專利名稱：豌豆的肽水解產(chǎn)物作為保濕活性劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于美容和藥學(xué)領(lǐng)域，更具體地是皮膚病學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及豌豆(Pisumsativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為保濕活性劑的美容用途。本發(fā)明更具體地涉及豌豆(Pisumsativum L.)的肽水解產(chǎn)物改善皮膚的組成型保濕的美容用途，這是由于其激活水通道蛋白表達(dá)、糖胺聚糖表達(dá)和聚絲蛋白表達(dá)的能力。本發(fā)明還涉及一種用于恢復(fù)皮膚老化期間發(fā)生的水不平衡的美容治療方法。所述活性劑可以單獨(dú)使用或者與其它活性劑聯(lián)用。本發(fā)明還涉及這種新活性劑在制備用于預(yù)防或治療皮膚的病理干燥的藥物組合物，特別是皮膚病學(xué)組合物中的用途。
背景技術(shù)：
皮膚是包含若干層(真皮、增殖層和角質(zhì)層)的重要器官，其覆蓋身體的整個(gè)表面并且實(shí)質(zhì)上提供針對外部環(huán)境的屏障功能。皮膚的質(zhì)量和高功能性與表皮和真皮的不同層的水含量直接相關(guān)。因此，在正常表皮中，增殖層包含約70%的水，而角質(zhì)層僅含10-15%的水。皮膚的保濕取決于3個(gè)因素生理體液循環(huán)提供的水供應(yīng)，損失至外部環(huán)境的水以及最后皮膚的各部分包含水分子的能力。水供應(yīng)由激素(醛固酮、性激素)、pH或滲透壓變化調(diào)節(jié)。細(xì)胞膜本質(zhì)上是疏水的，因此具有低水通透性，但是存在水通道，即促進(jìn)水和某些溶質(zhì)的流動(dòng)的孔。水通道蛋白是一類轉(zhuǎn)運(yùn)水和溶液中的小分子的跨膜蛋白。3型水通道蛋白或AQP3存在于人表皮中，更具體地存在于表皮的增殖層的角質(zhì)形成細(xì)胞中(R. Sougrat etal.，J. Invest. Dermatol.，2002)。它們能夠轉(zhuǎn)運(yùn)水和甘油，后者在構(gòu)成表面上的皮脂膜(hydrolipidic film)以及保持角質(zhì)層的柔軟和感官質(zhì)量中起著重要作用。保濕與角質(zhì)形成細(xì)胞的AQP3含量直接相關(guān)。因此，增加皮膚中的AQP3使得表皮能夠更好保濕(M. Dumas, J. DrugsDermatol. , 6 June 2007)。在另一方面，水通道蛋白通過正調(diào)節(jié)連結(jié)以及緊密連接的細(xì)胞通信的建立來參與屏障功能(J. Kawedia et al. , PNAS 104 (9)，2007)。角質(zhì)層形成限制水分流失的重要屏障。在角質(zhì)層的最深層中，在角質(zhì)細(xì)胞形成期間，存在于顆粒角質(zhì)形成細(xì)胞中的不溶性聚絲蛋白原變?yōu)榫劢z蛋白，并且因此能夠連接至角蛋白纖維以形成微原纖維。聚絲蛋白還涉及維持角質(zhì)層的水含量。角質(zhì)細(xì)胞成熟期間會發(fā)生什么取決于角質(zhì)層中的水分梯度。在正常皮膚中，當(dāng)環(huán)境濕度低時(shí)，聚絲蛋白水解并釋放包含氨基酸和氨基酸衍生物的吸濕性和可溶性物質(zhì)，這是“天然保濕因子”或NMF的部分。NMF能夠從空氣收集水并保留角質(zhì)層中的水，以便保持柔軟和柔韌的皮膚，并且允許角質(zhì)細(xì)胞向脫皮的最后階段發(fā)展所必需的酶促反應(yīng)。然而，在某些條件下(例如干燥病、特應(yīng)性)，或者甚至在皮膚老化時(shí)，NFM的量不足以確保保濕功能，或者其可以發(fā)生降解或跨越細(xì)胞膜，使得水逐漸逃脫，在外部環(huán)境中蒸發(fā)。然而，主要水儲備可以在真皮中找到，當(dāng)皮膚年輕時(shí)真皮包含多達(dá)80%的水(這個(gè)比例隨著年齡降低)。真皮水來源于血漿，并且與糖胺聚糖(GAG)和結(jié)構(gòu)糖蛋白直接相關(guān)。糖胺聚糖的主要功能是確保膠原和彈性蛋白纖維的構(gòu)建。透明質(zhì)酸是皮膚中最豐富的糖胺聚糖。它是真皮的主要組分，并且還存在于表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞周圍。GAG是令人難以置信的吸濕性分子，其能夠保留多達(dá)它們重量的一千倍的水(JE. Silbert, Proteoglycansandglycosaminoglyeans. In:Goldsmith LA，ed. Biochemistry and Physiology oftheSkin. New York，NY Oxford University; 1983:448-461)。由于這些獨(dú)特的特性，糖胺聚糖和膠原復(fù)合物是細(xì)胞外基質(zhì)中儲存水的主要物質(zhì)。皮膚水損失可以具有幾種來源遺傳性的、獲得性的或環(huán)境的。在非常干燥的環(huán)境中，通過從角質(zhì)層蒸發(fā)的水損失是顯著的，并且可以超過通過跨細(xì)胞擴(kuò)散的補(bǔ)充速率。在皮膚老化期間，皮膚變得干燥。因此，在老年個(gè)體，特別是在那些50歲以上的個(gè)體中，經(jīng)常觀察到與較低水平的皮脂分泌、激素水平變化或通過表皮的水流減速相關(guān)的干燥病或粘膜干燥。因此皮膚是瘙癢和緊繃的主要部位，這是干燥皮膚特征的兩種癥狀。光化療誘導(dǎo)的干燥病和濕疹是體現(xiàn)為皮膚干燥的獲得性疾病狀況的實(shí)例。干燥綜合征或頸部 放療可以作為導(dǎo)致口干或口干燥癥的獲得性疾病狀況的實(shí)例。最后，眼部或陰道干燥是涉及粘膜干燥的疾病狀況的實(shí)例。用于治療干燥皮膚的第一種替代由局部給予用于恢復(fù)皮膚屏障的產(chǎn)物或用于保水的膜形成劑組成。然而，這些產(chǎn)物在表面上發(fā)揮作用，并不修正患有慢性脫水的皮膚的生物學(xué)缺陷。還可以參見FR 2801504和FR 2874502，其描述植物提取物刺激水通道蛋白活性和改善皮膚保濕的用途。盡管如此，這些活性成分不允許皮膚的所有部分的組成型保濕的改善。已描述豌豆的肽提取物的著色效果(FR 2904556)或脫皮效果(JP 09025225)，但是從未描述對皮膚保濕的有益效果。現(xiàn)在本發(fā)明人證實(shí)豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為活性劑的用途,其能夠激活水通道蛋白、糖胺聚糖和聚絲蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生皮膚的組成型保濕的全面改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為皮膚保濕活性劑的新用途。皮膚理解為覆蓋組織的集合，其構(gòu)成皮膚和粘膜，包括頭皮。很明顯，本發(fā)明一般地為哺乳動(dòng)物而設(shè)計(jì)，并且更具體地為人而設(shè)計(jì)。本發(fā)明人實(shí)際上已鑒定可用于改善皮膚的組成型保濕的生物學(xué)活性，豌豆的肽水解產(chǎn)物。本發(fā)明的特征性的可用生物學(xué)活性在體外定義為豌豆的水解產(chǎn)物增加水通道蛋白、糖胺聚糖和聚絲蛋白的表達(dá)的能力?！澳軌蚋纳扑ǖ赖鞍?、糖胺聚糖和聚絲蛋白的表達(dá)的活性劑”理解為能夠通過直接或間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)或者通過其他生物學(xué)過程如翻譯后裝配或蛋白穩(wěn)定來改善這些化合物的蛋白合成的任何物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，水通道蛋白為3型水通道蛋白或AQP3，其存在于角質(zhì)形成細(xì)胞月吳中。本發(fā)明更具體地涉及豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物用于改善皮膚的組成型保濕的美容用途，這是由于其對水流的正面作用以及角質(zhì)層、表皮的基底層和真皮中儲存水的能力的改善?！敖M成型保濕”理解為與皮膚的所有部分相關(guān)的水含量，即真皮、表皮的基底層(或增殖性表皮)和角質(zhì)層?！半乃猱a(chǎn)物”理解為主要由肽代表的化合物的混合物。“局部施用”理解為將本發(fā)明的活性劑或含有所述活性劑的組合物施用或涂布在皮膚或粘膜表面上?！吧韺W(xué)可接受”理解為本發(fā)明的活性劑或含有所述活性劑的組合物適合與皮膚或粘膜接觸而不弓I起毒性或不耐受反應(yīng)。本發(fā)明的活性劑可以通過提取基于植物的蛋白，然后通過釋放生物學(xué)活性肽片段 的受控的水解來獲得。植物中發(fā)現(xiàn)的大量蛋白可能在它們的結(jié)構(gòu)內(nèi)包含生物學(xué)活性肽片段。受控的水解使得這些肽片段能夠被釋放。為了體現(xiàn)本發(fā)明，可以但不是必需的，首先提取所關(guān)注的蛋白，然后將它們水解，或者首先對粗提取物進(jìn)行水解，然后純化肽片段。還可以使用某些水解的提取物而不純化對應(yīng)于本發(fā)明的生物學(xué)活性肽的肽片段，但是通過使用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ù_保所述片段的存在。整個(gè)植物或植物的具體部分(葉、種子等)可以用來進(jìn)行提取。更具體地,根據(jù)本發(fā)明，使用來自豆科(豆類)的豌豆物種Pisum sativumL的植物種子。術(shù)語“豌豆”還包括種子，其本身富含蛋白(25%)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有提取或純化方法可以用于制備本發(fā)明的水解產(chǎn)物。在第一階段中，利用植物研磨機(jī)研磨種子。隨后可以將由此獲得的粉末通過標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)溶劑(例如醇、己烷或丙酮)“脫脂”。然后通過(修改的)標(biāo)準(zhǔn)方法(Osborne, 1924)提取蛋白；將研磨的植物材料懸浮于包含聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)類型的不溶性(0.01-20%)吸附劑產(chǎn)品的堿性溶液中；實(shí)際上觀察到通過這種方法促進(jìn)水解操作和隨后的純化。具體地，與蛋白相互作用的酚類物質(zhì)的濃度明顯較低。離心和過濾階段后，收集包含蛋白、碳水化合物和可能的脂質(zhì)的可溶性部分。然后將該粗溶液在受控的條件下水解以產(chǎn)生可溶性肽。水解定義為其中通過水分裂分子的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)能夠在中性、酸性或堿性介質(zhì)中發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，水解通過化學(xué)進(jìn)行和/或有利地通過蛋白水解酶進(jìn)行。因此這里可以提及基于植物的內(nèi)切蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶)和微生物(曲霉、根霉、桿菌等)的使用。為了與之前相同的原因，即為了除去多酚物質(zhì)，在這個(gè)受控的水解階段期間，將一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮加入反應(yīng)介質(zhì)。酶的熱失活和過濾之后，這允許除去殘余的酶和聚合物，將獲得的濾液(溶液)再次純化以選擇具有低分子量的肽化合物。分離可以有利地通過超濾和/或?qū)游龇椒ㄟM(jìn)行。在這個(gè)階段，豌豆的水解產(chǎn)物的特征在于70_80g/kg的干重、55_65g/l的蛋白水平、2-5g/l的糖水平以及l(fā)_3g/l的多酚水平。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的典型技術(shù)定性和定量分析根據(jù)本發(fā)明獲得的水解產(chǎn)物的物理化學(xué)特征及其蛋白和肽化合物含量。所得的水解產(chǎn)物包含分子量小于5kDa的肽。
下一階段是水或任何水性溶劑的混合物中的稀釋階段。因此，將本發(fā)明的活性劑有利地溶于一種或多種生理學(xué)可接受的溶劑，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二醇、環(huán)狀多元醇或者這些溶劑的任何混合物。然后將稀釋的活性劑通過無菌過濾來滅菌。這個(gè)階段后，豌豆的肽水解產(chǎn)物的特征在于O. 5-5. 5g/l的肽化合物含量。這種肽水解產(chǎn)物對應(yīng)于本發(fā)明的活性劑。這個(gè)稀釋階段后，可以將所述活性劑包裹或包含在美容或藥物載體如脂質(zhì)體或用于美容領(lǐng)域的任何其他微囊中，或者吸附在粉狀有機(jī)聚合物或礦物支持物如滑石和膨潤土上。本發(fā)明的第二方面是美容組合物用于保持或恢復(fù)皮膚保濕的用途，所述美容組合物包含生理學(xué)可接受的介質(zhì)中的作為活性劑的有效量的本發(fā)明的豌豆的肽水解產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)具體方面，豌豆的肽水解產(chǎn)物還在美容組合物中用作活性劑以 對抗皮膚干燥。根據(jù)本發(fā)明的有利實(shí)施方案，本發(fā)明的活性劑以有效量存在于本發(fā)明的組合物中，即相對于最終組合物的總重量的約O. 0001%-20%的濃度，并且優(yōu)選約O. 05%-5%的濃度。可以根據(jù)本發(fā)明使用的組合物能夠以任何適當(dāng)?shù)姆绞绞┯?，特別是口服、腸胃外或局部施用，并且所述組合物的制劑會由本領(lǐng)域技術(shù)人員修改，特別是美容或皮膚病學(xué)組合物。本發(fā)明的組合物有利地設(shè)計(jì)為局部給藥。因此，這些組合物必須包含生理學(xué)可接受的介質(zhì)，即與皮膚和上皮附屬物相容，并且覆蓋所有美容和皮膚病學(xué)形式。這些組合物可以具體地以水溶液、水醇溶液或油性溶液；水包油乳劑、油包水乳劑或復(fù)合型乳劑的形式存在；這些組合物還可以適合施用在皮膚、粘膜、嘴唇和/或上皮附屬物的乳膏劑、混懸劑或甚至粉劑的形式存在。這些組合物還可以或多或少是流體，并且具有乳膏、洗劑、乳、漿液、發(fā)蠟、凝膠、糊劑或摩絲的形式。它們還可以固體形式如棒存在，或者可以作為氣溶膠施用至皮膚。它們還可以用作皮膚護(hù)理產(chǎn)品和/或皮膚化妝品。此外，這套組合物包含申請范圍中設(shè)想的任何常規(guī)使用的添加劑以及它們的配制所必需的添加劑，例如助溶劑(乙醇、甘油、苯甲醇、加濕劑(damper)···)、增稠劑、稀釋劑、乳化劑、抗氧化劑、著色劑、防曬劑(solarfilter)、色素、填充劑、防腐劑、香料、去味劑、精油、微量元素、必需脂肪酸、表面活性劑、成膜聚合物、化學(xué)濾器或礦物質(zhì)、保濕劑或熱水等。例如，可以提及水溶性聚合物，優(yōu)選天然聚合物，例如多糖或多肽，甲基纖維素或羥丙基纖維素類型的纖維素衍生物，或者甚至合成聚合物，泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP，特別是ISP公司出售的聚合物。在每種情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會確保以這樣的方式選擇這些添加劑及其比例，而不會損害本發(fā)明的組合物期望的有利特性。例如，這些添加劑可以所述組合物總重量的
O.01%-20%的濃度存在。當(dāng)本發(fā)明的組合物為乳劑時(shí)，脂肪相可以占所述組合物總重量的5-80重量％，并且優(yōu)選5-50重量％。所述組合物中使用的乳化劑和助乳化劑選自相關(guān)領(lǐng)域通常使用的那些乳化劑。例如，它們可以相對于所述組合物總重量的O. 3-30重量％的比例使用。很容易理解本發(fā)明的活性劑可以單獨(dú)使用或與其他活性成分聯(lián)用。此外，可以根據(jù)本發(fā)明使用的組合物有利地包含至少一種其他活性劑，所述其他活性劑用于促進(jìn)本發(fā)明的活性劑發(fā)揮作用的方式?？梢苑窍拗菩苑绞教峒耙韵骂愋偷某煞制渌幕钚詣?，植物提取物，愈合劑，抗老化劑，抗皺劑，安慰劑，抗自由基劑，抗UV劑，刺激皮膚大分子合成或能量代謝的物質(zhì)，保濕劑，抗細(xì)菌劑，抗真菌劑，抗炎劑，麻醉劑，調(diào)節(jié)皮膚分化、皮膚色素沉積或色素脫失的物質(zhì)，以及刺激指甲和毛發(fā)生長的物質(zhì)。優(yōu)選使用抗自由基劑或抗氧化劑，或者刺激皮膚大分子合成或能量代謝的物質(zhì)。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含豌豆的肽水解產(chǎn)物，以及-至少一種細(xì)胞色素c激活化合物，和/或；-至少一種保濕化合物如水通道蛋白激活化合物，和/或；
-至少一種sirtuin激活化合物，和/或；-至少一種用于改善細(xì)胞粘附的化合物，和/或；-至少一種用于提高基質(zhì)蛋白如膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖的產(chǎn)生的化合物，和/或；-至少一種用于調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的化合物，和/或；-至少一種用于調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的化合物，和/或；-至少一種用于調(diào)節(jié)HSP蛋白的化合物，和/或；-至少一種用于增加細(xì)胞能量的化合物，和/或；-至少一種用于調(diào)節(jié)皮膚色素沉積的化合物，和/或；-至少一種用于激活輔酶QlO的化合物，和/或；-至少一種用于改善屏障功能的化合物，例如用于激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或HMG-CoA還原酶的化合物。-至少一種用于保護(hù)線粒體的化合物。上述化合物可以是天然的，如植物的肽水解產(chǎn)物，或者還可以是合成的，如肽化合物。本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種用于恢復(fù)皮膚老化期間發(fā)生的水不平衡的美容治療方法，其特征在于將包含本發(fā)明的豌豆的肽水解產(chǎn)物的組合物局部施用在待治療的皮膚上。本發(fā)明的第四個(gè)目的是有效量的豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為保濕活性劑在制備用于預(yù)防或治療皮膚的病理干燥的藥物組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的這種形式，為了藥學(xué)用途，所述組合物適合口服給藥。因此所述組合物具體地可以為片劑、液體膠囊劑、粉末膠囊劑、口香糖、用于吞咽的粉末(例如它們?yōu)橐后w、糖漿劑、凝膠劑，或者即時(shí)與液體、糖漿劑、凝膠劑混合)形式，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他形式。這些組合物還包含通常用于設(shè)想的應(yīng)用范圍的任何添加劑，以及它們的配制所必需的添加劑，例如溶劑、增稠劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、其他活性藥物成分、精油、維生素、必需脂肪酸等。這種美容治療方法的具體實(shí)施方案也由上文的描述所致。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征可以通過閱讀提供的說明性非限制性實(shí)施例而更詳細(xì)地了解。
實(shí)施例實(shí)施例I :制備豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物
肽水解產(chǎn)物獲得自物種豌豆的植物提取物。在第一階段中，利用有機(jī)溶劑己烷將Ikg的去殼豌豆脫脂。在2%的POLYCLAR 10 (聚乙烯聚吡咯烷酮_ PVPP -不溶性)的存在下，將由此獲得的磨碎的豌豆放置在10體積水的溶液中。用IM蘇打水溶液將混合物調(diào)整至7-8的pH值。調(diào)整pH之后，將2%的flavourzym 加入反應(yīng)介質(zhì)。在50C下攪拌2小時(shí)后獲得水解產(chǎn)物。然后通過將溶液加熱至80C保持2小時(shí)來使酶失活。由此獲得的反應(yīng)混合物對應(yīng)于粗豌豆提取物。通過利用遞減孔隙率(直至O. 2 μ m)的Seitz-Orion濾器連續(xù)過濾來開始純化過程，以便獲得澄清、透亮的溶液、在這個(gè)階段，豌豆的水解產(chǎn)物的特征在于70-80g/kg的干重、55-65g/l的蛋白水平、2-5g/l的糖水平以及l(fā)_3g/l的多酚水平。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定這種水解產(chǎn)物的蛋白成分。對于這種分析，使用NuPAGE Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen)凝膠。將豌豆的肽水解產(chǎn)物在還原變性條·件下于NuPAGE LDS樣品緩沖液中加熱至70C保持10分鐘。將NuPAGE 抗氧化溶液加入內(nèi)腔(陰極)，從而還原的蛋白在電泳期間不會重新氧化。利用NuPAGE MES電泳緩沖液進(jìn)行蛋白遷移，用標(biāo)準(zhǔn)品SeeBlue Plus2作為分子量的標(biāo)記。利用Coomassie 亮藍(lán)R-250進(jìn)行蛋白染色。在這些條件下，觀察到2個(gè)大蛋白家族第一個(gè)家族對應(yīng)于具有25-20kDa分子量的蛋白，而第二個(gè)家族對應(yīng)于具有低于5kDa分子量的蛋白。然后通過利用錯(cuò)流過濾除去分子量大于5kDa的蛋白來純化該溶液。為此，將豌豆的水解產(chǎn)物在壓力下泵過裝打Pellicoil 2Biomax-30kDa盒的Pellicon 支持架。收集第一濾液以便隨后通過另一Pellieon 2Biomax-5kDa盒過濾。當(dāng)純化完成時(shí)，獲得淡黃色-米色、澄清和透亮的豌豆的肽水解產(chǎn)物。其特征在于50-55k/kg的干重和50-52g/l的蛋白含量。下一階段為水-甘油混合物中的稀釋階段。然后將稀釋的活性劑通過無菌過濾來滅菌。這個(gè)階段后，豌豆的肽水解產(chǎn)物的特征在于約2. 5g/l的蛋白含量。實(shí)施例2 :鑒定實(shí)施例I的豌豆提取物對水通道蛋白表達(dá)的刺激效果這個(gè)研究的目的是確定實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物對正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(NHK)中的水通道蛋白-3表達(dá)的影響。方法將NHK在；LabTek 玻片中培養(yǎng)直至80%匯合，然后用0. 5%或1%的實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理24小時(shí)。然后利用水通道蛋白-3特異性的多克隆山羊抗體(Tebu Santa Cruz, sc-9885)進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后將二抗偶聯(lián)至熒光標(biāo)記。然后通過落射熒光顯微鏡(Nikon EclipseE600顯微鏡)檢查細(xì)胞。:顯微鏡觀察顯示在用0. 5%和1%的實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理的細(xì)胞中突光較強(qiáng)。結(jié)論實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物增加人角質(zhì)形成細(xì)胞中的水通道蛋白-3表達(dá)。實(shí)施例3 :研究在實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物的存在下人皮膚活組織檢查中的聚絲蛋白原/聚絲蛋白表達(dá)這個(gè)研究的目的是確定實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物對人皮膚活組織檢查中存在的聚絲蛋白和聚絲蛋白原質(zhì)量的影響。
方法:將人皮膚樣品在氣-液界面培養(yǎng)。將樣品用O. 5%和1%的實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理24小時(shí)。然后將這些皮膚樣品用甲醛固定，然后包埋在石蠟中。然后制備4ym的切片。通過胃蛋白酶溫育暴露特異性位點(diǎn)后進(jìn)行免疫標(biāo)記。然后利用聚絲蛋白特異性的單克隆小鼠抗體(Tebu SantaCruz, sc-66192)進(jìn)行免疫標(biāo)記,然后將二抗偶聯(lián)至突光標(biāo)記。然后通過落射熒光顯微鏡(Nikon Eclipse E600顯微鏡)檢查皮膚切片。益里與未處理的皮膚活組織檢查相比，在用實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理的活組織檢查上觀察到較低強(qiáng)度的聚絲蛋白原標(biāo)記。結(jié)論實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物使得皮膚中的聚絲蛋白原和聚絲蛋白表達(dá)增加。實(shí)施例4 :研究在實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物的存在下人皮膚活組織檢查中的糖胺聚糖表達(dá)

這個(gè)研究的目的是確定實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物對人皮膚活組織檢查中的糖胺聚糖(GAG)的量的影響。方法:將人皮膚樣品在氣-液界面培養(yǎng)。將樣品用O. 5%的實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理48小時(shí)。然后將這些皮膚樣品用甲醛固定，然后包埋在石蠟中。然后制備4μπι的切片。利用膠體鐵溶液，然后利用與用來染色GAG藍(lán)的亞鐵氰化物-鹽酸反應(yīng)來進(jìn)行糖胺聚糖染色。結(jié)果在用提取物處理的活組織檢查上觀察到GAG表達(dá)增加。結(jié)論實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物使得皮膚中的糖胺聚糖表達(dá)增加。實(shí)施例5 :評價(jià)實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物對誘導(dǎo)的皮膚干燥的保護(hù)效果這個(gè)研究的目的是確定實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物對通過誘導(dǎo)的皮膚干燥而經(jīng)受應(yīng)激的離體培養(yǎng)物的保護(hù)效果。方法將人皮膚活組織檢查離體培養(yǎng)24小時(shí)，并且用O. 5%或1%的實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物溶液處理。然后通過通風(fēng)3小時(shí)來使活組織檢查干燥。然后將這些皮膚樣品用甲醛固定，然后包埋在石蠟中。然后制備4μπι的切片。組織學(xué)蘇木精-伊紅(Η&Ε)染色使得能夠評價(jià)皮膚結(jié)構(gòu)的質(zhì)量。結(jié)果:進(jìn)行干燥應(yīng)激的受控制的活組織檢查表現(xiàn)出應(yīng)激的特征性跡象如角質(zhì)層厚度減少，存在水腫以及基底角質(zhì)形成細(xì)胞的混亂。與未處理的皮膚活組織檢查相比，干燥并用實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物處理的皮膚樣品表現(xiàn)出細(xì)胞應(yīng)激跡象的顯著減少以及改善的皮膚結(jié)構(gòu)維持。另一方面，與未處理的皮膚活組織檢查相比，角質(zhì)層表現(xiàn)出改善的保濕的典型跡象。結(jié)論實(shí)施例I的豌豆的水解產(chǎn)物有效保護(hù)皮膚免受干燥誘導(dǎo)的應(yīng)激。實(shí)施例6 :制備組合物I.日霜
權(quán)利要求
1.豌豆(Pisumsativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為皮膚保濕活性劑的美容用途,所述豌豆的肽水解產(chǎn)物包含O. 5-5. 5g/l的分子量低于5kDa的肽。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述活性劑增加水通道蛋白表達(dá)，特別是水通道蛋白-3。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述活性劑增加糖胺聚糖表達(dá)。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述活性劑增加聚絲蛋白表達(dá)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于將所述豌豆的肽水解產(chǎn)物溶于一種或多種生理學(xué)可接受的溶劑中，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二醇、環(huán)狀多元醇或者這些溶劑的任何混合物。
6.美容組合物用于保持或恢復(fù)皮膚保濕的用途，所述美容組合物包含a)有效量的如前述權(quán)利要求之一定義的豌豆的肽水解產(chǎn)物作為活性劑，以及b)生理學(xué)可接受的介質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的美容組合物用于對抗皮膚干燥的用途。
8.如權(quán)利要求6或7之一所述的用途，其特征在于所述豌豆的肽水解產(chǎn)物以所述組合物總重量的約O. 0001%-20%的濃度使用，并且優(yōu)選以所述組合物總重量的O. 05%-5%的濃度使用。
9.如權(quán)利要求6-8之一所述的用途，其特征在于所述組合物為適合局部施用的形式。
10.如權(quán)利要求6-9之一所述的用途，其特征在于所述組合物還包含至少一種其他活性劑，所述其他活性劑用于促進(jìn)如權(quán)利要求1-5之一定義的豌豆的肽水解產(chǎn)物發(fā)揮作用的方式。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于所述其他活性劑為植物的肽水解產(chǎn)物或合成的肽化合物。
12.用于恢復(fù)皮膚老化期間發(fā)生的水不平衡的美容治療方法，其特征在于將如權(quán)利要求6-11之一定義的組合物局部施用于待治療的皮膚。
13.有效量的豌豆(Pisumsativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為保濕活性劑在制備用于預(yù)防或治療皮膚的病理干燥的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及豌豆(Pisum sativum L.)的肽水解產(chǎn)物作為皮膚保濕活性劑的美容用途。本發(fā)明還涉及美容組合物用于預(yù)防皮膚干燥或恢復(fù)皮膚保濕的用途，所述美容組合物包含生理學(xué)可接受的介質(zhì)中的有效量的本發(fā)明的活性劑。本發(fā)明還涉及這種新活性劑在制備用于治療皮膚的病理干燥的藥物組合物，特別是皮膚病學(xué)組合物中的用途。
文檔編號A61Q19/00GK102892404SQ201180024181
公開日2013年1月23日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者C·達(dá)爾法拉, N·東洛熱, J-M·博托 申請人:Isp投資公司