γ-氨基丁酸（GABA）和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及γ-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于：通過均質(zhì)工藝將γ-氨基丁酸和新型小肽添加在化妝品中，其中所述的新型小肽為：（a）Glu-Glu-Lys-Ala-Asp所示的序列組成的小肽；（b）Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro所示的序列組成的小肽；或（c）Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的序列組成的小肽。該小肽能與GABA轉(zhuǎn)運蛋白GAT-1結(jié)合，降低其對GABA的攝取功能，還能與Syntaxin1A競爭性結(jié)合SNAP-25，最終造成興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞抑制，從而抑制了神經(jīng)傳遞，減輕了肌肉收縮和面部皺紋。本發(fā)明首次將神經(jīng)遞質(zhì)攝取通路抑制劑與神經(jīng)細(xì)胞抑制因子在化妝品中聯(lián)合應(yīng)用，使用功能小肽JKB-A和神經(jīng)細(xì)胞抑制因子GABA對天然抑制通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，比現(xiàn)有的抗皺類產(chǎn)品更加安全高效，而且生產(chǎn)成本低，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】Y-氨基丁酸(GABA)和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及Y -氨基丁酸(GABA)和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，具體涉及Y -氨基丁酸(GABA)和一種具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類似功能的小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，屬于日化產(chǎn)品/生物技術(shù)產(chǎn)品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)遞質(zhì)是指神經(jīng)元在進(jìn)行化學(xué)突觸傳遞過程中，起信息傳遞的化學(xué)物質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元細(xì)胞中合成，存儲于神經(jīng)末梢的突觸小泡中，在外界刺激的作用下，一種稱為N-乙基馬來酸胺敏感因子附著蛋白受體(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor proteins, SNARE)的蛋白刺激突觸小泡,使其釋放出神經(jīng)遞質(zhì)，并經(jīng)突觸縫隙到達(dá)突觸后膜，產(chǎn)生突觸去極化電位或超極化電位，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)興奮性升高或降低。
[0003]SNARE是一類位于細(xì)胞器及膜泡膜上的跨膜蛋白家族，介導(dǎo)膜泡與靶膜的準(zhǔn)確識別。SNARE復(fù)合體(SNARE complex)由兩個位于細(xì)胞質(zhì)膜上的定向SNARE蛋白(target-SNARE) SyntaxinlA、SNAP-25以及一個位于囊泡膜上的囊泡SNARE蛋白(vesicle-SNARE)VAMP-2三者組成。在參與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程中，SyntaxinlA和SNAP-25首先形成一個中間復(fù)合體， 即定向SNARE復(fù)合體(target-SNARE complex),再與VAMP-2結(jié)合，形成SNARE復(fù)合體。
[0004]主要的神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿、兒茶酚胺、谷基酸、多巴胺(DA)、5_羥色胺(5-HT)、Y-氨基丁酸(GABA)、P物質(zhì)和一氧化氮等。其中GABA和谷氨酸為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其他均為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。
[0005]從生理上來講，皺紋的產(chǎn)生與面部肌肉纖維的緊張收縮有關(guān)。在外界作用下，SNARE受體刺激突觸小泡，使其釋放出乙酰膽堿、兒茶酚胺等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，促使肌肉發(fā)生收縮。而通過直接減少肌肉運動收縮或減弱神經(jīng)遞質(zhì)對肌肉收縮的作用可以減少皺紋的產(chǎn)生或者消除已經(jīng)生成的皺紋。
[0006]Y-氨基丁酸(Y — aminobutyric acid,GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)，約50%的中樞神經(jīng)突觸部位以GABA為遞質(zhì)。GABA可以快速穿透皮膚，釋放皺紋，淡化細(xì)紋，增強肌肉本身的放松機能，從而減壓美容的效果。另外，GABA可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，具有安定、促進(jìn)放松和消除神經(jīng)緊張的作用。但體內(nèi)GABA的作用會受到機體自身終止途徑的干擾，降低GABA的效果或者縮短GABA的有效作用時間。
[0007]神經(jīng)遞質(zhì)的作用可通過兩個途徑中止:一是再回收抑制，即通過突觸前載體的作用將突觸間隙中多余的神經(jīng)遞質(zhì)回收至突觸前神經(jīng)元并貯存于囊泡；另一途徑是酶解，如以多巴胺(DA)為例，它經(jīng)由位于線粒體的單胺氧化酶(MAO)和位于細(xì)胞質(zhì)的兒茶酚胺鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的作用被代謝和失活。[0008]GABA轉(zhuǎn)運蛋白(GABA transporter)會重攝取突觸間隙中的GABA以終止突觸的信號傳遞。syntaxinlA及SNAP-25/syntaxinlA復(fù)合體(即定向SNARE復(fù)合體)可以與位于神經(jīng)元上的GABA轉(zhuǎn)運蛋白GAT-1 (GABA transporter-1)亞型直接結(jié)合，從而抑制它的重攝取功能。SNAP-25與syntaxinlA結(jié)合加強了 syntaxinlA與GAT-1的相互作用，從而顯著增強了 syntaxinlA介導(dǎo)的對GAT-1重攝取功能的抑制。例如,一氧化氮(NO)促進(jìn)的syntaxinlA與SNAP-25結(jié)合以及SNARE復(fù)合體形成能夠加強syntaxinlA與GAT-1的相互作用，從而抑制GAT-1對GABA的重攝取。
[0009]當(dāng)前已有部分開發(fā)的產(chǎn)品及其相關(guān)發(fā)明涉及通過阻斷乙酰膽堿在神經(jīng)-肌肉接頭處的釋放和抑制SNARE受體的合成，引起臉部肌肉組織的松弛，釋放皺紋。如A型肉毒毒素(Botox)結(jié)合到神經(jīng)元細(xì)胞膜，通過鈣和pH依賴易位過程進(jìn)入細(xì)胞，并以溫度和鋅離子依賴方式阻斷SNARE位點，從而抑制了鈣依賴性神經(jīng)元的細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，使得肌肉因沒有接受到信息而不產(chǎn)生收縮。雖然Botox除皺效果優(yōu)異，但因其毒性強，只能在醫(yī)囑條件下謹(jǐn)慎使用，難以普及。因此另有公司試圖合成與SNAP-25類似的小肽，以期達(dá)到與Botox相似的功效，如西班牙LipoTec公司的Agriline和法國Kappa Biotech公司開發(fā)的LETTICELINE。該小肽是一種已肽物(Ac_EEMQRR_NH2)，模仿了 SNAP-25的末端鏈，可與SNAP-25競爭占有SNARE中的位置，從而抑制了鈣依賴性兒茶酚胺從親鉻細(xì)胞中釋放出來。
[0010]由于目前已開發(fā)和申請專利的抑制劑主要是通過強烈阻斷完整的神經(jīng)細(xì)胞信號通路達(dá)到目的，因此可能會引起正常細(xì)胞的信號通路紊亂。如果能夠利用機體中存在的天然神經(jīng)信號抑制通路，既可以達(dá)到抑制神經(jīng)興奮，阻止肌肉收縮的效果，又可以避免外在強制阻斷信號通路的弊端。如前所述，GABA是一種天然存在的抑制性神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)，在神經(jīng)信號抑制通路中起重要作用，但目前在體外使用含有GABA的產(chǎn)品涂抹皮膚，大多未發(fā)現(xiàn)有明顯的體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)抑制效應(yīng)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明人對抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的信號通路進(jìn)行了深入研究，最終設(shè)計出了一種具有SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域類似功能的小肽(在本文中稱為JKB-A小肽)，實現(xiàn)了對GABA的再回收抑制。并且在化妝品中偶聯(lián)利用GABA與GABA回收途徑抑制劑JKB-A小肽，因而提高局部GABA的有效作用濃度，降低機體對GABA的回收終止作用，從而達(dá)到減輕肌肉收縮和面部皺紋的功效。目前，還沒有關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)攝取通路抑制劑與神經(jīng)細(xì)胞抑制因子在化妝品中聯(lián)合應(yīng)用的報道和專利申請。
[0012]因此，本發(fā)明的目的在于提供Y -氨基丁酸和JKB-A小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有Y -氨基丁酸和JKB-A小肽的抗皺類產(chǎn)品。
[0014]一方面，本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0015]Y-氨基丁酸和JKB-A小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，是通過均質(zhì)工藝將Y -氨基丁酸和JKB-A小肽添加在化妝品中，其中所述的JKB-A小肽為:
[0016](a) Glu-Glu-Lys-Ala-Asp (SEQ ID NO:1)所示的序列組成的小肽；
[0017](b) Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro (SEQ ID NO:2)所示的序列組成的小肽；或
[0018](c)Glu-Glu-Lys-Ala-Asn (SEQ ID NO:3)所示的序列組成的小肽。
[0019]本發(fā)明人將JKB-A小肽在UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比搜索，未發(fā)現(xiàn)有功能相同的同類小肽。本發(fā)明人利用分析程序，按照本領(lǐng)域技術(shù)的默認(rèn)參數(shù)對JKB-A小肽與SyntaxinlA的同源性進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果得出JKB-A與SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能類似，而SyntaxinlA H3結(jié)構(gòu)域已被鑒定為結(jié)合SNAP-25和GAT-1的位點(Fan, et al., SNAP-25/syntaxinlA complex functionally modulates neurotransmittergamma-aminobutyric acid reuptake.J Biol Chem.2006;281(38):28174-84)。[0020]本發(fā)明通過聯(lián)合應(yīng)用功能小肽JKB-A和神經(jīng)細(xì)胞抑制因子GABA，增強了對GAT-1的重攝功能的抑制，從而延長GABA的抑制作用，提高局部GABA的有效作用濃度。同時，本發(fā)明人通過實驗還證實JKB-A小肽在體外能夠與SyntaxinlA競爭性結(jié)合SNAP-25，導(dǎo)致SNARE復(fù)合體的結(jié)合效率降低甚至解聚。因為JKB-A小肽和SNAP-25形成的中間復(fù)合體，不能再與VAMP-2結(jié)合形成SNARE復(fù)合體，進(jìn)一步阻止了皮膚神經(jīng)細(xì)胞中的乙酰膽堿、兒茶酚胺等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)經(jīng)SNARE的激活作用，從而抑制了神經(jīng)傳遞，減輕了肌肉收縮和面部皺紋。
[0021]由于本發(fā)明JKB-A小肽為僅有5~7個氨基酸序列的小肽，所以本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很容易對JKB-A小肽的氨基酸序列進(jìn)行本領(lǐng)域常規(guī)的改變而不改變其功能，所述改變例如進(jìn)行常規(guī)取代、缺失或添加等操作，尤其是進(jìn)行非極性氨基酸間或是極性氨基酸間(特別是不帶電荷的極性氨基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負(fù)電荷)的極性氨基酸間)的取代。
[0022]本發(fā)明的GABA的可通過現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)合成法或生物合成法制備，或直接通過商業(yè)化途徑購買。
[0023]作為對上述技術(shù)方案的改進(jìn)，其中每克化妝品中新型JKB-A小肽的含量為0.08~
0.20mg,純度為90~99% ;每克化妝品中Y -氨基丁酸的含量為0.05~0.30mg,純度為
85 ~99%。
[0024]作為對上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述的均質(zhì)工藝具體包括以下步驟:將化妝品原料中需要加熱的成分分為油性組分和水性組分，分別加熱后混合，接著勻質(zhì)乳化，再將乳化原料冷卻至35~50V，加入不需加熱的組分以及調(diào)配好的所述新型JKB-A小肽氨基丁酸溶液，攪拌均勻，真空脫氣。
[0025]作為對上述技術(shù)方案的改進(jìn)，通過納米包封工藝將所述的新型JKB-A小肽制成穩(wěn)定的納米顆粒溶液，所述納米包封工藝中所用的載體材料為殼聚糖。
[0026]作為對上述技術(shù)方案的改進(jìn)，其中所述納米包封顆粒的制備工藝具體包括以下步驟:
[0027]( I)所述新型JKB-A小肽經(jīng)脫鹽、純化處理后，溶解在一定體積二硫蘇糖醇水溶液中，使得所述新型JKB-A小肽的終濃度達(dá)到10~25mg/mL ；
[0028](2)在均勻磁力攪拌下，將步驟(1)所得的溶液滴加到溶解有殼聚糖的HAc-NaAc緩沖溶液中，再加入多聚磷酸鈉使所述新型小肽的終濃度達(dá)到3.39~8.47mM ；
[0029](3)將步驟(2)所得到的溶液在16°C下反應(yīng)4小時，即可得到包封有所述新型JKB-A小肽的殼聚糖納米顆粒懸濁液；
[0030](4)將步驟(3)所得到的納米顆粒懸濁液在0~20°C下透析，即可得到所述新型JKB-A小肽的納米顆粒溶液。
[0031]所述的新型JKB-A小肽是使用自動多肽合成儀合成的或是用基因工程方法制備的，也可以是通過酶解切割細(xì)胞培養(yǎng)液天然分離的SyntaxinlA得到的。其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列測序結(jié)果如圖3所示，
[0032]在上述技術(shù)方案中，所述的化妝品包括抗皺類產(chǎn)品、功能性化妝品、藥物類化妝品和美容類化妝品。
[0033]進(jìn)一步，所述抗皺類產(chǎn)品包括眼霜、面霜、潤膚霜、護(hù)手霜、日霜、晚霜、緊膚水和化妝水；所述功能性化妝品包括美白護(hù)膚品、抗皺護(hù)膚品、保濕護(hù)膚品、祛痘護(hù)膚品和抗汗護(hù)膚品；所述藥物類化妝品包括除皺化妝品、育發(fā)化妝品和美乳化妝品；所述美容類化妝品包括面膜、底霜、唇膏和胭脂。
[0034]另一方面，本發(fā)明提供了一種抗皺類產(chǎn)品，所述抗皺類產(chǎn)品含有相當(dāng)于所述抗皺類產(chǎn)品質(zhì)量80~200ppm的新型JKB-A小肽以及50~300ppm的Y _氨基丁酸。
[0035]另一方面，本發(fā)明提供了一種眼霜，主要含有如下按質(zhì)量百分比計的成分:
[0036]
【權(quán)利要求】
1.Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:通過均質(zhì)工藝將Y-氨基丁酸和新型小肽添加在化妝品中，其中所述的新型小肽為: (a)Glu-Glu-Lys-Ala-Asp所示的序列組成的小肽； (b)Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro所示的序列組成的小肽；或 (c)Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的序列組成的小肽。
2.如權(quán)利要求1所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:其中每克化妝品中新型小肽的含量為0.08~0.20mg，純度為90~99% ;每克化妝品中Y -氨基丁酸的含量為0.05~0.30mg,純度為85~99%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:所述的均質(zhì)工藝具體包括以下步驟:將化妝品原料中需要加熱的成分分為油性組分和水性組分，分別加熱后混合，接著勻質(zhì)乳化，再將乳化原料冷卻至35~50°C，加入不需加熱的組分以及調(diào)配好的所述新型小肽-Y -氨基丁酸溶液，攪拌均勻，真空脫氣。
4.如權(quán)利要求3所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:通過納米包封工藝將所述的新型小肽制成穩(wěn)定的納米顆粒溶液，所述納米包封工藝中所用的載體材料為殼聚糖。
5.如權(quán)利要求4所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:所述納米包封顆粒的制備工藝具體包括以下步驟: (1)所述新型小肽經(jīng)脫鹽、純化處理后，溶解在一定體積二硫蘇糖醇水溶液中，使得所述新型小肽的終濃度達(dá)到10~25mg/mL ； (2)在均勻磁力攪拌下，將步驟(1)所得的溶液滴加到溶解有1%(W/V)殼聚糖的HAc-NaAc緩沖溶液中，再加入多聚磷酸鈉使所述新型小肽的終濃度達(dá)到3.39~8.47mM ； (3)將步驟(2)所得到的溶液在16°C下反應(yīng)4小時，即可得到包封有所述新型小肽的殼聚糖納米顆粒懸池液； (4)將步驟(3)所得到的納米顆粒懸濁液在0~20°C下透析，即可得到所述新型小肽的納米顆粒溶液。
6.如權(quán)利要求1或2所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:所述的新型小肽是使用自動多肽合成儀合成的或是用基因工程方法制備的，也可以是通過酶解切割細(xì)胞培養(yǎng)液天然分離產(chǎn)物得到的。
7.如權(quán)利要求1或2所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:所述的化妝品包括抗皺類產(chǎn)品、功能性化妝品、藥物類化妝品和美容類化妝品。
8.如權(quán)利要 求7所述的Y-氨基丁酸和一種新型小肽在化妝品中的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:所述抗皺類產(chǎn)品包括眼霜、面霜、潤膚霜、護(hù)手霜、日霜、晚霜、緊膚水和化妝水；所述功能性化妝品包括美白護(hù)膚品、抗皺護(hù)膚品、保濕護(hù)膚品、祛痘護(hù)膚品和抗汗護(hù)膚品；所述藥物類化妝品包括除皺化妝品、育發(fā)化妝品和美乳化妝品；所述美容類化妝品包括面膜、底霜、唇膏和胭脂。
9.一種抗皺類產(chǎn)品，其特征在于:如權(quán)利要求1所述的新型小肽以及Y-氨基丁酸在所述抗皺類產(chǎn)品中的含量分別為80~200ppm和50~300ppm。
10.一種含有如權(quán)利要求1所述的新型小肽以及Y-氨基丁酸的眼霜，其特征在于主要含有如下按質(zhì)量百分比計的成分:
【文檔編號】A61Q19/02GK103637925SQ201310651647
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】趙偉, 李波 申請人:廣州健坤生物科技有限公司