專利名稱：用于防止紫外線引起的皮膚細(xì)胞損傷的包含穗花杉雙黃酮的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于防止紫外線引起的皮膚細(xì)胞損傷的包含穗花杉雙黃酮的組合物。
背景技術(shù)：
核纖層蛋白是在細(xì)胞核中形成原纖維網(wǎng)絡(luò)(fibrillar network)的蛋白質(zhì)。核纖層蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式分為A型和B型。核纖層蛋白A型在核膜內(nèi)部形成纖層(lamina)。核纖層蛋白A型基因上的突變引起被稱為核纖層蛋白病(Iaminopathy)的疾病。典型實例是Hutchison-Gilford早老綜合征(HGPS)、非典型性維爾納氏綜合征和下頌?zāi)┒税l(fā)育不良癥(mandibuloacral dysplasia，MAD)，也被稱為早衰。早衰主要是由基因的第1擬4位的點突變引起的，由胸腺嘧啶代替胞嘧啶，產(chǎn)生一種在表達(dá)過程中不能被正確加工成蛋白質(zhì)并在細(xì)胞核積聚的核纖層蛋白基因形式。早衰的代表性癥狀包括硬皮病皮膚、脫發(fā)、骨質(zhì)缺損、牙齒形成延遲(delayed tooth formation)、生長遲緩和皮下脂肪丟失(loss of subcutaneous fat)。據(jù)報道在早衰患者中有細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能異常。核畸變(nuclear aberration)是代表性實例。根據(jù)最新研究，在未患早衰的老年人中也觀察到核畸變。在年齡為81-91歲之間的老年人中發(fā)生的核畸變與早衰患者的核畸變非常相似。并且，如在早衰患者中發(fā)現(xiàn)的，在老年人中發(fā)現(xiàn)DNA損傷標(biāo)記磷酸化H2AX增加。因此，需要探索一種能夠控制核畸變、缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)和磷酸化H2AX 的表達(dá)的用于抗老化的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明涉及用于防止由紫外線引起的皮膚細(xì)胞損傷或用于抗老化的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。技術(shù)方案本發(fā)明提供用于防止皮膚細(xì)胞損傷以防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的核膜的損傷的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。本發(fā)明還提供用于防止皮膚細(xì)胞損傷以控制由紫外線輻射引起的缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。本發(fā)明還提供用于防止皮膚細(xì)胞損傷以控制由紫外線輻射引起的磷酸化H2A組蛋白家族的成員X(H2AX)的表達(dá)的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。本發(fā)明還提供用于對抗由紫外線輻射引起的老化的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。本發(fā)明還提供用于防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的損傷的化妝品組合物， 其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
本發(fā)明還提供用于防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的損傷的藥物組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。在以下詳細(xì)說明、附圖和權(quán)利要求中會清楚其它特征和方面。


從以下所給出的特定示例性實施方案的描述并結(jié)合附圖會清楚本發(fā)明的上述目的和其它目的、特征和優(yōu)點，在所述附圖中圖1顯示在19歲和39歲個體的細(xì)胞中，由紫外線B輻射引起的對細(xì)胞核的損傷；圖2顯示39歲個體的細(xì)胞核提取物中的早衰蛋白(progerin)( 一種核纖層蛋白突變體)和磷酸化H2AX的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；并且圖3比較在紫外線B處理組和穗花杉雙黃酮處理組中，在39歲個體的細(xì)胞中由核纖層蛋白A型缺陷引起的核損傷和磷酸化H2AX表達(dá)的程度。
具體實施例方式從下文中所述的以下實施方案的說明并參考附圖會清楚本發(fā)明的優(yōu)點、特征和方面。但是，本發(fā)明可以以不同形式實施，而不應(yīng)被解釋為限于本文所述的實施方案。相反， 提供這些實施方案是為了使本發(fā)明詳盡而完整，并將向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分表達(dá)本發(fā)明的范圍。本文所用的術(shù)語僅僅是出于描述具體實施方案的目的，而并非意圖限制示例性實施方案。除非上下文中另有明確說明，本文所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”意圖也包括復(fù)數(shù)形式。還應(yīng)理解，當(dāng)用于本說明書中時，術(shù)語“包含”和/或“包括”表示存在所述特征、 整數(shù)、步驟、操作、要素和/或組分，但不排除一種或多種其它特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、 組分和/或它們的組合的存在或添加。下文中會參考附圖詳細(xì)地描述示例性實施方案。穗花杉雙黃酮由化學(xué)式1表示本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)用紫外線處理成纖維細(xì)胞導(dǎo)致缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)增加和核膜的結(jié)構(gòu)畸變。并且，磷酸化H2A組蛋白家族的成員X(H2AX，NCBI參考序列 NP_002096. 1)的表達(dá)增加。他們還發(fā)現(xiàn)用穗花杉雙黃酮處理降低了缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)，并且保持了核膜的結(jié)構(gòu)。并且，經(jīng)穗花杉雙黃酮處理降低了 DNA損傷標(biāo)記磷酸化H2AX 的表達(dá)。所述紫外線可以是紫外線A、紫外線B或紫外線C。本發(fā)明提供用于對抗由紫外線輻射引起的老化的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。本發(fā)明提供抗老化方法，其包括向個體給藥有效量的穗花杉雙黃酮。該抗老化方法可以包括向個體給藥化妝品組合物或藥物組合物形式的穗花杉雙黃酮。本發(fā)明還提供用于防止由紫外線引起的對皮膚細(xì)胞的損傷的化妝品組合物或藥物組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。所述用于防止對皮膚細(xì)胞的損傷的藥物組合物可以包含穗花杉雙黃酮以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的藥物組合物制備成用于口服給藥的制劑， 例如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、氣霧劑等；或者用于腸胃外給藥的制劑，例如局部用溶液劑、栓劑、無菌注射劑等?？梢园诒景l(fā)明的藥物組合物中的載體、 賦形劑或稀釋劑可以是例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂或礦物油。此外，常用的填充劑、增稠劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等可用作稀釋劑或賦形劑。用于口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑等?？梢酝ㄟ^將一種或多種賦形劑(例如淀粉、 碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等)添加到本發(fā)明的組合物中來制備固體制劑。除簡單賦形劑外， 還可以添加潤滑劑，例如硬脂酸鎂或滑石。用于口服給藥的液體制劑包括混懸劑、內(nèi)部溶液劑(internal solution)、乳劑、糖漿劑等。除簡單賦形劑(例如水或液體石蠟)外，它們還可以包含各種其它賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、香料、防腐劑等。用于腸胃外給藥的制劑包括無菌水溶液劑、非水溶液劑、混懸劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。對于非水溶液劑或混懸劑， 可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、注射用酯如油酸乙酯等。作為栓劑的基質(zhì)，可以使用wit印sol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂脂(laurin butter)、甘油明膠等?？梢匀Q于目的而將本發(fā)明的組合物口服給藥或腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹內(nèi)或局部)給藥?？梢匀Q于患者的情況、體重、年齡和性別、飲食、排泄率、疾病的嚴(yán)重性、 組合物類型、給藥時間、給藥方法、給藥途徑、給藥期等而不同地確定給藥劑量。基于凍干制劑的重量，每日給藥劑量是100-300mg/kg，特別是100-200mg/kg。必要時，所述組合物可以一天給藥一次或數(shù)次?，F(xiàn)在會描述實施例和實驗。以下實施例和實驗僅用于說明的目的，而并非意圖限制本發(fā)明的范圍。實施例1.在19歲和39歲個體中，由紫外線B輻射引起的核纖層蛋白A型的表達(dá)將19歲或39歲個體的細(xì)胞以30，000個細(xì)胞/孔分布在裝有培養(yǎng)基的4孔培養(yǎng)腔式載玻片(chamber slide)中，所述培養(yǎng)基是通過向106培養(yǎng)基中添加LSGS和100IU 青霉素G制備得到的。將細(xì)胞分成紫外線B未處理組和紫外線B處理組。第二天，用含有胎牛血清(FBS)的106培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。M小時后，用 PBS洗孔，然后僅對紫外線B處理組用200mJ/cm2的紫外線B照射。然后，再次用含有 FBS的106培養(yǎng)基處理，然后將細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)6天。對處理后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光(IF) 染色。用含有ImM CaCl2和ImM MgCl2的PBS洗孔，然后將細(xì)胞在室溫下在3. 5%低聚甲醛溶液中固定10分鐘。將固定的細(xì)胞用PBS洗3次，每次10分鐘，用0. 1% TritonX-IOO處理5分鐘，然后用PBS洗3次，每次10分鐘。使細(xì)胞與作為第一抗體的用含有0. 05%吐溫 20的PBS(PBST)稀釋至1 300的核纖層蛋白A型抗體(Santa Cruz)在4°C下反應(yīng)過夜 (0/N)，然后將細(xì)胞用PBST洗3次，每次10分鐘，然后與與FITC結(jié)合的第二抗體(1 400)在室溫下反應(yīng)1小時。然后，用PBST洗3次，每次10分鐘，然后加入封固溶液并以蓋玻片覆蓋。將染色細(xì)胞用共聚焦激光掃描顯微鏡(Ziess)顯像。結(jié)果顯示在圖1中。與19歲個體相比，在39歲個體的細(xì)胞中觀察到更多的細(xì)胞核損傷。實施例2.在19歲和39歲個體中，由紫外線B輻射引起的突變體核纖層蛋白A型的表達(dá)，以及穗花杉雙黃酮對其的抑制作用將19歲或39歲個體的細(xì)胞以100，000個細(xì)胞/孔分布在裝有培養(yǎng)基的4孔培養(yǎng)腔式載玻片中，所述培養(yǎng)基是通過向106培養(yǎng)基中添加LSGS和100IU青霉素G制備得到的。將細(xì)胞分成紫外線B未處理陰性對照組、紫外線B處理組和紫外線B/穗花杉雙黃酮處理組。第二天，用含有FBS的106培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。在紫外線B照射前先用5 μ M穗花杉雙黃酮處理穗花杉雙黃酮處理組。M小時后，用PBS洗孔，然后用IOOmJ/ cm2的紫外線B照射測試組。然后，再次用含有FBS的106培養(yǎng)基處理，然后將細(xì)胞在 37°C下培養(yǎng)6天。對處理后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色。對于蛋白質(zhì)印跡，將細(xì)胞用RIPA緩沖液(Sigma)溶解，并按照Lowry法定量蛋白質(zhì)。使10 μ g的各蛋白質(zhì)在 4-12% Nupage凝膠(Invitrogen)上流動，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上。將該膜用5% BSA封閉，并與核纖層蛋白A型突變體抗體，即分別用5% BSA稀釋至1 300和1 200的早衰蛋白 (Abeam)和p-H2AX (Millipore)在4°C下反應(yīng)過夜。第二天，將該膜用含有0. 05 %吐溫20 的TBS (TBST)洗3次，每次10分鐘，然后與HRP標(biāo)記小鼠和兔第二抗體(1 1000)在室溫下反應(yīng)1小時。然后，用PBST洗3次，每次10分鐘，然后用ECL和LAS3000檢測譜帶。結(jié)果顯示在圖2中。紫外線B輻射引起早衰蛋白(突變體核纖層蛋白A型)的增加，其通過用穗花杉雙黃酮處理而得以減少。對于磷酸化H2AX也顯示了相同的結(jié)果。微管蛋白用作蛋白質(zhì)負(fù)荷(protein loading)對照。對于免疫熒光染色，用含有ImMCaCl2和ImMMgCl2的PBS洗孔，然后將細(xì)胞在室溫下在3. 5%低聚甲醛溶液中固定10分鐘。將固定的細(xì)胞用PBS洗3次，每次10分鐘，用 0. 1 % TritonX-IOO處理5分鐘，然后用PBS洗3次，每次10分鐘。使細(xì)胞與作為第一抗體的用含有0. 05%吐溫20的PBS(PBST)稀釋至1 300的核纖層蛋白A型抗體(Santa Cruz) 或稀釋至1 200的P-H2AX抗體(Millipore)在4°C下反應(yīng)過夜，然后將細(xì)胞用PBST洗 3次，每次10分鐘，然后與與FITC和羅丹明結(jié)合的第二抗體(1 400)在室溫下反應(yīng)1小時。然后，用PBST洗3次，每次10分鐘，并用碘化丙啶(PI)將細(xì)胞核染色，然后加入封固溶液并以蓋玻片覆蓋。將染色細(xì)胞用共聚焦激光掃描顯微鏡(Ziess)顯像。結(jié)果顯示在圖3中。在39歲個體的細(xì)胞中，紫外線B輻射導(dǎo)致核損傷增加和由核纖層蛋白A型缺陷引起的磷酸化H2AX的表達(dá)增加。用穗花杉雙黃酮處理減少了磷酸化 H2AX的表達(dá)并維持了細(xì)胞核結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在會描述本發(fā)明的化妝品組合物或藥物組合物的制備例。以下實施例僅用于說明的目的，而并非意圖限制本發(fā)明的范圍。制備例1.柔膚水(Softening lotion)(化妝水)如表1所述，按照常用方法制備柔膚水。表 權(quán)利要求
1.用于防止皮膚細(xì)胞損傷以防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的核膜的損傷的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
2.用于防止皮膚細(xì)胞損傷以控制由紫外線輻射引起的缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
3.用于防止皮膚細(xì)胞損傷以控制由紫外線輻射引起的磷酸化H2A組蛋白家族的成員X (H2AX)的表達(dá)的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
4.用于對抗由紫外線輻射引起的老化的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
5.用于防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的損傷的化妝品組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
6.用于防止由紫外線輻射引起的對皮膚細(xì)胞的損傷的藥物組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于防止紫外線引起的皮膚細(xì)胞損傷的包含穗花杉雙黃酮的組合物。本發(fā)明提供用于防止由紫外線引起的皮膚細(xì)胞損傷或用于抗老化的組合物，其包含穗花杉雙黃酮作為活性成分。通過控制由紫外線輻射引起的缺陷核纖層蛋白A型的表達(dá)、控制由紫外線輻射引起的磷酸化H2A組蛋白家族的成員X(H2AX)的表達(dá)或者防止核膜損傷，由此防止皮膚細(xì)胞損傷。因此，包含穗花杉雙黃酮作為活性成分的組合物可以用作化妝品組合物或藥物組合物。
文檔編號A61Q19/08GK102342895SQ201110238460
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者曹濬喆, 樸錄賢, 羅勇柱, 裵芝賢, 金志映 申請人:株式會社愛茉莉太平洋