專利名稱：細(xì)胞結(jié)合的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，一種它的抗體，以及含該抗體作為有效成份的齲齒預(yù)防組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞結(jié)合的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶與蔗糖反應(yīng)并且催化合成水不溶性葡聚糖的反應(yīng)，本發(fā)明還涉及純化和生產(chǎn)這種酶的方法。
本發(fā)明還涉及一種對(duì)于Streptococcusmutans具有免疫活性的抗體，該細(xì)菌已知是誘發(fā)齲齒的病原菌，本發(fā)明還涉及含所說(shuō)抗體作為有效成份的預(yù)防齲齒的組合物。
從預(yù)防齲齒的角度出發(fā)，已經(jīng)對(duì)被認(rèn)為是引起齲齒的細(xì)菌S.mutans進(jìn)行了大量的研究，還對(duì)這種細(xì)菌在齲齒形成中有關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。
至于與形成齲齒有關(guān)的S.mutans菌株，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了按血清分類可分為血清a至h的八種菌株。在這些血清型中，根據(jù)血清學(xué)的類似性，已確定了兩個(gè)亞組，血清型a和g在一組，而血清型c，e和f在另一組。
早已了解到在S.mutans與形成齲齒有關(guān)的機(jī)制中，由蔗糖產(chǎn)生粘著的、水不溶性葡聚糖的過(guò)程是重要的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，由S.mutans產(chǎn)生的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(以下稱GTF)起了重要作用。
這種由S.mutans產(chǎn)生的GTF既可在培養(yǎng)物上清液中找到，也可在已結(jié)合形式的細(xì)胞表面上找到。
例如，在血清型d或g株的培養(yǎng)液中，兩者在血清學(xué)上相類似，在沒有蔗糖存在的情況下，GTF幾乎全部存在于培養(yǎng)物的上清液中。其中有三種GTF，即GTF-S1，GTF-S2和GTF-I，目前已得到分離和純化(S代表一種水溶性葡聚糖合成酶，而I代表水不溶性葡聚糖合成酶)。這三種類型的GTF一起配合產(chǎn)生粘著的、水不溶性葡聚糖(如見“SynthesisofglucansbyStreptococcusmutansandadherencemechanisms”T.Koga，Jap.J.Bacteriol.，41(4)，679，1986)。
此外，在蔗糖存在的情況下，血清型(d)和g株的培養(yǎng)物中，已知上述三種GTF幾乎都是通過(guò)與葡聚糖連接而與細(xì)胞結(jié)合，從而得到細(xì)胞結(jié)合的型式(Hamada，S.andSlade，H.D.，ArchsOral.Biol.，24，399-402，1979)。
另一方面，GTF-S和GTF-I也已從血清學(xué)上彼此相似的血清型c，e和f系的培養(yǎng)物上清液中得以分離(Kuramitsu，H.K.andWondrack，L.，Infect.Immun.，42，763-770，1983)。
然而，現(xiàn)在還沒有一份有關(guān)不溶性的、粘著的葡聚糖能用這些GTF-S和GTF-I的聯(lián)合作用來(lái)合成的報(bào)導(dǎo)。
此外，一直在努力研制防止齲齒的方法，把S.mutans作為靶生物體。一種已知的通過(guò)控制口腔中S.mutans的集群化(特別是通過(guò)控制與牙齒表面的粘著)來(lái)防止齲齒的方法的例子是一種使用對(duì)S.mutans有免疫活性的抗體來(lái)防止齲齒的方法。也就是通過(guò)使用已經(jīng)用S.mutans細(xì)胞而獲得免疫力的牛奶來(lái)防止口腔中S.mutans的集群化。這一方法已公開在英國(guó)專利說(shuō)明書1505513號(hào)中。日本專利公開說(shuō)明60-38327公開了一種由抗血清和/或用S.mutans培養(yǎng)物口收的組分如細(xì)胞壁而獲得免疫力的哺乳動(dòng)物的乳汁，以及選自葡糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、蛋白酶和葡聚糖酶中的一種或多種增效劑復(fù)合而成的齲齒預(yù)防劑。
然而，通過(guò)對(duì)S.mutans具有免疫活性的抗體來(lái)防止齲齒的效果，并不總是令人滿意的，除此之外，還因?yàn)檫@類抗體通常是用免疫的哺乳類動(dòng)物的乳汁或抗血清來(lái)制備的，在許多情況下，由于不適于成批生產(chǎn)或生產(chǎn)成本過(guò)高這樣一些缺點(diǎn)，而不能實(shí)際生產(chǎn)。
為了建立一些更加有效的齲齒預(yù)防技術(shù)，本發(fā)明人一直將注意力集中于分布于人口腔中并被認(rèn)為對(duì)人的齲齒形成起最重要作用的血清型c株，也對(duì)與血清型c在血清學(xué)上相似的血清型e和f株進(jìn)行了研究。在各種用于說(shuō)明這些菌株與形成齲齒有關(guān)的機(jī)制的研究過(guò)程中，本發(fā)明人已分離并純化了在用這些細(xì)菌合成水不溶性葡聚糖的過(guò)程中起作用的GTF組分。而且，還從說(shuō)明GTF的性質(zhì)是很重要的角度進(jìn)行了這些研究工作。
結(jié)果，本發(fā)明人證實(shí)了在由這些細(xì)菌產(chǎn)生的GTF組分中，存在細(xì)胞結(jié)合的GTF，它們具有水不溶性葡聚糖的合成酶活性(下文稱之為CA-GTF-I)，這種活性在細(xì)菌與牙齒表面的粘著中，特別是在與蔗糖有關(guān)的粘著中可能起著重要作用。因此，本發(fā)明人力求分離和純化這種CA-GTF-I。
此外，使用一些常規(guī)技術(shù)，分離血清型c、e或f株的細(xì)胞結(jié)合型的GTF-I成為純化的酶蛋白，至今未能成功地實(shí)現(xiàn)，以便能徹底地研究它們的性質(zhì)。
例如，對(duì)于由血清型c株產(chǎn)生的細(xì)胞結(jié)合型GTF-I，有Kuramitsu的一份報(bào)告(Kuramitsu，H.K.，Infect.Immun.，10，227-235，1974)。也就是說(shuō)，Kuramitsu等人通過(guò)采用1M的NaCl，從細(xì)胞中獲得了具有水不溶葡聚糖合成酶活性的提取物，并研究了作為GTF的這種提取物的性質(zhì)。在該文中，報(bào)導(dǎo)了對(duì)提取物中的GTF活性來(lái)說(shuō)PH最佳值為6.0，而溫度最佳值為37℃。
然而，由于在純化過(guò)程中必須進(jìn)行的脫鹽處理時(shí)，Kuramitsu獲得的提取物變成不溶于水的，所以從該提取物中獲得一個(gè)具有GTF活性的提純的蛋白質(zhì)組分一直不大成功。因此，Kuramitsu提供的有關(guān)細(xì)胞結(jié)合GTF組份的數(shù)據(jù)不是以一個(gè)純化的酶蛋白質(zhì)組分為基礎(chǔ)的，因而，這些數(shù)據(jù)用在描述具有GTF活性的酶上被認(rèn)為是極不合適的，尤其是由細(xì)胞提取的組分中所含有的酶完全不能表征成酶蛋白，即還沒有說(shuō)明任何諸如分子量或等電點(diǎn)這樣的特性。
另一方面，Kenney等人或Kuramitsu等人現(xiàn)已證明血清型c株的GTF-I存在于培養(yǎng)物的上清液組分中。
Kenney等人還證明了具分子量為153K道爾頓，具有合成水不溶性的多糖類活性的GTF-Ic存在于血清型c株的培養(yǎng)物上清液中(A.C.KenneyandJ.A.Cole，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，16，159-162，1983)。
然而，Kenney等人只是證明了GTF-Ic在培養(yǎng)物上清液中的存在，他們既沒有提供分離和純化該酶的資料，也沒有提供以一個(gè)蛋白質(zhì)形式來(lái)描述該酶所必須的數(shù)據(jù)。
在另一方面，Kuramitsu等人已從c型株的培養(yǎng)物上清液中分離出包含具有合成水溶性葡聚糖活性的葡聚糖蔗糖酶(DS，GTF-Sc)組分，以及包含具有合成水不溶性葡聚糖活性的mutansynthetase(MS，GTF-Ic)組分，然后對(duì)這些組分進(jìn)行各種分析例如進(jìn)行GTF活性分析以證明DS和MS是兩種不同的酶。所獲得的MS具有與DS不同的免疫性，且分子量為155K道爾頓，等電點(diǎn)(pl)為4-5(Kuramitsu，H.K.andWondrack.L.，Infect.Immun.，42，763-770，1983)。
在這些情況下，本發(fā)明人為證實(shí)這種酶的存在，在研究分離和純化CA-GTF-I的工藝過(guò)程中做出了許多努力。結(jié)果，本發(fā)明人首次由血清型c細(xì)菌的細(xì)胞成功地分離并純化出CA-GTF-I，并且獲得了有關(guān)其特征的新的資料，從而完成了本發(fā)明。
此外，本發(fā)明人還獲得了這樣分離和純化得到的抗CA-GTF-I的抗體，在防止與牙齒表面的粘著上具有顯著效果的新的信息，以及可以通過(guò)用這種純化的CA-GTF-I作為抗原而獲得免疫的母雞，以很低的費(fèi)用大規(guī)模地生產(chǎn)這種抗體，以至于完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供水不溶性葡聚糖合成酶形式的CA-GTF-I，它可用于開發(fā)說(shuō)明齲齒形成的詳盡機(jī)制或?qū)x齒預(yù)防所必須的更有效的技術(shù)和各種藥劑中。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供對(duì)S.mutans具有免疫活性的抗體，該抗體在防止S.mutans粘著在牙齒表面有著足夠的效果，并且適于作齲齒預(yù)防組合物的有效成份。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供以低成本大規(guī)模生產(chǎn)這種抗體的方法。
本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供一種含該抗體作為有效成分的齲齒預(yù)防組合物。


圖1表示從例3的DEAE-Sephacel上洗提出的組分中的蛋白質(zhì)濃度(A280)，GTF钚院虵T酶(D-果糖基轉(zhuǎn)移酶)活性。
圖2表示由例3的羥基磷灰石(hydroxylapatite)上洗提出的組分中的蛋白質(zhì)濃度(A280)、GTF活性和FT酶活性。
圖3表示例3免疫母雞抗體滴定度的變化。
本發(fā)明的分離出的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CA-GTF-I)至少具有下列物理化學(xué)特性(1)反應(yīng)和底物特性與蔗糖反應(yīng)產(chǎn)生水不溶性葡聚糖。
(2)PH最佳值PH6.7-7.0。
(3)最佳溫度范圍15-50℃。
(4)失活條件于80℃下加熱5分鐘失活。
(5)分子量用SDS-聚丙烯酰凝膠電泳測(cè)定為150K-165K道爾頓。
(6)免疫性是動(dòng)物體的免疫原，因?yàn)檎T發(fā)產(chǎn)生抗該酶的特異抗體。
還鑒于CA-GTF-I的GTF活性的最佳PH值如前所述與口腔中的PH值大致相同這一事實(shí)，很容易理解CA-GTF-I可能會(huì)對(duì)口腔中S.mutans的特性上起重要的作用。
如上所述，由于CA-GTF-I能夠是動(dòng)物體的免疫原，所以通過(guò)向動(dòng)物體施用這種酶就能產(chǎn)生該酶的特異抗體。用這種方法所獲得的抗體如前所述，在防止齲齒的領(lǐng)域中是有用的。
此外，CA-GTF-I能有效地應(yīng)用于由蔗糖生產(chǎn)葡聚糖。
例如通過(guò)測(cè)量進(jìn)入到該酶與作為底物的〔14C-葡萄糖〕蔗糖反應(yīng)而產(chǎn)生的葡聚糖中的放射活性量可以測(cè)定出CA-GTF-I的酶活性。
規(guī)定一個(gè)單位(U)的GT酶活性為每分鐘有1.0毫摩爾的葡萄糖殘基從蔗糖分子進(jìn)入葡聚糖中所需要的酶的量。
例如通過(guò)分離和純化以細(xì)胞結(jié)合型式產(chǎn)生的GTF-I可以從這些細(xì)胞獲得CA-GTF-I。
很明顯，正如下文各實(shí)例中所描述的那樣，CA-GTF-I與存在于血清型c細(xì)菌培養(yǎng)物上清液中的GTF-S(CF-GTF-S)有顯著的區(qū)別，并具有合成水溶性葡聚糖的活性。
本發(fā)明的CA-GTF-I能按下述方式自血清型c、e或f株的細(xì)菌中分離并純化出來(lái)。
首先，血清型c、e或f的細(xì)胞在一合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集所得到的細(xì)胞，需要時(shí)可以洗滌。
用于本發(fā)明的血清型c菌株是如S.mutansMT8148株，Ingbritt株和NCTC10449株。
而且，這些菌株都為公知，并易獲取。
例如S.mutansMT8148株和Ingbritt株可以從大板大學(xué)牙科系得到，而NCTC10449株則從美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心以ATCC25175菌株得到。此外，對(duì)于血清型e和f株，可以使用任何一種公知的可取得的菌株。
至于培養(yǎng)基，任何一種至少含果糖的培養(yǎng)基都可使用。例如，TTy培養(yǎng)基〔由胰蛋白酶(Trypticase)、類胰蛋白酶(Tryptose)和酵母提取物組成的復(fù)合培養(yǎng)基〕、BHI(腦心浸劑Brain.HeartInfusion)培養(yǎng)基和FMC培養(yǎng)基都可使用。
除此之外，預(yù)期對(duì)適宜的細(xì)菌會(huì)生長(zhǎng)和CA-GTF-I會(huì)產(chǎn)生的任何溫度范圍都可用于進(jìn)行培養(yǎng)。然而，就充分的細(xì)菌生長(zhǎng)和CA-GTF-I的產(chǎn)生而言，通常采用接近37℃的溫度。
培養(yǎng)所需要的時(shí)間隨培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)溫度和使用的培養(yǎng)基種類的不同而不同。使CA-GTF-I的產(chǎn)率達(dá)到最佳值的培養(yǎng)時(shí)間可以很方便地被選擇通?？刹捎?8-20小時(shí)。
此外，其他培養(yǎng)條件也可根據(jù)上述的觀點(diǎn)加以選擇。
接著從這些細(xì)胞中提取CA-GTF-I。
從細(xì)胞中提取CA-GTF-I，例如可以通過(guò)將細(xì)胞與諸如脲溶液和胍-HCl溶液這樣的提取溶液接觸的方法來(lái)進(jìn)行。
提取條件如懸浮于提取溶液中細(xì)胞的濃度、提取溶液的濃度、提取的溫度和時(shí)間都可根據(jù)提取溶液的種類適當(dāng)?shù)剡x擇，使所需要的酶盡可能充分地被提取。
此外，為了以高產(chǎn)率獲得具有高特異活性的提取物，用6-10M的脲溶液為好，最好是8M，提取在20-30℃下進(jìn)行為好，最好是25℃，時(shí)間大約在15分鐘到2小時(shí)。
提取之后，固體組分如細(xì)胞通過(guò)例如離心法從提取物中被除去，所得到的上清液再通過(guò)諸如透析、超濾或凝膠過(guò)濾這樣的一些程序加以處理，以便從提取物中除去脲、低分子量雜質(zhì)等物，便可得到粗制CA-GTF-I提取物。
在用如透析法處理的過(guò)程中，如有沉淀形成，沉淀要用離心法除去。
除此之外，粗的提取制劑可以被純化，以得到純化的CA-GTF-I制劑。
為了純化，通常用于酶純化的各種方法都可使用，例如，像在下文所要說(shuō)明的那樣，一種由兩個(gè)吸附程序組合的方法，一個(gè)用陰離子交換劑而另一個(gè)用羥基磷灰石是很方便的。
用于純化粗提取物制劑的陰離子交換劑的例子是具有諸如二乙氨基乙基(DEAE)功能基團(tuán)的陰離子交換劑，具體地說(shuō)，可以使用DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)。
要被使用的羥基磷灰石的例子是生物-凝膠HTP(Bio-Red實(shí)驗(yàn)室)。
在使用陰離子交換劑進(jìn)行純化的程序中，含在粗提取制劑中的被提取成分(粗蛋白質(zhì)成分)被加至陰離子交換柱上，然后選擇性地從吸附于陰離子交換劑上的組份中選擇性地把含所需酶的組份洗脫下來(lái)。
例如，通過(guò)控制洗脫液的鹽濃度，可獲得含所需酶的組分。
這種鹽的濃度依陰離子交換劑的種類或洗脫條件而變化。通過(guò)選擇一個(gè)范圍來(lái)確定鹽的濃度，在該范圍內(nèi)含GTF(I)的組份可選擇性地被分級(jí)分離。
例如在使用DEAE-Sephacel的情況下，可用在磷酸鹽緩沖液中的濃度范圍在0.45-1.0M的NaCl來(lái)獲取GTF-I。
要與陰離子交換劑接觸的樣品可由粗的提取制劑按一種方式來(lái)制備。以這種方式，粗的蛋白質(zhì)組份是通過(guò)用如硫酸銨這樣的鹽的溶液或諸如乙醇這樣的有機(jī)溶劑去沉淀該粗提取制劑，然后采用離心等步驟回收所得到的沉淀，再將該沉淀懸浮于一種合適的溶劑中，需要時(shí)再采用如滲析這樣的方法從沉淀中除去低分子量的雜質(zhì)而獲得的。
在用陰離子交換劑處理之后，合并具有GTF(-I)活性的各組份。采用例如滲析法脫鹽，然后加到羥基磷灰石柱上。
其后，CA-GTF-I組份被選擇性地從已吸附于羥磷灰石上的組份中洗脫下來(lái)，合并，需要時(shí)可再經(jīng)滲析等步驟處理，以便得到純化的CA-GTF-I制劑。
如此得到的純化CA-GTF-I制劑在SDS-PAGE凝膠上能給出相應(yīng)于分子量為150K-160K道爾頓的單一譜帶。
而且，根據(jù)上述步驟，例如如同在下面實(shí)例中要說(shuō)明的那樣，這樣的純化應(yīng)當(dāng)達(dá)到具有比活性為6.96U/mg蛋白質(zhì)的酶。
此外，本研究中的CA-GTF-I能通過(guò)前述的細(xì)菌培養(yǎng)和提取步驟生產(chǎn)。所得到的提取物能被純化至所要求的純度。
本發(fā)明的具有抗S.mutans免疫活性的抗體(抗-CA-GTF-I抗體)能以免疫球蛋白的形式而被制取，這種免疫球蛋白是由用上述CA-GTF-I而獲免疫力的母雞所產(chǎn)的蛋來(lái)制備的。
為了制備母雞免疫用的抗原體液，能使用的CA-GTF-I的例子是含在細(xì)胞提取物中或由上述分離CA-GTF-I步驟所得的粗制劑中的，或以純萍列問交竦玫腃A-GTF-I。
這種抗CA-GTF-I抗體可由用上述CA-GTF-I免疫的母雞的蛋來(lái)制備。
至于用來(lái)免疫的母雞，任何種類的母雞都可使用，但從大批量生產(chǎn)的觀點(diǎn)來(lái)看，最好使用產(chǎn)蛋雞，如白來(lái)亨雞(WhiteLeghorns)。
而且，用CA-GTF-I進(jìn)行免疫的方法是一些普通的方法，如皮下注射、腹腔注射、肌肉注射、鼻內(nèi)注射和滴入眼睛。此外，劑量要適當(dāng)?shù)丶右赃x擇，以便獲得所要求的抗體滴定度，而對(duì)雞不會(huì)帶來(lái)危害性的影響。
通常，在首次免疫作用后的數(shù)周內(nèi)，在雞蛋中(蛋黃)會(huì)產(chǎn)生與抗原特別反應(yīng)的抗體，如果需要，佐劑如FCA(Freund完全佐劑)或FlA(Freund不完全佐劑)可以與CA-GTF-I結(jié)合使用。
本發(fā)明的抗CA-GTF-I抗體是由免疫作用后約一個(gè)月或更久的產(chǎn)蛋雞所生的蛋來(lái)制備。
而且，例如可以采用酶連接的免疫溶劑測(cè)定法(ELISA)或放射免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定抗體滴定度。而抗體滴定度的變化可在免疫作用后以約2周的時(shí)間間隔內(nèi)，通過(guò)測(cè)量抗體滴定度加以跟蹤。
在下文將要提到的各實(shí)施中，抗體滴定度的變化是通過(guò)使用ELISA法監(jiān)測(cè)的。而雞蛋是在抗體滴定度提高到足以制備本發(fā)明的抗CA-GTF-I抗體時(shí)，再收集的。
通常高的抗體滴定度能維持3個(gè)月以上。
免疫作用后，當(dāng)抗體滴定度下降時(shí)，抗體滴定度可通過(guò)以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔適當(dāng)?shù)亟o予補(bǔ)充的免疫作用而增加。
本發(fā)明的抗CA-GTF-I抗體可以例如通過(guò)提取和分離含在如上所述的免疫母雞的蛋黃中的免疫球蛋白來(lái)制備。
用于提取和分離的方法的例子包含各種通常用于提取和分離免疫球蛋白的方法，例如使用葡聚糖硫酸鹽或聚乙烯醇(PEG)沉淀并用丙醇或氯仿萃取。
如上所述獲取的抗CA-GTF-I抗體，作為抗體能和以與S.mutans細(xì)胞結(jié)合形式存在的CA-GTF-I發(fā)生特異反應(yīng)。換句話說(shuō)，它具有抗S.mutans的免疫活性。
具有抗S.mutans免疫活性的抗CA-GTF-I抗體具有抑制S。mutans與牙齒表面粘著的作用，因此，通過(guò)向口腔施用該抗體，能夠控制口腔中S.mutans的活性，從而防止了齲齒的形成。
本發(fā)明齲齒預(yù)防組合物含有上述抗CA-GTF-I抗體作為有效成份，并且可按照向口腔給藥的方式制成各種劑型。
例如，當(dāng)以漱口劑或牙膏形式使用時(shí)，可以以一個(gè)有效的量將抗CA-GTF-I抗體加到該制備方法中的各種組分中。
加入齲齒預(yù)防組合物中抗CA-GTF-I抗體的量，要按照適合于每種給藥方式的劑量，適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，當(dāng)抗體滴定度超過(guò)103時(shí)，可使用重量計(jì)約0.0001-10%的量抗體。
本發(fā)明的齲齒預(yù)防組合物可按多種制品形式提供，包括例如牙粉、漱口劑、口腔涼爽液糖錠劑、口香糖等。齲齒預(yù)防組合物還可通過(guò)將上述抗CA-GTF-I抗體與各種載體和/或一般用于制備該制品的多種添加劑組合起來(lái)制備。對(duì)于它們的制備，可以采用用于該制品制備的任何一種眾所周知的方法。
普遍用于制備該制品的載體和添加劑的混合比例也可用于制備本發(fā)明的組合物。
一般來(lái)說(shuō)牙膏可以由磨擦劑、粘合劑、水份保留劑、發(fā)泡劑和香料組成。
磨擦劑的例子包括磷酸氫鈣、碳酸鈣、焦磷酸鈣、不溶性偏磷酸鈉、硅膠水合物等。牙膏通常含有10-95%(重量計(jì))的磨擦劑。
粘合劑的例子包括羧甲基纖維素、藻酸鈉、角叉菜膠(Carrageenan)等。牙膏一般含0.5-4%的粘合劑。
水份保留劑的例子包括山梨糖醇、甘油、丙二醇等。牙膏一般含有5-30%的水份保留劑。
發(fā)泡劑的例子可包括陰離子活性劑，如月桂基硫酸二鈉鹽、月桂酰肌氨酸酯和甘油-月桂酸酯。非離子活性劑如蔗糖脂肪酸脂、月桂基二乙醇胺和硬脂酸單酸甘油酯等。牙膏一般含發(fā)泡劑為0.5-2%。
另外，利用母雞采用上述的方法獲得的本發(fā)明的抗CA-GTF-I抗體，與用常規(guī)哺乳類動(dòng)物免疫法所獲得的抗體相比較，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明的抗體能在免疫母雞的蛋中生產(chǎn)，這樣在收集或處理雞蛋以及由雞蛋制取抗體中，不需要專門的或熟練的技術(shù)。然而，在免疫球蛋白中，只有IgG抗體被轉(zhuǎn)移到蛋黃中，以至于只有IgG易于取得。
相反，在抗體是由抽取免疫哺乳類動(dòng)物血液制取的情況下，抽血必須熟練的技術(shù)，此外，由血漿分離和純化大量的IgG也是很困難的。
(2)用于制備本發(fā)明抗體的母雞易于飼養(yǎng)，以至于飼養(yǎng)費(fèi)用與例如飼養(yǎng)大鼠相比還要便宜。
況且，采用哺乳類動(dòng)物法不適于大量生產(chǎn)抗體，因?yàn)橛刹溉轭悇?dòng)物連續(xù)獲取大量的血液或乳汁是很困難的。相反，本發(fā)明的方法有可能大批量低費(fèi)用地生產(chǎn)抗體，因?yàn)槟鸽u能在一很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)連續(xù)不斷地產(chǎn)蛋。
(3)在許多情況下，由免疫哺乳類動(dòng)物的血漿或乳汁制備的抗體穩(wěn)定性并不總是令人滿意的，以至于在血漿或其純化形式下必需在-80℃左右儲(chǔ)存。
相反，本發(fā)明的抗體顯示了優(yōu)良的穩(wěn)定性并且以雞蛋的形式例如在4℃下貯存就能很好地保存。
此外，使用母雞制備抗體，在某些類型的抗原情況下，并不總是獲得足夠的抗體滴度，例如，當(dāng)使用病毒作為抗原時(shí)，就不能得到足夠的滴度。
因此，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫的母雞能夠獲得具有足夠高抗體滴度的抗體。
本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)例予以更詳細(xì)地說(shuō)明例1〔研究GTF在S.mutans不同的血清型中的定位〕表1(由大板大學(xué)牙科系得到)舉出每種不同血清型的S.mutans分別于50mlBHI培養(yǎng)基和TH(Todd-Hewitt)培養(yǎng)基中于37℃下被保溫18小時(shí)。
保溫后，細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液用離心法分離，并用鹽水洗滌所得到的細(xì)胞。
之后，細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液每種的GTF活性按下法測(cè)定。所得結(jié)果列于表1。
測(cè)定GTF活性的方法1)用于測(cè)定的樣品細(xì)胞場(chǎng)合下培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)收獲，用鹽水洗滌，懸浮于5ml10mM磷酸鹽緩沖液中(PH6.0)，然后采用超聲破壞處理以獲取用于測(cè)定的細(xì)胞懸浮液樣品。
上清液場(chǎng)合下培養(yǎng)物上清液作為樣品無(wú)須任何處理即可使用。
2)GTF活性的測(cè)定每種樣品10微升與含有20mM〔14C-葡萄糖〕蔗糖0.05Ci/mol)作為底物的10微升0.2M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)混合，并于37℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，將所有的反應(yīng)混合物都置于矩形濾紙上(1.0×2.0cm)，并用甲醇洗滌。測(cè)量濾紙上保留的結(jié)合到甲醇不溶性葡聚糖中的放射性，以計(jì)算出GTF活性。
表1菌株培養(yǎng)基GTF活性(mV/ml)EX/CA(血清型)培養(yǎng)基最終PH胞外細(xì)胞結(jié)合(EX)(CA)MT8148BHI5.610.12.44.2(c)TH5.614.53.64.0MT4245BHI5.517.51.412.5(e)TH5.519.52.19.3MT4251BHI5.416.71.511.1(f)TH5.512.03.33.6OMZ176BHI5.813.10.526.2(d)TH5.73.111.20.286715BHI5.911.80.259.0(g)HI6.01.93.20.59根據(jù)表1所給出的結(jié)果，很明顯的，對(duì)于血清型d和g的細(xì)菌，在BHI培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，即無(wú)蔗糖的情況下，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的GTF活性是在上清液中，而在TH培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，即有蔗糖的情況下，大多數(shù)GTF活性發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞里(細(xì)胞結(jié)合型)。
另一方面，對(duì)血清型c、e和f細(xì)菌來(lái)說(shuō)，未觀察到在血清型d和g中觀察到的那么大的差異。
例2〔從細(xì)胞提取CA-GTF-I〕將S.mutans菌株MT8148(血清型c)在1升TTY培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。采用離心法收獲細(xì)胞，并進(jìn)一步用鹽水洗滌兩次。
然后，將幾份細(xì)胞懸浮于不同的提取液中，攪拌下提取所得到的懸浮液。
在完成提取程序之后，用離心法使細(xì)胞與提取液分離，并以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)所得到的上清液進(jìn)行滲析處理。
透析后，各個(gè)上清液中產(chǎn)生的雜質(zhì)用離心法除去，再測(cè)量各個(gè)上清液中的GTF活性及蛋白質(zhì)濃度。
為此，用例1所述的方法測(cè)量GTF活性，并以?？蒲迩宓鞍?BSA)作標(biāo)準(zhǔn)，按照Lowry等人的方法測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度，從而計(jì)算出比活性。
表2示出用于提取程序中的提取溶液和提取條件以及提取物中GTF活性的一些代表性的例子。
此外，將按上述方法得到的細(xì)胞懸浮于1mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)中，并用20KHZ和200W的超聲振蕩3分鐘，以破裂所得到的懸浮液，制成細(xì)胞碎裂混合物。在離心脫除不溶部分后同樣地測(cè)量生成的上清體液GTF活性。所得結(jié)果也列在表2中。
表2提取方法條件比活性回收率(U/mg)(%)8M脲25℃，1小時(shí)0.9895.14℃，1小時(shí)0.2928.86M胍-HCl4℃，1小時(shí)0.4452.8(49.2)＊1MNaCl4℃，1小時(shí)0.457.3(19.7)＊超聲振蕩4℃，3分鐘0.0920.0＊透析過(guò)程中產(chǎn)生的不溶化合物回收率。
根據(jù)表2所示結(jié)果明顯的是它揭示出具有GTF活性的蛋白質(zhì)組分能分別使用各種提取程序從細(xì)胞中提取出來(lái)，還指出為了獲得高產(chǎn)率、高比活性的提取物，用8M脲溶液于25℃提取1小時(shí)是最為合適的。
例3〔制備CA-GTF-I純化制劑〕因?yàn)橐呀沂玖擞?M脲于25℃下提取1小時(shí)的提取程序是最為合適的，所以，用例2介紹的同樣方式在TTy培養(yǎng)基中(8升)培養(yǎng)S.mutansMT8148，收獲所得到的細(xì)胞，洗滌，然后將其懸浮于300ml的8M脲溶液中。培養(yǎng)的細(xì)胞量干重為9.7克。
接著，將懸浮液在攪拌下于25℃提取1小時(shí)。
提取后，為了從提取液中分離出細(xì)胞，用離心法得到上清液，然后以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)它進(jìn)行透析處理。
透析后，上清液中產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)通過(guò)離心法除去，從而制得CA-GTF-I粗提取物。
接著，向CA-GTF-I粗提取物中添加硫酸銨以達(dá)到60%飽和度，產(chǎn)生沉淀。將沉淀進(jìn)一步溶于20ml50mM磷酸鹽緩沖液(PH7.5)中，再將所得到的溶液在50ml磷酸鹽緩沖液中(PH7.5)進(jìn)行透析處理。
透析后，從溶液中將透析過(guò)程產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)用離心法除去，并將所得到的上清液加于DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)柱(2.5×13cm)上。
桂上吸附的組份用線性濃度梯度的NaCl磷酸鹽緩沖液(PH7.5)選擇性地洗脫。
用例1所述的方法測(cè)量每個(gè)組份的GTF活性，并通過(guò)在280nm處測(cè)量UV吸收值以測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)用濃度為0.45-1.0M的NaCl所得到的組份中有明顯的GTF活性。
將濃度為0.45-1.0M的NaCl洗脫的各組份合并，以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)它進(jìn)行透析，然后加到預(yù)先用10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)平衡過(guò)的羥基磷灰石(BioGelHTP，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)柱(1.0×13cm)上。
柱上吸附的組份用0.01、0.2、0.26和0.5M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)分步洗脫。
如上所述對(duì)每一組份都要測(cè)定其GTF活性和蛋白質(zhì)的濃度。如圖2所示，在0.5M磷酸鹽緩沖液洗脫的組份里發(fā)現(xiàn)了GTF活性。
接著，合并用0.5M磷酸鹽緩沖液洗脫的高活性組份，并以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)它進(jìn)行透析，以制備純化的酶制劑。
此對(duì)，表3給出了GTF活性，蛋白質(zhì)含量，GTF比活性以及按上述提取和純化程序各步驟中所得到的GTF活性組份的得率。
表3純化步驟總蛋白質(zhì)總活性比活性回收率純化(mg)(U)(U/mg)(%)(一倍數(shù))SM脲提2074712.011001取物硫酸銨(60%1192602.18621.1飽和度)PEAE-Sephacel37.485.92.30211.1羥磷灰石4.7132.86.9683.5當(dāng)在下述條件下將該純化的酶制劑加至SDS-PAGE(其中，蛋白質(zhì)用CoomassieBrilliant蘭染色)時(shí)，可在分子量156K道爾頓的蛋白質(zhì)位置上觀察到單一譜帶，這就證實(shí)了純化的酶制劑是一種分子量為156K道爾頓的酶蛋白。
SDS-PAGE程序的條件按Laemmli等人的方法進(jìn)行SDS-PAGE。
即粗的提取物和純化過(guò)的酶制劑(0.2-35mg)分別用含2%SDS，5%2-巰基乙醇和20%甘油的62.5mMTris-HCl緩沖液(PH6.8)于100℃下處理3分鐘。
在含0.1%SDS和4%丙烯酰胺積層凝膠的7.5%丙烯酰胺分離凝膠上，在室溫下用10mA電泳2小時(shí)。
此外，用作分子量標(biāo)準(zhǔn)的是鐵蛋白(220K道爾頓)、磷酸化酶(94K道爾頓)、中血清清蛋白(67K道爾頓)、過(guò)氧化氫酶(60K道爾頓)、卵清蛋白(43K道爾頓)和乳酸脫氫酶(36K道爾頓)(均從Pharmacia公司得到)。
把相當(dāng)于50mU酶活性量的純化酶制劑加至含有1%蔗糖和0.1%疊氮化鈉(每個(gè)均為最終濃度)的0.1M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)中。然后用蒸餾水將該混合物的總體積調(diào)至3ml，混合并于37℃下反應(yīng)18小時(shí)，再用冰冷卻反應(yīng)溶液至4℃終止酶反應(yīng)。
在酶反應(yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)物于1600×g下離心，使水不溶性沉淀部份和上清液分離。
用蒸餾水將水不溶性部份洗滌兩次，然后使其懸浮于3ml的蒸餾水中，以制取水不溶性的葡聚糖制劑)。
把2.5體積的乙醇加至上清液中，并在混合完全后于4℃下放置1小時(shí)，于1600×g下離心回收所產(chǎn)生的沉淀，再將沉淀溶于3ml蒸餾水中，相似地重復(fù)沉淀程序，并將回收的沉淀再次溶于3ml蒸餾水中，以得到水不溶性葡聚糖制劑。
上述各制劑中所含的葡聚糖采用蒽酮法進(jìn)行定量分析，并對(duì)用純化酶制劑合成的葡聚糖的種類進(jìn)行研究，結(jié)果揭示了純化酶制劑是具有合成水不溶性葡聚糖能力的CA-GTF-I。
分別地重復(fù)上述的酶反應(yīng)，并且用離心法分離出生成的水不溶性葡聚糖沉淀。沉淀(2mg)經(jīng)洗滌后，采用Hakomori(Hakomori，S.，J.Biochem.，55，205，1964)法使其全部甲基化，并用90%(V/V)甲酸，接著用2M三氟乙酸使其水解。生成的水解物在有硼氫化鈉存在的情況下進(jìn)行還原，并在吡啶-乙酐混合物(1∶1V/V)中乙?；?，以獲得部份甲基化的乙酸甘露糖醇酯(alditolacetate)衍生物。然后用帶有涂以硅SPB-5(Shimadgu生產(chǎn))的毛細(xì)管柱(0.25mm×30m)氣相色譜分析儀(型號(hào)GC-14A，Shimadgu生產(chǎn)┓治齙玫降難萇鎩Ｆ暇厶荰10(Pharmacia)的乙酸甘露糖醇酯也可按上述同樣方法制備并用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。
分析結(jié)果表明在上述程序中得到的水不溶性葡聚糖含有62摩爾%α-1，3連接的，28%α-1，6連接的和5%α-1，3，6-連接的葡萄糖殘基。
而且，通過(guò)改變?nèi)缋?所述測(cè)定GTF活性中心溫度和PH，對(duì)于水不溶葡聚糖合成酶活性中的純化酶制劑的最佳溫度和最佳PH值進(jìn)行了研究。
還通過(guò)普通的方法測(cè)定它的Km值。
通過(guò)上述測(cè)量和試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)列于表4。
此外，為了進(jìn)行比較，表4還包括了用Baba等人的方法(Carbohydr.Res.，158，147-155，1986)，從含有滲析BHI的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的S.mutansMT8148的培養(yǎng)物上清液，獲得的CF-GTF-S的相應(yīng)數(shù)據(jù)。
表4性質(zhì)CF-GTF-SCA-GTF-I分子量156K156KpI 7.4 未測(cè)＊最佳PH5.5-6.56.7-7.0蔗糖(mM)的Km值17.311.1產(chǎn)品葡聚糖在水中溶解度水可溶水不溶＊因?yàn)槟z中形成了大范圍的聚集，所以不可能進(jìn)行測(cè)量。
通過(guò)使用由本發(fā)明CA-GTF-I免疫的鼠制備的抗血清的免疫斑法，證實(shí)了能與本發(fā)明CA-GTF-I反應(yīng)的抗體在抗血清中被得到。
另一方面，按上述方法得到的CA-GTF-I和CF-GTF-S的抗原性質(zhì)通過(guò)ELISA法來(lái)進(jìn)行研究。為此目的，從皮下注射有Freund完全佐劑(FCA)的CA-GTF-I(由菌株MT8148獲得)和與水溶性葡聚糖合成酶反應(yīng)的單克隆抗體而被免疫的小鼠制取抗CA-GTF-I的鼠抗血清，該合成酶是采用Sato等人(Sato，S.，Koga，T.，和Inoue，M.，Carbohydr.Res.，134，293-304，1984)的方法由菌株MT8148培養(yǎng)物的上清液制備的。此外，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgA+IgG+IgM抗體被用作第二代抗體，而P-硝基苯基磷酸二鈉被用作為底物。所得結(jié)果列于表5。也就是說(shuō)，表5顯示了抗-CA-GTF-I的鼠抗血清不能與CF-GTF-S反應(yīng)，而抗CF-GTF-S的單克隆抗體不能與CA-GTF-I反應(yīng)，這就證明了這些酶具有不同的抗原性。
表5涂布的抗原在405nm處的吸收率抗-CF-GTF-S抗-CA-GTF-I的單克隆抗體的抗血清CF-GTF-S粗的0.3360.066純化的0.8900.045CA-GTF-I粗的0.1250.356純化的0.0540.666例4〔制備抗原〕S.mutans株Ingbritt(血清型C，取自大板大學(xué)牙科系)在15升TTy培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞用鹽水洗兩次。
然后，將洗滌過(guò)的細(xì)胞懸浮于400ml8M脲溶液中，并將該細(xì)胞懸浮液在25℃下攪拌1小時(shí)。離心細(xì)胞懸浮液以去除細(xì)胞，所得到的上清液用10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)進(jìn)行透析。
透析后，離心除去上清液中產(chǎn)生的沉淀，并把所得到的上清液用硫酸銨以60%的飽和度進(jìn)行沉淀。用離心法回收所得到的沉淀。然后再把沉淀溶于10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)中。得到的溶液再以同樣的緩沖液進(jìn)行滲透，而且用離心法脫除該溶液中出現(xiàn)的沉淀以得到上清液。所得到的上清液用作(免疫抗原)粗制劑。
該制劑的蛋白質(zhì)濃度和總蛋白質(zhì)用CBB-G法(Branford，M.M.，Anal.Biochem.，72，248，1976)測(cè)量，結(jié)果表明蛋白質(zhì)濃度為5.1mg/ml，而總蛋白質(zhì)為141mg。
而且，在例3中所述的條件下，對(duì)制劑進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并用CoomassieBrilliant蘭(CBB)染色。結(jié)果鑒定了一些譜帶。包括對(duì)應(yīng)于155K道爾頓位置的譜帶。
制劑分別在Tris-HCl緩沖液中于37℃下處理30分鐘，并按上述同樣的方式進(jìn)行SDS-PAGE，只是電泳溫度是4℃，生成的凝膠浸入含有1%蔗糖和0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液中(PH6.0)，于37℃下處理18小時(shí)。然后，取出浸過(guò)的凝膠并用PAS(PeriodicacidSchiff)試劑染色，結(jié)果在155K道爾頓的位置上檢測(cè)出顯示產(chǎn)生葡聚糖的明顯著色帶。
從上述SDS-PAGE的結(jié)果計(jì)算出制劑中CA-GTF-I含量是40%(以重量計(jì))例5〔制備純化的CA-GTF-I制劑〕菌株Ingbritt在與例4所述同樣的條件下，在TTy培養(yǎng)基(8升)中培養(yǎng)。收獲所生成的細(xì)胞洗滌，然后將細(xì)胞懸浮于300ml8M的脲溶液中。
所述懸浮液于25℃下攪拌提取1小時(shí)。
提取后，將提取溶液離心以脫除細(xì)胞，并以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)得到的上清液進(jìn)行滲析。
滲析后，除去上清液中產(chǎn)生的沉淀，得到CA-GTF-I粗的提取制劑。
然后，加硫酸銨于粗的提取制劑中，至60%飽和度，產(chǎn)生沉淀，生成的沉淀進(jìn)一步溶解于20ml50mM的磷酸鹽緩沖液(PH7.5)中，并以同樣的緩沖液對(duì)它進(jìn)行滲析。
滲析后，用離心法除去滲析過(guò)程中產(chǎn)生的沉淀，把得到的上清液加到DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)柱上(2.5×13cm)。
用線性濃度梯度NaCl的磷酸鹽緩沖液(PH7.5)選擇性地洗脫吸附于柱上的組分。
洗脫后的每一個(gè)組份GTF活性皆按例1所述的方法測(cè)量，蛋白質(zhì)濃度通過(guò)測(cè)量280nm處的UV吸收率來(lái)測(cè)定。結(jié)果觀察到了在用濃度為0.45-1.0M的NaCl洗脫的組份活性明顯的高。
合并用NaCl濃度為0.45-1.0M洗脫的各組份，以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)它進(jìn)行滲析，然后加到已用10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)平衡過(guò)的羥基磷灰石(BioGelHTP，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)柱(1.0×13cm)上。
吸附于柱上的組份用0.01M、0.2M、0.26M和0.5M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)分步洗脫。
每一組份的GTF活性及蛋白質(zhì)濃度均用上述方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在0.5M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)洗脫的組份中發(fā)現(xiàn)GTF活性。
合并用0.5M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)洗脫的高活性組份，并以10mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)對(duì)它進(jìn)行滲析，得到純化的酶制劑。
純化的酶制劑再在前面所述條件下進(jìn)行SDS-PAGE，并用CBB使蛋白質(zhì)著色，其結(jié)果是在相應(yīng)于分子量155K道爾頓的位置上檢測(cè)出單一譜帶，它證實(shí)了純化的酶制劑是分子量為155K道爾頓的酶蛋白。
改進(jìn)例1介紹的GTF測(cè)定條件，以便研究GTF活性的PH最佳值、反應(yīng)的最佳溫度范圍以及失活條件，其結(jié)果證明了所得到的純化酶制劑具有前述(2)至(4)的物理化學(xué)性質(zhì)。
按照例3介紹的方法，對(duì)通過(guò)純化酶制劑的作用而合成的這種葡聚糖進(jìn)行了研究，純化酶制劑的用量相當(dāng)于50mU的酶活性，其結(jié)果指出純化酶制劑是具有合成水不溶性葡聚糖活性的CA-GTF-I。
按上述方法對(duì)得到的純化酶制劑的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)量，其量為9.7mg。
例6〔抗體的制備〕以1∶1的比例混合0.5ml按例4獲得的粗CA-GTF-I制劑(按CBB-B法測(cè)量，其蛋白質(zhì)含量為1mg)和0.5mlFCA(Freund′scompleteadjuvant)制成W/O型乳劑。
第一次免疫作用是通過(guò)對(duì)母雞左、右側(cè)胸肌各注射0.5ml上述乳劑，然后，采用下述方法測(cè)量由雞蛋獲得的WSF(下面詳述)的抗體滴定度，并觀察其變化。
(1)從雞蛋中分離抗體的方法把從蛋中分離出來(lái)的蛋黃與等體積的PBS(磷酸鹽-緩沖的鹽水，PH7.4)和兩倍體積的氯仿相混合。
該混合物于室溫下培養(yǎng)30分鐘，以3，000rpm離心20分鐘，取其上層作為WSF(水溶性組份)。
(2)測(cè)量抗體滴定度的方法。
用ELISA法測(cè)量抗體滴定度。
首先，把例1中得到的粗免疫抗原制劑加到SDS-PAGE上，以便采用電洗脫法，在SDS-PAGE上從相應(yīng)于分子量為155K道爾頓的部份中分離出含蛋白質(zhì)的組分。再將這一組份加到SDS-PAGE上，用CBB-R250使凝膠著色。在相應(yīng)于分子量為155K道爾頓的位置上檢測(cè)到一條單一譜帶。
將得到的組份溶解于50mM碳酸鈉緩沖液(PH9.6)中，以得出1.25mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。將所得到的每份為100μl的等分試樣加到96孔微量滴定板(Immulon2，Dynateck)的每一孔上，并于4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，使含在組份中的純化抗原能被涂在該板上。
所述板用PBS-T(含0.05%吐溫20的PBS)(PH7.4)洗五次。
洗滌后，用含3%BSA(?？蒲迩宓鞍?的PBS(PH7.4)于37℃把孔封閉1小時(shí)，然后用PBS-T洗板5次。
將以前得到的已用PBS-T分兩步稀釋的WSF的每份100μl的等分試樣加到各孔中，然后于37℃反應(yīng)1小時(shí)。
反應(yīng)完成后，用PBS-T洗板5次，并將每份為100μl的結(jié)合3抗-雞IgG抗體的(蛋白質(zhì)含量為1.67μg/ml)過(guò)氧化物酶，分送至滴定板上的各孔中，該板于25℃培養(yǎng)30分鐘，然后用PBS-T洗5次。
將20mg鄰苯二胺和10μl的過(guò)氧化物(作底物)溶于50ml0.2mM磷酸二鈉和0.1M檸檬酸緩沖液(PH5.0)中，取該溶液100μl加至滴定板上的各孔內(nèi)。于25℃培養(yǎng)20分鐘進(jìn)行反應(yīng)，然后加入100μl3N的硫酸溶液使反應(yīng)終止。
反應(yīng)后，由每個(gè)孔內(nèi)的光密度(OD492)測(cè)量抗體滴定度。通過(guò)在稀釋后得到0.2光密度時(shí)的終點(diǎn)滴定度法來(lái)確定抗體滴定度。
然后如圖1所示，在證實(shí)第一次免疫作用后8周，蛋黃內(nèi)的抗體滴定度開始下降，則按照前述同樣的方法進(jìn)行第二級(jí)免疫。
在第二次免疫后大約1個(gè)月收集雞蛋，用上述方法測(cè)定抗體滴定度。
其結(jié)果是在第一次免疫后12周(2次免疫后4周)獲得具有抗體滴定度為8.4×103的WSF。
而且，用Biured法測(cè)量了具有抗體滴定度為8.4×103(13ml，從13ml蛋黃中制備的)的WSF的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果WSF中的總蛋白量約為26mg(約2.0mg/ml×13ml)。
例7〔證實(shí)抗體可抑制S.mutans與平滑表面的粘著〕作為S.mutans與牙齒表面粘著的模型試驗(yàn);進(jìn)行了在玻璃表面粘著的試驗(yàn)。
這個(gè)實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)加入例6得到的抗體后對(duì)S.mutans與玻璃表面粘著的抑制程度，下面說(shuō)明此方法。
首先，把例6中獲得的具有抗體滴定度8.4×103的WSF，稀釋10倍后的溶液作為試驗(yàn)溶液。
第二，按照例6介紹的方法，從未經(jīng)免疫的母雞(與例5所用的同一種類)的雞蛋制備WSF作為試驗(yàn)溶液待用。證實(shí)這種WSF與CA-GTF-I無(wú)特異反應(yīng)。
然后，把每份1ml的這些試驗(yàn)溶液分送至試管內(nèi)(13mm×100mm)，然后再將每份2ml含1.5%蔗糖的濃縮1.5倍的BHI培養(yǎng)基加入試管。
接著，在每個(gè)試管內(nèi)添加0.1ml在BHI培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的S.mutans菌株Ingbritt的懸浮液，使試管傾斜30°，于37℃下靜置培養(yǎng)18小時(shí)。
每個(gè)試管制備的制劑組合物列于表6。
在完成靜止培養(yǎng)后，每個(gè)試管按下述方法進(jìn)行處理，測(cè)定細(xì)胞對(duì)試管壁的粘著率。
在靜止培養(yǎng)完成后，使每個(gè)試管(下文稱為第1組試管)緩慢旋轉(zhuǎn)，把含有細(xì)胞的、與試管壁不粘著的全部液體轉(zhuǎn)移至第二組每個(gè)試管內(nèi)。將每份為3ml50mM磷酸鹽緩沖液(PH6.8)加到壁上粘著了細(xì)胞的第一組試管中，并再次使試管旋轉(zhuǎn)，在向每個(gè)第三組試管轉(zhuǎn)移含有釋放出細(xì)胞的全部緩沖液后，再向每個(gè)這樣得到的第一組試管添加3ml50mM磷酸鹽緩沖液(PH6.8)。
第一組、第二組和第三組試管要經(jīng)超聲振蕩處理，為的是在每根試管內(nèi)制備均勻的細(xì)胞懸浮液。測(cè)量每根試管懸浮液的光密度(OD550)，按下式計(jì)算各自的粘著率粘著率(%)＝ (第一組試管的光密度)/(第一、第二、第三組試管光密度之和) ×100計(jì)算結(jié)果列于表6。
表6細(xì)胞懸浮液號(hào)數(shù)123含1.5%蔗糖的BHI培養(yǎng)基濃縮3/2倍2ml2ml2mlWSF1ml--WSF稀釋10倍-1ml-由未經(jīng)免疫母雞的蛋得到的WSF--1ml細(xì)菌細(xì)胞(在BHI中S.mutans株Ingbritt0.1ml0.1ml0.1ml的預(yù)培養(yǎng)物)粘著率(%)26.065.389.6例8按照例6所述的同樣方法制備抗體，不同的是用例5獲得的純化CA-GTF-I制劑作為抗原。結(jié)果所獲得的抗體同樣能與CA-GTF-I特異反應(yīng)。
接著，按照例7介紹的同樣方式檢查所得到的抗體對(duì)防止細(xì)菌粘著的效果，證明所得到的抗體同樣具有優(yōu)良的防止效果。
例9將例6所獲得的具有抗體滴定度為8.4×103的WSF加至〔按重量計(jì)0.5%〕具有表7給出的組合物成份中，以制備牙膏和加至具有表8所列組合物的溶液中，以制備漱口劑。
更具體地說(shuō)，在蒸餾水中溶解1.2%(重量)羧甲基纖維素和0.1%(重量)糖精鈉以制成溶液，將其加至42%(重量)的焦磷酸鈣中，以得到一混合物。再進(jìn)一步向該混合物添加15%(重量)甘油，10%(重量)山梨醇(Sorbit)、2.0%(重量)十二烷基硫酸鈉、1.0%(重量)香料和0.5%(重量)WSF。用一臺(tái)捏合機(jī)或一臺(tái)混合攪拌器使得到的混合物充份混合，再輥壓，以制得表7所示牙膏組合物。在從該組合物脫除氣泡以后，將該組合物裝入管內(nèi)。
另外，1.0%(重量)香料和0.3%(重量)月桂基二乙醇酰胺溶于22.5%(重量)的乙醇中，得到一溶液，再溶解0.05%(重量)糖精鈉和0.5%(重量)的WSF于蒸餾水中，將該溶液加到上述溶液中，從而得到一混合物，進(jìn)一步向該混合物添加蒸餾水，以便獲得具有表8所示組合物的漱口劑。
表7組份濃度(%以重量計(jì))焦磷酸鈣42甘油15山梨醇10羧甲基纖維素1.2糖精鈉0.1十二烷基硫酸鈉2.0香料1.0水其余100%
表8組份濃度(%以重量計(jì))乙醇22.5糖精鈉0.05月桂基二乙醇酰胺0.3香料1.0水其余量100%
權(quán)利要求
1.細(xì)胞結(jié)合的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，它具有下列物理化學(xué)性質(zhì)a)、與蔗糖反應(yīng)合成水不溶性葡聚糖；b)、具有的最佳pH值在6.7-7.0之間c)、具有的最佳溫度在15-50℃之間；d)、于80℃熱處理5分鐘失去其活性；e)、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定其分子量為150-165K道爾頓；和f)、在動(dòng)物體內(nèi)具有免疫性，以至于產(chǎn)生該酶本身的特異抗體。
2.一種分離和純化權(quán)利要求1所述的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括的步驟有，從c、e或f血清型S.mutans培養(yǎng)細(xì)胞中提取具有產(chǎn)生細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶能力的所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，該酶能催化由蔗糖合成水不溶性葡聚糖，以及通過(guò)由兩種吸附程序組成的方法純化該葡糖基轉(zhuǎn)移酶，一種使用陰離子交換劑，而另一種使用羥基磷灰石。
3.一種生產(chǎn)共有合成水不溶性葡聚糖酶活性的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括的步驟有培養(yǎng)血清型c、e或f的S.mutans，它具有產(chǎn)生催化自蔗糖合成水不溶性葡聚糖反應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶的能力以及由得到的培養(yǎng)細(xì)胞制備權(quán)利要求1所述的被分離的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
4.一種抗體，它用權(quán)利要求1所述的分離細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)免疫的母雞所產(chǎn)的蛋制備的，并對(duì)產(chǎn)生齲齒的血清型c、e、或f的S.mutans表現(xiàn)出免疫活性。
5.一種生產(chǎn)抗體的方法，該抗體對(duì)產(chǎn)生齲齒的牙的血清型c、e或f的S.mutans表現(xiàn)出免疫活性，所述方法包括的步驟有使用權(quán)利要求1中所述分離的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)免疫母雞，和從免疫的母雞蛋制備具有對(duì)所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶有免疫活性的免疫球蛋白。
6.一種齲齒預(yù)防組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求4中所述的抗體作為有效成份。
7.一種制備齲齒預(yù)防組合物的方法，其特征在于包括混合一個(gè)如權(quán)利要求4中所述的抗體和至少一種載體的步驟。
全文摘要
能產(chǎn)生齲齒的s.mutans血清型c、e或f的細(xì)胞結(jié)合葡糖基轉(zhuǎn)移酶被分離和凈化，并揭示了它作為一種酶的特征。此外，抗該種酶的抗體已由用這種酶免疫的母雞所產(chǎn)的蛋來(lái)制備。由于這種抗體能有效地防止上述s.mutans對(duì)牙齒表面的粘著，所以它被用作齲齒預(yù)防組合物的有效成分。
文檔編號(hào)A61Q11/00GK1036036SQ89101420
公開日1989年10月4日 申請(qǐng)日期1989年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1988年1月22日
發(fā)明者堀越俊雄, 平岡淳一郎, 藤田勇, 所透, 兒玉義勝, 橫山英明 申請(qǐng)人:紡株式會(huì)社, 株式會(huì)社源