專利名稱：含有酰胺和類視色素的皮膚護理組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有酰胺和視黃醇或視黃酯的皮膚護理組合物，并涉及美容方法，包括在皮膚上施用這種的組合物的方法。
背景技術(shù)：
視黃醇(維生素A)是一種內(nèi)源的化合物，其在人體天然地存在，并且是對正常的上皮細(xì)胞分化來說是必要的。天然的和合成的維生素A衍生物已經(jīng)被廣泛地用于治療多種皮膚疾病，也已用作皮膚護理或再生劑。視黃酸已被使用在治療多種皮膚病癥，例如粉刺、皺紋、牛皮癬、老年斑和變色。見例如Vahlquist,A等，皮膚研究雜志，Vol.94,Holland D.B.and Cunliffe,W.J.(1990),496-498頁；Ellis,C.N.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，Vasel,Karger,Vol.3(1989),249-252頁；Lowe,N.J.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，Vol.3(1989),240-248頁；PCT專利申請?zhí)朩O93/19743。
人們相信，利用視黃醇或視黃酯比視黃酸更有利。視黃醇是一種內(nèi)源化合物。視黃醇的酯在體內(nèi)水解生成視黃醇。視黃醇和視黃酯(retinyl esters)被認(rèn)為比視黃酸安全。不利的是，視黃醇和視黃酯在護理皮膚方面沒有視黃酸有效。本發(fā)明部份地基于這樣一個發(fā)現(xiàn)，即將視黃醇或視黃酯與羥基脂肪酸酰胺結(jié)合，導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞分化的協(xié)同抑制。羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯結(jié)合的作用，類似于視黃酸的作用。因此，羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯的混合物可以模擬視黃酸，但使用時比視黃酸更容易和更安全Thomfeldt(美國專利5057501)公開了一種用含有倍半萜化合物和大約0.025％至大約35％單羧基脂肪酸、酯或酰胺的組合物，治療丘疹鱗屑病和濕疹的方法。所述組合物也可包含類視色素。Thomfeldt講授了某些類視色素，即異維A酸、維A酸、阿維A(它們都是視黃酸的立體形式(stereoform))和阿維A酯(三甲氧基苯基視黃酸的酯)，具有抗丘疹鱗屑病的功效。PCT申請WO/9325177(寶潔公司)向皮膚局部施用的組合物，它含有特定類型的無環(huán)氨甲酰冷卻劑，也可包含類視色素，例如視黃酸及其衍生物(例如順式和反式衍生物)。PCT申請WO/9403156(Rhone Poulenc)公開了含有作為活性成分的亞油酸或衍生物的局部施用組合物，用于治療和預(yù)防皮膚病變(例如丘疹、膿皰或comedones)。該組合物也可含有0.025-0.1重量％的維A酸。歐洲專利0388275(Pierre Fabre Cosmetique)公開了用于治療皮脂溢的組合物，它含有烷基酰胺和鋅鹽一種可以是視黃酸鋅的鋅鹽。
Klaus等(美國專利5216148)公開了特定絡(luò)合的羧酰胺在治療和防止贅生物、皮膚病和皮膚老化中的應(yīng)用。Van Scott等(美國專利4380549)和Yu等(美國專利4363815)公開了用羥酸或其酰胺治療粉刺、皮膚干燥、脫皮、鱗狀皮膚。EP0582458公開了N,N-(C14烷基)月桂酰胺的應(yīng)用。EP0559304公開了含有至少25個碳原子的烴鏈的一種酰胺作為皮膚光滑劑的應(yīng)用。Beauquey等(美國專利5308551)公開了一種皮膚清洗和調(diào)理組合物，它含有(除其它成分外)C8-16脂肪酸的C1-4烷醇酰胺。英國專利說明書1126289(Hoffmnan-La Roche)公開了一種常備(stock)維生素制劑，它含有維生素A醇或維生素A酯、乳化劑和選自單羧酸(例如N,N-二乙基-乙酰胺，N,N-二甲基-乙酰胺或N,N-二甲基甲酰胺)的醇或二烷酰胺的溶劑。該維生素制劑具有非常高的維生素含量，即，最低濃度為250,000國際單位維生素A/毫升。此外，′289申請中公開的酰胺不包括或涉及melinamide。
1996年11月13日出版(本申請的優(yōu)先權(quán)日之后)的較早前提交的歐洲專利申請EP 0742005(聯(lián)合利華，優(yōu)先權(quán)日1995年5月8日)，公開了脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯的結(jié)合.EP′005沒有講授羥基脂肪酸酰胺。
上述
背景技術(shù)：
沒有公開基于羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯協(xié)同性結(jié)合的皮膚調(diào)理組合物。上面引用的文獻沒有提及對視黃酸的有效替代物的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明部份地包括一種皮膚調(diào)理組合物，其含存(a)0.001％到10％的選自視黃醇和視黃酯的類視色素；(b)0.0001％到50％的羥基脂肪酸的酰胺；(c)美容用賦形劑。
本發(fā)明也提供一種調(diào)理皮膚的美容方法，包括將本發(fā)明的組合物局部地施用在皮膚上。本發(fā)明進一步提供一種模擬視黃酸在皮膚上的作用的美容方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物局部地施用在皮膚上。
本文使用的術(shù)語“調(diào)理”是指防止和治療一種或一種以上的如下皮膚病癥皮膚干燥，皮膚的光損傷，出現(xiàn)皺紋，老年斑，皮膚老化，粉刺，牛皮癬，特應(yīng)性皮膚病。該組合物也可以用于使皮膚增亮和/或控制皮脂分泌，和/或增加角質(zhì)層彈性，和全面地改善皮膚質(zhì)量。該組合物可以用于改善脫皮和促進細(xì)胞增生。
羥基脂肪酸酰胺在本發(fā)明產(chǎn)物中的存在明顯提高了視黃醇或視黃酯的功效，即羥基脂肪酸酰胺明顯提高了視黃醇或視黃酯影響細(xì)胞增生的能力。當(dāng)單獨使用時，羥基脂肪酸酰胺沒有或有很少的改善皮膚的作用。只有當(dāng)羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯結(jié)合時，才能明顯表現(xiàn)出對皮膚的改善。
簡而言之，本發(fā)明至少部分地基于視黃醇或視黃酯和羥基脂肪酸酰胺之間協(xié)同性相互作用的發(fā)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，由于在含有視黃醇或視黃酯的組合物中加入了有效量的羥基脂肪酸酰胺，該組合物的效能有了實質(zhì)性的提高。此外，可以在含有羥基脂肪酸酰胺的組合物中加入較低濃度的視黃醇或視黃酯，其效能與不含酰胺的組合物相近。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明組合物含有作為第一必需成分的選自視黃醇、視黃酯及其混合物的化合物。
在此使用的術(shù)語“視黃醇”尤其包括視黃醇的下列異構(gòu)體全-反-視黃醇、13-順-視黃醇、11-順-視黃醇、9-順-視黃醇、3,4-二脫氫-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全-反-視黃醇、13-順-視黃醇、3,4-二脫氫-視黃醇、9-順-視黃醇。最優(yōu)選的是全-反-視黃醇，因為它有廣泛的商用上易得性。
視黃酯是一種視黃醇的酯。術(shù)語“視黃醇”已在上文定義。適合用于本發(fā)明的視黃酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20的酯，并最優(yōu)選C2、C3和C16的酯，因為它們較易得到。視黃酯的例子包括但不限于棕櫚酸視黃酯、甲酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、丁酸視黃酯、戊酸視黃酯、異戊酸視黃酯、己酸視黃酯、庚酸視黃酯、辛酸視黃酯、壬酸視黃酯、癸酸視黃酯、十一酸視黃酯、十二酸視黃酯、十三酸視黃酯、十四酸視黃酯、十五酸視黃酯、十七酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、異硬脂酸視黃酯、十九酸視黃酯、廿酸視黃酯、二十二酸視黃酯、亞油酸視黃酯、油酸視黃酯、乳酸視黃酯、甘醇酸視黃酯、羥基辛酸視黃酯、羥基十二酸視黃酯、酒石酸視黃酯。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯和丙酸視黃酯、因為這些是商業(yè)上最易得的，也因此最便宜。亞油酸視黃酯由于其功效也是優(yōu)選的。
本發(fā)明組合物中類視色素的用量為0.001％到10％，優(yōu)選0.01％到1％，最優(yōu)選0.01％到0.5％。
本發(fā)明組合物的第二必需成分是羥基脂肪酸酰胺。一種羥基脂肪酸酰胺的結(jié)構(gòu)如下所示

其中R1、R2和R4各自獨立地選自氫和脂肪族飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，它們可被羥基化，并含有1至20個碳原子；R3是(CH2)n，其中n是0-18的整數(shù)。
優(yōu)選地，R1、R2和R4各自獨立地含有2至20個碳原子，更優(yōu)選2至15個碳原子，最優(yōu)選3至13個碳原子。
優(yōu)選地，羥基酰胺是α-或β-羥基酸的酰胺，即n是0或1。
本發(fā)明的組合物中的最優(yōu)選的羥基脂肪酸酰胺是N-羥乙基乳酸酰胺、C13-β-羥基酰胺(2-羥基-C13-酰胺)、N-羥基乙基-2-羥基-C16酰胺、12-羥基-N-(2-羥基乙基)十八酰胺，以及蓖麻油一乙醇酰胺。
本發(fā)明組合物中的酰胺的含量為0.0001％到50％，優(yōu)選0.01％到10％，最優(yōu)選0.1％到5％。美容用賦形劑本發(fā)明的組合物也包含一種美容用賦形劑，作為組合物中活性成分的稀釋劑、分散劑或載體，以促進它們在施用于皮膚上時的分布。
除了水之外，賦形劑還可包括液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和粉末。一種特別優(yōu)選的非含水載體是聚二甲基硅氧烷，和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的硅氧烷可以是在25℃時粘度范圍在10到10,000,000mm2/s(厘司)中任何一值的硅氧烷。特別優(yōu)選的是低粘度和高粘度硅氧烷的混合物。這些硅氧烷可以從通用電氣公司以商標(biāo)Vicasil,SE和SF獲得，或在Dow Coming公司的200和550系列中獲得。可以在本發(fā)明的組合物中利用的硅氧烷的用量范圍以組合物重量計為5％到95％，優(yōu)選25％到90％。
美容用賦形劑的含量以組合物重量計通常占5％到99.9％，優(yōu)選25％到80％，并且在缺少其他的化妝品助劑時，可以使組合物達到足量。優(yōu)選地，以賦形劑的重量計，賦形劑中最少50重量％，更優(yōu)選最少80％是水。優(yōu)選地，以組合物的重量計，水最少含50重量％，更優(yōu)選60％到80重量％的本發(fā)明的組合物?？蛇x的對皮膚有益的材料和化妝品助劑可以采用一種油或油性的材料，以及一種乳化劑，從而主要依據(jù)所用乳化劑的平均親水親脂平衡值(HLB)而提供油包水乳液或水包油乳液。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含吸光成份(sunscreens)。吸光成份包括通常用于阻隔紫外光的材料。例示化合物有對氨基苯甲酸酯(PABA)、肉桂酸酯和水楊酸酯衍生物。例如，可以用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基-二苯甲酮(也稱氧苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基-二苯甲酮都可以分別以商標(biāo)Parsol MCX和二苯甲酮-3購得。用于乳劑中的確切的吸光成份含量會視乎所需的防紫外光的保護程度而變化。
另一種優(yōu)選的可選成份選自必需脂肪酸(EFA)，即那些對形成所有細(xì)胞的細(xì)胞膜所必需的脂肪酸。角質(zhì)細(xì)胞如果缺乏EFA，會使細(xì)胞增殖過度。補充EFA可以抑制細(xì)胞增殖過度。EFA還會提高表皮中脂類的生物合成，并且為表皮的阻擋層的形成提供脂類。必需脂肪酸優(yōu)選亞油酸，γ-亞油酸，高-γ-亞油酸(homo-γ-linolenic acid)，咖倫賓(columbinic)酸，二十碳-(n-6,9,13)-三烯酸(trienoic acid)。花生四烯酸，α-亞油酸，二十碳五烯酸，己烯酸(hexaenoic acid)和其混合物。
另一種可選成份選自吡咯類，例如氯咪巴唑、聯(lián)苯芐唑、克霉唑、酮康唑、咪康唑、益康唑、伊曲康唑、氟康唑、特康唑、布康唑、硫康唑、lionazole和其混合物。吡咯在本發(fā)明組合物中的含量是從0.001到50重量％，優(yōu)選從0.001到10重量％，最優(yōu)選從0.1到5％。
潤膚劑常被加進本發(fā)明的美容組合物中。如此的潤膚劑的水平自0.5％到50％，優(yōu)選從5％到30％的總組合物重量。潤膚劑通常分為酯類、脂肪酸類和脂肪醇類、多醇類和碳?xì)浠衔镱悺?br> 酯類可以是單酯或二酯?？山邮艿闹径サ睦影憾岫□ィ锒岫阴?，二聚二異丙酯(diisopropyl dimerate)，和丁二酸二辛酯?？山邮艿闹ф溨觉グㄊ耐樗?-乙基己酯?？山邮艿娜龎A酸酯包括三亞油酸三異丙酯和檸檬酸三月桂酯?？山邮艿闹辨溨觉グㄗ貦八嵩鹿瘐?，乳酸十四烷酯，oleyl eurcate，和硬脂酰油酸酯。優(yōu)選的酯包括椰子辛酸酯/癸酸酯(coco-caprylate/caprate)(一種椰子辛酸酯(coco-caprylate)和椰子癸酸酯(coco-caprate)的混合物)，丙二醇十四烷基醚醋酸酯，己二酸二異丙酯和辛酸十六烷酯。
合適的脂肪醇和酸包括有10至20個碳原子的化合物，特別優(yōu)選的化合物有十六烷-，十四烷-，棕櫚-和十八烷醇和酸。
在多醇類中能可用作潤膚劑的是直鏈和支鏈烷基多羥基化合物。例如，優(yōu)選丙二醇，山梨醇和丙三醇。也可用聚合的多醇(polyol)如聚-丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也特別優(yōu)選用作滲透增強劑。
可以用作潤膚劑的示例碳?xì)浠衔锸菗碛?2至30 個碳原子的碳?xì)滏湣?br> 具體的例子包括礦物油，凡士林，鯊烯和異鏈烷烴。
另一類在本發(fā)明的美容組合物的功能性成分是增稠劑。增稠劑通常用量為組合物重量的0.1到20％，優(yōu)選從0.5％到10％?？梢杂米髟龀韯┑睦邮墙宦?lián)聚丙烯酸酯材料，在B.E.Goodrich公司可以商標(biāo)Carbopol購得?？梢允褂媚z質(zhì)如黃原膠(xanthan)、角叉菜膠(arrageenan)、明膠、梧桐膠、果膠和刺槐豆膠。在某些情況中該增稠功能可以通過一種材料完成，該材料也起到硅氧烷或潤膚劑的作用。例如，粘度超過10厘司的硅氧烷膠質(zhì)與諸如硬脂酸甘油酯的酯均有雙官能度。
可以將粉末加進本發(fā)明的美容組合物。這些粉末包括白堊、滑石、漂白土、高嶺土、淀粉、綠土、化學(xué)改性的鎂鋁硅酸鹽、化學(xué)改性的蒙脫土、水化硅酸鋁、熏制二氧化硅、鋁淀粉琥珀酸辛烯酯及其混合物。
其他的附助性次要成分也可加進美容組合物中。這些成分可以包括著色劑、遮光劑和香水。這些附助性次要成分的用量范圍可以是組合物重量的0.001％到20％。組合物的應(yīng)用本發(fā)明的組合物主要地用來成為一種局部施用在人類皮膚上的產(chǎn)品，特別地是用作一種皮膚調(diào)理劑和皮膚光滑劑，并且防止或減少皺紋或皮膚衰老的出現(xiàn)。
在應(yīng)用時，將少量的，例如從1到100ml的本發(fā)明組合物涂在皮膚的暴露部位。該少量的本發(fā)明組合物可以取自一種合適的容器或敷料器，并且如有需要，用手或手指或一種合適的裝置將該組合物涂和/或擦在皮膚之上。產(chǎn)品形式與包裝根據(jù)本發(fā)明的局部皮膚治療的組合物可以適當(dāng)?shù)刂瞥上磩?、霜劑或凝膠。該組合物可以在合適的容器內(nèi)包裝以配合它的黏度和消費者所需的應(yīng)用。例如，洗劑或霜劑可以在瓶子或滾珠敷料器(roll-ball applicator)內(nèi)包裝，或是在一種噴霧裝置內(nèi)包裝或在一種安裝了適用于手指操作的泵的容器內(nèi)包裝。當(dāng)組合物是霜劑時，它可以簡單地儲存在一種不會變形的瓶子或擠壓容器內(nèi)，例如一種管或有蓋的罐內(nèi)。本發(fā)明的組合物也可包含在膠囊內(nèi)，例如那些在美國專利5063057中所描述的。
本發(fā)明也相應(yīng)地提供一種密封的容器，該容器含有一種在本文中定義的美容組合物。
下列的具體實施例進一步闡明本發(fā)明。類視色素得自Sigma公司。材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞，以胰蛋白酶處理分離自新生的包皮，在用射線照射的3T3老鼠纖維原細(xì)胞存在下，培養(yǎng)于Dulbecco Modification Fagle(DME)HamsF12(1∶1)培養(yǎng)基/10％胎牛血清中，用以確立分裂中的角質(zhì)細(xì)胞集落。該細(xì)胞在上述的條件生長到它們的第二代(second passage)，并且冷凍保存以作未來之用。解凍冷凍的第二代角質(zhì)細(xì)胞，將上述的培養(yǎng)基放進平板并培養(yǎng)五日，然后換成Clonetics公司(San Diego,CA)的角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM)，它是含有0.15mM鈣的無血清的基于MCDB 153的培養(yǎng)基,或者GIBCO公司的含有0.09mM鈣的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)。到第七日，當(dāng)細(xì)胞80-90％匯合時，將細(xì)胞用胰蛋白酶處理并置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以用于不同的實驗。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶檢測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶檢測與角質(zhì)細(xì)胞分化在表皮內(nèi)末端分化(terminal differentiation)的過程中，一個15nm厚的蛋白質(zhì)層，稱為角質(zhì)被膜(CE)，形成于細(xì)胞外周的內(nèi)表面。該角質(zhì)被膜由許多不同的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)通過形成Nc-(γ-谷氨?；?懶氨酸異二肽鍵交聯(lián)在一起，該Nc-(γ-谷氨?；?賴氨酸異二肽鍵的形成是經(jīng)至少兩種不同的在表皮中表達的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)催化完成。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)在表皮的已分化層(特別是粒狀層)中大量表達，卻不存在于未分化的基底皮層。因此TGaseⅠ是一種有用的表皮角質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)記物，TGaseⅠ的水平高時，表示較高程度的分化狀態(tài)。利用一種基于ELISA、使用TGaseⅠ抗體的TGaseⅠ檢測方法，評定下述實施例中培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞的分化狀態(tài)
對于實施例1，采用下面的步驟將角質(zhì)細(xì)胞(用如同上述的方法培養(yǎng))置于96孔平板中，密度為每孔200μl培養(yǎng)基中有3000個細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每個測試用六個重復(fù)實驗)。將細(xì)胞進一步培養(yǎng)72小時，然后吸出培養(yǎng)基并將平板儲存于-70℃。將平板從冷藏箱中取出，并且用PBS洗滌細(xì)胞。加入100μl無菌水，在通過在-70℃冷凍然后溶化使細(xì)胞冷凍破碎。然后用PBS/3％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)在室溫(R/T)溫育細(xì)胞達一小時，然后用新鮮的等份洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞與得自BiomedicalIndustries、用洗滌緩沖液以1∶2000比率稀釋的50μl的初級抗體單克隆抗-人類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶鼠抗體(IgG)一起溫育，在37℃溫育一小時，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次。然后將細(xì)胞與用洗滌緩沖液以1∶4000比率稀釋的50的μl次級抗體(Fab片段，從Amersham得到的過氧化物酶偶聯(lián)的抗-鼠IgG)溫育，在37℃達一小時，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次。將細(xì)胞與底物溶液(4mg鄰-苯二胺和在10ml的0.1MpH5.0檸檬酸緩沖液中的3.33μl0％過氧化氫)溫育，在室溫下，黑暗中(在鋁箔下)溫育五分鐘。加入50μl4N硫酸以中止反應(yīng)。于492nm在平板讀數(shù)器中測讀試樣的吸光度。在六個重復(fù)實驗中，四個接受兩種抗體的處理，兩個只接受次級抗體的處理(即，測定與酶偶聯(lián)的抗體的本底結(jié)合)。TGase水平由每個處理的讀數(shù)減去本底值，并且測定暴露于兩種抗體的重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
對于實施例2，采用下面的步驟將角質(zhì)細(xì)胞(用如同上述的方法培養(yǎng))置于96孔平板中，密度為每孔200μl細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中有3000個細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每測試用六個重復(fù)實驗)。將細(xì)胞進一步培養(yǎng)72小時，然后吸出培養(yǎng)基，并將平板儲存于-70℃。將平板從冷藏箱取出以后，透過冷凍后解凍進一步將細(xì)胞冷凍破碎，然后用PBS洗滌細(xì)胞三次。用PBS/5％BSA緩沖液在室溫(R/T)溫育細(xì)胞達一小時。將細(xì)胞以100∶1的比率與由BiomedicalTechnologies Inc.得到的、用TBS/1％BSA緩沖液以1∶2000比率稀釋的單克隆抗-人類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(IgG)鼠抗體(初級抗體)溫育，在37℃溫育二小時，然后用洗滌緩沖液(TBS/1％BSA/0.05％Tween-20)洗滌六次。然后將細(xì)胞與用洗滌緩沖液以1∶4000比率稀釋的100μl的Fab斷片，即從Amersham得到的與過氧化物酶偶聯(lián)的抗-鼠IgG(次級抗體)一起溫育，在37℃達二小時，然后用洗滌緩沖液洗滌三次和用PBS洗滌三次。將細(xì)胞與底物溶液(4mg鄰-苯二胺和在10ml的0.1MpH5.0檸檬酸緩沖液里的3.33μl0％過氧化氫)，在室溫下，黑暗中(在鋁箔下)溫育五分鐘。加入50μl4N硫酸以中止反應(yīng)。于492nm在平板讀數(shù)器中測讀試樣的吸光度。在六個重復(fù)實驗中，四個接受兩種抗體的處理，兩個只接受次級抗體的處理(即，測定與酶偶聯(lián)的抗體的本底結(jié)合)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平由每個處理的讀數(shù)減去本底值，并且測定暴露于兩種抗體的重復(fù)實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。DNA檢測細(xì)胞處理后測得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平可受細(xì)胞數(shù)目的影響，即，細(xì)胞數(shù)目越大，測得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平越高。將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶Ⅰ(TGaseⅠ)水平歸一化為在同一孔內(nèi)細(xì)胞的脫氧核糖核酸含量，從而消除細(xì)胞數(shù)目差異引起的變化。脫氧核糖核酸的量是一個特別有用的細(xì)胞數(shù)目(包括角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目)的指標(biāo)，因為每個細(xì)胞實際上有相同的基因組，因此有相同的脫氧核糖核酸量。一個孔內(nèi)細(xì)胞的總脫氧核糖核酸含量是與那個孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目成正比的。脫氧核糖核酸的量可用于將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶數(shù)據(jù)歸一化為細(xì)胞數(shù)目。
將角質(zhì)細(xì)胞(用如同上述的方法培養(yǎng))培養(yǎng)在96孔平板中，密度為每孔200μl細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中有3000個細(xì)胞。培養(yǎng)了四日以后，將培養(yǎng)基換為含有受試化合物的培養(yǎng)基(每測試用六個重復(fù)實驗)。將細(xì)胞進一步培養(yǎng)72小時，然后吸出培養(yǎng)基，并將平板于-70℃至少儲存1.5小時。將平板從冷藏箱取出，并且將細(xì)胞解凍30分鐘。加入100μl/孔的Hoechst染料(最終濃度1μg/ml)，并溫育15分鐘，蓋上蓋后用熒光計讀數(shù)(ex.360nm,em.460nm)。去掉染料溶液，用PBS洗孔，以準(zhǔn)備TGase 檢測。實施例1視黃酸在改變角質(zhì)細(xì)胞分化狀態(tài)方面比視黃醇更有效檢測加入了視黃酸(RA)和加入了視黃醇(ROH)對歸一化為細(xì)胞DNA含量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平的作用，結(jié)果在表1中顯示。
表1

n=3
所有受測試的視黃酸濃度，即，2.5×10-7M,2.5×10-8M和2.5×10-9M與乙醇對照實驗比較，都使角質(zhì)細(xì)胞分化下降，并且與對應(yīng)的2.5×10-7M,2.5×10-8M和2.5×10-9M視黃醇處理后的相比，角質(zhì)細(xì)胞分化下降得更為顯著。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平的下降依賴于視黃酸和視黃醇兩者的劑量。這和視黃酸具有比視黃醇更高的抑制表皮分化的作用是一致的。實施例2羥基脂肪酸酰胺和視黃醇協(xié)同抑制角質(zhì)細(xì)胞分化檢測用受試化合物處理72小時對歸一化為細(xì)胞脫氧核糖核酸含量的TGaseⅠ水平的作用。酰胺得自Quest Intemational。C13β-羥基酰胺具有下列結(jié)構(gòu)

表2A視黃醇和C13β-羥基酰胺對角質(zhì)細(xì)胞TGase/DNA的作用

n=3
2.5×10-8M視黃酸在抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平方面是非常有效的(達對照水平的6％)。當(dāng)單獨使用時，2.5×10-8M視黃醇不如視黃酸有效(79％)，而10-8M C13β-羥基酰胺對角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平?jīng)]有抑制作用。然而，2.5×10-8M視黃醇+10-8MC13β-羥基酰胺抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平達對照水平的62％。因此，C13β-羥基酰胺和視黃醇可以以類似于視黃酸作用的方式協(xié)同抑制角質(zhì)細(xì)胞分化。
檢測用受試化合物處理72小時對歸一化為細(xì)胞脫氧核糖核酸含量的TGaseⅠ水平的作用?！叭轷０稭EA”是N-羥乙基乳酸酰胺。它得自Croda化學(xué)公司。乳酰胺具有下列結(jié)構(gòu)

表2B視黃醇和乳酰胺MEA對角質(zhì)細(xì)胞分化的作用<

n=3
2.5×10-7M視黃酸在抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平方面是非常有效的(達對照水平的73％)。當(dāng)單獨使用時，2.5×10-7M視黃醇和10-6M乳酰胺DEA不如視黃酸有效(79％)。然而，2.5×10-7M視黃醇+10-6M乳酰胺DEA抑制角質(zhì)細(xì)胞TgaseⅠ水平達對照水平的72％。因此，乳酰胺MEA和視黃醇可以以類似于視黃酸作用的方式協(xié)同抑制角質(zhì)細(xì)胞分化。
實施例1-2顯示視黃酸以劑量依賴方式降低角質(zhì)細(xì)胞分化。在實施例1-2中，視黃酸被用作陽性對照和與其它受試化合物進行比較的參比化合物。視黃醇在抑制角質(zhì)細(xì)胞分化方面明顯不如視黃酸有效。
實施例1和2的出人意料的結(jié)果是，通過將視黃醇或視黃酯與羥基脂肪酸酰胺(其本身有很少的作用或沒有作用)結(jié)合，可以使視黃醇對培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞的作用提高到與視黃酸相近的水平。上述結(jié)果表明羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯協(xié)同作用，減少角質(zhì)細(xì)胞的分化，模擬視黃酸的作用。
實施例3-8例示了本發(fā)明局部組合物。這些組合物可用常規(guī)的方法加工。它們適于化妝用。具體地說，這些組合物適用于皮膚皺紋、粗糙、干燥、脫皮、老化和/或紫外傷害，以改進皮膚的外觀和感覺；也可適用于健康的皮膚以防止或延緩傷害。
實施例3本實施例例示摻入了本發(fā)明組合物的高內(nèi)相油包水乳液。

*Brij92是聚氧乙(2)油醚實施例4本實施例示摻入了本發(fā)明組合物的水包油霜劑。

*Brij56是十六烷醇POE(10)Alfol16RD是十六烷醇實施例5本實施例例示摻入了本發(fā)明組合物的乙醇洗液。

實施例6本實施例例示摻入了本發(fā)明組合物的另一種乙醇洗液。

實施例7本實施例例示摻入了本發(fā)明組合物的防曬霜

實施例8本實施例例示摻入了本發(fā)明結(jié)合物的非水性的皮膚護理組合物。<

1一種二甲基硅氧烷聚合物，分子量至少為50,000,25℃下粘度至少為10,000厘司，可從GEC獲得。2二甲基硅氧烷環(huán)化五聚物，可從Dow Coming公司獲得。3二甲基硅氧烷四聚物，可從Dow Corning公司獲得。
權(quán)利要求
1．一種皮膚調(diào)理組合物，它含有(a)0.001％-10％的選自視黃醇、視黃酯及其混合物的化合物；(b)0.0001％-50％的羥基脂肪酸酰胺；(c)美容用賦形劑。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中視黃酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、亞油酸視黃酯及其混合物。
3．權(quán)利要求1的組合物，其中成分(a)是視黃醇。
4．一種調(diào)理皮膚的美容方法，該方法包括向皮膚局部施用權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的組合物。
5．一種模擬視黃酸對皮膚作用的美容方法，該方法包括向皮膚施用權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的組合物。
全文摘要
羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯結(jié)合后，對角質(zhì)細(xì)胞分化產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。羥基脂肪酸酰胺與視黃醇或視黃酯結(jié)合后的作用與用視黃酸處理后的作用類似。
文檔編號A61Q19/02GK1237899SQ97199922
公開日1999年12月8日 申請日期1997年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月27日
發(fā)明者S·P·格蘭格, A·V·羅林斯, I·R·斯科特 申請人:尤尼利弗公司