一種米酒酒糟提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種米酒酒糟提取物的制備方法及其制得的提取物和所述提取物的應(yīng)用。所述制備方法包括步驟：（1）米酒酒糟二次發(fā)酵：往米酒酒糟中加入水發(fā)酵得料液1；（2）酶解：往步驟（1）所得的料液1中加入蛋白酶和糖苷水解酶進(jìn)行酶解后過(guò)濾，得料液2；（3）純化和濃縮：將步驟（2）所得的料液2進(jìn)行脫色、脫臭后過(guò)濾，得料液3，將料液3進(jìn)行濃縮，即得米酒酒糟提取物。所述制備方法還可以包括步驟（4）或步驟（4’）時(shí)，即相應(yīng)制得米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液體制劑。本發(fā)明對(duì)米酒酒糟的利用全面和綜合，大大提高了米酒酒糟的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種米酒酒糟提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種米酒酒糟提取物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]米酒中含有10多種氨基酸，其中8種是人體自身不能合成而又必需的氨基酸。《本草綱目》里記載，米酒可以開(kāi)胃健脾、促進(jìn)消化、除濕氣、潤(rùn)皮膚、活血化游，是男女老少皆宜的營(yíng)養(yǎng)品。近代的研究表明，米酒有美容養(yǎng)顏、活氣養(yǎng)血的功效。
[0003]米酒酒糟是米酒釀造過(guò)程中的副產(chǎn)品。以稻米為原料的米酒酒糟中不僅含有未被發(fā)酵利用的稻米，而且還有大量的酵母。稻米中含有各種大小不同的肽，這些肽具有一定的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基具有較高的清除能力。酵母經(jīng)破壁提取后可以獲得其中的氨基酸、肽、核酸、維生 素等對(duì)人體具有滋養(yǎng)功效的天然活性成分。其中包括:氨基酸是皮膚角質(zhì)層中自然保濕因子(NMF)的主要成分，易被皮膚吸收；寡肽類物質(zhì)可加速皮膚真皮層中成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白和彈性蛋白的速度，使老化的表皮恢復(fù)彈性，延緩皮膚衰老；核酸及核苷酸是人體的主要遺傳物質(zhì)，具有促進(jìn)新陳代謝、提高蛋白質(zhì)合成速度等作用。
[0004]我國(guó)是米酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，米酒酒糟量大而集中，如果不及時(shí)加以處理，就會(huì)腐敗變質(zhì)，不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，還會(huì)嚴(yán)重污染周圍環(huán)境。因此，對(duì)酒糟進(jìn)行有效的綜合利用對(duì)我國(guó)的資源開(kāi)發(fā)和環(huán)境保護(hù)具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前對(duì)米酒酒糟尚缺乏有效利用的方法，一般都是直接丟棄或者作為養(yǎng)殖飼料和食用菌栽培原料，利用價(jià)值比較低的現(xiàn)狀，而提供一種米酒酒糟提取物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種米酒酒糟提取物的制備方法，其包括如下步驟:
[0007](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往米酒酒糟中加入水發(fā)酵得料液1，所述水的添加量為I~20mL/g米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為20~50°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為2~48小時(shí)；
[0008](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入蛋白酶和糖苷水解酶進(jìn)行酶解后過(guò)濾，得料液2，所述蛋白酶的添加量為I~5g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量為I~5g/L料液1，所述酶解的溫度為20~65°C，所述酶解的時(shí)間為I~16小時(shí)，所述蛋白酶的酶活為20~150萬(wàn)U/g，所述糖苷水解酶的酶活為20~150萬(wàn)U/g ；
[0009](3)純化和濃縮:將步驟(2)所得的料液2進(jìn)行脫色和脫臭處理后采用截留分子量為1500~2500道爾頓的超濾膜過(guò)濾，得料液3，將料液3進(jìn)行濃縮，即得米酒酒糟提取物。
[0010]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的米酒酒糟為本領(lǐng)域常規(guī)所述，一般指稻米(如糯米、粳米或秈米)等原料在酵母發(fā)酵工藝下進(jìn)行制酒的過(guò)程中，將體系中的發(fā)酵液過(guò)濾后所剩余的殘?jiān)?，為制備米酒所得到的副產(chǎn)物，其中富含酵母菌、未被酵母菌發(fā)酵利用的原料以及酵母發(fā)酵產(chǎn)物。[0011]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的水為本領(lǐng)域常規(guī)所述，只要滿足發(fā)酵工藝常規(guī)的潔凈度要求即可，較佳地為蒸餾水。
[0012]本發(fā)明中，步驟(1)中所述發(fā)酵為將米酒酒糟進(jìn)行二次發(fā)酵，以使米酒酒糟中剩余的物料得到更充分的分解利用，同時(shí)使米酒酒糟中含有的酵母菌得到充分增殖，并得到酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物。較佳地，所述水的添加量為3~15mL/g米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為25~45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為4~16小時(shí)。更佳地，所述水的添加量為4~10g/mL米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為32~40°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為5~12小時(shí)。最佳地，所述水的添加量為3g/mL米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為40°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為8小時(shí)。
[0013]本發(fā)明中，步驟(2)中所述的蛋白酶為本領(lǐng)域常規(guī)所述，較佳地選自堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的任一種。所述蛋白酶可以是常規(guī)市售的蛋白酶，如諾維信生物科技有限公司的堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶等均可以使用。所述的糖苷水解酶為本領(lǐng)域一般所述的糖苷水解酶，可以水解糖苷鍵，所述的糖苷水解酶較佳地選自葡聚糖酶或甘露聚糖酶。所述糖苷水解酶可以是常規(guī)市售的糖苷水解酶，如諾維信生物科技有限公司的葡聚糖酶或甘露聚糖酶等均可以使用。
[0014]本發(fā)明中，較佳地，步驟(2)中所述蛋白酶的添加量為2~4g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量為2~4g/L料液1，所述酶解的溫度為35~60°C，所述酶解的時(shí)間為2~8小時(shí)。最佳地，步驟(2)中所述蛋白酶的添加量為3g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量為3g/L料液1，所述酶解的溫度為55°C，所述酶解的時(shí)間為4小時(shí)。
[0015]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，一般的酶解過(guò)程在結(jié)束后需要進(jìn)行滅酶的操作，即將酶解反應(yīng)體系于70~100°C下放置5~30min。因此，在本發(fā)明步驟(2)中，較佳地，所述酶解在結(jié)束后還包括滅酶的步驟，即將酶解反應(yīng)體系于70~100°C下放置5~30min，以使反應(yīng)體系中的蛋白酶和糖苷水解酶失活即可。
[0016]本發(fā)明中，步驟(2)中所述的過(guò)濾為本領(lǐng)域常規(guī)所述的過(guò)濾工藝，較佳地，所述過(guò)濾采用真空抽濾，其中過(guò)濾介質(zhì)選擇濾紙，并以硅藻土助濾。
[0017]本發(fā)明中，步驟(3)中所述的脫色和脫臭處理為本領(lǐng)域常規(guī)所述的脫色和脫臭處理工藝，一般指采用安全度符合要求的具有脫色和除臭功能的物質(zhì)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行處理以去除顏色和異味。較佳地，在步驟(3)中，所述脫色和脫臭處理為使用大孔樹(shù)脂、硅藻土和活性炭中的任一種對(duì)體系進(jìn)行處理，更佳地，所述脫色和脫臭處理為在料液2中加入0.5~8%的活性炭，于30~70°C下保溫脫色、脫臭30~90分鐘，所述百分比為活性炭占料液2的質(zhì)量百分比。更佳地，所述脫色和脫臭處理為在料液2中加入I~3%的活性炭，于50~60°C下保溫脫色、脫臭40~60分鐘，所述百分比為活性炭占料液2的質(zhì)量百分比。如本領(lǐng)域常規(guī)，所述脫色和脫臭處理的最后階段一般都包括對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行過(guò)濾的步驟，以達(dá)到固液分離的目的，在過(guò)濾后收集所得濾液進(jìn)行后續(xù)操作步驟。
[0018]本發(fā)明中，步驟(3)中所述的濃縮為本領(lǐng)域常規(guī)的濃縮處理工藝，一般指減少體系中的溶劑含量以提高溶液濃度的過(guò)程。較佳地，在步驟(3)中，所述濃縮為將料液3進(jìn)行減壓濃縮。
[0019]本發(fā)明中，在步驟(3 )之后較佳地還包括步驟(4 )或步驟(4 ’)；
[0020]所述步驟(4 )為:將步驟(3 )濃縮所得的濃縮液進(jìn)行干燥，收集干燥所得的干粉即得米酒酒糟提取物的干粉；[0021]所述步驟(4’ )為:將步驟(3)濃縮所得的濃縮液與醇類混合得混合液，在所述混合液中加入防腐劑后采用0.2~0.25μπι微孔濾芯進(jìn)行保安過(guò)濾，所得濾液即為米酒酒糟提取物的液體制劑。
[0022]本發(fā)明中，步驟(4)中所述的干燥為本領(lǐng)域常規(guī)所述的干燥工藝，如噴霧干燥、真空加熱干燥等。本發(fā)明優(yōu)選噴霧干燥。
[0023]本發(fā)明中，步驟(4’)中所述的醇類為本領(lǐng)域常規(guī)所述，優(yōu)選丙二醇、丁二醇和乙醇中的任一種或多種，最優(yōu)選丙二醇。所述醇類的用量為本領(lǐng)域常規(guī)所述，只要能充分混合所述濃縮液使成穩(wěn)定的液體制劑即可，較佳地，所述醇類的用量為所述濃縮液體積的1/10~1/3。
[0024]本發(fā)明中，步驟(4’)中所述的防腐劑為本領(lǐng)域常規(guī)所述，一般是指加入后用以保持物質(zhì)原有品質(zhì)并抑制微生物繁殖從而達(dá)到延長(zhǎng)保質(zhì)期的一類添加劑，包括天然的和合成的防腐劑，只要安全性符合要求即可。本發(fā)明所述的防腐劑為一般的防腐劑即可，更優(yōu)選自尼泊金酯、山梨酸、山梨酸鉀和山梨酸鈉中的一種或多種。所述防腐劑的用量為常規(guī)，根據(jù)不同防腐劑種類而定，如山梨酸、山梨酸鉀或山梨酸鈉的常規(guī)用量可為0.05%~0.15%，尼泊金酯類的常規(guī)用量可為0.01%~0.03%，所述百分比為防腐劑占混合液的質(zhì)量百分比，如0.02%即指在100g混合液中加入0.02g防腐劑。
[0025]利用本發(fā)明所述的制備方法制得的米酒酒糟提取物主要由30%~95%的分子量小于1000道爾頓的寡肽、氨基酸和核苷酸組成，其物化性質(zhì)能夠滿足化妝品和藥品領(lǐng)域的使用要求。
[0026]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是:如前所述的制備方法制備而得的米酒酒糟提取物。
[0027]本發(fā)明中，當(dāng)前述制備方法優(yōu)選地包括步驟(4)或步驟(4’)時(shí)，即相應(yīng)制得米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液體制劑。
[0028]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是:如前所述的米酒酒糟提取物、米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液體制劑在制備抗衰老、抗氧化、美白的化妝品和/或藥物中的應(yīng)用。
[0029]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0030]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0031]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明提供了一種從米酒酒糟中提取功效物質(zhì)的方法，通過(guò)采用生物酶法技術(shù)、低溫水解技術(shù)和脫色、脫臭技術(shù)等生產(chǎn)工藝，能夠確保得到的米酒酒糟提取物的各項(xiàng)物化性質(zhì)滿足化妝品領(lǐng)域的使用要求，所述的米酒酒糟提取物具有良好的美白、抗衰老功效，可用于美白、抗衰老類護(hù)膚品。相比直接丟棄米酒酒糟會(huì)造成環(huán)境污染和浪費(fèi)，或者傳統(tǒng)的作為飼料或食用菌栽培原料利用價(jià)值低而言，本發(fā)明對(duì)米酒酒糟的利用全面和綜合，大大提`高了米酒酒糟的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0033]下述實(shí)施例中，所使用的堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶購(gòu)于諾維信生物技術(shù)有限公司，上述酶的酶活均為20~150萬(wàn)U/g。所使用的米酒酒糟購(gòu)自上海相申調(diào)味品有限公司。
[0034]小牛血清購(gòu)自上海尚誼化工科技有限公司。
[0035]DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。
[0036]人成纖維細(xì)胞購(gòu)自四川省化妝品工程技術(shù)研究中心。
[0037]B16黑色素瘤細(xì)胞購(gòu)自四川省化妝品工程技術(shù)研究中心。
[0038]HaCaT細(xì)胞購(gòu)自四川省化妝品工程技術(shù)研究中心。 [0039]實(shí)施例1米酒酒糟提取物干粉的制備
[0040]制備步驟包括:
[0041](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下攪拌發(fā)酵4小時(shí)，得料液I ;
[0042](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入lg/L料液I的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和Ig/L料液I的β -葡聚糖酶，在55°C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80°C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0043](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比2%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0044](4)將步驟(3)所得的濃縮液噴霧干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0045]實(shí)施例2米酒酒糟提取物干粉的制備
[0046](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下攪拌發(fā)酵8小時(shí)，得料液I ;
[0047](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入3g/L料液I的堿性蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80 C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0048](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比1%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0049](4)將步驟(3)所得的濃縮液進(jìn)行真空加熱干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0050]實(shí)施列3米酒酒糟提取物干粉的制備
[0051](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下發(fā)酵12小時(shí)，得料液I ;
[0052](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入2g/L料液I的中性蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80 C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，得料液2 ;
[0053](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比1%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；[0054]實(shí)施例4米酒酒糟提取物干粉的制備
[0055]制備步驟包括:
[0056](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入300ml蒸餾水，在50°C下攪拌發(fā)酵2小時(shí)，得料液I ;
[0057](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入lg/L料液I的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和5g/L料液I的β -葡聚糖酶，在20°C下酶解16小時(shí)后，將體系升溫至80°C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0058](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比5%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為1500道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0059](4)將步驟(3)所得的濃縮液噴霧干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0060]實(shí)施例5米酒酒糟提取物干粉的制備
[0061]制備步驟包括:
[0062](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入6000ml蒸餾水，在20°C下攪拌發(fā)酵48小時(shí)，得料液I ; [0063](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入5g/L料液I的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和Ig/L料液I的β -葡聚糖酶，在65°C下酶解I小時(shí)后，將體系升溫至80°C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0064](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比0.5%的硅藻土，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2500道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0065](4)將步驟(3)所得的濃縮液噴霧干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0066]實(shí)施例6米酒酒糟提取物干粉的制備
[0067]制備步驟包括:
[0068](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入4500ml蒸餾水，在45°C下攪拌發(fā)酵15小時(shí)，得料液I ;
[0069](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的中性蛋白酶和4g/L料液I的葡聚糖酶，在35°C下酶解8小時(shí)后，將體系升溫至80°C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0070](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比8%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0071](4)將步驟(3)所得的濃縮液噴霧干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0072]實(shí)施例7米酒酒糟提取物干粉的制備
[0073]制備步驟包括:
[0074](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在25°C下攪拌發(fā)酵16小時(shí)，得料液I ;
[0075](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入3g/L料液I的中性蛋白酶和3g/L料液I的β -葡聚糖酶，在60°C下酶解2小時(shí)后，將體系升溫至80°C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，過(guò)濾后濾液澄清，即料液2 ；
[0076](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比8%的大孔樹(shù)脂，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液；
[0077](4)將步驟(3)所得的濃縮液噴霧干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0078]實(shí)施例8米酒酒糟提取物液體制劑的制備
[0079](1)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下發(fā)酵24小時(shí)，得料液I ;
[0080](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的復(fù)合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80 C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，得料液2 ;
[0081](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比3%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行濃縮得濃縮液；
[0082](4’)調(diào)節(jié)步驟(3)所得濃縮液的pH值為4.5，向其中加入占濃縮液體積1/3的丙二醇，并加入占料液量質(zhì)量百分比0.02%的尼泊金酯防腐劑，攪拌混合均勻，然后將料液用
0.22 μ m微孔濾芯進(jìn)行保安過(guò)濾，濾液直接分裝入事先滅菌、潔凈的包裝容器中，即得米酒酒糟提取物液體制劑。
[0083]實(shí)施例9米酒酒糟提取物液體制劑的制備
[0084](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下發(fā)酵24小時(shí)，得料液I ;
[0085](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的復(fù)合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80 C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，得料液2 ;
[0086](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比3%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行濃縮得濃縮液；
[0087](4’)調(diào)節(jié)步驟(3)所得濃縮液的pH值為4.5，向其中加入占濃縮液體積1/4的丁二醇，并加入占料液量質(zhì)量百分比0.05%的山梨酸，攪拌混合均勻，然后將料液用0.25μπι微孔濾芯進(jìn)行保安過(guò)濾，濾液直接分裝入事先滅菌、潔凈的包裝容器中，即得米酒酒糟提取物液體制劑。
[0088]實(shí)施例10米酒酒糟提取物液體制劑的制備
[0089](I)米酒酒糟二次發(fā)酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸餾水，在40°C下發(fā)酵24小時(shí)，得料液I ;
[0090](2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的復(fù)合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小時(shí)后，將體系升溫至80 C保溫30min以滅酶，之后過(guò)濾，得料液2 ;
[0091](3)純化和濃縮:在料液2中加入占料液量質(zhì)量百分比3%的活性炭，60°C，保溫脫色、脫臭60min，將脫色、脫臭處理后的料液過(guò)濾，濾液再采用截留分子量為2000道爾頓的超濾膜過(guò)濾以去除大分子蛋白質(zhì)，將所得濾液進(jìn)行濃縮得濃縮液；
[0092](4’)調(diào)節(jié)步驟(3)所得濃縮液的pH值為4.5，向其中加入占濃縮液體積1/4的乙醇，并加入占料液量質(zhì)量百分比0.1%的山梨酸鉀，攪拌混合均勻，然后將料液用0.2μπι微孔濾芯進(jìn)行保安過(guò)濾，濾液直接分裝入事先滅菌、潔凈的包裝容器中，即得米酒酒糟提取物液體制劑。
[0093]效果實(shí)施例1米酒酒糟提取物對(duì)成纖維細(xì)胞的活化功效
[0094]用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，傳代2次，確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)情況穩(wěn)定，取生長(zhǎng)融合率為80%左右的細(xì)胞待用。
[0095]在無(wú)菌操作臺(tái)中將培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至80%左右的細(xì)胞回收至離心管中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加實(shí)施例1的提取物，使其在培養(yǎng)基中的濃度(w/v)為0.1% (0.lg/100mL)和0.01%,同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明的提取物的一組為空白對(duì)照組。
[0096]培養(yǎng)3天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0097]檢測(cè)結(jié)果:樣品經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)后，含有樣品濃度0.1%、0.01%作用組的細(xì)胞存活率為106.36 ±3.15%、109.33 ±4.78%，對(duì)成纖維細(xì)胞分別增殖約6.36%與9.33%。
[0098]效果實(shí)施例2米酒酒糟提取物對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的活化功效
[0099]用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞(永生化的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞)，傳代2次，確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)情況穩(wěn)定，取生長(zhǎng)融合率為80%左右的細(xì)胞待用。
[0100]在無(wú)菌操作臺(tái)中將`培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至80%左右的HaCaT細(xì)胞回收至離心管中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加實(shí)施例1的提取物，使其在培養(yǎng)基中的濃度(w/v)為0.01%和0.005%，同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明提取物的一組為空白對(duì)照組。
[0101]培養(yǎng)3天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0102]檢測(cè)結(jié)果:樣品經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)后，含米酒酒糟提取物樣品濃度0.01%和0.005%的作用組同空白組比較，細(xì)胞存活率分別增加約25%與22%。效果實(shí)施例1和2的結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的米酒酒糟提取物具有良好的抗衰老功效。
[0103]效果實(shí)施例3米酒酒糟提取物對(duì)黑色素生成的抑制效果
[0104]用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)B16黑色素瘤細(xì)胞，傳代2次，確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)情況穩(wěn)定，取生長(zhǎng)融合率為80%左右的細(xì)胞待用。
[0105]在無(wú)菌操作臺(tái)中將培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至80%左右的黑色素瘤細(xì)胞回收至離心管中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加實(shí)施例3的提取物，使其在培養(yǎng)基中的濃度(w/v)為0.5%、0.25%,0.1%、0.05%,0.01%,同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明提取物的一組為空白對(duì)照組。
[0106]培養(yǎng)72h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒，了解細(xì)胞狀態(tài)?；厥占?xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。提取細(xì)胞中黑色素，用酶標(biāo)儀測(cè)定檢測(cè)液的吸光度值。以陰性對(duì)照組的黑色素含量為100%，進(jìn)行對(duì)照計(jì)算樣品組黑色素含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0107]檢測(cè)結(jié)果:在安全的米酒酒糟提取物濃度作用下，均檢測(cè)出抑制黑色素生成的效果。本發(fā)明的提取物在濃度分別為0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%時(shí)，對(duì)應(yīng)其黑色素抑制率為 92%、85%、69%、52%、20%。[0108]效果實(shí)施例4米酒酒糟提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果
[0109]L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶發(fā)生反應(yīng)后，呈現(xiàn)棕色，在470nm處有最大吸收波長(zhǎng)。加入酪氨酸酶抑制劑后，酶活性降低，溶液顏色變淺或變?yōu)闊o(wú)色，470nm處的吸光度變小。
[0110]選取實(shí)施例2的提取物，使其在反應(yīng)體系中的濃度(w/v)為0.085%、0.0425%、
0.0369%,0.0212%,0.0106%,同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明提取物的一組為空白對(duì)照組。
[0111]通過(guò)測(cè)定470nm處的吸光度值，與空白對(duì)照組對(duì)比，計(jì)算不同濃度抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制效果。
[0112]檢測(cè)結(jié)果:米酒酒糟提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的IC50為364ppm。
[0113]效果實(shí)施例3和4的結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的米酒酒糟提取物具有良好的抑制黑色素生成的功 效。
[0114]效果實(shí)施例5米酒酒糟提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果
[0115]I, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液顯紫色，最大吸收波長(zhǎng)為520nm。
[0116]當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，其孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，顯黃色或淡黃色，在520nm處的吸光度變小，通過(guò)測(cè)定吸光度值，并與對(duì)照組比較，計(jì)算樣品對(duì)自由基的清除率。
[0117]選取實(shí)施例3的提取物，使其在反應(yīng)體系中的濃度(w/v)為0.1052%,0.0526%,
0.0263%,0.0131%,0.0066%,同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明提取物的一組為空白對(duì)照組。
[0118]檢測(cè)結(jié)果:米酒酒糟提取物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為115ppm。
[0119]效果實(shí)施例5的結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的米酒酒糟提取物具有良好的抗氧化功效。
[0120]基于上述效果實(shí)施例的結(jié)果可以得知，本發(fā)明獲得的米酒酒糟提取物的活性功效較高，其中含有氨基酸、寡肽、核苷酸和礦物質(zhì)等成分，表現(xiàn)出理想的抗衰老、美白和抗氧化功效。
[0121]應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種米酒酒糟提取物的制備方法，其包括如下步驟: (1)米酒酒糟二次發(fā)酵:往米酒酒糟中加入水發(fā)酵得料液1，所述水的添加量為I~20mL/g米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為20~50°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為2~48小時(shí)； (2)酶解:往步驟(1)所得的料液I中加入蛋白酶和糖苷水解酶進(jìn)行酶解后過(guò)濾，得料液2，所述蛋白酶的添加量為I~5g/L料液I，所述糖苷水解酶的添加量為I~5g/L料液I，所述酶解的溫度為20~65°C，所述酶解的時(shí)間為I~16小時(shí)，所述蛋白酶的酶活為20~150萬(wàn)U/g，所述糖苷水解酶的酶活為20~150萬(wàn)U/g ； (3)純化和濃縮:將步驟(2)所得的料液2進(jìn)行脫色和脫臭處理后采用截留分子量為1500~2500道爾頓的超濾膜過(guò)濾，得料液3，將料液3進(jìn)行濃縮，即得米酒酒糟提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述水的添加量為3~15mL/g米酒酒糟，所述發(fā)酵的溫度為25~45°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為4~16小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的蛋白酶選自堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶中的一種或多種，所述的糖苷水解酶選自葡聚糖酶或甘露聚糖酶；或， 所述蛋白酶的添加量為2~4g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量為2~4g/L料液1，所述酶解的溫度為35~60°C，所述酶解的時(shí)間為2~8小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述脫色和脫臭處理為使用大孔樹(shù)脂、硅藻土和活性炭 中的任一種對(duì)體系進(jìn)行處理。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)之后還包括步驟(4)或步驟(4，)； 所述步驟(4)為:將步驟(3)濃縮所得的濃縮液進(jìn)行干燥，收集干燥所得的干粉即得米酒酒糟提取物的干粉； 所述步驟(4’ )為:將步驟(3)濃縮所得的濃縮液與醇類混合得混合液，在所述混合液中加入防腐劑后采用0.2~0.25 μ m微孔濾芯進(jìn)行保安過(guò)濾，所得濾液即為米酒酒糟提取物的液體制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的干燥為噴霧干燥或真空加熱干燥。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4’)中，所述的醇類選自丙二醇、丁二醇和乙醇中的任一種或多種；所述醇類的用量為所述濃縮液體積的1/10~1/3。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4’)中，所述的防腐劑選自尼泊金酯、山梨酸、山梨酸鉀和山梨酸鈉中的一種或多種。
9.如權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)前所述的制備方法制備而得的米酒酒糟提取物。
10.如權(quán)利要求1所述的米酒酒糟提取物、如權(quán)利要求5所述的米酒酒糟提取物的干粉和權(quán)利要求5所述的米酒酒糟提取物的液體制劑中的任一種在制備抗衰老、抗氧化、美白的化妝品和/或藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61Q19/02GK103757084SQ201410011117
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】駱?lè)? 楊海延 申請(qǐng)人:上海輝文生物技術(shù)有限公司, 駱?lè)?br>