皮膚美白用化妝料組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及皮膚美白用化妝料組合物，其包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，其具有如下效果：在單獨(dú)使用了所述植物提取物時，未明顯顯示出DPPH自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力及還原力，但在它們的混合提取物中DPPH自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力及還原力均顯著地提高，并在混合提取物中，抑制在黑色素生成初期階段中涉及到的蛋白質(zhì)即酪氨酸酶的活性，并有意識地減少TRP-1，顯示出比周知為具有美白功能成分的熊果苷更加優(yōu)異的美白效果，因此能夠用來制造美白功能性化妝品。
【專利說明】皮膚美白用化妝料組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有皮膚美白效果的新型天然植物混合提取物，更具體地，涉及包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]人的膚色是根據(jù)黑色素、葉紅素及血紅蛋白的量而決定的，其中最為決定性的要素是黑色素。黑色素在存在于皮膚(表皮)內(nèi)的基底層的色素細(xì)胞即黑素細(xì)胞(melanocyte)中合成而轉(zhuǎn)移到周邊角質(zhì)細(xì)胞(Keratinocyte)來顯現(xiàn)出人的膚色。如果黑色素的生成異常地少，則引發(fā)白斑癥(Vitiligo)這樣的皮膚病變。相反地，如果生成過多，則形成中年女性的主要煩惱之一的黑痣、雀斑，并且與皮膚癌也有密切的關(guān)系。
[0003]在此，對美白作用進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。黑色素是在存在于皮膚表皮的基底層的叫作黑素細(xì)胞的細(xì)胞中，由酪氨酸(Tyrosine)經(jīng)過酶及非酶性氧化反應(yīng)而生成的，并轉(zhuǎn)移到構(gòu)成表皮的角質(zhì)細(xì)胞。作為參與黑色素的生合成的重要的酶，有酪氨酸酶(Tyrosinase)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白I (Tyrosinase — Related proteinl)及多巴色素互變異構(gòu)酶(dopachrome tau tomerase)。除了酪氨酸酶之外,該兩個酶也引人注目，但是在黑色素合成中起到?jīng)Q定性作用的酶是酪氨酸酶。黑色素的生合成的第一步驟是根據(jù)酪氨酸酶而引發(fā)的。根據(jù)酪氨酸酶，酪氨酸成為多巴(Dopa),將該多巴制造為多巴醌(Dopa — quinone)。眾所周知，根據(jù)非酶性反應(yīng)也能夠進(jìn)行該兩個反應(yīng)的下一個步驟過程，但單獨(dú)通過酪氨酸酶也能夠生成黑色素。
[0004]最近，提出了關(guān)于根據(jù)皮膚細(xì)胞內(nèi)的信號傳達(dá)物質(zhì)的表達(dá)而形成黑色素的過程的新理論。當(dāng)皮膚暴露在紫外線中時，引發(fā)炎癥的白細(xì)胞介素一 a (Inter lukin —)由上皮(Epidermis)內(nèi)的角質(zhì)細(xì)胞(Keratinocyte)表達(dá)，該白細(xì)胞介素α促進(jìn)內(nèi)皮素(Endothelin)的表達(dá)。這樣的一系列的過程增加黑素細(xì)胞的形成，激活黑素細(xì)胞。在這樣形成的黑素細(xì)胞內(nèi)的黑素體中，酪氨酸通過酪氨酸酶而形成黑色素。
[0005]另外，NF-kB應(yīng)對多種刺激響應(yīng)性地被激活，從而對于免疫、增生、炎癥等，提高各種基因的表達(dá)。據(jù)稱NF-kB的過度激活關(guān)系到癌、類風(fēng)濕、干癬等，目前在全世界范圍內(nèi)研發(fā)NF-kB抑制劑。并且，得知NF-kB還存在于皮膚的表皮角質(zhì)細(xì)胞或真皮纖維細(xì)胞，因紫外線或炎癥等的刺激，NF-kB被過度激活，轉(zhuǎn)錄活性提高。NF-kB的過度激活造成細(xì)胞中的感染性細(xì)胞活素的生成，因該細(xì)胞活素導(dǎo)致進(jìn)一步的NF-kB的表達(dá)。另外，促進(jìn)作為細(xì)胞增生因子的bFGF (basic fibroblast growth factor)或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶MMP — I的生成，引起由表皮角質(zhì)細(xì)胞的過度增生或角質(zhì)異常導(dǎo)致的表皮的肥厚、由黑素細(xì)胞的增生導(dǎo)致的色素的沉淀、由MMP — I的真皮膠原蛋白的分解導(dǎo)致的皮膚彈性的下降等，這關(guān)系到皮膚的光老化。
[0006]生成作為皮膚的黑色素細(xì)胞的色素的表皮黑素細(xì)胞因紫外線或慢性炎癥等而增加，這導(dǎo)致皮膚中的黑色素生成量增加。
[0007]在受感染時，NF-kB在表皮角質(zhì)細(xì)胞中被過度地表達(dá)而促進(jìn)具有黑色素細(xì)胞增生作用的bFGF在表皮角質(zhì)細(xì)胞中的生成。即，抑制NF-kB的作用的物質(zhì)顯現(xiàn)出防止由炎癥或紫外線導(dǎo)致的黑痣或雀斑等的色素沉淀的效果。
[0008]因?yàn)榭弓h(huán)血酸(日本特開平4-9320)、對苯二酚(日本特開平6-192062)、曲酸(日本特開56-7710)、熊果苷(日本特開平4-9315)及一部分化合物具有酪氨酸酶阻礙作用，因此已經(jīng)作為美白化妝料的原料而使用，但因?yàn)槿缦聠栴}而其在處方界的使用受到限制:因穩(wěn)定性低，分解而著色，或者產(chǎn)生異味，在活體級上的功效、效果的不確定及安全性問題等。并且，雖然論證了酪氨酸酶的抑制效果，但是在與實(shí)際活體級類似的實(shí)驗(yàn)中，其效果較低，并且對苯二酚被規(guī)定為致癌物質(zhì)，因此被禁止使用。
[0009]因此，目前需要研發(fā)穩(wěn)定性優(yōu)異，且具有突出的皮膚美白活性的天然物質(zhì)。
[0010]韓國授權(quán)專利第0562348號
[0011]韓國授權(quán)專利第0850686號

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明人為了尋找有效改善皮膚美白的物質(zhì)，從大自然的各種天然物質(zhì)中篩選了對皮膚美白有效的物質(zhì)，其結(jié)果查明了在白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中具有非常優(yōu)異的皮膚美白效果，從而完成了本發(fā)明。
[0013]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種作為有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物。
[0014]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供作為有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物。
[0015]在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述白茯苓提取物在化妝料組合物的總重量份中占
0.001~2重量％，榆白皮提取物在化妝料組合物的總重量份中占0.001~2重量％，甘草提取物在化妝料組合物的總重量份中占0.001~5重量％。
[0016]在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物使用從以下的組中選擇的溶劑而進(jìn)行提取:水、碳數(shù)為I~4個的無水或含水低級醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸異丁酯以及1，3-丁二醇。
[0017]在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述化妝料組合物具有酪氨酸酶活性阻礙和/或者黑色素生合成阻礙效果。
[0018]在本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述化妝料組合物形成為從以下的組中選擇的劑型--溶液、懸浮液、乳液、糊狀物、凝膠、膏狀物、護(hù)膚液、粉、香皂、含有表面活性劑的洗面奶、油、粉末狀粉底、乳液狀粉底、蠟型粉底及噴霧。
[0019]本發(fā)明涉及包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物，其具有如下效果:在單獨(dú)使用了所述植物提取物時，未明顯顯示出DPPH自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力及還原力，但在它們的混合提取物中DPPH自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力及還原力均顯著地提高，并在混合提取物中，抑制在黑色素生成初始階段中涉及到的蛋白質(zhì)即酪氨酸酶的活性，并有意識地減少TRP-1，顯示出比周知為具有美白功能成分的熊果苷更加優(yōu)異的美白效果，因此能夠用來制造美白功能性化妝品。
【專利附圖】

【附圖說明】[0020]圖1是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在細(xì)胞毒性而進(jìn)行MTT assay分析的結(jié)果。
[0021]圖2是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而確認(rèn)DPPH自由基清除能力的結(jié)果。
[0022]圖3是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而測定了還原力的結(jié)果。
[0023]圖4是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性，根據(jù)輕自由基(hydroxyl radical)而測定了 DNA的氧化損傷與否的結(jié)果。
[0024]圖5是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在抗氧化活性而測定了脂質(zhì)過氧化程度的結(jié)果。
[0025]圖6是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而測定了酪氨酸酶活性的結(jié)果。
[0026]圖7是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而測定了黑色素生成程度的結(jié)果。
[0027]圖8是為了了解在本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中是否存在美白活性而確認(rèn)了酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2及S0D-1的蛋白質(zhì)表達(dá)程度的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明為了尋找有效改善皮膚美白的物質(zhì)，從大自然的各種天然物質(zhì)中篩選了對皮膚美白有效的物質(zhì)，其結(jié)果確認(rèn)了在白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物中具有非常優(yōu)異的皮膚美白效果。
[0029]因此，本發(fā)明的特征在于，提供一種作為有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物。
[0030]特別是，本發(fā)明人在為了尋找來自天然物質(zhì)而對人體穩(wěn)定且體現(xiàn)顯著的美白效果和抗氧化效果的素材而摸索的過程中，關(guān)注到白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，并通過實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)了實(shí)際上是否具有美白效果。
[0031]即，根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，為了以本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物為對象測定DPPH自由基清除能力，對Brand — Williams實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行變形，測定了對于
I,l-diphenyl-2-picryIhydrazyI (DPPH)自由基的 PCEE> GUEE> UMEE> PGUE 組的清除能力，其結(jié)果顯示:分別單獨(dú)處理的組和處理了混合溶液的組的對于DPPH自由基的消除能力與濃度成正比地增加，特別是作為它們的混合物的PGUE在15.6 μ g/ml濃度以上中顯示出78%的DPPH自由基消除能`力。這表明與作為陽性對照組的100 μ g/ml的維生素C相比，PGUE的清除能力高10% (參照圖2)。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，以本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物為對象測定了還原力，其結(jié)果顯示:在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮酒精提取物的混合物(PGUE)中未顯示出還原力，但是GUEE、UMEE, PGUE組的還原力與濃度成正比地增加。GUEE在62.5 μ g/ml濃度中顯示出150 %的還原力，UMEE和PGUE在62.5 μ g/ml的濃度中，UMEE顯示出350%的還原力，PGUE顯示出270%的還原力，由此可知與作為陽性對照組而使用的10 μ g/ml的維生素C相比，還原力優(yōu)異(參照圖3)。[0033]根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，為了了解在本發(fā)明的混合提取物中是否存在對于脂質(zhì)過氧化的抗氧化活性，對于各種濃度的亞油酸懸浮液進(jìn)行處理之后測定了抗氧化活性，其結(jié)果如下:在分別處理了白茯苓、甘草及榆白皮酒精提取物的組中未顯示出有效的抑制效果，但作為白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物及榆白皮酒精提取物的混合物的本發(fā)明的PGUE在7.8 μ g/ml以上的濃度下抑制17%的脂質(zhì)過氧化，在15.6 μ g/ml的濃度下，與作用陽性對照組而使用的1000yg/ml的維生素E類似地，抑制了 20%程度的脂質(zhì)過氧化(參照圖5)。
[0034]因此，具有抗氧化活性的本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物可用作功能性化妝料。
[0035]另外，根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例可知，本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物與將白茯苓、甘草及榆白皮提取物單獨(dú)處理的組相比，酪氨酸酶活性抑制效果及黑色素合成抑制效果優(yōu)異(參照圖6及7)。
[0036]進(jìn)而，為了確認(rèn)在本發(fā)明的白茯苓、甘草及的榆白皮酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在作為黑色素形成中的重要的酶的酪氨酸酶和在黑色素生成信號傳達(dá)機(jī)制中重要的 TRP_l(tyrosinase related protein — I)和 TRP-2 (tyrosinase related protein —2)及在抗氧化酶中作為最重要的SOD (Superoxide dismutase)的S0D-1的蛋白質(zhì)表達(dá),進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，其結(jié)果可知:本發(fā)明的混合提取物與對照組相比，在3.12 μ g/ml濃度下，對TRP-2和酪氨酸酶的蛋白質(zhì)表達(dá)不產(chǎn)生影響，但減少了 TRP-1及S0D-1的表達(dá)(參照圖8)。
[0037]通過這樣的結(jié)果，本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)來論證了如下的事實(shí):本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物具有抗氧化效果及皮膚美白效果，并且這樣的效果比單獨(dú)根據(jù)白茯苓、榆白皮及甘草的提取物而獲得的效果更加優(yōu)異。
[0038]因此，本發(fā)明能夠提供作為有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的皮膚美白用化妝料組合物。
[0039]本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物是使用本領(lǐng)域公知的提取及分離方法，從天然物提取及分離獲得而使用，本發(fā)明中所定義的“提取物”是利用適當(dāng)?shù)娜軇┒鴱陌总蜍摺⒂馨灼ぜ案什萏崛〉?，例如包括所有白茯苓、榆白皮及甘草的粗提取物、極性溶劑可溶提取物或非極性溶劑可溶提取物。
[0040]作為用于提取所述白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的適當(dāng)?shù)娜芤?，只要是醫(yī)學(xué)上允許的有機(jī)溶劑，則可使用任何溶劑，可使用水或有機(jī)溶劑，但不限于此，例如可將下述的各種溶劑單獨(dú)或混合而使用:純凈水、包括甲醇(methanol )、乙醇(ethanol)、丙醇(propanol)、異丙醇(isopropanol)、丁醇(butanol)等的碳數(shù)為 I至 4 的醇、丙酮(acetone)、乙醚(ether)、苯(benzene)、三氯甲燒(chloroform)、乙酸乙酯(ethylacetate)、二氯甲燒(methylene chloride)、己燒(hexane)及環(huán)己燒(cyclohexane)等。優(yōu)選使用乙醇(酒精)。
[0041]作為提取方法，可從下述方法中選擇一個來使用:熱水提取法、冷浸提取法、環(huán)流冷卻提取法、溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法、噴涌法、壓榨法等。另外，關(guān)于目標(biāo)提取物，可追加執(zhí)行通常的劃分工藝，也可以利用通常的精制方法來精心制作。關(guān)于本發(fā)明的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的制造方法不進(jìn)行限制，可利用公知的任何方法。[0042]例如，本發(fā)明的組合物中所包含的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物可通過如下方法制造:將通過所述的熱水提取法或溶劑提取法來提取的一次提取物，通過減壓蒸餾及凍結(jié)干燥或噴霧干燥等這樣的追加過程而制造成粉末狀態(tài)。另外，對于上述一次提取物，利用硅膠柱層析法、薄層層析法、高性能液體層析法等各種層析法，獲得追加性地精心制造的劃分。
[0043]因此，在本發(fā)明中，白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物包括在提取、劃分或精制的各個階段獲得的所有提取液、劃分及精制物、它們的稀釋液、濃縮液或干燥物。
[0044]另外，在本發(fā)明的組合物被制造成化妝品組合物的情況下，本發(fā)明的組合物不僅包括上述的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物，還包括在化妝料組合物中通常所利用的成分，例如包括抗氧化劑、穩(wěn)定劑、溶解劑、維生素、顏料及香料這樣的通常的助劑和載體。
[0045]另外，本發(fā)明的組合物除了上述的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物之外，在與白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物反應(yīng)而不損傷皮膚保護(hù)效果的限度內(nèi)，可混合使用以往一直使用的有機(jī)防曬霜。
[0046]作為有機(jī)防曬霜，可使用從以下的組中選擇的一種以上:甘油基己酯(GlycerylPABA)λ 甲酌.曲唑三娃氧焼(Drometrizole Trisiloxane)、甲酌.曲唑(Drometrizole)、二沒食子酰三油酸酯(Digalloyl Trioleate)、苯基二苯并咪唑四磺酸二鈉(DisodiumPhenyl Dibenzimidazole Tetrasulfonate)、二乙基己基丁酸胺基三嗪酮(DiethylhexylButamido Triazone)、二乙氨基輕苯甲酉先基己基苯甲酸酯(Diethylamino HydroxybenzoylHexyl Benzoate)、DEA-甲氧基肉桂酸鹽(DEA-Methoxycinnamate)、2_ 羥基-1，4_ 萘醌(Lowsone)和二羥基丙酮(Dihydroxyacetone)的混合物、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酌二物理防劑曬(Methylene Bis-Benzotriazolyl Tetramethylbutylphenol)、4-甲基亞芐基樟腦(4-MethyIbenzyIidene Camphor)、鄰氨基苯甲酸甲酯(MenthylAnthranilate)、二苯甲麗 _3 (輕苯甲麗)(Benzophenone-3 (Oxybenzone))、二苯甲麗 _4(Benzophenone-4)、二苯甲麗 _8 (二輕苯麗)(Benzophenone_8 (Dioxybenzone))、丁基甲氧基二苯酉先化甲焼(Butyl Methoxydibenzoylmethane)、雙-乙基己氧苯酌二甲氧苯基三嗪(Bis-ethylhexy1xyphenoI methoxyphenyl triazine)、西諾沙酯(Cinoxate)、乙基二輕丙基 PABA (Ethyl Dihydroxypropyl PABA)、氰雙苯丙烯酸辛酯(octocrylene)、乙基己基二甲基PABA (Ethylhexyl Dimethyl PABA)、乙基己基甲氧基肉桂酸酯(Ethylhexilemethoxycinnamate)、水楊酸乙基己酯(Ethylhexyl Salicylate)、乙基己基三嗪酮(Ethylhexyl Triazone)、對甲氧基肉桂酸異戊酯(Isoamyl p-methoxycinnamate)、聚娃氧焼-15 (Dimethicodiethylbenzal malonate)、麥素寧濾光環(huán)(TerephthalylideneDicamphor Sulfonic Acid)及其鹽類、TEA-水楊酸鹽(TEA-Salicylate)、氨基苯甲酸(對氨基苯甲酸)(aminobenzoic acid (PABA))。
[0047]另外，本發(fā)明的化妝料組合物可以制造成本領(lǐng)域中通常制造的任何劑型，例如可制造為如下劑型:溶液、懸浮液、乳液、糊狀物、凝膠、膏狀物、護(hù)膚液、粉、香皂、含有表面活性劑的洗面奶、油、粉末粉底、乳液粉底、蠟型粉底及噴霧等，但不限于此。更具體地，本發(fā)明的化妝料組合物可制造為如下劑型:柔軟化妝水、營養(yǎng)化妝水、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、目艮霜、潔面霜、潔面膠、卸妝水、面膜、噴霧或粉。
[0048]在本發(fā)明的劑型為糊狀物、膏狀物或凝膠的情況下，作為載體成分，可利用動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、膠黃蓍、纖維衍生物、聚乙二醇、硅、膨潤土、硅石、滑石或氧化鋅
坐寸O
[0049]在本發(fā)明的劑型為溶液或乳液的情況下，作為載體成分而利用溶劑、溶解劑、乳化劑，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸亞乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯酸芐酯、丙二醇、1，3 —丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、或山梨聚糖的脂肪酸酯。
[0050]在本發(fā)明的劑型為懸浮液的情況下，作為載體成分可利用如下成分:水、乙醇或丙二醇這樣的液態(tài)的稀釋劑、乙氧基異硬脂醇、聚氧化乙烯酯、及聚氧化乙烯酯這樣的懸浮液、微小決定性纖維、氫氧化鋁、膨潤土、瓊膠或膠黃蓍等。 [0051]在本發(fā)明的劑型為粉或噴霧的情況下，作為載體成分可利用乳糖、滑石、硅石、氫氧化鋁、鈣硅酸鹽或聚酰胺粉，特別是在劑型為噴霧的情況下，可追加性地包含氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚這樣的推進(jìn)劑。
[0052]在本發(fā)明的劑型為含有表面活性劑的洗面奶的情況下，作為載體成分而可利用如下:脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇乙醚硫酸鹽、磺基琥珀酸磷酸、羥乙基磺酸鹽、咪唑烷衍生物、氨基乙磺酸甲酯、肌氨酸鹽、脂肪酸胺乙醚硫酸鹽、脂肪酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛酯衍生物或聚氧乙烯甘油醚脂肪酸脂等。
[0053]另外，本發(fā)明提供化妝方法，其特征在于將作為有效成分而包含白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的化妝料組合物適用于人的皮膚而獲得美白效果。
[0054]本發(fā)明的化妝方法是指所有利用本發(fā)明的化妝料組合物的所有化妝方法。即，利用化妝料組合物的在本領(lǐng)域公知的所有方法均包括在本發(fā)明的化妝方法中。
[0055]本發(fā)明的化妝料組合物可單獨(dú)或重復(fù)使用，或者與本發(fā)明之外的其他化妝料組合物重復(fù)而使用。另外，本發(fā)明的化妝料組合物可根據(jù)通常的使用方法來使用，并且根據(jù)使用者的皮膚狀態(tài)或愛好來采取不同使用次數(shù)。
[0056]在本發(fā)明的化妝料組合物為香皂、含有表面活性劑的洗面奶劑型或不含有表面活性劑的洗面奶劑型的情況下，在涂敷于皮膚之后，可擦掉或取下或者用水來清洗。作為具體例，所述香皂為液體香皂、粉末香皂、固體香皂及油香皂，所述含有表面活性劑的洗面奶劑型為潔面膠、卸妝水、洗面巾、潔面面膜，所述不含有表面活性劑的洗面奶劑型為潔面霜、潔面液、卸妝水及潔面凝膠，但不限于此。
[0057]下面，對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)的說明。這些實(shí)施例只是為了更具體地說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。
[0058]<實(shí)施例1>
[0059]材料及試料的制造
[0060]〈1-1>材料的準(zhǔn)備
[0061]從Gibco BRL, Life Technologies(Paisley, Scotland)購美了用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)、膜蛋白酶 EDTA、青霉素(penicillin)/鏈霉素(streptomycin)/ 兩性霉素(amphotericin)(分別為 10,000U/ml, 10,000 μ g/ml 及2, 500 μ g/ml )、胎牛血清(FBS)試劑。另外，從 ATCC (American Type CultureCoIIection,USA)購買了 B16F1 細(xì)胞株(cell line),并從 Sigma Chemical C0.(St.Louis, MO, USA)購買了 MTT試劑、白明膠(gelatin)、瓊脂糖(agarose)和其他試劑。
[0062]〈1-2>試料的制造[0063]通過如下的方法來提取了白茯苓酒精提取物(在本發(fā)明中，將白茯苓酒精提取物命名為“PCEE ”)、油溶性甘草提取物(在本發(fā)明中，將油溶性甘草提取物命名為“GUEE ”)、榆白皮酒精提取物(在本發(fā)明中，將榆白皮酒精提取物命名為“UMEE ”)以及它們?nèi)齻€的混合物(在本發(fā)明中，將白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物、榆白皮酒精提取物的混合物命名為“P⑶E”)。
[0064]首先，將白茯苓、榆白皮用流動的水清洗干凈之后，使其完全自然干燥。將清洗、干燥的所述白茯苓、榆白皮在酒精中提取3天，將所述提取物過濾之后，將過濾的濾液減壓并濃縮而獲得了粉末形態(tài)的白茯苓、榆白皮酒精提取物。在甘草提取物的情況下，用無水乙醇來提取甘草根，并將所獲得的提取物再用乙酸乙酯(ethyl acetate)提取之后，把將提取液減壓、濃縮并干燥的油溶性提取物制造成粉末形態(tài)，將制造的粉末形態(tài)的試料稀釋為實(shí)驗(yàn)濃度而用于本發(fā)明中。
[0065]<實(shí)施例2>
[0066]MTT assay 分析
[0067]本發(fā)明人為了分析通過實(shí)施例1的方法來制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的MTT assay,根據(jù)Hansen [10]的方法，利用MTT(溴化3_ (4，5_ 二甲基_2基)_2，5- 二苯基四唑(3- (4, 5-dimethyl-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoIium bromide))而測定了對于B16F1 細(xì)胞的 PCEE、GUEE, UMEE, PGUE 的細(xì)胞毒性。
[0068]在測定對于B16F1細(xì)胞的各個試料的細(xì)胞毒性的結(jié)果，如圖1所示，可知PCEE、GUEE, UMEE、PGUE在3.12 μ g/ml以下的濃度下，與對照組相比，沒有任何的毒性效果(參照圖1)。
[0069]<實(shí)施例3>
[0070]DPPH自由基分析
[0071]本發(fā)明人為了測定通過實(shí)施例1的方法來制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的DPPH自由基消除能力，將Brand-WiIIiams實(shí)驗(yàn)方法變形而測定了 PCEE、GUEE、UMEE、PGUE 對于 1，1-二苯基-2-苦餅基(1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (DPPH)自由基的消除能力。將各個試料處理為實(shí)驗(yàn)濃度之后，混合10秒鐘，并使它們在室溫下反應(yīng)20分鐘之后，在525nm下測定了吸光度。另外，DPPH自由基含量是將試料添加組和對照組的吸光度比換算為％值而表示的。
[0072]通常，DPPH自由基消除法作為以將抗氧化物質(zhì)所致的DPPH自由基的脫色程度為指標(biāo)而預(yù)測氧化抑制程度的尺度來使用，在此顯示出分別單獨(dú)使用的組和處理了混合溶液的組對于DPPH自由基的消除能力與濃度成正比地增加，特別是它們的混合物即PGUE在15.6 μ g/ml的濃度以上中顯示出78%的DPPH自由基消除能力。這表示:與作為陽性對照組的100 μ g/ml的維生素C相比，PGUE的消除能力提高了 10% (參照圖2)。
[0073]<實(shí)施例4>
[0074]還原力分析
[0075]本發(fā)明人為了分析通過實(shí)施例1的方法來制造的白茯苓、榆白皮及甘草的混合提取物的還原力，根據(jù)Oyaizu的方法來進(jìn)行了測定。
[0076]在PCEE、GUEE, U MEE, PGUE中依次分別加入Iml的ρΗ6.6的200mM磷酸緩沖溶液及I %的赤血鹽(potassium ferricyanide)而攪拌之后,在50°C的水浴中反應(yīng)了 20分鐘。在其中加入Iml的10% TCA溶液而在13，500 Xg中進(jìn)行15分鐘的離心分離而獲得的上等液Iml中,將蒸懼水及氯化鐵(ferric chloride)分別加入Iml而混合之后,在700nm下測定了吸光度。作為陽性對照組而使用了 0.01%的維生素C，將試料添加組和對照組的吸光度比換算為％值而示出了試料的還原力。
[0077]其結(jié)果，在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中未顯示出還原力，但是GUEE、UMEE、PGUE的還原力與濃度成正比地增加。GUEE在62.5 μ g/ml濃度下顯示出了 150%的還原力，UMEE和PGUE在62.5 μ g/ml濃度下，UMEE顯示出350%的還原力，PGUE顯示出270%的還原力，可知比作為陽性對照組而使用的10 μ g/ml的維生素C還原力優(yōu)異(參照圖3)。
[0078]另外,本發(fā)明人利用從B16F1細(xì)胞分離的genomic DNA,對于由fenton反應(yīng)發(fā)生的輕自由基(hydroxyl radical)所致的DNA的氧化損傷,調(diào)查了 PGUE的抗氧化效果,其結(jié)果對照組的genomic DNA被分解為如圖4所示那樣。但是，在添加了 PGUE的組中，對于DNA的氧化損傷的保護(hù)效果根據(jù)濃度而增加，在62.5 μ g/ml中顯示出130%的較高的保護(hù)效果(參照圖4)。
[0079]<實(shí)施例5>
[0080]對于脂質(zhì)過氧化的抗氧化活性分析
[0081 ] 為了了解在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE )中是否存在對于脂質(zhì)過氧化的抗氧化活性，使PCEE、GUEE, UMEE, PGUE與亞麻酸乳液(Iinolenicacid emulsion)混合30分鐘而形成0.0625,0.125,0.25,0.5、I %的濃度之后，使混合了0.8mM H2O2及0.8mM FeSO4的溶液反應(yīng)5小時，然后添加0.4% TBA，在95°C下反應(yīng)2小時，并在室溫下反應(yīng)了 10分鐘。然后，添加500 μ I的15:1比例的正丁醇:吡啶溶液，在1，OOOXg下進(jìn)行10分鐘的離心分離，對于由此獲得的上清液在532nm下測定了吸光度，脂質(zhì)過氧化程度是將試料添加前后的吸光度比換算為％值而顯示的。
[0082]其結(jié)果，在對各個試料進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，PCEE, GUEE, UMEE未顯示出有效的抑制效果，但是作為白茯苓酒精提取物、油溶性甘草提取物及榆白皮酒精提取物的混合物的本發(fā)明的PGUE在7.8 μ g/ml以上的濃度下，抑制了 17 %的脂質(zhì)過氧化，在15.6 μ g/ml的濃度下，與作為陽性對照組而使用的1000 μ g/ml的維生素E類似地抑制了 20%程度的脂質(zhì)過氧化(參照圖5)。
[0083]<實(shí)施例6>
[0084]酪氨酸酶的活性分析
[0085]酪氨酸酶作為在人體內(nèi)的黑色素生合成路徑中最重要的初期速度決定階段中涉及到的酶，很多美白成分具有抑制該酶的作用機(jī)制。因此，本發(fā)明人為了了解在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在美白活性，測定了酪氨酸酶的活性。
[0086]首先，在試管中依次放入了 0.1M磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.5)220 μ I和試料液20 μ I以及蘑菇酪氨酸酶(1500U/mL)液20 μ I。在該溶液中放入1.5mM的塔羅素液40 μ I，并在37°C下反應(yīng)10~15分鐘之后,利用ELISA reader而在490nm下測定了吸光度。[0087]其結(jié)果，如圖6所示，白茯苓酒精提取物(PCEE)和榆白皮酒精提取物(UMEE)未顯示出酪氨酸酶抑制效果，但是在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中，酪氨酸酶的抑制效果根據(jù)處理濃度而增加。另外，本發(fā)明的混合物(PGUE)在31.2 μ g/ml濃度下,與作為陽性對照組而使用的2000 μ g/ml的熊果苷(arbutin)的效能相t匕，顯示出更加優(yōu)異的酪氨酸酶活性抑制效果(參照圖6 )。
[0088]因此，可知本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)與單獨(dú)處理白茯苓、甘草及榆白皮提取物的組相比，酪氨酸酶活性抑制效果明顯優(yōu)異。
[0089]<實(shí)施例7>
[0090]黑色素生成分析 [0091]為了了解在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否具有美白活性而測定了黑色素生成程度。
[0092]首先，在6-孔板中以3 X 105ce 11 s/we 11分開種植了細(xì)胞，并處理了試料，在I小時后用L-dopa刺激了黑色素的生成，然后進(jìn)行了 48小時的細(xì)胞培養(yǎng)。收集細(xì)胞而在1，200rpm下進(jìn)行5分鐘的離心處理而沉淀之后，通過Iml均化劑(均化緩沖液，50mM磷酸鈉，pH6.5，
I% Triton X-100,2mM PMSF)進(jìn)行了溶解。在此，在所獲得的顆粒中添加200 μ I的IN NaOH(10% DMSO)而混合(vortex)后,在405nm下測定了吸光度，并利用由黑色素標(biāo)準(zhǔn)(Sigma,USA)獲得的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)線而算出了在各個孔中所生成的黑色素量。關(guān)于黑色素，比較了在單位細(xì)胞(IO4Cells)中的黑色素生成量。
[0093]另外，本發(fā)明人為了調(diào)查通過多巴(DOPA)刺激的黑色素生成調(diào)節(jié)效果，使用B16F1細(xì)胞而測定了黑色素含量，其結(jié)果白茯苓酒精提取物(PCEE)在3.12 μ g/ml濃度下，與對照組相比，抑制了 9%的黑色素的生成，在6.25 μ g/ml的濃度下，與作為陽性對照組而使用的熊果苷(arbutin)抑制效果類似。
[0094]在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)的情況下，在
6.25 μ g/ml濃度下，與對照組相比，黑色素生成抑制效果更有意識性(P < 0.01)，在利用INNaOH而測定細(xì)胞內(nèi)的黑色素的結(jié)果，如圖7所示地，除了示出受到色素的影響而增加的形態(tài)的甘草提取物(GUEE)組之外，白茯苓酒精提取物(PCEE)在0.39 μ g/ml以上濃度下，抑制了 25%以上的黑色素合成。
[0095]在本發(fā)明中作為陽性對照組而使用的2000 μ g/ml的熊果苷抑制了 25%程度的黑色素的合成。榆白皮酒精提取物(UMEE )也顯示出與白茯苓酒精提取物(PCEE )類似的效果，在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)的情況下，在0.78 μ g/ml以上濃度下，抑制了 23%的黑色素的合成。
[0096]<實(shí)施例8>
[0097]蛋白質(zhì)印跡分析
[0098]為了確認(rèn)在本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)中是否存在作為在黑色素形成中重要的酶的酪氨酸酶和在黑色素生成信號傳達(dá)機(jī)制中重要的TRP-1 (與酪氨酸酶有關(guān)的蛋白-1 (tyrosinase related protein-1))和TRP_2(與酪氨酸酶有關(guān)的蛋白_2 (tyrosinase related protein-2))及在抗氧化酶中作為最重要的SOD(超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase))的S0D-1的蛋白質(zhì)表達(dá),進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。
[0099]首先，在5% CO2及在37°C中維持了 95 %以上的濕度的培養(yǎng)器中，在包括10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺及100 μ g/ml青霉素一鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 B16F1細(xì)胞。[0100]在B16F1 細(xì)胞中添加噴涌緩沖溶液(50mM TrisHCl, pH7.5,0.4% Nonidet P-40，120mM NaCl, 1.5mM MgC12, 2mM 苯甲基橫酸基氟(phenylmethylsulfonyl fluoride),80μ g/ml亮抑蛋白肽酶(leupeptin),3mM NaF和ImM DTT),在4°C下進(jìn)行了 30分種的處理。在10% TrisHCl凝膠中對10 μ g的細(xì)胞噴涌液進(jìn)行電泳之后，電氣地將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移為硝酸纖維膜(nitrocellulose membrane)。
[0101]然后，將10 %脫脂油預(yù)先處理到硝酸纖維膜(nitrocellulose membrane),處理對目標(biāo)蛋白質(zhì)的一次抗體(抗-酪氨酸酶(ant1-tyrosinase),抗-TRP-1,抗-TRP-2,抗-S0D-1,抗-β -肌動蛋白(ant1-beta-actin))之后，處理二次抗體,然后使用化學(xué)突光劑 chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)而檢測了目標(biāo)蛋白質(zhì)。利用LAS3000圖像分析儀(Fujifilm Life Science,Tokyo, Japan)而觀察了蛋白質(zhì)印跡的區(qū)域。
[0102]其結(jié)果，顯示出白茯苓酒精提取物(PCEE)減少了 S0D-1的蛋白質(zhì)的表達(dá)，對于與黑色素生成相關(guān)的其他蛋白質(zhì)的表達(dá)并未產(chǎn)生影響。這樣的結(jié)果表示由白茯苓的氧化力減少作為抗氧化酶的S0D-1的蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0103]但是，可知本發(fā)明的白茯苓、甘草及榆白皮的酒精提取物的混合物(PGUE)與對照組相比，在3.12 μ g/ml濃度下，對TRP-2和酪氨酸酶蛋白質(zhì)的表達(dá)未產(chǎn)生影響，但減少了TRP-1及S0D-1的表達(dá)(參照圖8)。
[0104]〈實(shí)施例9>
[0105]統(tǒng)計處理
[0106]通過將各個實(shí)驗(yàn)反復(fù)進(jìn)行3次以上而得到其結(jié)果，對于各自的試料濃度顯示為平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差。關(guān)于對各個試料濃度組的有意差檢驗(yàn)，與對照組比較而進(jìn)行Student’ sttest之后,將p < 0.05值統(tǒng)計為有意義的結(jié)果。
[0107]以上，對于本發(fā)明，以其優(yōu)選實(shí)施例為中心進(jìn)行了說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)特性的范圍內(nèi)能夠以變形的形態(tài)來實(shí)現(xiàn)。因此，所公開的實(shí)施例并不是限定本發(fā)明，而是對本發(fā)明進(jìn)行說明。本發(fā)明的范圍并不體現(xiàn)在上述說明中，而是記載于權(quán)利要求書中，在與此相同的范圍內(nèi)的所有區(qū)別點(diǎn)均包括在本發(fā)明中。
【權(quán)利要求】
1.一種皮膚美白用化妝料組合物，其特征在于，該皮膚美白用化妝料組合物包含白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物，作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚美白用化妝料組合物，其特征在于， 所述白茯苓提取物在化妝料組合物的總重量份中占0.0Ol重量％~2重量％，榆白皮提取物在化妝料組合物的總重量份中占0.001重量％~2重量％，甘草提取物在化妝料組合物的總重量份中占0.001重量％~5重量％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚美白用化妝料組合物，其特征在于， 所述白茯苓、榆白皮及甘草混合提取物使用從以下的組中選擇出的溶劑而進(jìn)行提取:水、碳數(shù)為I~4個的無水或含水低級醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸異丁酯以及1，3-丁二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚美白用化妝料組合物，其特征在于， 所述化妝料組合物具有酪氨酸酶活性阻礙和/或者黑色素生合成阻礙效果。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚美白用化妝料組合物，其特征在于， 所述化妝料組合物形成為從以下的組中選擇的劑型:溶液、懸浮液、乳液、糊狀物、凝膠、膏狀物、護(hù)膚液、粉、香皂、含有表面活性劑的洗面奶、油、粉末狀粉底、乳液狀粉底、蠟型粉底及噴霧。
【文檔編號】A61Q1/12GK103599020SQ201310567094
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】金文武, 吳榮姬, 南香, 權(quán)恩廷, 樸慧貞, 李守卿, 洪秀暻, 金相珉 申請人:芽美化妝品有限公司