專利名稱：應(yīng)用可剝離的膜局部施用酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及局部施用含酶組合物的領(lǐng)域。
酶被應(yīng)用于一些消費(fèi)品中，其中有洗滌劑和化妝品。一個(gè)與含酶制品相關(guān)的問題是在吸入空氣傳播的粉塵或氣溶膠時(shí)，酶可能引起變應(yīng)性致敏。例如，在局部施用含酶的乳膏之后，當(dāng)乳膏干燥時(shí)含酶的塵?？赡軓氖┯貌课槐会尫懦鰜怼?br> 一種防止吸入含酶塵粒的解決辦法是在其實(shí)際應(yīng)用前將酶固定化(參見日本專利申請(qǐng)J57073098和J61268611)。但是，已知固定化酶對(duì)固體底物(皮膚)的活性很低。例如，預(yù)計(jì)固定化蛋白酶不與角質(zhì)層蛋白質(zhì)相互作用。
因此，希望以這樣的方式施用含非固定化形式的酶的組合物，即不會(huì)發(fā)生塵粒從施用部位的釋放。
本發(fā)明提供了一種解決上述問題的簡(jiǎn)便方法，即通過提供一種局部施用酶的方法，其中含酶塵粒從施用部位的釋放被避免了而酶的活性得到了保障。
本發(fā)明公開了一種局部施用含酶組合物的方法，其中施用了另外還包括成膜劑的酶組合物。在局部施用所述組合物時(shí)，由于應(yīng)用的溶劑的蒸發(fā)，所以成膜劑使得可形成摻和了所述酶的可剝離膜。在溶劑蒸發(fā)之后并且在酶完成了它的任務(wù)以后，從施用部位除去摻和了該酶的膜。這樣，避免了含酶塵粒(當(dāng)含酶組合物在施用部位干燥時(shí)它們?nèi)菀仔纬?的釋放。
具體地說，本發(fā)明的方法包括如下步驟制備包括酶和成膜劑的組合物，局部施用所述組合物，
將施用部位上的所述組合物保溫足夠長的一段時(shí)間使之能形成摻和了所述酶的膜，以及從施用部位除去摻和了該酶的所述膜。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述包括酶和成膜劑的組合物是通過混合兩種單獨(dú)的組合物(即包括所述酶的第一種組合物和包括所述成膜劑的第二種組合物)而制備的。這樣，所述酶不會(huì)受到溶解的成膜劑的存在或者任何助劑的存在的有害影響。
該實(shí)施方案一個(gè)優(yōu)選的選擇包括將所述兩種單獨(dú)的組合物包裝在雙組分分配系統(tǒng)中。應(yīng)用雙組分分配系統(tǒng)，可以同時(shí)送遞包括所述酶的組合物和包括所述成膜劑的組合物。在送遞時(shí)，這兩種單獨(dú)的組合物或者被就地混合，或者在分配系統(tǒng)中被混合。兩種組合物的混合形成呈適合直接應(yīng)用的形式的、包括所述酶和成膜劑的最終組合物。
對(duì)應(yīng)用于本發(fā)明該實(shí)施方案中的分配系統(tǒng)要求不苛刻。能單獨(dú)盛裝所述酶組合物和包括成膜劑的組合物的任何系統(tǒng)都可應(yīng)用。
例如，分配系統(tǒng)可選自為包裝和送遞不相容性化合物(即在接觸時(shí)能相互反應(yīng)的化合物)而開發(fā)的雙組分分配系統(tǒng)。例如，從粘合劑領(lǐng)域得知的雙組分分配器。
除了粘合劑外，還描述了關(guān)于在牙膏中配制不相容性化合物的多組分分配系統(tǒng)。柔性兩室牙膏管被描述于美國專利US4,487,757和US4,098,435中。FR2,051,922中描述了一種兩室管，它可供貯存與水性牙膏組合物隔離的非水酶組合物。
但是在另一個(gè)基本上很簡(jiǎn)單的方法中，一對(duì)塑料袋提供只供一次應(yīng)用的物質(zhì)。兩個(gè)袋的出口相互靠近，可通過撕開所述袋的端頭實(shí)現(xiàn)其內(nèi)含物的排放(德國專利申請(qǐng)DE3 630 849)。
此外，德國“Gebrauchsmuster”DE，U，93 07 726提到了一種兩室包裝單元，其中兩種獨(dú)立地包裝的組分可通過在一個(gè)室上加壓而混合。只有在完全混合之后，才開啟該包裝從而釋放新配制的混合物。
示于

圖1中的可商購的容器也是合適的。在該容器中，酶組合物(例如呈凍干的粉末形式)存在于放置在小瓶頂部的塞子中。向下推瓶帽就刺穿將酶組合物和包括成膜劑的組合物分開的膜。在振蕩時(shí)，所述酶組合物和成膜組合物被混合接著就被應(yīng)用。
應(yīng)用示于圖2A和B中的容器可獲得相同的完全混合方法。圖2A的容器是一種常規(guī)管，它包括含成膜劑的組合物，另外還包括一個(gè)含呈穩(wěn)定化形式的酶的小囊或細(xì)頸瓶。圖2B的容器是一種兩室囊，其中兩個(gè)室被易破的膜隔離。就在應(yīng)用前，通過以釋放所述穩(wěn)定化酶的方式彎曲或壓緊而開啟或破碎該囊或細(xì)頸瓶。在充分混合所述酶與包括成膜劑的組合物之后，開啟該管或囊，于是局部施用其內(nèi)容物。
應(yīng)用于本發(fā)明方法中的酶將取決于所需的施用。合適的酶一般見于下列分類的酶氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶和/或異構(gòu)酶。例如，該酶是葡糖氧化酶、過氧化物酶、脂肪氧合酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶、蛋白酶、磷酸酶、植酸酶、糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶、酯酶、脂肪酶、磷脂酶、硫酸酯酶、脲酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。還可應(yīng)用包括兩種或多種酶的混合物的組合物。
應(yīng)用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的酶是蛋白酶。
對(duì)本發(fā)明來說，對(duì)酶的配制方法要求并不苛刻。該酶可作為固體組合物或液體組合物配制。液體組合物例如可以是含水的組合物，其中該酶被溶解了并且優(yōu)選被穩(wěn)定化了；或者可以是懸浮液，其中固體形式的酶被懸浮于液體中。備選地，該酶可被配制成水包油型乳液或油包水型乳液。在兩種乳液中，該酶優(yōu)選呈穩(wěn)定化形式存在于水相中。此外，該酶可作為大致干燥的粉末存在，任選懸浮于非水液體中。于是，該酶組合物的性質(zhì)可能取決于例如所需的施用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶組合物是含水組合物，其中該酶被溶解了。為了穩(wěn)定地將酶配制于含水組合物中，所述酶組合物優(yōu)選包括足量的水活度降低劑。例如，可應(yīng)用多元醇來穩(wěn)定。
在這方面，被用于穩(wěn)定含水的酶組合物的多元醇的選擇在本發(fā)明中要求并不苛刻?？蓱?yīng)用技術(shù)人員已知的能有效地穩(wěn)定水溶液中的酶的任何多元醇。特別適用的多元醇是選自下組的多元醇甘油、山梨糖醇、丙二醇、麥芽糖糊精，或者是糖，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖或海藻糖。至于局部應(yīng)用，應(yīng)考慮局部應(yīng)用可接受的多元醇，即甘油、聚乙二醇、丁二醇、丙二醇、海藻糖或山梨糖醇。
所述多元醇以高濃度應(yīng)用，即導(dǎo)致所述酶組合物中足夠低的水活度從而充分地穩(wěn)定該酶的濃度。在本技術(shù)中已知這些濃度可能隨應(yīng)用的多元醇而稍有變化。優(yōu)選地，應(yīng)用的多元醇是以20～100％的濃度，更優(yōu)選以30～90％的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選以40～90％的濃度，更進(jìn)一步優(yōu)選以50～90％的濃度，最優(yōu)選以60～80％的濃度。
這種穩(wěn)定的含水組合物還可被用于制備(當(dāng)與合適的乳化劑結(jié)合時(shí))油包水型乳液(參見WO95/28092)或水包油型乳液。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶組合物是含水組合物，它是一種呈沉淀形式的酶懸浮液。例如，通過添加高濃度的鹽(例如硫酸銨)而使該酶沉淀。
所述成膜劑可以是滿足如下條件的任意試劑，即它既能在局部施用包括所述酶和成膜劑的組合物后、當(dāng)溶劑蒸發(fā)時(shí)形成可剝離的面層(可剝離的膜)，又能釋放90％或更多被摻加入所述可剝離膜的酶。
例如，該成膜劑可以是可溶的或可分散的膠體，包括寬范圍的聚合化合物，例如聚乙烯醇、丙烯酸(共)聚合物、聚氨基甲酸乙酯、膠乳、聚乙烯吡咯烷酮、水解膠體(如刺梧桐樹膠或藻酸鹽)等。待應(yīng)用的成膜劑的選擇可能取決于想要局部施用的酶。所述選擇進(jìn)一步可能取決于溶解度、立構(gòu)規(guī)正度、可塑性、流變學(xué)和干燥時(shí)間。除了這些方面外，貯存穩(wěn)定性可能也應(yīng)考慮。
一種應(yīng)用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的成膜劑是聚乙烯醇(PVA)。技術(shù)人員一般都知道，PVA膜的性能將主要取決于被用于其配制的PVA的類型。不同類型的PVA的性能主要由分子量(聚合度)和殘余的乙?；繘Q定(例如參見the Hoechst High Chem brochure on MowiolPVA，可得自Clariant Benelux，Amsterdam，the Netherlands)。
可選擇的PVA的具體類型還取決于關(guān)于具體的成膜劑的選擇而考慮的綜合方面。
如果需要的話，可應(yīng)用不同類型PVA的混合物而獲得具有最佳特性的膜。
例如，與水性含酶組合物組合應(yīng)用的合適的PVA是在大量水存在下給出令人滿意的粘度的PVA。于是，PVA制劑的粘度一般地將取決于PVA的類型和PVA的濃度。
除了成膜劑外，本發(fā)明的組合物中可能還存在會(huì)影響該組合物和/或形成的膜的性能的化合物。
例如，要獲得很粘稠的溶液，可添加合適的增粘劑，例如黃原膠或羥乙基纖維素。
本發(fā)明的組合物中高含量的水使酶能較長時(shí)間地作用于皮膚。然而，較短的干燥時(shí)間可能更方便于使用者。為了縮短PVA溶液的干燥時(shí)間，可能選擇降低所述制劑的水含量。例如，該組合物的水相可進(jìn)一步包含促進(jìn)蒸發(fā)的溶劑(例如乙醇)。
為了更進(jìn)一步降低該制劑的水含量，可應(yīng)用低粘度級(jí)PVA，例如Mowiol 3-83或4-88(Clariant)，因?yàn)榈驼扯燃?jí)PVA可以以較高濃度應(yīng)用。采用這些低粘度級(jí)PVA，在水中直到35％(W/W)的溶液給出可接受的覆蓋性。這種較高PVA濃度的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是干燥時(shí)形成的膜的撕裂強(qiáng)度提高。
為了產(chǎn)生具有不同可塑度的膜，可應(yīng)用增塑劑，例如甘油、山梨糖醇、乙二醇。
要將立構(gòu)規(guī)正度減至最小，可添加所謂的退粘劑。這類化合物的實(shí)例有硅油或某些蠟。要增大立構(gòu)規(guī)正度，可添加某些化妝品上可接受的化合物(例如蜂蜜)。
要改善覆蓋性、干燥行為和可除去性，本發(fā)明的組合物可包括起濕潤劑作用的表面活性劑，例如非離子型表面活性劑，如Tween20，和/或甜菜堿。
PVA被以可在0.1～40％內(nèi)變化的濃度應(yīng)用于所述制劑中。高粘度級(jí)PVA(例如Mowiol 40-88(Clariant))一般以更低的濃度范圍應(yīng)用，例如0.1～20％，優(yōu)選1～10％，但低粘度級(jí)PVA(例如Mowiol 3-83或4-88)一般以更高范圍內(nèi)濃度應(yīng)用，例如20～40％，優(yōu)選25～30％。
僅次于酶和成膜劑，本發(fā)明的組合物可包括其它活性成分。
例如，本發(fā)明的組合物可包括存在于該組合物中的所述酶的底物。實(shí)例有作為脂肪氧合酶的底物的亞油酸或亞麻酸；作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物的酪蛋白；作為過氧化物酶的底物的過氧化氫；作為酯酶/脂肪酶的底物的維生素前體。
此外，本發(fā)明的組合物還包括與所述感興趣的酶協(xié)同作用的活性成分。
技術(shù)人員能決定另外的活性成分應(yīng)存在于包括所述成膜劑的組合物中還是應(yīng)存在于所述酶組合物中。某些活性成分(例如所述感興趣的酶的底物)優(yōu)選存在于包括所述成膜劑的組合物中。
具體的化妝品制劑進(jìn)一步包括常用的組分。
所述組合物包括載體從而使活性成分可被輸送到皮膚。載體包括水、固體和液體。這些載體可分成軟化劑、乳化劑、表面活性劑、增溶劑、推進(jìn)劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑和粉末。該組合物進(jìn)一步可包括抑制微生物生長的防腐劑。
軟化劑包括烷基高級(jí)脂肪酸、天然油、高級(jí)脂肪醇、甘油酯和異丙基酯、礦物油、脂肪醇酯。
乳化劑包括HLB(親水/親油平衡)值在較低或較高范圍內(nèi)的化合物，即分別是能形成油包水型乳液的化合物或者能形成水包油型乳液的化合物。
增稠劑包括多糖、樹膠和含羧基的聚合物。
粉末包括白堊、滑石粉、淀粉。
本發(fā)明的方法適合在化妝品領(lǐng)域和皮膚病領(lǐng)域中(其中需要酶的作用)局部施用的任何形式。本發(fā)明的方法特別適合蛋白酶的局部施用。蛋白酶一般在化妝品組合物中用于其清潔、使皮膚變光滑、抗毛發(fā)生長和抗痤瘡的性能。
圖1和2.送遞兩種單獨(dú)的組合物的容器。
實(shí)施例1通過PVA膜除去蛋白酶這樣制備蛋白酶制劑首先混合35g甘油、35g丁二醇、15mg氯化鈣.1aq、150mg山梨酸、800mg Carbopol Ultrez 10(BFGoodrich)、160mg MES(2-N-嗎啉代乙磺酸)和16g水。然后用8N氫氧化鈉將該混合物的pH調(diào)節(jié)到6.0。把約500mg蛋白酶[MaxataseTM，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)堿性絲氨酸蛋白酶，2000個(gè)蛋白酶單位/mg]溶于上述混合物，再通過添加水將總重量調(diào)節(jié)到100g。
MaxataseTM粉末(2.16BYU/kg)得自Genencor International(Bruges，Belgium)，應(yīng)用色譜法在強(qiáng)陽離子凝膠型樹脂上將它純化成均一的酶。將該酶加到柱內(nèi)的3mmol/l乙酸鈉(pH5.3)中，用100mmol/l檸檬酸鈉(pH5.8)洗脫。
除了該蛋白酶制劑外，還通過將4％Mowiol 40-88(Clariant)溶于水而配制PVA制劑。
為了測(cè)試通過所述PVA膜除去蛋白酶的情況，將1份所述蛋白酶制劑與9份PVA制劑混合，將4ml該蛋白酶/PVA混合物吸移入一個(gè)玻璃燒杯。在40℃下保溫一夜后，水已蒸發(fā)，從該玻璃燒杯底部除去形成的PVA膜。在除去膜之后，用4ml 50mM氯化鈉溶液漂洗該玻璃燒杯。
對(duì)所述蛋白酶制劑、未固化的蛋白酶/PVA混合物和所述漂洗液分析蛋白酶活性(通過它們?cè)趐H7下水解酪蛋白的能力進(jìn)行分析)。將結(jié)果列于表1中。
表1不同樣品的蛋白酶活性
這些結(jié)果清楚地表明，應(yīng)用的蛋白酶在PVA溶液中有活性，并且該蛋白酶被有效地固定入干PVA膜。
實(shí)施例2蛋白酶/PVA混合物中的蛋白酶性能將50μl實(shí)施例1中所述的未固化蛋白酶/PVA混合物等分樣涂在膠片的明膠層上。作為參比樣，應(yīng)用了1份蛋白酶制劑(見實(shí)施例1)和9份蒸餾水的混合物。將具有兩種液體樣品的膜在40℃下保溫，在不同的反應(yīng)時(shí)間后目測(cè)蛋白酶作用。所述蛋白酶/PVA混合物和參比樣品的應(yīng)用導(dǎo)致15分鐘的保溫時(shí)間后在明膠層中形成完全透明的孔。因此，溶液中PVA的存在沒有有害地影響蛋白酶作用。
實(shí)施例3應(yīng)用PVA膜從皮膚除去蛋白酶這樣制備蛋白酶制劑首先混合35g甘油、35g丁二醇、15mg氯化鈣.1aq、150mg山梨酸、800mg羥乙基纖維素、160mg MES和16g水。然后用8N氫氧化鈉將該混合物的pH調(diào)節(jié)到6.0。通過添加水將總重量調(diào)節(jié)到100g。將蛋白酶粉末(枯草芽孢桿菌堿性絲氨酸蛋白酶，4345個(gè)蛋白酶單位/mg)以10mg/ml的濃度溶于該混合物。
通過將Mowiol 40-88溶于水而配制4％的PVA制劑。通過添加0.8％羥乙基纖維素(Natrosol，Hercules)而調(diào)節(jié)該P(yáng)VA制劑的粘度，然后將pH調(diào)節(jié)到6.0。將1份該蛋白酶制劑與9份PVA制劑混合。約1g含4710個(gè)蛋白酶單位的該蛋白酶/PVA混合物被涂在人皮膚上(10cm2表面積)。
約45分鐘后水已蒸發(fā)，于是可從皮膚上除去PVA膜。將膜除去之后，用2ml 10mM MES緩沖液(pH6.0，它還含有50mM氯化鈉和1mg/mlBSA)漂洗處理過的皮膚。對(duì)該蛋白酶/PVA混合物和所述漂洗液分析蛋白酶活性，將結(jié)果列于表2中。
上述皮膚應(yīng)用試驗(yàn)是在三名受試驗(yàn)的人手掌前臂的兩個(gè)點(diǎn)上進(jìn)行的。
表2通過PVA除去蛋白酶
實(shí)施例4含高濃度PVA的膜的特性該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地表明了所述可剝離的膜在包封游離酶(在蛋白酶的情況下)方面很有效并且還將酶塵粒的釋放減至最少。
為了將PVA膜中的水含量減至最小并且增大形成的膜的撕裂強(qiáng)度，用低粘度級(jí)PVA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。原料是都得自Clariant的Mowiol 3-83和Mowiol 4-88。在稱量所需量的PVA之后，將干物質(zhì)加到Milli-Q水中并且在不斷攪拌下加熱到70～80℃直到PVA被完全溶解。在添加足夠的水達(dá)到所需的PVA濃度后，將該溶液均化再冷卻。形成的溶液的pH值約為6。
這樣制備酶濃縮物將純化過的蛋白酶粉末溶于50mmol/l MES緩沖液(pH6.0)；50mmol/l NaCl和2mmol/l CaCl2。冷卻后，將各種PVA溶液中的每一種與該酶濃縮物以每10份PVA溶液1份濃縮物的比例混合從而達(dá)到表3中給定的PVA濃度。然后測(cè)定每種溶液的粘度、覆蓋性、干燥時(shí)間和蛋白水解活性。用DV-III布氏粘度計(jì)測(cè)定粘度，并且在25℃和50rpm(Spindle SC4-29)下記錄粘度。PVA混合物中的蛋白水解特性是按實(shí)施例2中所述那樣通過將等分樣涂在膠片上測(cè)定的。在40℃下的明膠層中產(chǎn)生透明孔所需的時(shí)間被用于指示蛋白水解活性(所需的短保溫時(shí)間＝高活性；所需的長保溫時(shí)間＝低活性)。將得到的數(shù)據(jù)示于表3中。
表3
在25～35％之間的PVA濃度提供很好地可涂的混合物。在這些條件下，不必添加另外的增稠劑。最重要的是在這些低水條件下，所述膜的干燥時(shí)間很短，而所述混合物的蛋白水解活性則幾乎未減弱。
實(shí)施例5應(yīng)用最佳化PVA制劑的酶的除去除了增大所述制劑的PVA含量外，還可摻和迅速蒸發(fā)的溶劑(例如乙醇)從而促進(jìn)PVA膜的形成。此外，添加弱表面活性劑[例如Tween20(ICI)]可進(jìn)一步改善該制劑在皮膚上的覆蓋性(例如改善的潤濕性)，于是改善蛋白酶從皮膚的除去。
選定的基本(即未添加酶濃縮物)PVA制劑之一包含·Mowiol 3-8328％(w/w)·乙醇 10％(w/w)·Tween 20 1％(w/w)·MilliQ水 添加至100在該Mowiol/Tween制劑完全溶解并冷卻后添加乙醇。接著，按實(shí)施例4中描述的那樣以1∶10的比例添加所述酶濃縮物。在小心混合后，將全部混合物在六位受試驗(yàn)的人皮膚(手掌前臂)上涂一薄層。作為參比，在MilliQ水中配制含0.7％羥乙基纖維素和相似含量的蛋白酶的溶液，也涂在受試驗(yàn)的人皮膚上。
從所述PVA溶液和羥乙基纖維素溶液獲得的結(jié)果闡明了，涂敷的全部蛋白酶的99％以上通過從皮膚上撕下干PVA膜而被除去了。
這意味著，即使應(yīng)用呈非固定化形式的酶，也急劇減小了由酶促活性化妝品物質(zhì)引起的變應(yīng)性致敏的危險(xiǎn)。
權(quán)利要求
1.一種局部施用酶的方法，該方法包括如下步驟制備包括所述酶和成膜劑的組合物，局部施用所述組合物，將施用部位上的所述組合物保溫足夠長的一段時(shí)間使之能形成摻和了所述酶的可剝離膜，再從施用部位除去摻和了所述酶的所述膜。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述包括酶和成膜劑的組合物是通過將包括所述酶的單獨(dú)組合物與包括所述成膜劑的單獨(dú)組合物混合而制備的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述包括酶和成膜劑的組合物的局部施用是通過應(yīng)用雙組分分配系統(tǒng)進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)的方法，其中所述成膜劑是聚乙烯醇(PVA)。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是蛋白酶。
6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)的方法，它是一種化妝品應(yīng)用的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種局部施用酶的方法,其中該酶在其應(yīng)用之后被摻和入可剝離的膜(例如聚乙烯醇膜)。這樣,避免了含酶塵粒從施用部位的釋放。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1256625SQ99800143
公開日2000年6月14日 申請(qǐng)日期1999年1月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月8日
發(fā)明者L·伊登斯, B·諾達(dá)姆 申請(qǐng)人:Dsm公司