連翹提取物在制備具有抗uva輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了連翹提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用，本發(fā)明中的連翹提取物具有抗UVA輻射作用，能顯著降低UV輻射引起的細(xì)胞損傷，同時對巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)具有明顯的抑制作用，可發(fā)揮抗炎抗衰老作用；本發(fā)明還從細(xì)胞和分子水平闡明了連翹提取物具有抗UV輻射和抗衰老作用。另外，本發(fā)明還公開了上述具有抗輻射和抗衰老功效的連翹提取物的一種優(yōu)選的制備方法。
【專利說明】連翹提取物在制備具有抗UVA輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于連翹【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及連翹提取物在制備具有抗UVA輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]近年來，來源于植物的活性成分已越來越多的用于以藥物、治療和美容等為目的的組合物仲。
[0003]衰老是一種生理性現(xiàn)象，生理上表現(xiàn)就是各器官的功能衰退，導(dǎo)致各種老化疾病的產(chǎn)生。而最直觀的證據(jù)即皮膚的老化。在分子水平表現(xiàn)為細(xì)胞的衰老，這是與機(jī)體老化相伴的一個漸進(jìn)的事件。衰老不但導(dǎo)致機(jī)體的生理功能退化，機(jī)體的免疫體統(tǒng)也在逐漸退化。在人體衰老過程中不但由于自身的生理和免疫系統(tǒng)的原因，還有很多外因也會加速衰老，其中紫外的輻射就是引起衰老最為常見的原因，并且由于老化引起的慢性炎癥也是免疫系統(tǒng)退化的一個表征。
[0004]紫外線照射是導(dǎo)致皮膚衰老最主要的環(huán)境因素，紫外線照射使皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，使組織抗氧化防御體系能力減弱，最終導(dǎo)致皮膚衰老。自由基極易侵害細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成過氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)與氨基酸，核酸，蛋白質(zhì)和磷脂等和游離氨基反應(yīng)形成脂自由基，它廣泛地參與機(jī)體的生理與病理過程。在正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基不易發(fā)生蓄積和過氧化損傷，其中SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)機(jī)體長期受紫外線輻射，體內(nèi)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生與清除便失去平衡，氧自由基產(chǎn)生過多時，會對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。并且紫外線的輻射還可以引起DNA的損傷。
[0005]衰老或老化是機(jī)體代謝過程中的一個必然階段，主要表現(xiàn)為機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)能力減弱以至喪失。衰老的機(jī)制頗為復(fù)雜，涉及到機(jī)體的各個系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能的改變，有關(guān)老化的假說頗多。主要包括神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說，自由基學(xué)說，免疫學(xué)說，體細(xì)胞突變學(xué)說，應(yīng)激學(xué)說等。隨著近現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，人們開始認(rèn)識到衰老和老年性疾病在許多方面與免疫功能的改變有密切關(guān)系。認(rèn)為免疫系統(tǒng)與體內(nèi)大多數(shù)器官和細(xì)胞保持持續(xù)接觸，它的改變勢必影響這些器官和組織細(xì)胞。隨著年齡的增長，免疫機(jī)能減退，由此誘發(fā)出一些嚴(yán)重影響組織器官的疾病，加劇了機(jī)體各系統(tǒng)的衰老過程。阻止或逆轉(zhuǎn)免疫功能的衰竭，可以延緩衰老，并改變衰老病變組織器官的嚴(yán)重程度。衰老的免疫學(xué)表現(xiàn)有免疫器官功能衰退，隨著年齡增加，各免疫器官的功能日漸衰退，其中最明顯的是胸腺，胸腺萎縮是老年人免疫功能下降的關(guān)鍵。細(xì)胞免疫和體液免疫功能也在衰老的過程中有所改變，細(xì)胞免疫是依賴胸腺分化成熟的T細(xì)胞發(fā)揮作用的，因此隨著年老胸腺萎縮，T細(xì)胞的質(zhì)和量都受到影響是無疑的。免疫和衰老的關(guān)系密切，從免疫的角度提高機(jī)體的免疫力來抗衰老和延緩衰老有著重要的意義。
[0006]另外，衰老和炎癥之間也有著密切的聯(lián)系，炎性衰老受到越來越多的關(guān)注，炎癥衰老是指隨著年齡的增長機(jī)體出現(xiàn)一個慢性炎癥的過程。炎癥是宿主系統(tǒng)對病原體感染以及各種組織損傷等產(chǎn)生的一系列復(fù)雜的應(yīng)答事件，它通過影響機(jī)體微環(huán)境中多種細(xì)胞與因子的相互作用，調(diào)控機(jī)體多種生理與病理信號網(wǎng)絡(luò)的平衡走向，表現(xiàn)出了高度的兩面性:在一般情況下當(dāng)致炎因素如感染或組織損傷消除后，炎癥反應(yīng)隨即終結(jié)，之后轉(zhuǎn)變成為一種高度活躍、精細(xì)調(diào)控的平衡狀態(tài)，這種炎癥被稱為可控性炎癥。但是在某些不確定因素的作用下，如持續(xù)的或低強(qiáng)度的刺激，靶組織處于長期或過度反應(yīng)時，炎癥無法從抗感染組織損傷模式下轉(zhuǎn)變成為平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行表現(xiàn)為非可控性炎癥狀態(tài)。炎性衰老的炎癥具有非可控炎癥的特征。炎癥如同免疫反應(yīng)一樣是機(jī)體的正常生理功能，適度的炎癥反應(yīng)對機(jī)體有利，反之則有害。炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)包括促炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和抗炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。這兩個既相互對立又相互依存的子網(wǎng)絡(luò)的變化控制著炎癥的有利或有害作用的方向。正常情況下他們之間處于一個動態(tài)平衡的關(guān)系，炎性衰老中的病理性炎癥是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡所致，還與炎癥介質(zhì)的異常密切相關(guān)。
[0007]免疫衰老與炎性衰老相伴而行，炎性衰老的機(jī)制可以歸納成如下:應(yīng)激學(xué)說，應(yīng)激是機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會心理因素刺激時所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。應(yīng)激是一把雙刃劍，對機(jī)體有利也有害。炎性衰老進(jìn)程中機(jī)體長期處在應(yīng)激原所形成的環(huán)境中。應(yīng)激原是導(dǎo)致和維持慢性促炎性反應(yīng)狀態(tài)存在的原因。氧化炎癥學(xué)說，氧化應(yīng)激、炎性衰老與免疫衰老三者密切相關(guān)。細(xì)胞因子學(xué)說，促炎癥細(xì)胞因子在慢性炎癥所致機(jī)體的炎性衰老中發(fā)揮著重要的作用。
[0008]由于輻射引起炎癥，而炎癥可以引起衰老，目前，植物連翹提取物被用于各種醫(yī)藥和保健方面，但是將連翹提取物用于抗輻射，抗炎癥和抗衰老方面的研究還暫未發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供連翹提取物在制備具有抗輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明對連翹提取物進(jìn)行了抗輻射和抗衰老的功效細(xì)胞生物學(xué)驗證，由于輻射引起炎癥，而炎癥可以引起衰老，因此 申請人:研究了連翹提取物抵抗UVA輻射作用，并且目前關(guān)于此類的應(yīng)用很少。本申請?zhí)峁┑倪B翹提取物具有抗UVA輻射作用，顯著降低UVA輻射引起的真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞損傷，另外，衰老與炎癥之間也有密切的聯(lián)系， 申請人:同時研究了連翹提取物在體外的抗炎效果，發(fā)現(xiàn)其能有效地抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)。促炎細(xì)胞因子能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，促炎細(xì)胞因子(如TNF- a，IFN- y，IFN- β )等通過產(chǎn)生活性氧和激活A(yù)TM/P53/P21信號通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞衰老，趨化因子受體CXCR2通過P53通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老，DNA損傷激活NF-KB等信號通路產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(IL-1，IL_6，IL-8等)，從而阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)和維持細(xì)胞衰老表型。DNA損傷學(xué)說，由于DNA損傷積累使得干細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為促炎癥細(xì)胞因子過表達(dá)細(xì)胞，使多層狀細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)崩潰，導(dǎo)致炎性而導(dǎo)致衰老。
[0011]本發(fā)明中上述具有抗輻射和抗衰老功效的連翹提取物，可以采用市售的產(chǎn)品，也可以優(yōu)選采用本發(fā)明提供的下述優(yōu)選的方法制備的連翹提取物。
[0012]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，本發(fā)明中所述的連翹提取物，其可通過如下方法制備獲得:[0013](I)前處理將原料連翹清洗后，粉碎；
[0014](2)超聲波處理用乙醇水溶液超聲提取后，過濾，濃縮得濃縮液，在濃縮液中加水稀釋后，過濾，得到B過濾液；
[0015](3)大孔樹脂柱上樣:將B過濾液上到PIP0-02大孔樹脂分離柱上；
[0016](4)分離:用乙醇水溶液洗脫以除去大孔樹脂中的雜質(zhì)，再次用乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，得到D分離液；
[0017](5)濃縮干燥:真空減壓濃縮D分離液，并真空干燥得到連翹提取物。
[0018]在上述步驟中:
[0019]本發(fā)明步驟(I)中粉碎后優(yōu)選過篩至30-60目。
[0020]本發(fā)明步驟(2)中乙醇水溶液超聲提取時，乙醇水溶液的用量優(yōu)選為原料總重量的8-10倍，乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量優(yōu)選為40-80%，超聲提取兩次，每次優(yōu)選20-40分鐘。
[0021]本發(fā)明步驟(2)中濃縮優(yōu)選得3-5倍原料重的濃縮液，在濃縮液中加水稀釋時，水的用量優(yōu)選為濃縮液總重量的2-4倍。
[0022]本發(fā)明步驟(3)中PIP10-02大孔樹脂分離柱優(yōu)選為兩根，且相串聯(lián)；以雙柱串聯(lián)模式，先洗脫極性雜質(zhì)，盡可能濃縮連翹中的連翹苷成分。
[0023]本發(fā)明步驟(4)中除去大孔樹脂中的雜質(zhì)時乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量優(yōu)選為5-12%，其用量優(yōu)選為連翹原料重的0.8-4.8倍；再次用乙醇水溶液洗脫時乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為25-45%，其用量優(yōu)選為連翹原料重的0.4-2.4倍。
[0024]本發(fā)明步驟(5)中優(yōu)選在40_70°C真空減壓濃縮D分離液。
[0025]本發(fā)明步驟(5)中連翹提取物中經(jīng)HPLC檢測連翹苷的質(zhì)量百分含量在70%以上。
[0026]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0027](I)本發(fā)明方法提取的連翹提取物中連翹苷的含量高于70%，在保健食品或化妝品中應(yīng)用量小，含量明確容易質(zhì)量控制；
[0028](2)本發(fā)明連翹提取物色澤淺談，適合化妝品中應(yīng)用，不影響化妝品的原有色澤；
[0029](3)本發(fā)明提取效率高，能充分利用資源；
[0030](4)本發(fā)明的連翹提取物生產(chǎn)制備成本低，宜于在保健食品或化妝品中應(yīng)用，具有市場競爭力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031 ] 圖1是本發(fā)明實施例4中(1.2)連翹提取物對UVA照射下的3T3細(xì)胞保護(hù)作用；
[0032]圖2是本發(fā)明實施例4中(1.3 )彗星電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的實驗結(jié)果，其中左圖為加入了連翹提取物，中圖為有UVA照射的3T3細(xì)胞，右圖為無UVA照射的3T3細(xì)胞的DNA
產(chǎn)生彗星拖尾率；
[0033]圖3是本發(fā)明實施例4中(1.4)流式細(xì)胞儀檢測連翹提取物對UVA輻射3T3細(xì)胞周期的保護(hù)作用，其中A圖為無UVA照射的3T3細(xì)胞，B圖為有UVA照射的3T3細(xì)胞，C圖為加入了連翹提取物的3T3細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖；
[0034]圖4是本發(fā)明實施例4中(1.5) MTT法檢測連翹提取物對RAW264.7細(xì)胞毒性；
[0035]圖5是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子IL-6的產(chǎn)生；
[0036]圖6是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子IL-1的產(chǎn)生；
[0037]圖7是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子TNF-alpha的產(chǎn)生；
[0038]圖8是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子MCP-1的產(chǎn)生；
[0039]圖9是本發(fā)明實施例4 (1.5)中PCR檢測連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子MCP-1的產(chǎn)生。
【具體實施方式】
[0040]下面是結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0041](一)本發(fā)明優(yōu)選的連翹提取物的提取方法
[0042]實施例1
[0043]本實施例提供的連翹提取物的優(yōu)選的制備方法，含以下步驟:
[0044]A:前處理:將原料連翹用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重I千克；
[0045]B:提取:用8-10千克乙醇體積百分含量為40-80%的乙醇水溶液超聲提取2次，每次20-40分鐘，過濾，合并提取液，將提取液濃縮得到3-5千克濃縮液，在濃縮液中加入6-20千克水稀釋濃縮液，過濾，得到9-25千克B過濾液；
[0046]C:上樣:將B過濾液上到200-600毫升柱體積的PIP0-02 (分離材料重200-600克)大孔樹脂分離柱，相同體積和裝有雙柱節(jié)串聯(lián)中；
[0047]D:分離，用體積百分含量為5-12%的乙醇水溶液洗脫800-4800毫升，除去前雜，用體積百分含量為25-45%%的乙醇水溶液洗脫，收集400-2400毫升，得到D分離液；
[0048]E:濃縮干燥:在40-70°C真空減壓濃縮D分離液，并真空干燥得到連翹提取物，用HPLC連翹苷對照品測試發(fā)現(xiàn)，連翹提取物中連翹苷的含量在70%以上，稱重為60-120克。
[0049]實施例2
[0050]本實施例提供的連翹提取物的優(yōu)選的制備方法，含以下步驟:
[0051]A:前處理:將原料連翹用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重10千克；
[0052]B:提取:用80-100千克乙醇體積百分含量為40_80%的乙醇水溶液超聲提取2次，每次20-40分鐘，過濾，合并提取液，濃縮得到30-50千克濃縮液，在濃縮液中加入60-200千克水稀釋濃縮液液，過濾，得到90-250千克B過濾液；
[0053]C:上樣:將B過濾液上到2000-6000毫升柱體積的PIP0-02 (分離材料重2000-6000克)分離柱，相同體積和裝有雙柱節(jié)串聯(lián)中；
[0054]D:分離，用乙醇體積百分含量為5-12%的乙醇水溶液洗脫8000-48000毫升，除去前雜，用乙醇體積百分含量為25-45%%的乙醇水溶液水洗脫，收集4000-24000毫升，得到D分離液；
[0055]E:濃縮干燥:在40-70°C真空減壓濃縮D分離液，并真空干燥得到連翹提取物，用HPLC連翹苷對照品測試發(fā)現(xiàn)，其中連翹苷的質(zhì)量百分含量在70%以上，稱重為600-1200克。
[0056]實施例3[0057]本實施例提供的連翹提取物的優(yōu)選的制備方法，含以下步驟:
[0058]A:前處理:將原料連翹用水洗凈，粉碎，過篩至30-60目，稱重100千克；
[0059]B:提取:用800-1000千克40_80%乙醇超聲提取2次，每次20_40分鐘，過濾，合并，濃縮得到300-500千克提取液，加600-2000千克水稀釋提取液，過濾，得到900-2500千克B過濾液；
[0060]C:上樣:將B過濾液上到2000-6000毫升柱體積的PIP0-02 (分離材料重2000-6000克)分離柱，相同體積和裝有雙柱節(jié)串聯(lián)中；
[0061]D:分離，用5-12%乙醇洗脫80-480升，除去前雜，用25_45%%乙醇水洗脫，收集40-240升，得到D分離液；
[0062]E:濃縮干燥:真空減壓在40-70度濃縮D分離液，并真空干燥得到連翹提取物，用HPLC連翹苷對照品測試發(fā)現(xiàn)，其中連翹苷的質(zhì)量百分含量在70%以上，稱重為原料重量的6-12千克。
[0063](二)連翹提取物的功效驗證
[0064]實施例4連翹提取物抗輻射和抗衰老功效驗證
[0065]4.1實驗原料
[0066]以下采用本發(fā)明實施例1中制備獲得連翹提取物，進(jìn)行抗輻射和抗衰老功效驗證。
[0067]4.2抗輻射功效驗 證 實驗
[0068]采用本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對UVA輻射3T3細(xì)胞的防護(hù)作用，方法如下:
[0069]通過MTT法檢測細(xì)胞增殖情況來測定化合物對UVA輻射3T3細(xì)胞的防護(hù)作用。
[0070](I)收集對數(shù)期3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μ L，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔；
[0071](2)2.5%C02，37°C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，梯度濃度依次為:200 μ g/mL , 100 μ g/mL , 50 μ g/mL , 25 μ g/mL , 12.5 μ g/mL , 6.25 μ g/mL,每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，每組設(shè)置3個空白孔，對照組不作處理5%C02，37°C孵育16-24小時；
[0072](3)輻射組各組細(xì)胞按UVA輻射劑量條件摸索實驗的得到的紫外條件進(jìn)行紫外輻射:輻照時間45min ;輻射劑量1.4J/cm2，對照組不作處理，5%C02，37°C孵育16-24小時；
[0073](4)每孔加入10 μ LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
[0074](5)每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值；
[0075]結(jié)果如圖1中所示，試驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明實施例1中提取的連翹提取物對UVA輻射3T3細(xì)胞具有防護(hù)的活性(≤90%cell viability)。
[0076]4.3抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0077]采用彗星電泳檢測本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對UVA輻射3T3細(xì)胞DNA的保護(hù)作用，方法如下=DNA損傷越嚴(yán)重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強(qiáng)度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。
[0078](I) 3T3細(xì)胞預(yù)12孔板，細(xì)胞密度為70% ；[0079](2)化合物處理:將上述實驗篩選出的化合物稀釋至200 μ g/mL (我們采用有效最大濃度作為該實驗的藥物工作濃度)，吸棄培養(yǎng)基，加入稀釋的化合物稀釋液，每孔lmL，37度，5%C02的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ；
[0080](3)將處理的細(xì)胞UVA輻照lh，60uff/cm2, 37°C，5%C02的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ；
[0081](4)胰酶消化細(xì)胞，含血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入15mL離心管內(nèi)，1000rpm/min,離心5min,棄上清,加入適量PBS重懸細(xì)胞，同上離心5min,棄PBS,加入適量的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至106cells/mL ；
[0082](5)制膠:溶解0.7%濃度的正常熔點瓊脂糖，快速滴加70 μ L至干凈的載玻片，快速用蓋玻片壓膠，4°C凝膠20min，輕輕剝離蓋玻片，將細(xì)胞懸液和0.8%低熔點瓊脂糖混勻，快速滴加至第一層膠上，快速蓋玻片壓膠，4°C凝膠20min ；
[0083](6)輕輕剝離第二層膠上的蓋玻片，將膠放入堿性裂解液中，4°C裂解1.5?2h ;
[0084](7)輕輕取出載玻片，用單蒸水洗膠2次；
[0085](8)將膠放入堿性電泳液中，靜置20min，25V，電泳15min，pH7.5的Tris-HCl中和三次，每次5min ；
[0086](9) PI染色鏡檢，拍照。
[0087]彗星電泳檢測細(xì)胞DNA損傷的實驗結(jié)果如圖2中所示，本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對UVA輻射引起的DNA損傷具有顯著地抑制作用。
[0088]4.4抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0089]流式細(xì)胞儀檢測藥物本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對UVA輻射3T3細(xì)胞周期的保護(hù)作用，方法如下:細(xì)胞DNA損傷，發(fā)動細(xì)胞基因組修復(fù)機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)而完成基因組的損傷修復(fù)，保證細(xì)胞基因組的完整。UV輻射對細(xì)胞的基因組DNA造成斷裂損傷，必將導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生變化。因此利用細(xì)胞流式儀來檢測化合物對變化的細(xì)胞周期是否具有調(diào)節(jié)抑制作用。
[0090](I) 3T3細(xì)胞預(yù)12孔板，培養(yǎng)過夜；
[0091](2)細(xì)胞藥物處理:將藥物做濃度稀釋，加入細(xì)胞，24h后UVA輻射lh，60yW/cm2，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后收樣品；
[0092](3)胰酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管，1000rpm/min離心5min，棄上清，PBS洗兩遍，離心條件同上，棄PBS，加入500 μ L的70%乙醇4度固定過夜；
[0093](4)棄PBS，加入500 μ L的70%乙醇4°C固定過夜；
[0094](5) 1000rpm/min, 4°C,離心5min,棄乙醇，加入PBS重懸，同上離心；
[0095](6)棄PBS，加入含有DNA酶I和PI染料的PBS中，200目的篩網(wǎng)過濾；
[0096](7)上細(xì)胞流式儀測周期；
[0097]流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果如圖3中所示,其中Gl是DNA合成前期,細(xì)胞靜止期；S為DNA復(fù)制時期；G2是DNA合成后期，為增殖期的細(xì)胞。如果Gl加藥前>G1加藥后，S期和G2期的細(xì)胞比例增加，細(xì)胞則表現(xiàn)增殖活躍。
[0098]圖3中的流式結(jié)果表明:本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物與UVA組數(shù)據(jù)相比，連翹提取物具有保護(hù)作用。
[0099]4.5抗炎抗衰老作用機(jī)理驗證實驗
[0100]MTT法檢測篩選的本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對RAW264.7細(xì)胞毒性，方法如下:
[0101](I)收集對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μ L，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔；
[0102](2)2.5%C02，37°C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，隨機(jī)分為60組，每個藥物一組，每組加入濃度梯度的連翹提取物，梯度濃度依次為:200 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、12.5 μ g/mL、6.25 μ g/mL,每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔,每組設(shè)置3個空白孔，5%C02，37°C孵育16-48小時；
[0103](3)每孔加入10 μ LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
[0104](4)每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值；
[0105]本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對RAW264.7細(xì)胞的毒性如圖4中所示，從圖4中可以看出，連翹提取物對細(xì)胞無毒害的最大無毒濃度。
[0106]4.6抗炎抗衰老作用功效驗證實驗
[0107]PCR檢測本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物在轉(zhuǎn)錄水平抑制或降低炎癥因子的產(chǎn)生，方法如下:對篩選得到的具有抗UVA輻射的化合物連翹提取物在巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞模型進(jìn)行抗炎活性實驗。
[0108](I)取對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞，預(yù)24孔板，鋪板調(diào)整細(xì)胞密度為3X 105cells/mL ；
[0109](2)加入50ng/mL的PMA，培養(yǎng)48h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；
[0110](3)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍后，加入無血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h ；
[0111](4)加入100ng/mL的LPS以及連翹提取物，培養(yǎng)18?24h ;
[0112](5)抽提給藥組細(xì)胞的RNA，使用real-time PCR法對IL-6和IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1，白細(xì)胞介素 6 白細(xì)胞介素 I)，TNF- a (tumor necrosisfactor-alpha,腫瘤壞死因子)，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-l,巨卩遼細(xì)胞趨化蛋白I)、和iNOS進(jìn)行定性定量分析，觀察活性物對炎性因子表達(dá)的影響，本發(fā)明實施例1中制備得連翹提取物對炎癥因子的表達(dá)的抑制作用。
[0113]IL-6 和 IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1,白細(xì)胞介素 6 白細(xì)胞介素 I)的結(jié)果如圖5和6中所不,TNF-a (tumor necrosis factor-alpha,腫瘤壞死因子)的結(jié)果如圖7中所不，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1,巨卩遼細(xì)胞趨化蛋白I)和iNOS結(jié)果如圖8和9中所示，
[0114]從圖5-9中可以看出:檢測本發(fā)明實施例1中制備的連翹提取物表現(xiàn)出不同的抑炎作用，本發(fā)明實施例1中制備的連翹提取物對IL-1、IL-6和TNF-a的抑制作用顯著。
[0115]實際上，本發(fā)明 申請人:還同時對其他來源的連翹提取物如市售的連翹提取物或其他方法制備獲得連翹提取物進(jìn)行上述試驗，結(jié)果表明，也具有上述抗輻射和抗衰老功效。
[0116]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.連翹提取物在制備具有抗UVA輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連翹提取物在制備具有抗UVA輻射和抗衰老功效的保健食品或化妝品中的應(yīng)用，其特征是:所述的連翹提取物中連翹苷的質(zhì)量百分含量在70%以上。
3.一種具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是含以下步驟:(O前處理將原料連翹清洗后，粉碎；(2)超聲波處理用乙醇水溶液超聲提取后，過濾，濃縮得濃縮液，在濃縮液中加水稀釋后，過濾，得到B過濾液；(3)大孔樹脂柱上樣:將B過濾液上到PIP0-02大孔樹脂分離柱上；(4)分離:用乙醇水溶液洗脫以除去大孔樹脂中的雜質(zhì)，再次用乙醇水溶液洗脫,收集洗脫液，得到D分離液；(5)濃縮干燥:真空減壓濃縮D分離液，并真空干燥得到連翹提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(I)中粉碎后過篩至30-60目。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(2)中乙醇水溶液超聲提取時，乙醇水溶液的用量為原料總重量的8-10倍，乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為40-80%，超聲提取兩次，每次20-40分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(2)中濃縮得3-5倍原料重的濃縮液，在濃縮液中加水稀釋時，水的用量為濃縮液總重量的2-4倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(3)中PIP10-02大孔樹脂分離柱為兩根，且相串聯(lián)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(4)中除去大孔樹脂中的雜質(zhì)時乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為5-12%，其用量為連翹原料重的0.8-4.8倍；再次用乙醇水溶液洗脫時乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為25-45%，其用量為連翹原料重的0.4-2.4倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(5)中在40-70°C真空減壓濃縮D分離液。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗UVA輻射和抗衰老功效的連翹提取物的制備方法，其特征是:步驟(5)中連翹提取物中經(jīng)HPLC檢測連翹苷的質(zhì)量百分含量在70%以上。
【文檔編號】A61Q17/04GK103564503SQ201310519771
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】趙宏偉, 王一飛, 吳志韻, 袁曉, 鄒士玉, 馬忠華 申請人:無限極（中國）有限公司