專利名稱：用于濃縮omega-3脂肪酸的方法
用于濃縮omega-3脂肪酸的方法本申請要求2010年9月24日提交的美國臨時申請第61/386，096號的優(yōu)先權(quán)，將其全文引入本文作為參考。本發(fā)明總體涉及用銀鹽水溶液(例如AgNO3水溶液)從脂肪酸油混合物中濃縮多不飽和脂肪酸(例如omega-3脂肪酸)的方法。omega-3脂肪酸可用于多種應(yīng)用，包括藥物和/或營養(yǎng)補充產(chǎn)品。例如，omega-3脂肪酸可調(diào)節(jié)血漿脂質(zhì)水平、心血管和免疫功能、胰島素作用、神經(jīng)元發(fā)育和視覺功能。omega-3脂肪酸可對心血管疾病(例如高血壓和高甘油三酯血癥)的風(fēng)險因素和對凝血因子VII磷脂絡(luò)合物活性產(chǎn)生有益的效果。omega-3脂肪酸還可以降低血清甘油三酯，增加血清HDL膽固醇，降低收縮期和舒張期血壓和/或脈搏率，并且可降低凝血因子VI1-磷脂絡(luò)合物的活性。另外，omega-3脂肪酸通?？闪己玫啬褪?，且不引起嚴重的副作用。海產(chǎn)品油(通常也指魚油)是omega-3脂肪酸(包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的來源·之一，已發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)脂類代謝。植物油、微生物油和藻類油也是omega-3脂肪酸的來源。已研發(fā)了多種omega-3脂肪酸的制劑。例如,omega-3脂肪酸油混合物的一種形式是從含有DHA和EPA的魚油中得到的主要omega-3、長鏈、多不飽和月旨肪酸的濃縮物，例如以商標Omacor /Lovaza / Zodin / Seacor 銷售的商品。參見，例如，美國專利第5，502，077號、第5，656，667號和第5，698，594號。特別地，每IOOOmg的Lovaza 膠囊含有至少90%的omega-3脂肪酸乙酯(84%的EPA/DHA);約465mg EPA乙酯和約375mg DHA乙酯。其他的omega-3脂肪酸可提供活性。例如，Kaur等人(Prog.Lipid Res.(2011)vol.50 (I),pp.28-34)認為n_3DPA具有某些生物效應(yīng)。有證據(jù)表明，n_3DPA具有比EPA大10倍的內(nèi)皮細胞遷移能力，這可能在傷口愈合過程中是很重要的。此外，報道了 n-3DPA在抑制血小板聚集方面比EPA和DHA更有效。另外，n-3DPA可在減弱與年齡相關(guān)的空間學(xué)習(xí)(spatial learning)和長時程增強(long-term potentiation)的下降方面發(fā)揮作用。然而，由于純化合物的供應(yīng)量有限，還未對n-3DPA進行廣泛的研究。omega-3脂肪酸的許多來源也是omega-6脂肪酸的來源。然而，在一些生物學(xué)過程中，omega-3和omega-6脂肪酸可表達相反的活性，因而低濃度的omega-6脂肪酸(即高n-3/n-6比例)是期望的。符合歐洲藥典專論1250的市售產(chǎn)品通常具有范圍為24-40的n-3/n_6 比例。Breivik (Long-Chain 0mega_3Specialty Oils, The Oily Press, PJBarnes&Associates, Bridgwater UK, pp.111-140, 2007)給出了用于制備 omega-3 酸濃縮物的方法的綜述。由于海產(chǎn)品油的脂肪酸組成很復(fù)雜，難以僅用一種濃縮技術(shù)制備高度濃縮的omega-3脂肪酸組分。通常情況下，使用技術(shù)的組合，最經(jīng)常使用結(jié)合了根據(jù)不飽和度分離(例如，酶分離和/或尿素分餾)和根據(jù)碳鏈長度分離(例如，分子/短程蒸餾和/或超臨界流體提取)的技術(shù)。與起始油的量相比，常規(guī)技術(shù)通常具有獲得含低收率omega-3脂肪酸的濃縮物的缺點。這在結(jié)合低收率的技術(shù)(如尿素包合和短程蒸餾)時可能尤為突出。
此外，分離方法(如短程蒸餾和主要基于鏈長分離脂肪酸酯的其他方法)通常無法分離具有相同碳原子數(shù)的omega-3和omega-6脂肪酸,例如C20:4n_3和C20:4n_6,或C22:5n-3和C22:5n_6。例如,尿素分懼可導(dǎo)致omega-6脂肪酸比同系物omega-3脂肪酸具有更高的濃縮因子，因為脂肪酸衍生物與尿素形成固體絡(luò)合物的傾向隨著脂肪酸酯的第一雙鍵與羰基的距離(通常被稱為Λ值)而增大。如果omega-6脂肪酸的Λ值為Λ ’，則相應(yīng)的omega-3脂肪酸的Λ值為(Λ’+3)，從而導(dǎo)致與尿素形成絡(luò)合物的程度更高。這種傾向?qū)τ趏mega-3脂肪酸的高度濃縮物尤其顯著，其中使用了相對量很高的尿素。已進行了使用銀鹽從混合物中分離多不飽和脂肪酸的研究。參見，例如，Quinn 等人(pp.133-169, Perry 等人，Progress in separetion and Purification^:,ffiley-1nterscience, New York,1971) ；Peers 等人(J.Food Technology (1986)vol.21pp.463-469) ；Suzuki 等人(Bioseparetion(1993)vol.3, pp.197-204) ；Teramoto等人(Ind.Eng.Chem.Res.(1994), vol.33pp.341-345) ；Teramoto 等人(J.MembraneSc1.，(1994)vol.91, pp.209-213) ；Kubota 等人(Sep.Sc1.Technol.(1997)，vol.32,pp.1529-1541) ;·Chen 等人(J.Jiangsu University of Science and Technology (NaturalScience) (2000), vol.21, pp.18-22) ;Tao 等人(Chinese J.Marine Drugs, (2004) N0.3，pp.28-30) ；Huong(J.Chemistry (2007), vol.45,pp.757-762) ；Li 等人(Sep.Sc1.Technol.(2008)vol.43，pp.2072-2089) ;EP0454430B1 ;EP0576191A2 ;Seike 等人(Journal ofChemical Engineering of Japan (2007), Vol.40, ppl076_1084);和 Kamio 等人(Ind.Eng.Chem.Res., (2011) vol.50 (11), pp.6915-24)。然而,先前已知的方法未提供濃縮 omega-3脂肪酸的足夠選擇性和/或有效的方法。因此，在本領(lǐng)域中仍需要從脂肪酸油混合物中濃縮omega-3脂肪酸的更有效的方法。應(yīng)理解，前面的總體描述和下面的詳細描述僅僅是示例性和說明性的且對所要求保護的本發(fā)明不具限制性。本發(fā)明總體涉及從脂肪酸油混合物中濃縮至少一種omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括:(a)混合脂肪酸油混合物和銀鹽(例如AgNO3或AgBF4)水溶液以形成水相和有機相，其中在水相中，所述銀鹽水溶液與至少一種omega-3脂肪酸形成絡(luò)合物；(b)分離有機相和水相；(c)用置換液提取水相，或?qū)⑺嗟臏囟壬叩街辽?0° C，或用置換液提取與升高溫度相結(jié)合，從而形成至少一種提取物；(d)合并水相和水，或用超臨界CO2提取水相，或合并水相和水與用超臨界C02提取水相相結(jié)合，以解離絡(luò)合物，其中水相包含所述銀鹽和至少一種含有脂肪酸濃縮物形式的溶液；和(e)從包含所述銀鹽的水相中分離所述至少一種含有脂肪酸濃縮物形式的溶液。


圖1為通過將水相加熱至70° C所回收的脂肪酸濃縮物的氣相色譜，如實施例1所述。圖2為在除去圖1所示的濃縮物后通過將水相在水中稀釋所獲得的脂肪酸濃縮物的氣相色譜，如實施例1所述。圖3為通過用己烷作為置換溶劑提取所獲得的成分的氣相色譜，如實施例2A表4A所述。圖4為濃縮物4的氣相色譜,如實施例3表5所述。圖5為表示具體選定的脂肪酯的乙酯的相對濃度的圖表，如實施例2B表4E所述。詳細說明下文將更詳細地描述本發(fā)明的具體方面。本申請中使用的和本文闡明的術(shù)語和定義旨在表示在本發(fā)明之內(nèi)的含義。在本文和上文中參考的專利和科學(xué)文獻并入本文作為參考。本文提供的術(shù)語和定義若與引入?yún)⒖贾械男g(shù)語和/或定義相沖突，以本文為準。單數(shù)形式“一種(a)”、“一個(an)”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有指出。術(shù)語“約(approximately) ”和“約(about) ”表示與提到的數(shù)字或數(shù)值近似相同。本文所用的術(shù)語“約”通常應(yīng)理解為包含具體數(shù)量、頻率或數(shù)值的±30%范圍內(nèi)。術(shù)語“脂肪酸”包·括例如含有至少一個羧酸基團的短鏈和長鏈的飽和及不飽和的(例如，單不飽和的和多不飽和的)烴。術(shù)語“omega-3脂肪酸”包括天然的和合成的omega-3脂肪酸，以及藥學(xué)上可接受的酯、游離酸、甘油三酯、衍生物、綴合物(參見例如Zaloga等人，美國公開第2004/0254357號，以及Horrobin等人，美國專利第6，245，811號，各自并入本文作為參考)、前體、鹽及其混合物。omega-3脂肪酸油的實例包括但不限于:omega_3多不飽和脂肪酸,例如α -亞油酸(ALA, 18: 3η_3)、十八碳四烯酸(即 stearidonic acid, STA, 18: 4n_3)、二十碳三烯酸(ETE,20:3n-3)、二十碳四烯酸(ETA，20:4n-3)、二十碳五烯酸(EPA，20: 5n_3)、二i^一碳五烯酸(ΗΡΑ, 21: 5n_3)、二十二碳五烯酸(DPA, clupanodonic acid, 22: 5n_3)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3) ;omega_3脂肪酸與甘油的酯,例如單-、二-或三-甘油酯；以及omega-3月旨肪酸與伯醇、仲醇和/或叔醇的酯，例如脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯。術(shù)語“omega-6脂肪酸”包括天然的和合成的omega-6脂肪酸，以及藥學(xué)上可接受的酯、游離酸、甘油三酯、衍生物、綴合物、前體、鹽及其混合物。omega-6脂肪酸油的實例包括但不限于:omega-6多不飽和的長鏈脂肪酸，例如亞油酸(18:2η_6)、γ-亞油酸(18:3η-6)、二十碳二烯酸(20:2η-6)、二高-Y-亞油酸(20:3η_6)、花生四烯酸(20:4η_6)、二十二碳二烯酸(22:2η_6)、腎上腺酸(22:4η-6)和二十二碳五烯酸(即osbond acid,22:5n-6);以及酯、甘油三酯、衍生物、綴合物、前體、鹽和/或其混合物。本發(fā)明公開的多不飽和脂肪酸(例如，omega-3脂肪酸和/或omega-6脂肪酸)、酯、甘油三酯、衍生物、綴合物、前體、鹽和/或其混合物可以以它們的濃縮和/或純化形式和/或作為油(例如海產(chǎn)品油(例如，魚油)、藻類油、微生物油和/或植物油)的組分使用。脂肪酸油混合物根據(jù)本發(fā)明公開的脂肪酸油混合物可來自動物油和/或非動物油。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述脂肪酸油混合物來自至少一種選自海產(chǎn)品油、單細胞油、藻類油、植物油、微生物油及其組合的油。海產(chǎn)品油包括，例如，魚油、磷蝦油以及來自魚的脂類組分。植物油包括，例如，亞麻籽油、菜籽油、芥子油和大豆油。單細胞/微生物油包括，例如，Martek、Nutrinova和Nagase&Co的產(chǎn)品。單細胞油通常被定義為來自微生物細胞的油且其可供人類食用。參見，例如，Wynn and Ratledge, “Microbial oils !production,processing and markets for specialty long-chain omega-3polyunsatutrated fattyacids，，，pp.43-76，Breivik(Ed.)，Long-Chain 0mega_3Specialty Oils，The Oily Press，P.J.Barnes&Associates, Bridgewater UK, 2007 中。其他油包括植物油甘油三酯，通常被稱為長鏈甘油三酯，例如蓖麻油、玉米油、棉子油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、大豆油、氫化大豆油和氫化植物油；中鏈甘油三酯(例如來自椰子油或棕櫚籽油的那些)，甘油一酯，甘油二酯和甘油三酯。除混合的甘油酯夕卜，有其他油例如丙二醇酯，比如丙二醇的辛酸/癸酸混合二酯，飽和的椰子油與棕櫚仁油衍生的辛酸、亞油酸、琥珀酸的酯，或癸脂肪酸的丙二醇酯。脂肪酸油混合物中的脂肪酸可被酯化，例如形成烷基酯，例如乙酯。在一些實施方式中，所述脂肪酸為甘油酯形式，例如選自單_、二-和三甘油酯。在其他實施方式中，所述脂肪酸為游離酸形式。脂肪酸油混合物中的不飽和脂肪酸可以是順式和/或反式構(gòu)型。全順式構(gòu)型的omega-3脂肪酸的實例包括·但不限于:(全-Z) _9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)、(全-Z)-6，9，12，15-十八碳四烯酸(STA)、(全-Z)-11，14，17-二十碳三烯酸(ETE)、(全-Z)-8，11，14，17-二十碳四烯酸(ETA)、(全-Z)-，7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(DPA)、(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z)-6, 9, 12, 15, 18- 二^ 碳五烯酸(HPA)。全順式構(gòu)型的omega-6脂肪酸的實例包括但不限于:(全-Z)-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(osbond acid)、(全-Z)-9，12-十八碳二烯酸(亞油酸)、(全-Z)-5，8，11，14- 二十碳四烯酸(AA)和(全-Z)-6，9，12-十八碳三烯酸(GLA)。順式構(gòu)型的單不飽和脂肪酸的實例包括但不限于:(Z)-9-十六碳烯酸(棕櫚油酸)、(Z)-9-十八碳烯酸(油酸)、(Z)-1l-十八碳烯酸(異油酸)、(Z)-9-二十碳烯酸(鱈油酸)、(Z)-1l-二十碳烯酸(二十碳-11-烯酸)、(Z)-ll-eicoesenoic acid、(Z)-11-二十二碳烯酸(鯨臘烯酸)、Z_13_ 二十二碳烯酸(芥酸)和(R-(Z) )-12-羥基-9-十八碳烯酸(蓖麻油酸)。根據(jù)本發(fā)明公開的脂肪酸油混合物的實例包括但不限于歐洲藥典Omega-3酸乙酯60、歐洲藥典0mega-3酸專論中的魚油富集物(Fish Oil Rich)、美國藥典魚油專論、歐洲藥典0mega-3酸甘油三酯、歐洲藥典0mega-3酸乙酯90和美國藥典0mega-3酸乙酯專論中規(guī)定的脂肪酸。含有不同脂肪酸的脂肪酸油混合物的市售實例包括但不限于:Incromega omega-3 海產(chǎn)品油濃縮物，例如 Incromega TG7010SR、Incromega E7010SR>Incromega TG6015 > Incromega EPA500TG SR、Incromega E400200SR> Incromega E4010 >Incromega DHA700TG SR、 Incromega DHA700E SR、 Incromega DHA500TG SR、Incromega TG3322SR> Incromega E3322SR> Incromega TG3322> Incromega E3322>Incromega Trio TG/EE(Croda International PLC, Yorkshire, England) ;EPAX6000FA、EPAX5000TG、EPAX4510TG、EPAX2050TG,EPAX5500EE, EPAX5500TG、EPAX5000EE、EPAX5000TG、EPAX6000EE、EPAX6000TG、EPAX6500EE、EPAX6500TG、EPAX1050TG、EPAX2050TG、EPAX6015TG/EE、EPAX4020TG 和 EPAX4020EE (EPAX 為 Trygg Pharma AS 的全資子公司;Omacor /Lovaza / Z0din /SeaC0r 最終藥物產(chǎn)品，K85EE、AGP103、K30EE、K50EE 和 K70EE (PronovaBioPharma Norge AS) ； MEG-3⑩ EPA/DHA 魚油濃縮物(Ocean Nutrition Canada)；DHA FNO “功能性營養(yǎng)油(Functional Nutritional Oil) ” 和 DHA CL “清液(ClearLiquid) ”(Lonza) ;Superba 憐蟲下油(Aker Biomarine) ;Martek 生產(chǎn)的含 DHA 的 omega-3產(chǎn)品；Neptune磷奸油(Neptune) ； M(I)IleB生產(chǎn)的魚肝油產(chǎn)品和抗反流(ant1-reflux)魚油濃縮物(TG) ；Lysi omega-3 魚油；Seven Seas TrioHMgl 魚肝油混合物(Seven Seas)；Fri Flyt omega-3 (Vcstci^lciis):以及Epadel (Mochida)。這些市售的具體實例提供了多
種omega-3脂肪酸、組合以及酯基轉(zhuǎn)移方法或制備方法得到的其他成分，其中所述方法或制備方法是為了從多種來源(例如海產(chǎn)品、藻類、微生物(單細胞)和/或植物來源)得到omega-3脂肪酸。在本發(fā)明公開的一些實施方式中，所述脂肪酸油混合物含有至少一種omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。在至少一個實施方式中，所述脂肪酸油混合物含有EPA和DHA。，所述脂肪酸油混合物可進一步包含至少一種其他脂肪酸，例如EPA和DHA以外的多不飽和脂肪酸(PUFA)。這種PUFA的實例包括但不限于:其他omega-3脂肪酸，例如EPA和DHA以外的C2(|-C22omega-3脂肪酸,和omega-6脂肪酸。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述方法制備C22:5n-3(n_3DPA)的濃縮物。用于濃縮omega-3脂肪酸·的方法本發(fā)明公開的一些實施方式涉及從脂肪酸油混合物中濃縮至少一種omega-3脂肪酸的方法。根據(jù)一個實施方式，所述方法包括混合脂肪酸油混合物和銀鹽水溶液，例如硝酸銀(AgNO3)溶液。雖然本討論集中在AgNO3I，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可使用其他合適的銀鹽，例如四氟硼酸銀(AgBF4)。銀離子可以與脂肪酸油混合物中的多不飽和脂肪酸形成絡(luò)合物，所述多不飽和脂肪酸如omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。由此形成的銀絡(luò)合物可存在于水相中，而脂肪酸油混合物中的其他脂肪酸(例如，飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸、單不飽和脂肪酸和/或其他不飽和脂肪酸，如雙鍵比所述復(fù)雜的PUFA更少的脂肪酸)可作為不溶的脂肪酸存在于有機相中。所述銀鹽溶液(例如AgNO3溶液)的濃度范圍可以為約10%重量至約90%重量，例如約60%重量至約80%重量。在一些實施方式中，例如，AgNO3水溶液的濃度為約60%重量、約70%重量、約75%重量或約80%重量。在一些實施方式中，脂肪酸油混合物與AgNO3的重量比為至少0.4。例如，在一些實施方式中，脂肪酸油混合物與AgNO3的重量比范圍為約
0.4至約1.6。所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液可在室溫(例如，約20° C至約25。C)，或通過冷卻在低于室溫的溫度，例如約-25° C至約20° C，或在高于室溫的溫度，例如約25° C至約90° C混合。在與脂肪酸油混合物混合之前和/或之后，至少一種有機溶劑(例如極性有機溶劑)可以加入到AgNO3溶液中。合適的有機溶劑的實例包括但不限于醇，例如乙醇和甲醇。極性有機溶劑的加入可例如提高脂肪酸從脂肪酸油混合物到AgNO3水溶液的溶解度。所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液通?；旌洗蠹s數(shù)分鐘至幾小時，例如，約15分鐘至約2小時，從而得到有機相和水相，例如油-水乳液。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，所需的混合時間將取決于所涉及的體積和混合效率。例如，在通過微型反應(yīng)器制備的節(jié)涌流(slugflow)中，當用硝酸銀水溶液提取DHA乙酯和EPA乙酯時，可能需要小于20秒即達到平衡(Seike等人(2007) Journal of Chemical Engineering of Japan, Vol.40,ppl076_1084)。對于匯聚在一起使混合效率較低的大體積，脂肪酸與銀離子水溶液的轉(zhuǎn)移和絡(luò)合將花費基本上更長的時間以達到平衡，例如2小時或更長。 沉降后，所述有機相和水相可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法進行分離。例如，相分離可通過將所述混合物放置足夠長的時間以獲得兩個基本透明的相、通過離心分離、通過膜技術(shù)或通過其他合適的方法進行。除去有機相后，水相可用置換液(例如有機溶劑)提取，從而形成至少一種提取物。例如，所述置換液可通過優(yōu)先除去某種脂肪酸(如EPA和DHA以外的omega-6脂肪酸和/或omega-3脂肪酸)，提供升高的選擇性。不受理論所束縛，所述置換液可通過影響脂肪酸在水相中的相對溶解度和/或通過與銀絡(luò)合物相互作用來提供選擇性。在一些情況下，可選擇置換液使其不與銀離子形成絡(luò)合物，或與比待濃縮的omega-3脂肪酸相比，使其與銀離子形成弱的絡(luò)合物。合適的置換液的實例包括但不限于:烷烴、烯烴、環(huán)烷烴、環(huán)烯烴、二烯烴、芳烴(aromates)和鹵代溶劑。可以非限制性地提及具體實例，例如二氯甲烷和含有一個或多個氯原子的其他溶劑和/或一種或更多種其他的鹵化物、己烷、己烯、庚烷、庚烯、環(huán)己烷、環(huán)己烯、1，7-·辛二烯、1，5-環(huán)辛二烯，以及包含一個或多個雙鍵的其他烯烴，例如包含一個、兩個或甚至三個雙鍵的烯烴，以及含有氧和氮的溶劑，例如酮和酰胺/胺。所述水相可提取超過一次，即，至少兩次連續(xù)提取。以溶于銀離子水相的脂肪酸油混合物的重量計，每次提取中置換液的量的范圍可以為約0.1至約5倍?？梢愿鶕?jù)在濃縮一種或多種具體omega-3脂肪酸時所需的選擇性使用不同的置換液和/或置換液的組合。在分離所述水相和有機相前，可將其加熱。在這種情況下，確定適當?shù)臏囟葧r可考慮所述有機相的沸點。一般來說，可將所述水相/有機相混合物加熱至約30° C至約90° C的溫度范圍。在一些實施方式中，除去所述有機相后加熱所述水相，從而形成至少一種提取物。例如，所述水相可加熱至至少30° C的溫度，例如約30° C至約90° C的溫度范圍。在這種情況下，加熱可導(dǎo)致omega-6脂肪酸和/或具體omega-3脂肪酸(例如EPA和DHA以外的C2(|-C22omega-3脂肪酸)濃縮的脂肪酸油混合物從所述水相中釋放。加熱應(yīng)在無氧和足夠溫和的條件下謹慎完成以避免多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化、異構(gòu)化和/或降解。進一步根據(jù)所述方法，水相可用水稀釋以離解AgNO3絡(luò)合物，從而游離脂肪酸濃縮物，即，至少一種omega-3脂肪酸濃縮的脂肪酸油混合物。在一些實施方式中，稀釋所述水相超過一次，即，至少兩次連續(xù)稀釋。稀釋時使用水的量的范圍可以為所使用的固體硝酸銀(AgNO3(S))的重量的約I至約20倍。確切量取決于多種因素，包括銀離子濃度和脂肪酸油混合物的性質(zhì)。所述脂肪酸濃縮物隨后可以從水相中分離以形成至少一種溶液。在一些實施方式中，可回收銀離子用于在隨后方法中再次使用。例如，可通過再生(包括例如通過電解再生)、過濾、離心分離和/或純化回收銀離子用于再次使用。進一步根據(jù)所述方法，水相可在超臨界壓力下用二氧化碳(CO2)提取以離解Ag+絡(luò)合物，從而游離全部或部分脂肪酸濃縮物。二氧化碳可含有至少一種極性調(diào)節(jié)劑，例如水或醇，例如乙醇。用二氧化碳提取的益處可包括無需大量的水來裂解絡(luò)合物。CO2易于通過釋放壓力從乙酯中除去。CO2無毒并且可以為保護活性Ag+不生成非活性Ag2O提供所需的惰性氣氛。根據(jù)本發(fā)明的方法可濃縮至少一種omega-3脂肪酸，同時降低至少一種omega-6脂肪酸在脂肪酸油混合物中的濃度。例如，相對于脂肪酸油混合物，所述方法可提高脂肪酸濃縮物中omega-3與omega-6脂肪酸的比例。在一些實施方式中，脂肪酸濃縮物混合物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸(n-3/n_6)的比例大于約40,例如大于約80、大于約100、大于約150或大于約200。在一些實施方式中，脂肪酸濃縮物中的omega-6脂肪酸的總濃度可小于約3%重量，例如小于約2%重量，或小于約1%重量。本發(fā)明公開的方法還可以濃縮一種或多種omega-3脂肪酸，同時降低其他omega-3脂肪酸的濃度。在一些實施方式中，例如，所述方法濃縮EPA和DHA，同時降低EPA和DHA以外的C2(l-C22omega-3脂肪酸的濃度。在一些實施方式中，脂肪酸濃縮物中EPA和DHA以外的C2Q-C22omega-3脂肪酸的總濃度小于3%重量，例如小于2.5%重量，例如小于0.5%重量。本發(fā)明公開的方法進一步提供通過濃縮相對于其他的omega-3脂肪酸的更多或更少的一種omega-3脂肪酸，來·調(diào)整脂肪酸油混合物中的EPA/DHA比例。例如，所述EPA/DHA比例可通過改變溫度、置換液和/或水稀釋比例，和用含有或不含有極性調(diào)節(jié)劑(例如水或醇，例如乙醇)的CO2提取進行調(diào)整。在一些實施方式中，至少一種脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和至少一種溶液中的EPA/DHA比例范圍為約0.1至約10，以重量計。所述脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和/或至少一種溶液可使用至少一種純化方法進行純化。所述純化方法可除去例如殘留的銀化合物、殘留的置換液、短鏈脂肪酸(例如，脂肪酸16:4n-l)、通過與銀離子絡(luò)合而富集的低分子量化合物、環(huán)境污染物、膽固醇和/或維生素。這種純化方法包括但不限于:短程蒸餾、分子蒸餾、超臨界流體提取、酶分離方法、碘內(nèi)酯化分懼(iodolactonization fractionation)和制備色譜法。可重復(fù)本發(fā)明公開的方法以進一步濃縮至少一種omega-3脂肪酸和/或濃縮一種或多種其他的omega-3脂肪酸。所述方法還可以用于濃縮至少一種omega-6脂肪酸。例如，所述脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和/或至少一種溶液可包含在一種或多種上述的隨后方法中的脂肪酸油混合物。從根據(jù)本發(fā)明公開的一種或多種濃縮方法獲得的脂肪酸濃縮物可包含至少80%的至少一種omega-3脂肪酸,例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一種omega-3脂肪酸。從本申請公開的方法獲得的脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和/或至少一種溶液還可以通過至少一種常規(guī)分餾方法例如短程蒸餾、分子蒸餾、碘內(nèi)酯化分餾、酶分餾方法、提取和/或色譜法進行處·理。由此獲得的脂肪酸濃縮物可包含至少80%的至少一種omega-3脂肪酸，例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一種omega-3脂肪酸。在一個實施方式中，例如，至少一種分餾方法制備包含至少90%(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)，例如至少95%DHA，或例如至少98%DHA的脂肪酸濃縮物。在另一個實施方式中，至少一種分餾方法制備包含至少80% (全-Z)-7，10, 13，16，19- 二十二碳五烯酸(DPA)，例如至少90%DPA，例如至少95%DPA，或例如至少98%DPA的脂肪酸濃縮物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，通過至少一種常規(guī)分餾方法處理根據(jù)本發(fā)明公開獲得的濃縮物能夠制備符合例如歐洲藥典專論1250,0mega-3-酸乙酯90專論和/或美國藥典0mega-3-酸乙酯專論的組合物。本發(fā)明公開的方法可減少至少一種環(huán)境污染物在脂肪酸油混合物中的濃度，使得所述脂肪酸油濃縮物、至少一種提取物和/或至少一種溶液包含比脂肪酸油混合物濃度更低的至少一種環(huán)境污染物。環(huán)境污染物包括但不限于:多氯聯(lián)苯(PCB)化合物、多氯
二苯并二胃惡(PCDD)化合物、多氯二苯并呋喃(PCDF)化合物、溴化阻燃劑如多溴二苯醚
(PBDE)、四溴雙酚A (TBBP-A)和六溴環(huán)十二烷(HBCD)，以及殺蟲劑如DDT (2，2雙-(對氯苯基)-1，1，1-三氯乙烷)和DDT的代謝產(chǎn)物。本發(fā)明公開的方法還可降低總膽固醇(即，游離和/或結(jié)合的膽固醇)在脂肪酸油混合物中的濃度，使得脂肪酸濃縮物包含比脂肪酸油混合物濃度更低的總膽固醇。在本發(fā)明的一些實施方式中，在與AgNO3水溶液結(jié)合前，所述脂肪酸油混合物在至少一種剝離(stripping)方法步驟(例如蒸餾)中被剝離，其中所述剝離方法步驟降低至少一種環(huán)境污染物和/或總膽固醇在脂肪酸油混合物中的量。下面的實施例旨在舉例說明本發(fā)明，而且本質(zhì)上并非是限制性的。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解與本文提供的公開相一致的其他實施方式。下表中給出的組成值是基于氣相色譜(GC)面積百分·比。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，GC面積百分比不同于GC質(zhì)量百分比，例如，它們可高于相應(yīng)的GC質(zhì)量百分比。在歐洲藥典專論2.4.29“ Compos it ion of FattyAcids in Oils Rich in 0mega-3_Acids”中提供了分析GC質(zhì)量百分比的步驟?！嵤├龑嵤├?:溫度相分離前。將K50EE用70%重量AgNO3溶液(K50EE:AgN03=3:5)混合約1.5小時并升至所需溫度(參見表1，即，8° C、21° C、50° C、60° C或70° C)。將油/水混合物靜置約2小時分成水相和有機相，并除去有機相。水相用水稀釋(水:AgN03(s) =約7.5:1，以重量計)，導(dǎo)致有機物質(zhì)(即脂肪酸濃縮物)游離。收集濃縮物并通過GC分析(GC面積％)測定其組成，如表I所示。結(jié)果顯示，較高的溫度降低了 n-6脂肪酸和/或具體的n-3脂肪酸(例如，EPA和DHA以外的長鏈(LC)脂肪酸)的相對濃度。表1:脂肪酸濃縮物的組成；在各種溫度混合K50EE:AgN03=3:5(GC面積％)。
權(quán)利要求
1.從脂肪酸油混合物中濃縮至少一種omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括: (a)混合脂肪酸油混合物和銀鹽水溶液以形成水相和有機相，其中在水相中，所述銀鹽水溶液與至少一種omega-3脂肪酸形成絡(luò)合物； (b)分離有機相和水相； (c)用置換液提取水相，或?qū)⑺嗟臏囟壬叩街辽?0°C，或用置換液提取與升高溫度相結(jié)合，從而形成至少一種提取物； (d)合并水相和水，或用超臨界CO2提取水相，或合并水相和水與用超臨界C02提取水相相結(jié)合，以解離絡(luò)合物，其中水相包含所述銀鹽和至少一種含有脂肪酸濃縮物形式的溶液；和 (e)從包含所述銀鹽的水相中分離所述至少一種含有脂肪酸濃縮物形式的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中銀鹽的濃度范圍為約10%至約90%，以重量計于水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中銀鹽的濃度范圍為約60%至約80%，以重量計于水中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中銀鹽的濃度為約60%，以重量計于水中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述銀鹽選自AgNO3和AgBF4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種omega-3脂肪酸選自(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)及其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述方法濃縮EPA或DHA，或EPA和DHA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在至少一種脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和至少一種溶液中的EPA/DHA的比例范圍為約0.1至約10，以重量計。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含至少90%omega-3脂肪酸，以重量計。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含至少8096EPA和DHA，以重量計。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含相對于脂肪酸油混合物降低了濃度的至少一種omega-6脂肪酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述方法相對于脂肪酸油混合物提高了脂肪酸濃縮物中omega-3與omega-6脂肪酸的比例。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸的比例大于約40。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸的比例大于約80。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸的比例大于約100。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸的比例大于約150。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸的比例大于約200。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中的omega-6脂肪酸的總濃度小于約3%重量。
19.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中的omega-6脂肪酸的總濃度小于約2%重量。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中的omega-6脂肪酸的總濃度小于約1%重量。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中脂肪酸油混合物與銀鹽溶液的比例范圍為約0.4至約1.6,以重量計。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)進一步包括將醇加入水相中。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述醇包括乙醇。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述置換液包括有機溶劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述有機溶劑選自鹵代溶劑、烷烴、烯烴、環(huán)烷烴和環(huán)烯烴。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述有機溶劑選自二氯甲烷、己烷、己烯、環(huán)己烷、環(huán)己烯和二烯烴。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用置換液提取水相包括至少兩個連續(xù)提取。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少30°C的溫度范圍為約30° C至約90° C。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中至少重復(fù)一次合并水相和水，或用超臨界CO2提取水相，或合并水相和水與用超臨界C02提取水相相結(jié)合，以解離絡(luò)合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，分離包含脂肪酸濃縮物的有機相后，從含有銀鹽的水相中回收銀鹽用于再次使用。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物來自動物油、植物油、微生物油、藻類油或其任意組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述動物油是海產(chǎn)品油。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述海產(chǎn)品油是魚油。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項的方法，其中所述油的形式選自甘油酯、乙酯和游離脂肪酸形式。
35.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含相對于脂肪酸油混合物降低了濃度的至少一種環(huán)境污染物。
36.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含相對于脂肪酸油混合物降低了濃度的膽固醇。
37.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種omega-3脂肪酸選自乙酯、游離酸和甘油酯的形式。
38.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸濃縮物包含相對于脂肪酸油混合物降低了濃度的至少一種(全-Z) -5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸(DHA)以外的 C20-C22omega-3 脂肪酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的總濃度小于3%重量。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的總濃度小于2.5%重量。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述脂肪酸濃縮物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的總濃度小于0.5%重量。
42.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括:(f)通過至少一種純化方法純化所述脂肪酸濃縮物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述至少一種純化方法選自短程蒸餾、分子蒸餾、碘內(nèi)酯化分離、超臨界流體提取、酶分餾和制備色譜法。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述至少一種純化方法包含短程蒸餾和分子蒸餾。
45.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法至少重復(fù)一次，其中至少一種脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和至少一種溶液包含隨后方法中的脂肪酸油混合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述方法制備包含至少80%的選自(全-Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z) -7, 10, 13, 16, 19- 二十二碳五烯酸(DPA)的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述方法制備包含至少90%的選自EPA、DHA和DPA的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
48.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述方法制備包含至少95%的選自EPA、DHA和DPA的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
49.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述方法制備包含至少98%的選自EPA、DHA和DPA的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
50.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種脂肪酸濃縮物、至少一種提取物和至少一種溶液通過至少一種分餾方法進行處理。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述至少一種分餾方法選自蒸餾、提取、碘內(nèi)酯化和色譜法。
52.根據(jù)權(quán)利要求50-51中任一項的方法，其中所述至少一種分餾方法制備包含至少80%的選自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
53.根據(jù)權(quán)利要求50-51中任一項的方法，其中所述至少一種分餾方法制備包含至少90%的選自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
54.根據(jù)權(quán)利要求50-51中任一項的方法，其中所述至少一種分餾方法制備包含至少95%的選自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
55.根據(jù)權(quán)利要求50-51中任一項的方法，其中所述至少一種分餾方法制備包含至少98%的選自C2(|-C22omega-3脂肪酸的至少一種omega-3脂肪酸的脂肪酸濃縮物。
56.根據(jù)權(quán)利要求50-51中任一項的方法,其中所述至少一種omega-3脂肪酸選自(全-Z) -4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z) -7，10，13，16，19- 二十二碳五烯酸(DPA)。
57.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含至少一種選自二英、PCBs、DDT和TOBE的持久性有機污染物。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述方法減少脂肪酸油混合物中的至少一種持久性有機污染物達脂肪酸濃縮物中的至少95%。
59.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含膽固醇。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述方法將脂肪酸油混合物中的膽固醇減少到在脂肪酸濃縮物中小于0.lmg/g。
61.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中超臨界CO2包含至少一種極性調(diào)節(jié)劑。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述至少一種極性調(diào)節(jié)劑選自水和醇。
63.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在約-25°C至約20° C，約20° C至約25° C，或約25。C至約90° C的溫度范圍內(nèi)混合脂肪酸油混合物和銀鹽水溶液。
64.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，混合脂肪酸油混合物和銀鹽水溶液后，在約-25。C至約20° C，約20° C至約25° C，或約25° C至約90° C的溫度范圍內(nèi)分離水相和有機 相。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及用銀鹽水溶液(例如AgNO3水溶液)從脂肪酸油混合物中濃縮omega-3脂肪酸的方法。
文檔編號C11C1/08GK103221524SQ201180055920
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月24日
發(fā)明者H.布雷維克, O.索爾斯塔德, F.O.利布諾 申請人:普羅諾瓦生物醫(yī)藥挪威公司