一種保持生物活性醫(yī)用膠原的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種保持生物活性的I型醫(yī)用膠原材料的提取方法，其特點在于綜合利用酸法、堿法和酶法，在嚴(yán)格控制溫度、pH值、反應(yīng)時間及控制蛋白酶用量的條件下，生產(chǎn)出保持膠原特有生物活性、低免疫原性、高生物相容性的高純度醫(yī)用膠原材料，該方法提取的醫(yī)用膠原收率達(dá)到90％以上，純度達(dá)到99％以上，且適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。該材料可用于生產(chǎn)高檔止血材料、骨融合材料、組織再生膜片、注射美容用活性膠原溶液等。
【專利說明】一種保持生物活性醫(yī)用膠原的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種保持生物活性的醫(yī)用膠原的制備工藝及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原是一種天然的生物大分子，來源豐富，去除其抗原所在的端肽后可加工制備成具有良好生物相容性的生物材料，國內(nèi)外均投入了大量人力、物力開展醫(yī)用膠原材料的研究。
[0003]膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(ECMs)的主要成分，具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)，它不僅對組織和器官起支持和保護(hù)作用，而且參與介導(dǎo)一系列生物過程，包括細(xì)胞的粘附、遷移和分化以及組織再生，膠原的這些特殊生物學(xué)功能是通過膜受體、可溶性因子以及其它ECM組分等生物活性分子與膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的特異性結(jié)合來實現(xiàn)的。因此，對于膠原三螺旋結(jié)構(gòu)和功能的研究己成為當(dāng)今生物材料領(lǐng)域的熱點。膠原的熱變性過程是三螺旋結(jié)構(gòu)連續(xù)發(fā)生變化的過程，隨著溫度的升高，三螺旋會發(fā)生解旋，并最終形成無規(guī)則的單條多肽鏈，這個過程可以歸納為“三螺旋一單體”的熱變性過程。在這個過程中，穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用力逐漸被破壞，膠原熱變性后，三螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞，并且該過程不可逆，去除其抗原所在的端肽后可加工制備成具有良好生物相容性的生物材料。
[0004]膠原利用其獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)不僅能夠形成一個表面，允許細(xì)胞以及其它酶類或者生物活性因子與其相結(jié)合，而且這種螺旋狀的構(gòu)造包含著信息，使得生物體的生理環(huán)境得以有條不紊地運行。
[0005]膠原的三股螺旋是一種能容納膠原蛋白特有的氨基酸組成和序列的結(jié)構(gòu)。生物醫(yī)用材料的研究和臨床應(yīng)用已從第一代生物惰性材料、第二代生物活性材料及生物可降解材料發(fā)展到基于細(xì)胞和分子水平的第三代生物材料，第三代生物材料的一個重要研究方向是模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，在材料上引入特殊的蛋白質(zhì)、多肽以及其他生物分子，使材料在分子水平上刺激細(xì)胞產(chǎn)生特殊應(yīng)答反應(yīng)，引起細(xì)胞整合素的相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與組裝，從而啟動機(jī)體的再生系統(tǒng)，并且對于動物體的熱平衡發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。另外膠原具有良好的生物相容性，是研究和應(yīng)用廣泛的生物醫(yī)用材料，如組織工程支架、可吸收縫合線、組織引導(dǎo)再生隔膜等，但如何通過常規(guī)手段獲得保持這種具有活性的三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原以及利用這種膠原制備生物相容性醫(yī)用材料是人們追求的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)試驗，并經(jīng)紫外光譜、紅外光譜及電鏡測試，結(jié)果證明本發(fā)明制備方法制備的I型膠原完整的保存了膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，并有效去除端肽，降低了膠原的免疫原性,使其具有更好的生物相容性。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種抗原性低、保持生物活性具備三螺旋結(jié)構(gòu)的I型醫(yī)用膠原的制備方法。[0008]本發(fā)明的又一目的在于提供一種以本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原為原料制備而成的骨融合生物材料以及這種骨融合生物材料的制備方法，所制備的骨融合生物材料可用于骨缺損損傷部位的修復(fù)。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種以本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原為原料的生物組織再生膜及其制備方法，所制備的生物膜片不僅可用于高檔止血材料，同時也可用于皮膚及腦膜再生領(lǐng)域。
[0010]本發(fā)明保持膠原生物活性的制備方法具有提取收率高、抗原性低的特點，普通的提取方法得到的可溶性純膠原收率只能達(dá)到10-20%，一般只能用于實驗室研究，而本發(fā)明所提取活性膠原的收率可以達(dá)到90%以上，極大的提高了動物組織的利用率，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0011]本發(fā)明的保持生物活性具備三螺旋結(jié)構(gòu)的I型生物膠原可由下述方法步驟制備:
[0012]I)、原料前處理:選取新宰殺牛的牛跟腱，運輸過程在冰水中保存，到達(dá)加快處理地后，立即加工處理，用剪刀去除多余組織，放置于-20度冰箱中冷凍，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用鋁箔捆扎成IOmm大小圓柱狀，放置于冰箱中冷凍存放，備用。
[0013]2)、膠原提取:
[0014]A、取冷凍后的牛跟腱，切制成0.5毫米左右的薄片，用組織破碎機(jī)粗碎后，用5% -20%的NaCl溶液浸泡15_30min，再用加入0.5%的KH2PO4，在0-5°C的溶液浸泡l_3h，用純化水沖洗至PH值為中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在緩慢攪拌條件下脫脂1-3小時，得預(yù)處理原料。
[0015]B、原料用純化水沖洗后加入含23% NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值7.5)緩沖液浸泡3h，期間隨時吸取液面上的油脂，至無脂質(zhì)浮在液面。
[0016]C、后用組織破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)碎，調(diào)節(jié)溶液PH值至6.8，加入1: 100無花果蛋白酶，4°C條件下，二十分鐘攪拌一次，處理5小時，反復(fù)沖洗后用I %的H2O2處理4h后清洗。
[0017]D、將以上所得膠原加入飽和NaCl溶液中(PH7.0-7.2)，在4°C條件下靜置6-24小時，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化銨溶液浸泡，15_20°C條件下靜置36小時，最后用HCl進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)PH值至7.2，攪拌條件下用純化水沖洗3次，再用pH為6.8的注射用水在5°C溫度下浸泡3小時，濾過，除去多余水份，冷凍保存，即得。
[0018]以本發(fā)明制備方法制備的I型醫(yī)用膠原為原料制備生物止血膜可由以下方法制成:
[0019]1、凍干:將所得膠原按3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在線式高速均質(zhì)機(jī)分散2-3遍，其溫度控制在10°C以下，分散后的液體真空去除氣泡，放入冷凍干燥機(jī)凍干托盤，使厚度在4-6mm，在零下5°C (-5°C )至_15°C預(yù)凍2小時，再在_45°C至-55°C凍干30小時，在-10°C度升華15小時，15°C二次升華3小時，即得本發(fā)明的生物膜。
[0020]2、加強(qiáng):將膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小時，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小時。
[0021]3、滅菌:將所得膜片用鋁塑復(fù)合膜進(jìn)行雙層包裝，將包裝后的產(chǎn)品用伽馬射線進(jìn)行滅菌處理，即得。
[0022]所得膜片不僅可用于高檔止血材料，同時也可用于皮膚及腦膜再生領(lǐng)域。
[0023]以本發(fā)明制備方法制備的I型醫(yī)用膠原為原料制備骨融合醫(yī)學(xué)材料可用以下方法制備:將膠原溶于含0.1 % -1 %的有機(jī)酸(檸檬酸或冰醋酸)水溶液中，調(diào)節(jié)pH值至
2.0-5.0，采用高速剪切機(jī)進(jìn)行分散，期間溫度控制在0°C _5°C，分散好后分別加入與膠原重量份比例為1: 50-100: 50-100的磷酸三鈣和羥基磷灰石，再進(jìn)行分散，混合均勻，灌裝，滅菌，即得。
[0024]以本發(fā)明制備方法制備的I型醫(yī)用膠原為原料制備外用皮膚抗衰美容霜可由以下方法制成:將本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原溶于檸檬酸中，經(jīng)高速剪切機(jī)分散，再用超高壓均質(zhì)機(jī)將分散后的膠原液進(jìn)行納米級破碎，即得到可透皮吸收的活性納米膠原，與其他輔料混合，按常規(guī)護(hù)膚用乳劑制成護(hù)膚品即得。
【具體實施方式】:
[0025]實施例1
[0026]本發(fā)明的I型膠原的制備方法。
[0027]1、原料前處理:選取新宰殺牛的牛跟腱，運輸過程在冰水中保存，到達(dá)現(xiàn)場后，用剪刀去除多余組織，放置于-20度冰箱中冷凍，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用鋁箔捆扎成IOmm大小圓柱狀，放置于冰箱中冷凍存放，待用。
[0028]2、膠原提取:
[0029]I)將冷凍·后的牛跟腱lOOOg，切制成I毫米厚的薄片，用5%的NaCl溶液浸泡20min,用0.5%的KH2P4，溫度5°C浸泡2h，用純化水沖洗至PH值為中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在緩慢攪拌條件下脫脂I小時，得預(yù)處理原料950g。
[0030]2)用純化水沖洗后加入含23% NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值1.5)緩沖液浸泡3h，期間隨時吸取液面上的油脂，至無脂質(zhì)浮在液面。
[0031]3)后用組織破碎機(jī)將片狀跟腱進(jìn)行破碎，調(diào)節(jié)溶液PH值至6.8，加入1: 100無花果酶，4°C條件下緩慢攪拌5小時，反復(fù)沖洗后用1%的H202處理4h后清洗。
[0032]4)將以上所得膠原加入飽和NaCl溶液中(PH7.2)，在4度條件下靜置12小時，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化銨溶液浸泡，15度條件下靜置36小時，最后用HCl進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)PH值至7.2，攪拌條件下用純化水沖洗3次，再用PH為6.8的注射用水，5°C浸泡3小時，去除多余水份，得到910克純膠原。
[0033]實施例2
[0034]本發(fā)明的生物膜的制備
[0035]將本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原經(jīng)分散乳化后凍干，再高溫物理交聯(lián)，包裝、滅菌，即得。具體如下:
[0036]1、凍干:將所得膠原按3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在線式高速均質(zhì)機(jī)分散2-3遍，其溫度控制在10°C以下，分散后的液體真空去除氣泡，放入冷凍干燥機(jī)凍干托盤，使厚度在4-6mm，在零下5°C (-5°C )至_15°C預(yù)凍2小時，再在_45°C至-55°C凍干30小時，在-10°C度升華15小時，15°C二次升華3小時，即得本發(fā)明的生物膜。
[0037]2、加強(qiáng):將膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小時，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小時。
[0038]3、滅菌:將所得干燥后的膜片用鋁塑復(fù)合膜進(jìn)行雙層包裝，將包裝后的產(chǎn)品用伽馬射線進(jìn)行滅菌處理，即得本發(fā)明的生物膜。[0039]實施例3
[0040]本發(fā)明的注射用骨融合材料的制備
[0041]將本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原溶于有機(jī)酸中(檸檬酸或冰醋酸)，經(jīng)高剪切分散后，與一定比例的磷酸三鈣和羥基磷灰石均勻混合，包裝，滅菌，即得。具體如下:
[0042]1、分散:取1000ml注射用水，加入0.5%冰醋酸，調(diào)節(jié)PH值至3.2，后加入6g膠原，用高速分散機(jī)在21000轉(zhuǎn)/分的條件下攪拌4個小時，期間溫度控制在3-5°C。
[0043]2、混合:取滅菌后的磷酸三鈣400g、羥基磷灰石600g，加入到上述分散好的膠原液中，用分散機(jī)混合均勻。
[0044]3、包裝:將所得混合物封裝在IOml注射器中，密封包裝。
[0045]4、滅菌:包裝后的產(chǎn)品用伽馬射線進(jìn)行滅菌處理，即得本發(fā)明的注射性骨融合材料。
[0046]實施例4
[0047]本發(fā)明的皮膚抗衰老霜的制備
[0048]將本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原溶于檸檬酸中，經(jīng)高剪切分散，再用TIS超高壓均質(zhì)機(jī)將分散后的膠原液進(jìn)行納米級破碎，得到可透皮吸收的活性納米膠原，與其他輔料混合做成除皺抗衰霜，具體如下:
[0049]配方:
[0050]配料名稱:含量(％ Wt)
[0051]1、維生素A棕櫚酸脂1.00
[0052]2、維生素E乙酸脂0.5
[0053]3、(山崳酰乳酰乳酸鈉) 1.5
[0054]4、十六十八醇(50/50) 3.00
[0055]5、單甘酯2.60
[0056]6、棕櫚酸異丙酯4.00
[0057]7、高級橄欖油5.00
[0058]8、去離子水69.20
[0059]9、甘油3.00
[0060]10、DMDM 乙內(nèi)酰脲0.20
[0061]11、抗壞血酸磷酸酯鎂鹽和卵磷酯6.00
[0062]12、活性納米膠原3.00
[0063]13、棕櫚酰羥化小麥蛋白1.00
[0064]工藝:
[0065]1、按配方量稱取原料1-7，加入不銹鋼桶內(nèi)攪拌，混合均勻，加熱至80C，制成油相。
[0066]2、再取配方量甘油，加入到去離子水中，在不銹鋼桶內(nèi)混合攪拌，加熱至80C，制成水相。
[0067]3、將制好的水相倒入高速均質(zhì)罐內(nèi)，再將油相加入，啟動高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)兩遍，冷卻至25°C，再加入DMDM乙內(nèi)酰脲、抗壞血酸磷酸酯鎂鹽和卵磷酯、納米膠原和棕櫚酰羥化小麥蛋白，15°C低溫條件下用高剪切進(jìn)行均質(zhì)攪拌120分鐘，得到純白色膏狀抗衰老霜。[0068]4、將所得霜膏在15-25°C條件下加入灌裝機(jī)，進(jìn)行灌裝，封口。
[0069]5、將灌裝好的膏液瓶送至外包裝間，貼標(biāo)、裝盒，即得成品。
[0070]經(jīng)實驗測試，用此方法制成的膠原化妝品因含活性膠原成分，透皮吸收后，能夠在皮下形成新的網(wǎng)狀膠原支架，幫助新的皮下細(xì)胞再生，能有效的去除因皮膚衰老而產(chǎn)生的皺紋，經(jīng)臨床驗證，效果非 常明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種保持生物活性I型醫(yī)用膠原材料的制備方法，其特征在于: 1)、原料前處理:選取新宰殺牛的牛跟腱，運輸過程在冰水中保存，到達(dá)加快處理地后，立即加工處理，用剪刀去除多余組織，放置于-20度冰箱中冷凍，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用鋁箔捆扎成10_大小圓柱狀，放置于冰箱中冷凍存放，備用。 2)、膠原提取: A、取冷凍后的牛跟腱，切制成0.5-2毫米厚的薄片，用5% -20%的NaCl溶液浸泡15-30min，再用0.5%的KH2P4溫度在0_5°C的溶液浸泡I_3h，用純化水沖洗至PH值為中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在緩慢攪拌條件下脫脂1-3小時，得預(yù)處理原料。 B、原料用純化水沖洗后加入含23%NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值7.5)緩沖液浸泡3h，期間隨時吸取液面上的油脂，至無脂質(zhì)浮在液面。 C、后用組織破碎機(jī)將片狀跟腱進(jìn)行破碎，調(diào)節(jié)溶液PH值至6.8，加入1: 100無花果酶，4°C條件下緩慢攪拌5小時，反復(fù)沖洗后用I %的H2O2處理4h后清洗。 D、將以上所得膠原加入飽和NaCl溶液中(PH7.0-7.2)，在4°C條件下靜置6_24小時，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化銨溶液浸泡，15_20°C條件下靜置36小時，最后用HCl進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)PH值至7.2，攪拌條件下用純化水沖洗3次，再用pH為6.8的注射用水在5°C溫度下浸泡3小時，濾過，除去多余水份，冷凍保存，即得。
2.一種生物止血膜，其 特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料制備而成。
3.—種生物止血膜的制備方法，其特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料通過下述方法制備而成: 1)、凍干:將膠原按3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在線式高速均質(zhì)機(jī)分散2-3遍，溫度控制在10°C以下，分散后的液體真空去除氣泡，放入冷凍干燥機(jī)凍干托盤，使厚度在4-6mm，在零下5°C至零下15°C預(yù)凍2小時，再在_45°C至_55°C凍干30小時，在-10°C度升華15小時，15V二次升華3小時，備用； 2)、加強(qiáng):將膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小時，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小時。 3)、滅菌:將所得膜片用鋁塑復(fù)合膜進(jìn)行雙層包裝，將包裝后的產(chǎn)品用伽馬射線進(jìn)行滅菌處理，即得。
4.一種生物骨融合醫(yī)學(xué)材料，其特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料制備而成。
5.一種生物骨融合醫(yī)學(xué)材料的制備方法，其特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料通過下述方法制備而成:將膠原溶于含0.1% -1 %的有機(jī)酸(檸檬酸或冰醋酸)水溶液中，調(diào)節(jié)pH值至2.0-5.0，采用高速剪切機(jī)進(jìn)行分散，期間溫度控制在0°C _5°C，分散好后分別加入與膠原重量份比例為I: 50-100: 50-100的磷酸三鈣和羥基磷灰石，再進(jìn)行分散，混合均勻，灌裝，滅菌，即得。
6.一種皮膚抗衰美容霜，其特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料制備而成。
7.一種皮膚抗衰美容霜的制備方法，其特征在于:它是由權(quán)利要求1制得的具有生物活性保持膠原三螺旋結(jié)的膠原為原料通過下述方法制備而成:將本發(fā)明的I型醫(yī)用膠原溶于檸檬酸中，經(jīng)高速剪切機(jī)分散，再用超高壓均質(zhì)機(jī)將分散后的膠原液進(jìn)行納米級破碎，即得到可透皮吸收的保持三螺旋結(jié)構(gòu)的活性納米膠原，與其他輔料混合，按常規(guī)護(hù)膚用乳劑制成護(hù)膚 品即得。
【文檔編號】A61Q19/08GK103566409SQ201210262253
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】高廣田 申請人:高廣田