專利名稱：防止、去除、減少或破壞生物膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜生成的方法。
背景技術(shù)：
生物膜(biofilms)是產(chǎn)生并持續(xù)存在于含水環(huán)境中的生物或非生物性物體表面上的生物膜，它是微生物細(xì)胞吸附到所述固體表面上造成的。這種吸附使這些微生物具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兡軌蚍敝常軌颢@得更多樣的營(yíng)養(yǎng)物和氧條件，不被沖走，而且對(duì)抗微生物劑的敏感性降低。生物膜的形成還伴隨著外泌性(exo-)聚合物質(zhì)(多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì))的產(chǎn)生，其與細(xì)胞一道形成由充水的空間分隔的厚層的分化結(jié)構(gòu)。居留的微生物可以是單個(gè)物種的微生物細(xì)胞，或者是微生物細(xì)胞的混合群落，這些微生物細(xì)胞可包括好氧和厭氧的細(xì)胞，藻類、原生動(dòng)物，和真菌。因此，生物膜是活的微生物的復(fù)雜的集合，這些微生物被包埋在由居留的微生物分泌的一種或多種基質(zhì)聚合物所構(gòu)成的有機(jī)結(jié)構(gòu)中。生物膜可發(fā)展為厚達(dá)數(shù)毫米或厘米，并覆蓋廣大表面區(qū)域的宏觀結(jié)構(gòu)。這些形成物可能是管道系統(tǒng)中限制或完全阻斷流動(dòng)，熱交換器中減少熱傳遞，或在城市供水系統(tǒng)、食品加工、醫(yī)療設(shè)備(例如導(dǎo)管、整形外科設(shè)備、植入物、內(nèi)窺鏡)中造成病原性問(wèn)題的因素。另外，生物膜通過(guò)其包埋的微生物介導(dǎo)的腐蝕作用經(jīng)?？s短材料的壽命。在工業(yè)水處理系統(tǒng)、紙漿和紙生產(chǎn)過(guò)程、冷卻水系統(tǒng)、油回收用的注入井、冷卻塔、多孔介質(zhì)(砂和土壤)、海洋環(huán)境、空調(diào)系統(tǒng)，以及任何封閉的水再循環(huán)系統(tǒng)中，生物結(jié)垢(biological fouling)是嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)性問(wèn)題。在醫(yī)療科學(xué)和工業(yè)中，生物膜也是嚴(yán)重的問(wèn)題，其造成牙垢(dentalplaques)、感染(Costerton, 1999 等人,Science 284:1318-1322)，內(nèi)窺鏡和隱形眼鏡污染，假體裝置的定殖(colonisation)，及醫(yī)用植入物上生物膜的形成。常規(guī)上，去除或防止生物膜需要使用分散劑、表面活性劑、去污劑、酶制劑、抗微生物劑(anti-microbials)、殺生物劑(biocides)、煮沸(boil-out)方法,和/或腐蝕性化學(xué)品，例如堿。使用這些手段的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，在紙漿和造紙工業(yè)中，去除造紙機(jī)中的生物膜積聚常規(guī)上需要沉積物控制程序(deposit control program),包括合理的保養(yǎng)(houseke印ing)，以保持表面上沒有濺上的原料，對(duì)新鮮的水和添加物作抗微生物處理，使用殺生物劑減少機(jī)器上的微生物生長(zhǎng)，和按方案進(jìn)行煮沸以去除確實(shí)產(chǎn)生的沉積物。在生物膜中生長(zhǎng)的細(xì)菌對(duì)抗生素和消毒劑的抗性比浮游的細(xì)胞更強(qiáng)，而且該抗性隨著生物膜的年齡而增加。生物膜還對(duì)干燥、極端溫度或光顯示更高的物理抗性。如已提到的，生物膜的形成造成工業(yè)上、環(huán)境上和醫(yī)學(xué)上的問(wèn)題，而且在很多產(chǎn)業(yè)中，用化學(xué)品清除和消毒細(xì)菌生物膜是人們十分關(guān)心的問(wèn)題。另外，消毒和清潔組合物趨向變得更溫和，以減輕其環(huán)境影響，這樣可能使得對(duì)覆蓋生物膜的表面的清潔更加不足。本發(fā)明的目的是提供防止或去除表面上存在的生物膜的改進(jìn)的方法。


圖I顯示三種不同的α -淀粉酶對(duì)粗小麥淀粉的總水解的百分率(%)的比較。圖2是比較I) α-淀粉酶Α;2)單獨(dú)的去污劑；3) α -淀粉酶C的生物膜去除的色譜圖。發(fā)明概述 本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜的方法，包括使所述表面與來(lái)自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。術(shù)語(yǔ)“表面”在本文中定義為任何可能被生物膜覆蓋或傾向于形成生物膜的表面。表面的例子包括任何硬表面，例如金屬、塑料、橡膠、板、玻璃、木、紙、混凝土、巖石、大理石、石膏和陶瓷材料，這些材料可選地被包被，例如用油漆或瓷漆包被；任何軟表面，例如任何種類的纖維(例如紗線、織物、植物纖維、礦棉(rock wool)和毛)；或任何多孔表面；皮膚(人或動(dòng)物的)；角質(zhì)材料(例如甲(nails));和內(nèi)部器官(例如肺)。所述硬表面可以作為冷卻塔、水處理設(shè)備、水槽、乳品間(dairy)、食品加工設(shè)備、化學(xué)或制藥過(guò)程設(shè)備，或醫(yī)療裝置(例如導(dǎo)管、整形外科裝置、植入物)的部分存在。多孔表面可以存在于濾器，例如膜濾器中。術(shù)語(yǔ)“有效量”在本文中定義為足以降解由微生物所產(chǎn)生且包含α-1，4_葡糖苷鍵的生物膜的一種或多種α-淀粉酶的量。一種或多種α-淀粉酶的有效量依賴于包括下列的因素所述α-淀粉酶，目標(biāo)是否是防止、去除或減少表面上存在的生物膜，和用來(lái)例如降解微生物產(chǎn)生的生物膜的所希望的時(shí)間。一般而言，較高量/濃度的酶需要較短的處理時(shí)間，而較低量/濃度的酶需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間。另外，例如，在易于形成生物膜的表面上防止生物膜通常比從相應(yīng)的污染的表面上實(shí)際去除生物膜需要更低量/濃度的酶。但是，典型的有效使用水平是O. 005到500mg α -淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. Ol-IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液。術(shù)語(yǔ)“生物膜控制溶液”是指根據(jù)本發(fā)明用于防止、去除、減少或破壞表面上存在的生物膜的溶液。以下面實(shí)施例4給出的條件下的平均平板計(jì)數(shù)計(jì)，本發(fā)明的方法可使生物膜減少到IO-IO8分之一(10-108-fold)，優(yōu)選IO3-IO6分之一 O具體地，本發(fā)明涉及如下各項(xiàng)I. 一種防止、去除、減少或破壞表面上存在的生物膜的方法，包括使表面與源自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。2.項(xiàng)I的方法，其中所述α-淀粉酶源自芽孢桿菌屬的菌株，優(yōu)選來(lái)自芽孢桿菌屬菌種 NCIB12289，NCIB 12512，NCIB 12513 或 DSM 9375，或 DSMZ no. 12649，KSM AP1378，或KSM K36 或 KSM K38 的菌株。3.項(xiàng)2的方法，其中所述α -淀粉酶源自具有SEQ ID Ν0:2，4或6中所示序列的芽孢桿菌屬菌株，或者與SEQ ID Ν0:2，4或6具有60%同一性的α-淀粉酶。
4.項(xiàng)2或3的方法，其中所述芽孢桿菌屬α -淀粉酶在D183和/或G184位置(SEQ ID NO:2中)具有缺失。5.項(xiàng)3或4的方法，其中所述芽孢桿菌屬α -淀粉酶在N195F位置(SEQID NO: 2中)具有取代。6.項(xiàng)2-5中任一項(xiàng) 的方法，其中所述芽孢桿菌屬α -淀粉酶在D183+G184位置具有缺失，優(yōu)選其中所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶變體還具有一種或多種下列的取代R118K，N195F，R320K，R458K，特別是其中所述α -淀粉酶具有下面的突變?chǔ)?(D183+G184)+R118K+N195F+R320K+R458K(在 SEQ ID N0:2 中)。7.項(xiàng)I的方法，其中使被生物膜污染或易于產(chǎn)生生物膜的表面接觸I分鐘到2天。8.項(xiàng)I到7中任一項(xiàng)的方法，其中還存在表面活性劑。9.項(xiàng)I到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述α -淀粉酶在其N末端氨基酸區(qū)域中包含Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp ο10.項(xiàng)I到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述α -淀粉酶以O(shè). 005_500mg酶蛋白，優(yōu)選O. Ol-IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液的濃度使用。11.項(xiàng)I到10中任一項(xiàng)的方法，其中所述α -淀粉酶在40°C、3mg酶蛋白每g淀粉、pH 8. O下5小時(shí)后，具有高于15，優(yōu)選25，特別是35的水解淀粉百分率(%)。12.項(xiàng)I到11中任一項(xiàng)的方法，其中還存在其它的酶，這些酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化還原酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。13.項(xiàng)12的方法，其中所述果膠分解酶選自果膠反式消除酶(pectintranseliminase)、多聚半乳糖醒酸酶、果膠酯酶。14.項(xiàng)13的方法，其中所述纖維素酶是多組分纖維素酶制劑或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選腐質(zhì)霉屬(Humicola)內(nèi)切葡聚糖酶,特別是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選來(lái)自特異腐質(zhì)霉DSM 1800的EG I或EG V內(nèi)切葡聚糖酶或其變體或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選梭孢殼屬(Thielavia)內(nèi)切葡聚糖酶,優(yōu)選土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)內(nèi)切葡聚糖酶,或其變體。15.項(xiàng)12的方法，其中所述果膠分解酶是蛋白酶，優(yōu)選絲氨酸蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬菌株，例如遲緩芽孢桿菌或克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)，或其變體。16.項(xiàng)1-15中任一項(xiàng)的方法，其中還存在選自分散劑、表面活性劑、抗微生物劑和殺生物劑的一種或多種試劑。17.項(xiàng)1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面是硬、軟或多孔表面。18.項(xiàng)18的方法,其中所述表面是膜(membrane)。19.項(xiàng)1-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物膜去除是在10 — 70°C，優(yōu)選40_60°C的溫度下進(jìn)行的。20. α -淀粉酶在防止或去除表面的生物膜中的用途。21.項(xiàng)20的用途，其中所述α -淀粉酶是項(xiàng)1_19中任一項(xiàng)定義的α -淀粉酶。
22.項(xiàng)20或21的用途，其中使用項(xiàng)1_19中定義的其它酶和試劑。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生 物膜的改進(jìn)方法，包括使所述表面與如下定義的有效量的α-淀粉酶接觸。本發(fā)明的方法可以用來(lái)防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜形成。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這樣的方法可以在生物膜形成的不同階段使用。通過(guò)對(duì)表面使用有效量的α -淀粉酶，生物膜的防止和/或去除得到了改善，特別是當(dāng)生物膜中的某些微生物產(chǎn)生α-1，4連接的葡萄糖多糖，例如直鏈淀粉、支鏈淀粉、這兩種多糖的混合物(例如淀粉)、和糖原時(shí)。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種防止或去除表面上的生物膜的方法，包括使該表面與源自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌α-淀粉酶來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)。α -淀粉酶根據(jù)本發(fā)明所使用的α -淀粉酶來(lái)自細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)自芽孢桿菌屬菌種的菌株，特別是選自WO 00/60060中作為SEQ ID NO: 2公開的ΑΑ560 α -淀粉酶(本文的SEQ IDNO: 2)，美國(guó)專利申請(qǐng)10/877,847中公開的黃熱芽孢桿菌，WO 95/26397中公開的芽孢桿菌屬菌種的α -淀粉酶，來(lái)自芽孢桿菌屬菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513，DSM9375，DSMZ no. 12649, KSMAP1378 (W0 97/00324)，KSM K36 或 KSM K38 (EP1022334)的 α-淀粉酶，和 Tsukamoto 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications,151 (1988)，pp. 25-31 所公開的 #707 a -淀粉酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述α -淀粉酶是本文SEQ ID NO: 2的中所示的ΑΑ560 α -淀粉酶和/或本文SEQ ID NO: 4中所示的ΑΜΥ1048 α -淀粉酶，或與本文SEQ ID NO: 2或4所示的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的α -淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的α-淀粉酶是作為親本的本文中SEQID Ν0:2所公開的α-淀粉酶的變體，其在D183和/或G184位置具有缺失，優(yōu)選其中所述α-淀粉酶變體還含有在N195F位置或相應(yīng)的位置上具有取代，特別是其中親本α-淀粉酶在本文SEQ ID Ν0:2中具有一種或多種下列的缺失/取代Λ (R81-G182) ;Λ (D183-G184);Δ (D183-G184)+N195F ；R181Q+N445Q+K446N ； Δ (D183-G184)+R181Q，Δ (D183-G184)和一種或多種下列的取代R118K，N195F，R320K，R458K，特別是其中所述親本α -淀粉酶具有下列突變?chǔ)?(D183+G184) +Rl 18K+N195F+R320K+R458K(即，在本文的 SEQ ID Ν0:2 中)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:2中所示的ΑΑ560α-淀粉酶，或其變體，該變體還含有一種或多種下列的取代M9L，M202L, V214T，M323T, M382Y 或 M9L, M202L, V214T, M323T 和 E345R。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α -淀粉酶在40°C、3mg酶蛋白每g淀粉，pH8. O下5小時(shí)后的水解粗淀粉百分率(%)高于15，優(yōu)選25，特別是35 (見實(shí)施例2和圖I)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶在其N末端氨基酸區(qū)域中包含Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trpο這樣的α -淀粉酶的例子包括實(shí)施例2中使用的α -淀粉酶A和α -淀粉酶B。在一個(gè)實(shí)施方案中所述α -淀粉酶來(lái)自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的菌株，其序列如本文SEQ ID NO:6所示；或者是與本文SEQID N0:6所示的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的α -淀粉酶，優(yōu)選在對(duì)應(yīng)于Μ197位的位置上具有取代，優(yōu)選M197L，Τ，I，N，D，Q，Ε，P，W，特別是M197L或Τ?？缮藤?gòu)的α-淀粉酶產(chǎn)品或包含α-淀粉酶的產(chǎn)品包括以下列商品名出售的產(chǎn)品STAINZYME ，DURAMYL (Novozymes A/S,丹麥)，BIOAMYLASE D(G)，BIOAMYLASE L(Biocon India Ltd.)，KEMZYMtmAT 9000(Biozym Ges. m. b. H，奧地利)，PURASTAR ST,PURASTAR HPAmL, PURAFECT OxAm, RAPIDASE TEX (Genencorlnt. Inc，美國(guó))，KAM(ΚΑ0，日本)。
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在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在生成任何生物膜之前對(duì)易于產(chǎn)生生物膜的表面使用本發(fā)明的方法作為預(yù)防性手段，從而沒有生物膜生成?；蛘撸诔霈F(xiàn)生物膜生成的最初征象時(shí)，可以使用所述方法來(lái)防止進(jìn)一步的生成，并去除已經(jīng)沉積在表面上的生物膜。另外，在表面上積聚了大量生物膜的情況下，可以使用所述方法來(lái)降低生物膜的水平，或部分地或全部地去除它。生物膜可包含一種或兩種微生物的整體化的群落，或者主要包含某種特定的微生物(Palmer 和 White, 1997, Trends in Microbiology 5:435-440 ;Costerton 等人，1987,Annual Reviews of Microbiology 41:435-464 ;Mueller,1994,TAPPI Proceedings,1994Biological Sciences Symposium 195-201)。在本發(fā)明的方法中，所述一種或多種微生物可以是任何參與生物膜形成的微生物，包括但不限于，好氧細(xì)菌或厭氧細(xì)菌(革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性)、真菌(酵母或絲狀真菌)、藻類、和/或原生動(dòng)物。考慮到的細(xì)菌包括選自下列的細(xì)菌假單胞菌屬(Pseudomonas)的一些種，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa);維捏蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii);大腸桿菌(Escherichiacoli)；白喉棒桿菌(Corynebacterium diphteriae);肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum);鏈球菌屬(Streptococcus)的一些種；醋桿菌屬(Acetobacter);明串珠菌屬(Leuconostoc);貝塔桿菌屬(Betabacterium);肺炎球菌屬(Pneumococci);結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis);氣單胞菌屬(Aeromonas);伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderie);黃桿菌屬(Flavobacterium);沙門氏菌屬(Salmonella);葡萄球菌屬(Staphylococcus)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是好氧細(xì)菌。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是氣單胞菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是伯克霍爾德氏菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是黃桿菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是微桿菌屬(Microbacterium)菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是假單胞菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是沙門氏菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是葡萄球菌屬菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌是來(lái)自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(包括例如大腸桿菌)。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderie cepacia)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為蛾微桿菌(Microbacterium imperiale)或結(jié)核分枝桿菌。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為銅綠假單胞菌。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為熒光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述好氧細(xì)菌為腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述好氧細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述好氧細(xì)菌為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是厭氧細(xì)菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述厭氧細(xì)菌是脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)菌株。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述厭氧細(xì)菌是脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是真菌例如酵母或絲狀真菌。在另一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是假絲酵母(Candida)菌株。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母是白色假絲酵母(Candida albicans)。如上所述的，防止或去除生物膜的處理時(shí)間取決于α -淀粉酶的劑量、表面上的或所述區(qū)域傾向形成的生物膜的水平，但優(yōu)選地，所述處理時(shí)間應(yīng)該與用抗生素、殺生物齊U、殺菌劑(bactericides)、殺真菌劑(fungicides)、漂白劑(bleaching agents)、表面活性劑(surfactants)、腐蝕劑(caustic)合伙生物聚合物降解劑進(jìn)行常規(guī)處理所正常使用的時(shí)間相適應(yīng)。因此，α-淀粉酶的劑量可以根據(jù)常規(guī)處理中所用的時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)。但是，當(dāng)α-淀粉酶處理是加工中的單獨(dú)的步驟時(shí)，α -淀粉酶的劑量取決于完成處理所希望的時(shí)間。從α -淀粉酶活性方面來(lái)說(shuō)，防止或去除生物膜的合適的α _淀粉酶劑量表面上的或所述區(qū)域傾向形成的生物膜的量。技術(shù)人員可決定合適的α-淀粉酶單位劑量。該劑量可以表示為α-淀粉酶單位。α-淀粉酶單位可作為“KNU”測(cè)定，使用下面的“材料和方法”部分描述的測(cè)定方法。被生物膜污染的或易于產(chǎn)生生物膜的區(qū)域優(yōu)選以O(shè). 005到500mgα -淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. 01到IOOmg α -淀粉酶蛋白每升生物膜控制溶液的α -淀粉酶劑量處理I分鐘到2天，優(yōu)選10分鐘到I天，優(yōu)選I到15小時(shí)，更優(yōu)選少于10小時(shí)。所述α-淀粉酶可以是本發(fā)明的方法中要使用的組合物的部分。所述組合物可以是任何適于所述用途的形式，例如，干粉、聚結(jié)粉末(agglomerated powder),或顆粒(granulate),特別是非粉化(non-dusting)顆粒,液體,特別是穩(wěn)定化的液體,或被保護(hù)的α -淀粉酶。顆粒和聚結(jié)粉末可以用常規(guī)方法制備，例如通過(guò)在流化床制粒機(jī)中將α -淀粉酶噴霧到載體上。所述載體可由具有合適粒度的顆粒物核心(particulate core)組成。載體可以是可溶的或不可溶的，例如，鹽(例如氯化鈉或硫酸鈉)，糖(例如蔗糖或乳糖)，糖醇(例如山梨糖醇)，或淀粉。α-淀粉酶可包含于緩釋制劑中。制備緩釋制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。液體α -淀粉酶制備可以，例如，根據(jù)已建立的方法，通過(guò)加入營(yíng)養(yǎng)上可接受的穩(wěn)定劑諸如糖、糖醇或另一多元醇，和/或乳酸或另一有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定化。
該組合物還可添加一種或多種防止或去除生物膜生成的藥劑。這些藥劑可包括，但不限于，分散劑、表面活性劑、去污劑、其它的酶，抗微生物劑，和殺生物劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥劑是表面活性劑。所述表面活性劑可以是非離子型包括半極性和/或陰離子型和/或兩性離子型的表面活性劑。所考慮的陰離子表面活性劑包括線性苯磺酸烷基酯、α -烯屬磺酸酯、硫酸烷基酯(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、二級(jí)鏈烷磺酸鹽、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。所考慮的非離子表面活性劑包括脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺(“葡萄糖胺”(“glucamides”))的N-?；鵑-烷基衍生物。表面活性劑的可以以所述酶生物膜去除組合物的重量的O. 1%到60%的水平存在。 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面活性劑是十二烷基硫酸鈉、季銨化合物、溴化烷基批聢錆(alkyl pyridinium iodides), Tween 80, Tween, 85, Triton X-100, Brij 56,生物表面活性劑、鼠李糖脂、表面活性蛋白、visconsin或磺酸鹽或酯(sulfonates)。生物膜的形成還伴隨產(chǎn)生外泌性聚合物質(zhì)(多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì))，其與細(xì)胞一道形成由充水的空間分隔的厚層的分化結(jié)構(gòu)(McEldowney和Fletcher,1986, Journal of General Microbiology 132:513-523 !Sutherland, SurfaceCarbohydrates of the Prokaryotic Cell, Academic Press, New York,1977,pp.27-96)。在本發(fā)明的方法中，所述α-淀粉酶組合物可以還包含一種或多種能夠降解所述外泌性聚合物質(zhì)例如多糖、聚糖醛酸、藻酸鹽、糖蛋白和蛋白質(zhì)的其它的酶。其它的酶活件在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述一種或多種其它的酶可選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、氧化酶，包括糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。所述其它的酶可根據(jù)要去除的特定生物膜的性質(zhì)來(lái)選擇，或者可以選擇具有不同酶活性的數(shù)種酶的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶選自l，2-l，3_a-D-甘露聚糖甘露糖水解酶(1，2-1，3-alpha-D-mannan mannohydrolase),1，3-β -D-木聚糖木聚糖水解酶(I, 3-beta-D-xylan xylanohydrolase), 1，3_β -D-葡聚糖葡聚糖水解酶(I, 3-beta-D-glucan glucanohydrolase), I, 3 (I, 3; I, 4) - a -D-葡聚糖 3_ 葡聚糖水解酶(I, 3(1,3; I, 4) -alpha-D-glucan 3-glucanohydrolase), I, 3 (I, 3; I, 4) - β -D-葡聚糖 3 (4)-葡聚糖水解酶(I, 3(1,3; I, 4) -beta-D-glucan 3 (4) -glucanohydrolase)，I, 3-1, 4- a -D-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(1，3-1, 4-alpha-D-glucan4-glucanohydrolase),I, 4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan glucanehydrolase), I, 4- a -D-葡聚糖葡萄糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan glucohydrolase), I, 4-(1, 3:1, 4)-β -D-葡聚糖 4_ 葡聚糖水解酶(1，4_(1，3:1，4)-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase),1，4- β -D-葡聚糖葡萄糖水解酶(1，4-beta-D-glucan glucohydrolase)，1，4_ β -D-木聚糖木聚糖水解酶(1，4-beta-D-xylan xylanohydrolase)，1，4_β-D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶(1，4-beta-D-mannan mannanohydrolase)，1，5_ a -L-阿聚糖 1，5_ a -L-阿聚糖水角軍酶(1，5-alpha-L-arabinan 1，5-alpha-L_arabinanohydrolase)，1，4_a -D-葡聚糖麥芽糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan maltohydrolase)，1，6_ a -D-葡聚糖 6_ 葡聚糖水解酶(1，6-alpha-D-glucan 6-glucanohydrolase)，2，6_ β -D-果聚糖果聚糖水解酶(2，6-beta-D-fructan fructanohydrolase)，ct -糊精 6_ 葡聚糖水解酶(alpha-Dextrin6-glucanohydrolase)，a -D-半乳糖音半乳糖水解酶(alpha-D-galactosidegalactohydrolase), ct-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(alpha-D-glucoside glucohydrolase),a -D-甘露糖音甘露糖水解酶(alpha-D-mannoside mannohydrolase)，酸基神經(jīng)氨酰水解酶(acylneuraminyl hydrolase)，氣桿菌(Aerobacter)-莢膜多糖半乳糖水解酶(Aerobacter-capsular-polysaccharide galactohydrolase)， β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶(beta-D-fructofuranoside fructohydrolase)，β -D-巖藻糖苷巖藻糖水解酶(beta-D-fucoside fucohydrolase)，β -D-果聚糖果糖水解酶
(beta-D-fructan fructohydrolase)，β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶(beta-D-galactosidegalactohydrolase)，β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)，β -D-葡糖醒酸苷葡糖醒酸苷水解酶(beta-D-glucuronoside glucuronosohydrolase)，β -D-甘露糖音甘露糖水解酶(beta-D-mannoside mannohydrolase)， β -N-乙酰O-氨基己糖苷N-乙酰己糖胺水解酶(beta-N-acetyl-D-hexosaminideN-acetylhexosamino hydrolase，)，硫酸纖維素橫基水解酶(cellulose-sulfatesulfohydrolase)，膠原酶(collagenase)，糊精 6- a -D-葡聚糖水解酶(dextrin6-alpha-D-glucanohydrolase)，糖蛋白-磷脂酰肌醇磷脂酰水解酶(glycoprotein-phosphatidyl inositol phosphatidohydrolase)，透明質(zhì)酸 4_ 聚糖水解酶(hyaluronate4-glycanohydrolase)，透明質(zhì)酸葡糖醒酸糖苷酶(hyaluronoglucuronidase)，果膠果膠酰水解酶(pectin pectylhydrolase)，肽聚糖N-乙酰胞壁酰水解酶(peptidoglycanN-acetylmuramoylhydroIase)，憐脂酉先膽減 2_ 酸基水解酶(phosphatidylcholine2-acylhydrolase),磷脂酰膽堿 I-?；饷?phosphatidylcholine1-acylhydrolase)，聚(1，4_ a-D-半乳糖醒酸苷)半乳糖醒酸水解酶(poly (1，4_alpha-D-galacturonide)，聚(1，4-(N-乙酰 _β -D-氨基葡糖苷))_ 聚糖水解酶 poly (1，4_(N-acetyl-beta-D-glucosaminide)) -glycanohydrolase),鹿糖 α-葡糖苷酶(sucrosealpha-glucosidase)，三酸基甘油酸基水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，和三酉先基甘油蛋白酉先基水解酶(triacylglycerol protein-acylhydrolase)。蛋白水解酶(proteolytic enzyme)所述其它酶可以是任何在實(shí)際過(guò)程條件下具有蛋白水解活性的酶。因此，所述酶可以是植物來(lái)源的蛋白水解酶，例如木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶，或動(dòng)物來(lái)源的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，或微生物來(lái)源，即細(xì)菌、酵母或絲狀真菌來(lái)源的蛋白水解酶。應(yīng)當(dāng)理解，多種蛋白水解酶中的任何混合物都可適用于本發(fā)明的過(guò)程。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述其它酶是蛋白水解酶，例如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶。
絲氨酸蛋白酶的一個(gè)亞類通常被稱為枯草蛋白酶(subtilisins)?？莶莸鞍酌甘歉锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)測(cè)定了多種枯草蛋白酶的氨基酸序列，包括至少6種來(lái)自芽孢桿菌屬菌株的枯草蛋白酶，即枯草蛋白酶168，枯草蛋白酶BPN,枯草蛋白酶Carlsberg,枯草蛋白酶DY,枯草蛋白酶amylosacchariticus,和mesentericopeptidase, 一種來(lái)自放線菌目(actinomycetales)的枯草蛋白酶，來(lái)自普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)的thermitase,和一種真菌枯草蛋白酶，來(lái)自Tritirachium album的蛋白酶K。Subtilases是更新近被承認(rèn)的枯草蛋白酶的另一亞類。Subtilases被描述為高度堿性的枯草蛋白酶，包括例如枯草蛋白酶PB92 ( ΜΛΧΛ(:'Λ ./ ,Gist-Brocades NV)，枯草蛋白酶 309 ( S AV IN AS E'*, Novozymes A/S)，和枯草蛋白酶147 ( ESPERASE⑩，Novozymes A/S)。“枯草蛋白酶變體或突變的枯草蛋白酶蛋白酶”在本文中定義為由表達(dá)來(lái)自親本微生物的突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草蛋白酶，所述親本微生物具有原基因或稱親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)的親本酶，所述親本基因已經(jīng)被突變以產(chǎn)生突變基因，該突變基因在合適的宿主中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生所述突變的枯草蛋白酶蛋白酶。這些被提到的枯草蛋白酶和其變體構(gòu)成在本發(fā)明的方法中有用的優(yōu)選蛋白酶類群。有用的枯草蛋白酶變體的例子有枯草蛋白酶 309變體(SAV1NASE )，其中在195位上甘氨酸被取代為苯丙氨酸(G195F或195Gly到195Phe)。本發(fā)明的方法中可使用可商購(gòu)的蛋白酶。這樣的商品化蛋白酶的例子有ALCALASE (地衣芽孢桿菌菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，ESPERASE1 (芽孢桿菌屬的嗜堿性菌種深層發(fā)酵生產(chǎn)的),RENNILASE* (Mucor miehei的非病原性菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)-SAVINASE*'(遺傳修飾的芽孢桿菌屬菌株深層發(fā)酵生產(chǎn)的)，例如在公開的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 92/19729中披露的變體，以及DURAZYM* (SAV1NASE*的蛋白質(zhì)工程變體)，POLARZYME ，和EVERLASE 。上述所有的商品化蛋白酶都可以從Novozymes A/S,DK-2880 Bagsvcerd,丹麥獲得。其它優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶有來(lái)自曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬例如嗜堿芽抱桿菌(Bacillus alcalophilus)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、Bacillusvulgatus、蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoide)和根霉屬(Rhizopus)的蛋白酶,和來(lái)自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，特別是來(lái)自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)菌種,例如Nocardiopsis natto和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)(參見WO 88/03947),特別是來(lái)自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶。其它優(yōu)選的蛋白酶有來(lái)自國(guó)際專利申請(qǐng)PCT / DK89/00002和WO 91/00345中公開的芽孢桿菌屬枯草蛋白酶的突變體的絲氨酸蛋白酶，和EP 415 296中公開的蛋白酶。另一類優(yōu)選的蛋白酶是微生物來(lái)源的金屬蛋白酶。本發(fā)明中可以使用常規(guī)的發(fā)酵的商品化金屬蛋白酶，例如ΝΙΛ. KASLr (Zn)(由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
的菌株深層發(fā)酵生產(chǎn))，可獲自 Novozymes A/s,DK-2880 Bagsvaerd,丹麥;.BACTOSOL WO 和 BACTOSOL SI，可獲自 Sandoz AG, Basle,瑞士 ; TOYOZYME·,可獲自 ToyoBoseki Co. Ltd.，日本;^PR0TE1NASE K (由芽孢桿菌屬菌種KSM-K16的菌株深層發(fā)酵生產(chǎn))，可獲自Kao Corporation Ltd.,日本。
該蛋白酶可以O(shè). 005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. 01到IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。脂肪酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是脂肪酶，特別是微生物脂肪酶。就此而言，所述脂肪酶可選自酵母，例如假絲酵母；細(xì)菌，例如假單胞菌或芽孢桿菌；或絲狀真菌，例如腐質(zhì)霉屬(Humicola)或根毛霉屬(Rhizomucor)。更具體地，合適的脂肪酶可以是Rhizomucor miehei脂肪酶(例如，如EP 238 023描述地制備的)，Thermomyceslanuginosa脂肪酶,例如按EP 305 216的描述制備的，特異腐質(zhì)霉脂肪酶,施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)脂肪酶，洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)月旨肪酶、Candida antarctica 脂肪酶 A 或 B,或來(lái)自 rGPL, Absidia blakesleena,傘枝犁頭霉(Absidia corymb if era)，爺病鍵抱(Fusarium solani)，尖抱鍵抱(Fusarium oxysporum)，圓弧青霉(Penicillum cyclopium),皮落青霉(Penicillum crustosum),擴(kuò)展青霉(Penicillum expansum), Rhodotorula glutinis, Thiarosporella phaseolina,小抱根霉(Rhizopus microsporus), Sporobolomyces shibatanus,出芽短柄霉(Aureobasidium·pullulans),異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala), Geotricum penicillatum,彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),熱殺索絲菌(Brochothrix thermosohata),Coprinus cinerius, Trichoderma harzanium, Trichoderma reesei,日本根霉(Rhizopusjaponicus),或植物假單胞菌(Pseudomonas pIantari)的脂肪酶。其它合適的脂肪酶的例子可以是上面提到的任何一種脂肪酶的變體，例如W092/05249或WO 93/11254中描述的。可商購(gòu)的脂肪酶的例子包括LIP0LASE ，LIPOLASEULTRA , LIPOPRIME ,和LIPEX ,來(lái)自 Novozymes,丹麥。所述脂肪酶可以使用的劑量為O. 005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. Ol-IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液。纖維素酶在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是纖維素酶(cellulase)或纖維素水解酶(cellulolytic enzyme)，其指催化纖維素降解為葡萄糖、纖維二糖、三糖和其它纖維寡糖(cellooligosaccharides)的酶。優(yōu)選地，所述纖維素酶是內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase),更優(yōu)選微生物內(nèi)切葡聚糖酶，特別是細(xì)菌或真菌內(nèi)切葡聚糖酶。細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的例子有從選自假單胞菌屬的細(xì)菌或燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)得到的或可由其產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶。纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶可以是酸性、中性或堿性的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，即，分別在酸性、中性或堿性的PH范圍表現(xiàn)最大的纖維素水解活性。因此，有用的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選真菌酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選在酸性條件下具有顯著的纖維素水解活性的真菌酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述酶是從選自木霉屬(Trichoderma)、放線菌屬(Actinomyces)、漆斑菌屬(Myrothecium)、曲霉屬和葡萄孢屬(Botrytis)的真菌得到或可由其產(chǎn)生的。優(yōu)選的酸性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是從由黑曲霉(Aspergillus niger),米曲霉(Aspergillus oryzae)、灰色葡萄抱(Botrytis cinerea),撫抱漆斑菌(Myrotheciumverrucaria),長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)，里氏木霉(Trichodermareesei)，和綠色木霉(Trichoderma viride)構(gòu)成的組得到的。另一種有用的纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶是中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選真菌中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選在中性或堿性條件下具有顯著的纖維素水解活性的真菌中性或堿性纖維素酶或內(nèi)切葡聚糖酶，其中所述酶從選自支頂抱屬(Acremonium)、曲霉屬、毛殼霉屬(Chaetomium)、頭抱屬(Cephalosporium)、鐮孢屬(Fusarium)、膠霉屬(Gliocladium)、腐質(zhì)霉屬、把菌屬(Irpex)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、撫孢霉屬(Mycogone)，漆斑菌屬，絲葚霉屬(Papulospora)，青霉屬(Penicillium)，帚霉屬(Scopulariopsis)，葡萄穗霉屬(Stachybotryvs)，和輪枝孢屬(Verticillium)的真菌獲得或可由其產(chǎn)生。優(yōu)選的堿性纖維素酶或葡聚糖酶是從頭孢屬的菌種、尖孢鐮孢，特異腐質(zhì)霉，或 Myceliopthora thermophila，或優(yōu)選從頭抱屬菌種 RYM-202，F(xiàn)usarium oxysporum, DSM2672，特異腐質(zhì)霉，DSM 1800，或 Myceliopthora thermophila, CBS 117. 65 獲得的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它酶是木聚糖酶，例如內(nèi)切1，3-β-木糖苷酶(endo-1，3_ β-xylosidase) (EC 3.2.1.32)，木聚糖 1，4_β_ 木糖苷酶(xylanl，4_ β-xylosidase) (EC 3.2.1.37)，和 a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase) (EC 3. 2. I. 55)。優(yōu)選地，所述木聚糖酶選自 Aspergillusaculeatus (一種表現(xiàn)木聚糖酶活性的酶，該酶與針對(duì)來(lái)自Aspergillus aculeatusCBS 101.43的純化的木聚糖酶的抗體有免疫反應(yīng)性，參見例如WO 94 / 21785);米曲霉(參見例如SU 4610007);出芽短柄霉(參見例如EP O 373 107 A2);環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) (WO 91/18978);短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)(參見例如 WO 92/03540);嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)(參見例如 WO91/18976，WO 91/10724);芽孢桿菌屬菌種AC13 (特別是NCMB40482菌株，參見例如WO94/01532);特異腐質(zhì)霉(參見例如WO 92/17573);紅嗜熱鹽菌屬(Rhodothennus)(參見例如 WO 93/08275);淺青紫鏈霉菌(Streptomyces Iividans)(參見例如 WO 93/03155)；綠抱鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)(參見例如EP 496 671 A);地衣芽抱桿菌(參見例如JP 9213868);橙色熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)(參見例如美國(guó)專利4，966，850) ；Trichoderma Iongibrachiatum和 Chainia屬的菌種(參見例如EP O 353 342Al) ；Trichoderma harzianum and Trichoderma reseei (參見例如美國(guó)專利 4，725，544)；Thermomyces Ianuginosus (參見例如 EP O 456 033 A2);褐色熱單胞(Thermomonosporafusca)(參見例如EP O 473 545 A2) ；Trichoderma Iongibrachiatum(參見W. J. J. van denTweel 等編，Stability of Enzymes, Proceedings of an International Symposium heldin Maastrich, The Netherlands，1992. 11. 22-25，F(xiàn)isk，R. S.和 Simpson，pp. 323-328);網(wǎng)球菌屬(Dictyoglomus)(參見例如WO 92/18612);鏈霉菌屬(Streptomyces)(參見例如美國(guó)專利5，116，746);和/或棲熱袍菌屬(Thennotoga)(參見例如WO 93/19171)。其它合適的木聚糖酶的例子有上述任一種酶具有木聚糖水解活性的變體(衍生物或同源物)?？缮藤?gòu)的含纖維素酶產(chǎn)品的例子包括N0V0ZYM 342，CELLUZYME ，CAREZYME ，REN0ZYME (都來(lái)自 Novozymes，丹麥)。該纖維素酶可以O(shè). 005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. 01到IOOmg
酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。
果膠酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其它的酶是果膠酶，例如多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase) (EC 3. 2. I. 15)、果膠酯酶(pectinesterase) (EC 3. 2. I. 11)，或膠質(zhì)裂合酶(pectin lyase) (EC4. 2. 2. 10)。果膠酶的合適的來(lái)源生物可以是黑曲霉。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶組合物中的其它酶包括由真菌棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),優(yōu)選棘孢曲霉，CBS 101. 43所產(chǎn)生的水解性酶的組合物。已知該菌株產(chǎn)生包含果膠分解(pectinolytic)和多種半纖維素分解(hemicellulolytic)酶活性。可商購(gòu)的含果膠酶的產(chǎn)品的例子包括BioPrep ，SC0URZYME 和PECTAWASH (Novozymes,丹麥)。該果膠酶可以0. 005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選0. 01到IOOmg酶 蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。氣化i不原酶在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶與氧化還原酶，例如氧化酶、過(guò)氧化物酶或漆酶組合。a)漆酶作用于分子氧，產(chǎn)生水(H2O)，而不需任何過(guò)氧化物(例如H2O2)，b)氧化酶作用于分子氧，產(chǎn)生過(guò)氧化物(H2O2),c)過(guò)氧化物酶作用于過(guò)氧化物(例如H2O2)，產(chǎn)生水(H2O)。漆酶(E. C. I. 10. 3. 2)的例子包括來(lái)自多孔菌屬(Polyporus)菌種的菌株，特別是Polyporus pinsitus或變色多孔菌(Polyporus versicolor)的菌株，或毀絲霉屬菌種的菌株，特別是M. thermophila, Scytalidium屬菌種的菌株，特別是S. thermophilium,絲核菌(Rhizoctonia)屬菌種的菌株，特別是Rhizoctonia praticola或爺屬絲核菌(Rhizoctoniasolani),或Rhus屬菌種的菌株，特別是Rhus Vernicifera0所述漆酶還可以來(lái)自真菌例如金錢菌屬(Collybia),層孔菌屬(Fomes),香燕屬(Lentinus),灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus),曲霉屬，脈孢霉屬(Neurospora), Podospora 屬,射脈菌屬(Phlebia),例如輻射射脈菌(P. radiata) (W0 92/01046)，革蓋菌屬(Coriolus)的菌種，例如毛革蓋菌(C. hirsitus) (JP2-238885)，或葡萄孢屬。在具體考慮的實(shí)施方案中，所述漆酶可以選自WO 96/00290中描述的PolyporusP ini situs 漆酶(也稱為 Trametes vi I Iosa 漆酶)，WO 95/33836 中描述的 Myceliophthorathermophila 漆酶，WO 95/33837 中描述的 Scytalidiumthermophilium 漆酶，可從 SIGMA購(gòu)買的商品名為SIGMA no. L5510的Pyricularia oryzae漆酶，WO 96/06930中描述的Coprinus cinereus漆酶,及WO 95/07988中描述的爺屬絲核菌漆酶。過(guò)氧化物酶(I. 11. I. 7)的例子包括來(lái)自植物的過(guò)氧化物酶(例如辣根過(guò)氧化物酶)或來(lái)自微生物的過(guò)氧化物酶，包括真菌和細(xì)菌，例如Coprinus屬菌種,諸如Coprinuscinereus或Coprinus macrorhizus的菌株，或細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬，諸如短小芽孢桿菌。在特別考慮的實(shí)施方案中，所述過(guò)氧化物酶可選自WO 95/10602中公開的Coprinus cinereus IF08371過(guò)氧化物酶或其變體，以及來(lái)源于W097/04102中描述的Curvularia verruculosa CBS 147. 63 菌株的齒素過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)?？紤]到的氧化酶特別包括糖氧化酶(carbohydrate oxidases),這些酶被歸類為EC I. I. 3。糖氧化酶包括葡萄糖氧化酶(E. C. I. I. 3. 4)，己糖氧化酶(E. C. I. I. 3. 5)，木糖醇氧化酶，半乳糖氧化酶(E. C. I. I. 3. 9)，吡喃糖氧化酶(E. C. I. I. 3. 10)，醇氧化酶(E. C. I. I. 3. 13)。糖氧化酶可來(lái)自任何來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母或哺乳動(dòng)物來(lái)源。葡萄糖氧化酶的例子包括來(lái)自曲霉屬的菌種，例如黑曲霉的菌株，或來(lái)自Cladosporium 屬的菌種，尤其是 Cladosporium oxysporum,特別是 W095/29996 中描述的Cl. oxysporum CBS 163的葡萄糖氧化酶。己糖氧化酶的例子包括由紅色海藻Chondrus crispus (通常稱為角叉菜(Irishmoss)產(chǎn)生的己糖氧化酶(Sullivan 和 Ikawa, (1973)，Biochim. Biophys. Acts, 309,p. 11-22 ；Ikawa, (1982), Meth. in Enzymol.89, carbohydrate metabolism part D,145-149),其氧化廣譜的糖類，以及產(chǎn)生容易提取的己糖氧化酶的紅色海藻IridophycusfIaccidum所產(chǎn)生的己糖氧化酶,其氧化數(shù)種不同的單糖和雙糖(Bean和Hassid, (1956),J. Biol. Chem, 218, p. 425 ；Rand 等，(1972)，J. of Food Science 37，p. 698-710)。 該氧化還原酶可以0. 005到500mg酶蛋白每升生物膜控制溶液，優(yōu)選O. OI到IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液的劑量使用。本發(fā)明的最后一方面涉及使用芽孢桿菌α-淀粉酶來(lái)防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜生成物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶，優(yōu)選上面的“ α -淀粉酶”部分提到的α -淀粉酶。下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，它們不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。材料和方法作為緩沖劑和試劑使用的化學(xué)品都是商品化的產(chǎn)品，至少為試劑級(jí)。SI α-淀粉酶-A是作為親本的WO 00/60060的SEQ ID NO: 2所描述的芽孢桿菌屬菌種的α-淀粉酶的變體。所述α-淀粉酶的氨基酸序列具有下面6個(gè)氨基酸缺失/取代D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K。該變體在WO 01/66712也有公開。該堿性α -淀粉酶以批號(hào)03AGE014-4生產(chǎn)。α-淀粉酶B來(lái)自黃熱芽孢桿菌菌株，并在SEQ ID NO: 4中公開。α-淀粉酶C來(lái)自地衣芽孢桿菌菌株，并在WO 99/19467的SEQ ID NO: 6中顯示。蛋白酶E是克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)(舊名遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)C360=NCIB 10309)的一種枯草蛋白酶，具有取代M222S，并被EP專利396，608-B1所覆蓋(可從Novozymes,丹麥索取)。脂肪酶A是源自疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)菌株DSM 4109的脂肪酶變體，其具有下列突變T231R，N233R，公開于美國(guó)專利6，939，702-B (可從Novozymes索取)。纖維素酶A是來(lái)自特異腐質(zhì)霉的多組分纖維素酶(可從Novozymes索取)。細(xì)菌菌株得自ATCC 10774的枯草芽孢桿菌
大腸桿菌 ATCC#11229 和 ATCC#25922生物膜培養(yǎng)基根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)制備胰胨豆胨肉湯(Tryptic Soy Broth, TSB,購(gòu)自VWR，P / N DF0370-07)培養(yǎng)基，再用水稀釋到5%。每升加入2ml微量元素。瓊脂根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)使用胰胨豆胨瓊脂(Tryptic Soy Agar, TSA,購(gòu)自VWR, P /N DF0369-17)。
微量元素溶液每升1.5g CaCl2,1. Og FeSO4 ·7Η20，0· 35g MnSO4. 2Η20，0· 5g NaMoO4不鎊鋼試片(coupons)不鎊鋼試片No. 304 自 Metal Samples Company (Munford，AL)獲得。BioLC離子色譜系統(tǒng)該IC系統(tǒng)由下列組件構(gòu)成GP50 梯度泵(P/N059493)ED50A 電化學(xué)檢測(cè)器(P / N 059499)AS50溫控自動(dòng)進(jìn)樣器(P / N 056565)用于積分電流檢測(cè)(Integrated Amperometry)的電化學(xué)檢測(cè)池(Electrochemical Cell),備全了金電極和 Ag / AgCl 參比電極(P / N 060386)Chromelion 數(shù)據(jù)控制軟件 CHM-I-IC (P/N060930)CDC 生物膜反應(yīng)器購(gòu)自 Biosurface Technologies, Inc. (P/NCBR 90-2),備全了聚碳酸鹽試片(每個(gè)反應(yīng)器24個(gè)，P / N RD 128-PC)。去污劑清潔基料(DetergentCleaner Base),得自 Weiman Products (IL,美國(guó))，品名為Burnishine ME —多酶去污劑。在使用前通過(guò)微波爐高檔位(high setting)加熱I分鐘來(lái)使酶變性。方法:α-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測(cè)定淀粉水解活性。該方法基于酶降解變性的(modified)馬鈴薯淀粉,通過(guò)將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合來(lái)追蹤該反應(yīng)。開始，生成藍(lán)黑色，但在淀粉降解的過(guò)程中藍(lán)色變?nèi)酰⒅饾u變成紅棕色，將其與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)比較。I千Novo α -淀粉酶單位(KNU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(S卩37° C+/-0. 05 ；0. 0003ΜCa2+;ρΗ 5. 6)糊精化(dextrinize) 5260mg 的 Merck Amylum solubile 淀粉干物質(zhì)的酶量。更詳細(xì)地描述這種分析方法的小冊(cè)子EB-SM-0009. 02/01可從Novozymes A/S,丹麥索取，在此將該小冊(cè)子并入本文作為參考。兩個(gè)序列之間的同一性程度的確定為了本發(fā)明的目的，可以通過(guò)Clustal 方法(Higgins, 1989, CABIOS 5:151-153)確定兩個(gè)氨基酸序列間的同一性程度，其中上述方法使用的是LASERGENE MEGALIGN 軟件(DNASTAR，Inc. ,Madison, WI)，該軟件帶有同一性列表以及以下多個(gè)比對(duì)參數(shù)空位罰分(gap penalty) 10,空位長(zhǎng)度罰分(gap length penalty) IO0配對(duì)比對(duì)參數(shù)如下Ktuple=I,空位罰分=3, windows=5, diagonals=5。
實(shí)施例
實(shí)施例I使用α -淀粉酶A和α -淀粉酶C去除生物膜生物膜反應(yīng)器由400ml燒杯、磁力攪拌器和2個(gè)不銹鋼試片(coupon)組成。將試片垂直地用膠帶固定(taped)在燒杯的壁上，并使試片的底邊落在燒杯的底上。加入攪拌子，用圓形鋁箔覆蓋燒杯并高壓蒸汽滅菌。向每個(gè)燒杯中加入200ml無(wú)菌的生物膜培養(yǎng)基。為了培養(yǎng)接種物，將每種細(xì)菌菌株(來(lái)自枯草芽孢桿菌)在平板計(jì)數(shù)瓊脂(Plate countagar)上28°C培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌的拭子將每種菌株懸浮在無(wú)菌水中至OD686為O. 100,然后進(jìn)一步稀釋至10'每個(gè)測(cè)試由4個(gè)沒有酶的對(duì)照燒杯、2個(gè)具有50mg酶蛋白每升溶液的燒杯，和2個(gè)具有IOOmg酶蛋白每升溶液的燒杯組成。首先在37°C攪拌下將燒杯溫育過(guò)夜以在不銹鋼試片上生長(zhǎng)生物膜。該溫育步驟后，以上述的2種劑量按照下表加入酶，在40°C下再溫育2小時(shí)。然后，用無(wú)菌水小心地洗滌每個(gè)燒杯和不銹鋼試片，用結(jié)晶紫染色，用無(wú)菌水清洗，用乙酸溶解殘余的生物膜，然后用分光光度計(jì)在600nm下測(cè)量等份的每種溶液的吸光度。所測(cè)得的這些溶液的吸光度直接地指示不銹鋼試片上殘余的生物膜的量。低的吸光度對(duì)應(yīng)于酶的效用良好，幾乎沒有生物膜殘余；高的吸光度對(duì)應(yīng)于酶的效用差(或沒有)，有顯著的生物膜殘余。
權(quán)利要求
1.一種防止、去除、減少或破壞表面上存在的生物膜的方法，包括使表面與具有SEQ IDN0:6所示序列的α-淀粉酶或與SEQ ID NO:6具有至少80%同一性的α-淀粉酶接觸。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述α-淀粉酶來(lái)源于芽孢桿菌屬菌株。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述α-淀粉酶在Μ197位置具有取代，優(yōu)選M197L，Τ，I，N，D，Q，Ε，P，W,更優(yōu)選 M197L 或 Τ。
4.權(quán)利要求I到3中任一項(xiàng)的方法，其中使被生物膜污染或易于產(chǎn)生生物膜的表面接觸I分鐘到2天。
5.權(quán)利要求I到4中任一項(xiàng)的方法，其中還存在表面活性劑。
6.權(quán)利要求I到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-淀粉酶以O(shè). 005-500mg酶蛋白，優(yōu)選O.Ol-IOOmg酶蛋白每升生物膜控制溶液的濃度使用。
7.權(quán)利要求I到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述α-淀粉酶在40°C、3mg酶蛋白每g淀粉、pH 8. O下5小時(shí)后，具有高于15，優(yōu)選25，特別是35的水解淀粉百分率(%)。
8.權(quán)利要求I到7中任一項(xiàng)的方法，其中還存在其它的酶，這些酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化還原酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述果膠分解酶選自果膠反式消除酶(pectintranseliminase)、多聚半乳糖醒酸酶、果膠酯酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述纖維素酶是多組分纖維素酶制劑或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選腐質(zhì)霉屬(Humicola)內(nèi)切葡聚糖酶,特別是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)切葡聚糖酶，更優(yōu)選來(lái)自特異腐質(zhì)霉DSM 1800的EG I或EG V內(nèi)切葡聚糖酶或其變體或內(nèi)切葡聚糖酶，優(yōu)選梭孢殼屬(Thielavia)內(nèi)切葡聚糖酶,優(yōu)選土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)內(nèi)切葡聚糖酶,或其變體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述蛋白水解酶是蛋白酶，優(yōu)選絲氨酸蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬菌株，例如遲緩芽孢桿菌或克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)，或其變體。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中還存在選自分散劑、表面活性劑、抗微生物劑和殺生物劑的一種或多種試劑。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面是硬、軟或多孔表面。
14.權(quán)利要求13的方法,其中所述表面是膜(membrane)。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物膜去除是在10-70°C的溫度下進(jìn)行的，優(yōu)選40-60°C的溫度。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的α-淀粉酶在防止或去除表面的生物膜中的用途。
17.權(quán)利要求16的用途，其中使用權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的其它酶和/或試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及防止、去除、減少或破壞生物膜的方法，具體的涉及防止、去除、減少或破壞表面上的生物膜的方法，包括使所述表面與來(lái)自細(xì)菌的α-淀粉酶接觸。
文檔編號(hào)C11D3/386GK102919273SQ20121035647
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者蘭迪.戴因哈默, 卡斯滕.安德森 申請(qǐng)人:諾維信北美公司, 諾維信公司