索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及不同質(zhì)量濃度的索拉膠溶液在保護(hù)對(duì)紫外線UVA導(dǎo)致的皮膚損傷中的用途，本發(fā)明所采用的細(xì)胞模型為紫外線UVA所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，索拉膠的給藥量為0.625μg/μl～5μg/μl，本發(fā)明所采用的小鼠模型為紫外線UVA所誘導(dǎo)的小鼠皮膚損傷模型，索拉膠的給藥量為200μl的1%的溶液，索拉膠能提高細(xì)胞在紫外照射下的細(xì)胞存活率，降低小鼠皮膚中的炎癥因子和提高合成膠原蛋白的基因表達(dá)，從而抑制由紫外線UVA導(dǎo)致的皮膚損傷。本發(fā)明經(jīng)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明索拉膠具有顯著的抑制紫外線UVA對(duì)皮膚損傷的作用，故索拉膠可用于紫外線UVA對(duì)皮膚損傷的預(yù)防與修復(fù)過程，可制備抗紫外線輻射損傷藥物和抗紫外輻射化妝品。
【專利說明】索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥、化妝品【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紫外線是電磁波譜中波長從IOnm到400nm輻射的總稱，依據(jù)紫外線自身波長的不同，主要將紫外線分為三個(gè)區(qū)域，即短波紫外線(UVC)、中波紫外線(UVB)和長波紫外線(UVA)0紫外線對(duì)人體皮膚的滲透程度是不同的。長波紫外線可達(dá)到真皮深處，引起皮膚黑色素沉著，使皮膚曬黑、脂質(zhì)和膠原蛋白受損，長期積累，是導(dǎo)致皮膚老化和嚴(yán)重?fù)p害的主要原因。
[0003]目前，市場上的抗紫外線的防曬產(chǎn)品主要有物理性防曬品、化學(xué)性防曬品和物理化學(xué)相結(jié) 合的防曬品。物理防曬霜常用的是一些非常細(xì)的礦物質(zhì)顆粒，如氧化鋅、二氧化鈦等，同時(shí)還會(huì)加入一些滑石粉和鈣，形成一層保護(hù)膜，用來散射和吸收紫外線，其缺點(diǎn)是:必須涂得很厚，比較油膩，容易堵塞毛孔，并且在陽光下由于出汗溶化而影響美觀?；瘜W(xué)防曬是利用化學(xué)反應(yīng)，替皮膚吸收陽光中的紫外線，化學(xué)防曬品用后效果自然，顯得相對(duì)輕盈清透，這是化學(xué)防曬最大的優(yōu)勢，缺點(diǎn)是:化學(xué)防曬添加劑較多，其中的一些有效成分可能引起個(gè)別肌膚的過敏，且涂后半小時(shí)才發(fā)揮作用，長期使用對(duì)皮膚有一定的傷害?；瘜W(xué)物理相結(jié)合的防曬品是融合了化學(xué)性和物理性兩種防曬品的優(yōu)勢，用的比較普遍。
[0004]上世紀(jì)四十年代，圖倫大學(xué)的Diluzio博士首次從酵母細(xì)胞壁中分離得到β -葡聚糖，β_葡聚糖就得到了廣泛的關(guān)注。近年來，β_葡聚糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、個(gè)人護(hù)理品、飼料等領(lǐng)域，如含有β_葡聚糖的功能性化妝品可以滋養(yǎng)皮膚，改善皮膚外觀，并對(duì)各種皮膚病具有積極地療效(Singh RP, Agarwal R.Cosmeceuticals and silibinin.Clin Dermatol, 2009，27:479-484.)。β -葡聚糖是一種天然的高聚糖,可在皮膚上形成一層透明、有彈性、透氣的薄膜，能有效隔絕環(huán)境中有害物質(zhì)對(duì)皮膚的侵害。
[0005]索拉膠是一種土壤桿菌Agrobacterium sp.ΖΧ09分泌產(chǎn)生的胞外多糖，結(jié)構(gòu)為β-葡聚糖(中國專利，201010146371.2)。經(jīng)過急性毒理學(xué)和慢性毒理學(xué)的評(píng)價(jià)，索拉膠無毒安全。
[0006]目前已發(fā)現(xiàn)索拉膠具有降低血糖(中國專利，201010146371.2)和降低肝脂、血脂、體脂、體重和膽固醇(中國專利，201010198223.5)以及預(yù)防和治療便秘的作用，本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)索拉膠對(duì)紫外線UVA造成的皮膚損傷具有一定的抑制和/或修復(fù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是要提供一種索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用，該索拉膠具有使用方便、抑制和/或修復(fù)紫外線對(duì)皮膚的損傷的功能。
[0008]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為:一種索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用，將索拉膠溶液直接涂抹與皮膚表面。[0009]所述的索拉膠溶液的質(zhì)量濃度為0.5-1.5%。
[0010]所述的紫外線對(duì)皮膚的損傷是紫外線UVA所導(dǎo)致的。
[0011]所述的應(yīng)用包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0013]1.本發(fā)明方法中的索拉膠生產(chǎn)、提取方法簡便，可直接溶于冷水，其溶液具有優(yōu)異的抗紫外線功能，增加了皮膚對(duì)紫外線的耐受性。
[0014]2.索拉膠溶液可提高皮膚成纖維細(xì)胞在紫外線UVA下的存活率，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與經(jīng)紫外線UVA照射的正常小鼠比，涂抹索拉膠溶液的小鼠皮膚組織中的炎癥細(xì)胞因子明顯降低，合成膠原蛋白的相關(guān)基因明顯提高，HE切片顯示索拉膠明顯減輕了紫外線UVA對(duì)皮膚的損傷。
[0015]3.索拉膠配成溶液后可直接涂抹于哺乳動(dòng)物皮膚，索拉膠溶液在皮膚表面形成一層保護(hù)薄膜，可有效抵擋紫外線，可用于制備具有抑制紫外線對(duì)皮膚損傷的防曬系列的功倉泛廣1(?。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是索拉膠提高NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞在紫外照射后的細(xì)胞存活率。
[0017]圖2是索拉膠對(duì)紫外照射后小鼠皮膚炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響(A為TNF-α的mRNA表達(dá)，B為IL-1 β的 mRNA表達(dá))。
[0018]圖3是索拉膠對(duì)紫外照射后小鼠皮膚膠原蛋白基因表達(dá)的影響(A為Coll α I的mRNA表達(dá)，B為Col3 α I的mRNA表達(dá))。
[0019]圖4是索拉膠對(duì)紫外照射后小鼠皮膚形態(tài)變化的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021]實(shí)施例1索拉膠溶液的制備
[0022]索拉膠溶液的制備包括以下步驟:
[0023]I)索拉膠粗品采用改進(jìn)后的Sevag法純化。純化步驟為:
[0024]a.配制0.5%的索拉膠溶液，加熱(105°C，15min)，待冷卻至室溫時(shí)，7000r/10min,取上清，以除去殘余菌體。
[0025]b.按1:30的比例加入pH4.0的乙酸乙酸鈉溶液，以除去DNA。
[0026]c.按1:1的比例將上清與苯酚氯仿溶液(按1:1的比例配制成混合溶液)混合，劇烈振蕩約15min,7000r/10min,取上清。重復(fù)此步驟2~3次，以徹底除去蛋白。
[0027]d.向上清液中加入2倍體積的工業(yè)酒精，糖絮凝成團(tuán)狀，撈出，擠去酒精。
[0028]e.用75%的酒精洗滌沉淀2~3次，再用95%的酒精洗滌沉淀I~2次。
[0029]f.真空冷凍干燥。
[0030]2)稱取經(jīng)步驟I)得到的30mg索拉膠，溶于30ml蒸餾水中，待完全溶解后，加入6%。的苯氧乙醇(防腐劑)，混合均勻后，進(jìn)行常規(guī)滅菌后包裝為獨(dú)立小瓶，即為lwt%索拉膠溶液。用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的索拉膠溶液無需添加防腐劑，且分裝時(shí)要保證無菌操作。
[0031 ] 實(shí)施例2索拉膠對(duì)經(jīng)紫外線UVA照射的細(xì)胞存活率研究[0032]實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞。在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下培養(yǎng):細(xì)胞使用含10%的小牛血清和1%的青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(完全培養(yǎng)基)，置于37°C，5%C02的生化培養(yǎng)箱中，每2~3天更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞使用含0.25%胰酶-EDTA的胰酶液消化、傳代。
[0033]實(shí)驗(yàn)采用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同處理后，紫外線UVA照射導(dǎo)致細(xì)胞損傷，通過檢測紫外線UVA照射后細(xì)胞的存活率，評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度及索拉膠對(duì)細(xì)胞的保護(hù)程度。
[0034]NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞以2 X IO4密度種于96孔板中，設(shè)置分成6組，每組5個(gè)孔。實(shí)驗(yàn)分組情況為:CK, UVA，Salecan 組分為 0.625 μ g/μ 1、1.25 μ g/μ 1、2.5 μ g/μ 1、5 μ g/ μ I四個(gè)劑量組，其中CK為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，UVA組和Salecan四個(gè)劑量組。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，每孔均先加100 μ I的不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再按組處理，其中CK組和UVA組各加100 μ 1PBS, Salecan四個(gè)劑量組則各加100 μ I的0.125%,0.25%,0.5%和1%的索拉膠溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3小時(shí)后，UVA組和Salecan組接受30min的紫外線UVA照射，輻射劑量為18J/cm2，福射距離為20cm。照射結(jié)束后，連同CK組，一起棄去培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用凱基MTT細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測。
[0035]實(shí)施例3索拉膠對(duì)紫外照射后小鼠皮膚模型的研究
[0036]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8周齡的雄性C57BL/6J小鼠。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng):12小時(shí)光照-12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝取水和食物。將所有實(shí)驗(yàn)小鼠通過腹腔注射10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉，待麻醉充分時(shí)，固定小鼠使其背部朝上。以背部脊椎為中間線，用剪刀將背部鼠毛剪去，大小約2 X 2cm。一周后，小鼠隨機(jī)分成3組，分為CK組、UVA組、Salecan組，其中，CK組為正常對(duì)照組，UVA組為紫外線UVA照射組，這兩組在實(shí)驗(yàn)過程中給予對(duì)應(yīng)溶劑(即蒸餾水)處理；Salecan組為索拉膠溶液處理組，即在接受紫外線UVA照射前，涂抹200 μ I的索拉膠溶液，半小時(shí)后接受紫外照射，每4小時(shí)涂抹皮膚表面一次。UVA組和Salecan組接受6天共48h的紫外線UVA照射，輻射劑量為18J/cm2，輻射距離為20cm。最后一次照射24小時(shí)后，處死小鼠，取背部去毛區(qū)域的皮膚組織，用于評(píng)價(jià)皮膚損傷情況。
[0037]I)皮膚組織RNA的提取
[0038]取新鮮的背部皮膚組織約25mg,按照Invitrogen RNA提取試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄cDNA。cDNA原液稀釋20倍后用于RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl:
[0039]
【權(quán)利要求】
1.索拉膠在抑制紫外線對(duì)皮膚損傷中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的紫外線對(duì)皮膚的損傷是紫外線UVA所導(dǎo)致的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的索拉膠為質(zhì)量濃度為0.5-1.5%的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】A61Q17/04GK103735566SQ201310730754
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】張建法, 余曉紅, 詹亦貝, 陳金蘋, 周夢怡 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)