-PCR的第一鏈合成試劑盒 (Super Script First-Strand Synthesis System for RT-PCR) (invitrogen)合成 cDNA。為確認(rèn)導(dǎo)入的構(gòu)建物中MaLROl基因的表達(dá)，通過以下引物的組合進(jìn)行RT-PCR，確認(rèn)導(dǎo)入的構(gòu)建物中MaLROl基因的表達(dá)。引物 PD4P 5，-CGCATCCCGCAAACACACAC-3 ’ (序列號 25)引物MaLROI-5R :5’ -CTCTCCTGGATAGAACTCTTCCTCGG-3’ (序列號 8)為了確認(rèn)合計(jì)內(nèi)源性的MaLROl基因和導(dǎo)入構(gòu)建物的MaLROl基因的MaLROl基因的表達(dá),通過以下引物MaLROl-IF和MaLR01_3R、MaLR01_2F和MaLR01_4R的組合進(jìn)行PCR，確認(rèn)通過瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增的DNA片段。PCR的循環(huán)為20循環(huán)時，用LR01-1株擴(kuò)增的DNA片段的擴(kuò)增帶的深度明顯比對照株深。由此可確認(rèn)，LR01-1株與對照株相比MaLROl基因的表達(dá)量增加了。MaLROl-IF :5，-CCTGGAATCGTATCAACTGGCCTTG-3，(序列號 6)MaLR01-3R :5，-CAGGTCCGCCCGCTCCCGCCTCG-3’(序列號 7)MaLROI-2F :5，-GGCGGACCCAACTGGGTGAACGAC-3，(序列號 26)MaLR01-4R :5，-TCACAAGTCGACCTTGGCAGAGTAC-3，(序列號 27)脂肪酸分析將作為轉(zhuǎn)化株的LR01-1株和M. alpina 1S-4株(對照)接種到GY培養(yǎng)基4ml中(n = 3)，28°C、125rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)第9天時，將菌體的總量通過過濾回收，冷凍干燥。分取干燥菌體的一部分(約10-20mg左右)，通過鹽酸甲醇法將菌體的脂肪酸衍生為甲酯后，用己烷提取，將餾去己烷后的產(chǎn)物用氣相色譜法進(jìn)行分析，分析菌體內(nèi)總脂肪酸中所占的花生四烯酸比率(表I中的“ARA(% V)。表I表I :菌體內(nèi)總脂肪酸中所占的花生四烯酸的比率
LRQ1-1對照_
ARA(%)56.77 土 0.9052.42 土 2.99 _平均土 SD如表I所不，使MaLROl基因聞表達(dá)的聞山被抱霉(M.alpina)中，總脂肪酸中的花生四烯酸比率增加了。此外，在干燥菌體的一部分(約10_20mg左右)中添加4ml的氯仿甲醇2 1，70°C下保持I小時后，離心分離回收上清。進(jìn)而在殘留的菌體中再加入4ml的氯仿甲醇(2 : I)，將離心分離的上清與之前回收的上清一同回收。使用離心濃縮儀(SpeedVac)餾去溶劑，將殘?jiān)苡谏倭康穆确轮?。在硅膠60板(Merck)、展開溶劑己烷乙醚醋酸70 30 I的條件下進(jìn)行薄層色譜，分離脂質(zhì)。通過噴霧櫻草靈溶液、照射紫外線來檢測脂質(zhì)。刮取三酰甘油(TG)組分并收集到試管中，用鹽酸甲醇法將脂肪酸衍生為甲酯，通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸分析。表2表2 TG中的總脂肪酸中所占的花生四烯酸的比率
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸,其特征在于,為選自以下(a) (e)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸 (a)多核苷酸，其含有序列號I或4的堿基序列； (b)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中I 100個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)； (d)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；及 (e)多核苷酸，其為與由序列號I或4的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(f)或(g)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸 (f)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中I 10個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；及 (g)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有75%以上同一性的氨基酸序列，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的多核苷酸，其特征在于，含有序列號I或4的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的多核苷酸，其特征在于，編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其特征在于,為DNA。
6.—種蛋白質(zhì),其特征在于，由權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
7.—種載體，其特征在于，含有權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.一種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
9.一種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求7中所述的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體為脂質(zhì)生產(chǎn)菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述脂質(zhì)生產(chǎn)菌為高山被孢霉。
12.一種脂質(zhì)或脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，從權(quán)利要求8 11中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取脂質(zhì)或脂肪酸組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)為三酰甘油。
14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸為花生四烯酸或二I^-Y-亞麻酸。
15.一種食品、醫(yī)藥品、化妝品或肥皂，其特征在于，含有通過權(quán)利要求12中所述的制造方法提取的脂質(zhì)或脂肪酸組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶、編碼該酶的多核苷酸等。本發(fā)明提供例如含有序列號1或4的堿基序列的多核苷酸、編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸、含有該多核苷酸的表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體的脂質(zhì)或脂肪酸的制造方法或含有通過該制造方法制造的脂質(zhì)或脂肪酸的食品等。
文檔編號A61Q19/08GK102844431SQ20108005788
公開日2012年12月26日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者落合美佐 申請人:三得利控股株式會社