專利名稱：一種酶促油脫膠的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶促減少食用油中含磷成分的含量的改進方法。
背景技術：
從常用油和脂肪產(chǎn)品中通過對含油原料進行壓榨或通過從所述原料中提取油質并除去提取溶劑而加工所得的油包含諸如極性脂質類(主要由磷脂組成)、脂肪酸、色素、氣味成分等等的雜質。因此需要通過精加工除去這些雜質。這類方法可能需要脫膠的步驟。
本領域已知應用磷脂酶使食用油酶促脫膠(US 5，264，367；JP-A-2153997；和EP 622446)，以降低上述水脫膠食用油的含磷量。
但這些文獻并未具體指明在酶促脫膠方法中使用少量水。
相反，EP 622446建議在酶促脫膠方法中使用大量水。參見該文獻的第3頁，第33-44行以及權利要求4，其建議在上述方法中使用占油重30％以上的水。
發(fā)明簡述本發(fā)明將解決的問題是，提供又簡化又經(jīng)濟的使食用油酶促脫膠的廉價方法。
所述溶液使用少量水實施上述方法。
因此，本發(fā)明涉及減少食用油中含磷成分含量的方法，所述食用油的含磷量為50-10，000ppm，該方法包括使pH 1．5-8的上述油與磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、或磷脂酶B(PLB)的已乳化在油中的水溶液相接觸，直至油中含磷量減至12ppm以下，然后從處理過的油中分離水相，其中上述方法的特征在于，上述乳化條件是利用占油重0．01-1．5％的水，優(yōu)選占油重0．01-1．0％的水，更優(yōu)選占油重0．01-0．75％的水，更優(yōu)選占油重0．01-0．5％的水，最優(yōu)選占油重0．01-0．4％的水而形成。
而且，占油重0．01％以上水的這種較低劑量范圍可能優(yōu)選為占油重的0．1％的水。
本文所述方法的好處是減少了水以及廢水處理的成本。此外，由于只有少量的油將浪費到水相中而使油的回收量增加。
此外，本文所述方法的好處可能是，采用這種方法的油廠有可能省略對該方法中所用污水的污泥再循環(huán)過程。
本領域已知的酶促脫膠方法產(chǎn)生大量污水，其凈化處理的成本很高。運顯然是一種經(jīng)濟負擔。
此外，油廠過去不得不對工藝水進行再循環(huán)以減少上述污水純化的成本。
可通過本文所述方法中所用的少量水而省略上述再循環(huán)步驟。
根據(jù)本領域(如US 5，264，367)進行酶促脫膠時，常常將油包水乳液加熱處理至如65-75℃以促進油相與水相通過如離心而進行分離。當在油脫膠方法中使用熱穩(wěn)定性磷脂酶LecitaseTM(Novo Nordisk A／S，Denmark)時，含有此酶的水相可有利地重復使用多次(加或不加新鮮酶溶液均可)。
然而，對油廠而言，如果能完全避免水相的再循環(huán)則更為有利。一般情況下，再循環(huán)意味著水的總體消耗將增加，而成本也將增加。如果在酶促脫膠方法中只使用了少量水，可省去有時頗成問題的污泥相再循環(huán)過程。
本發(fā)明的實施方案敘述如下，只為舉例說明用。
發(fā)明詳述食用油原則上，任何食用油可按本發(fā)明的方法進行脫膠。油的實例如原油以及水脫膠的油。
原油(也稱未脫膠油)可能是從如油菜籽、大豆、或向日葵中壓榨或提取的油或它們的混合物。原油中的磷脂含量可能在0．5-3％w／w之間變動，對應于含磷量為200-10，000ppm、更優(yōu)選250-1200ppm。除了磷脂以外，原油中還包含低濃度的碳水化合物、蔗糖化合物以及鈣、鎂和鐵的金屬／磷脂酸復合物。
優(yōu)選地，上述食用油是已事先除去粘膠且含磷量為50-250ppm的油。
這類油通常通過水脫膠法獲得并稱之為“水脫膠油”。
水脫膠油通常通過使1-3％w／w的熱水與溫(60-90℃)原油混合而獲得。一般處理時間為30-60分鐘。水脫膠的步驟除去水合時在油中不溶的磷脂和粘質樹膠。水合磷脂及樹膠可通過沉降、過濾或離心從油中分離-離心為更主要的方法。
可供選擇地，在此稱為“水脫膠”的方法也可稱為“濕態(tài)精制以除去粘膠”(參見US 5，264，367)。
此外，食用油優(yōu)選為植物油。
本方法中所用的磷脂酶優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中所用的磷脂酶是得自微生物的磷脂酶，優(yōu)選微生物為絲狀真菌、酵母或細菌。
為了本發(fā)明的目的，在此與具體微生物來源一起使用的術語“得自”指所述酶以及編碼這種酶的DNA序列從所述具體來源產(chǎn)生。
因而所述酶是通過已知的標準方法從這種具體微生物來源中獲得，其中所述標準方法能使技術人員獲得含有所述酶并能應用于本發(fā)明的方法中的樣品。上述標準方法可能是從上述具體微生物來源中進行直接純化或克隆編碼所述酶的DNA序列，然后在同一來源中重組表達(同源重組表達)或在不同來源中重組表達(異源重組表達)。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中所用的磷脂酶得自鐮孢屬的絲狀真菌，如大刀鐮孢、異孢鐮孢、茄病鐮孢的菌株，或尤其是尖孢鐮孢的菌株；或曲霉屬的絲狀真菌，如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉的菌株，或尤其是米曲霉的菌株。
適當?shù)溺犳邔倭字傅膶嵗_在i) Tsung-Che等人(Phytopathological notes 581437-38(1968))(一種茄病鐮孢菌磷脂酶)；和ii) EP專利申請?zhí)?7610056．0公開了一種適當?shù)拇蟮剁犳呔字?參見該文獻的實施例18)和一種尖孢鐮孢菌磷脂酶(參見實施例1-17)。
適當?shù)那箤倭字笇嵗_在i) EP 575133公開了多種不同的曲霉菌磷脂酶(參見權利要求14)，尤其是米曲霉的磷脂酶(權利要求17或18)和黑曲霉的磷脂酶(權利要求19)；和ii) DE 19527274 A1公開了一種適當?shù)那怪破?參見實施例)。
此外，市售磷脂酶制品Degomma VOD(Roehm，Germany)也適用于本發(fā)明的方法中，據(jù)信這種制品包含曲霉菌磷脂酶。
此外，優(yōu)選本發(fā)明的方法中所用的磷脂酶具有特定的特性。
因此，本發(fā)明的實施方案涉及i)一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述磷脂酶是實質上不依賴于Ca2+濃度的磷脂酶，這種磷脂酶是在磷脂酶活性試驗中在5mM EDTA和5mM Ca2+下測得的相對磷脂酶活性，這一試驗是在包含2％磷脂酰膽堿、2％ TritonX-100、20mM檸檬酸鹽，pH 5的緩中液中；37℃溫育10分鐘，然后于95℃終止反應5分鐘而測量磷脂酰膽堿中釋放的游離脂肪酸；其中5mMEDTA／5mM Ca2+時的相對磷脂酶活性的比例大于0．25，更優(yōu)選大于0．5；和／或ii)一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述磷脂酶是具有能釋放至少7μmol游離脂肪酸／分鐘／mg酶；更優(yōu)選至少15μmol游離脂肪酸／分鐘／mg酶的磷脂酶活性的磷脂酶，該磷脂酶以其磷脂酶活性的形式在試驗中測量，這一試驗是在包含2％磷脂酰膽堿、2％ Triton X-100、20mM檸檬酸鹽，pH 5的緩沖液中；37℃溫育10分鐘后于95℃終止反應5分鐘而測量磷脂酰膽堿中釋放的游離脂肪酸。
對上述試驗的詳細描述公開在本文的具體實施例中(參見下文)。更詳細參考見EP專利申請?zhí)?7610056．0(參見該文獻中的實施例9)。
此外，已證實特異性適于酶促油脫膠的一般方法并尤其適于本文所述改進方法的磷脂酶的特征是具有特定的一級氨基酸序列。
因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的一種方法，其中所述磷脂酶是具有選自下列組的多肽序列的磷脂酶(a)具有示于SEQ ID NO 1中第31-346位的氨基酸序列的多肽；(b)具有示于SEQ ID NO 1中第31-303位的氨基酸序列的多肽；(c)與(a)，或(b)中所定義的上述多肽具有至少70％同源性的多肽；以及(a)，(b)或(c)的片段。
對具有上述多肽序列的磷脂酶的克隆和純化的詳細描述，參見EP專利申請?zhí)?7610056．0。
在該文獻中，還可知得自尖孢鐮孢菌并具有上述(b)所述多肽序列的磷脂酶表現(xiàn)出上述兩個功能性特征。因此，這種磷脂酶是本發(fā)明的方法中所用的最優(yōu)選的磷脂酶。本文的一個實施例證實了這種磷脂酶的應用(參見下文)。
最后，適當?shù)姆俏⑸锪字傅囊粋€實例是得自豬胰的市售磷脂酶(LecitaseTM，Novo Nordisk A／S，Denmark)。
本發(fā)明的方法的標準工藝參數(shù)本發(fā)明的方法中除了特別使用少量水以外，可根據(jù)本領域而應用任何其它工藝參數(shù)。參見參考本領域已知的方法的背景部分。
酶促處理是通過分散磷脂酶水溶液而進行，優(yōu)選將所述水溶液分散為平均直徑小于10μ(微)m的小滴。
根據(jù)本發(fā)明的方法，水的用量為相對于油重量的0．01-1．5％。
可任選加入乳化劑?？衫脵C械振蕩維持該乳液。
酶促處理可在pH 1．5-8的范圍內的任一pH下進行，優(yōu)選pH 3-6?？赏ㄟ^加入檸檬酸、檸檬酸鹽緩沖液、NaOH或HCl對pH進行調整。
溫度一般在30-75℃較適宜(特別是40-60℃)。反應時間通常為0．5-12小時(如2-6小時)，合適的酶劑量通常為每升油100-5000IU，特別是200-2000IU／l。
酶促處理可分批在如罐中攪拌進行，或可以在如一組攪拌的反應罐中連續(xù)進行。
酶促處理后分離水相和油相。這種分離是通過常規(guī)方式如離心進行。本發(fā)明的方法可該值降至12ppm以下，更優(yōu)選10ppm以下，進一步優(yōu)選5ppm以下。
材料和方法實施例實施例1對食用油酶促脫膠的試驗的總述用于進行酶促脫膠的設備該設備由1L夾套式鋼反應器(配有鋼蓋)、推進器(約600rpm)、折流板、溫度傳感器，頂部入水管，頂部回流冷凝器(約4℃)，和底部出水管組成。反應器夾套與恒溫水浴相通。出水管經(jīng)聚硅氧烷管道通向配備了“方口高剪切隔離屏(high shear screen)”的Silverson聯(lián)機攪拌頭，該攪拌頭由SilversonL4RT高剪切實驗室攪拌器(約8500rpm，流速約1．1升／分鐘)驅動。攪拌頭配備有冷卻旋管(5-10℃)和出水管并經(jīng)聚硅氧烷管道與該反應器的入水管管道相通。溫度傳感器插在聚硅氧烷管道中，剛好在攪拌頭之后。反應器／攪拌頭體系與外環(huán)境通過回流冷凝器進行唯一的連接。
進行酶促脫膠的一般方法開動所有冷卻和恒溫設備。然后將0．6L(約560g)油加入反應器中，該反應器保持在具體實驗所需的溫度附近。開動實驗室攪拌器，借此油開始從反應器循環(huán)至攪拌頭再回到反應器。使該系統(tǒng)平衡約10分鐘，在此期間精確校準溫度。添加溶于適量水中的檸檬酸一水合物0．6g(2．86mmol)或檸檬酸和檸檬酸三鈉的適量混合物而開始預處理階段(參見下表1和7；[檸檬酸]的水／油乳液=4．6mM)，此時設置t=0。在t=30分鐘時，加入適量的4MNaOH溶液(參見表1和7)。
表1．實驗A-D中的含水量；wdg(水脫膠的)菜籽油
*0．6g檸檬酸一水合物提供的水。
**0．5g檸檬酸一水合物和0．14g檸檬酸三鈉二水合物的混合物提供的水。
在t=35分鐘時，取樣進行P-分析和pH測定。緊接著，加入所需量的酶溶液(預處理階段結束)。在t=1，2，3．5，5，6小時時取出用于P(磷)分析和pH測定的樣品，然后終止反應。
排空反應器／攪拌器系統(tǒng)，用500ml 10％ Deconex／DI(去離子)水溶液漂洗2次，再用500ml DI水至少中洗3次。表2指示反應期間的各添加步驟和取樣步驟。
表2．酶處理時間表 磷分析P分析取樣取10ml油包水乳液，加入玻璃離心管中。將該乳液在沸水浴中加熱30分鐘。于5000rpm下離心10分鐘。將約8ml的上層(油相)轉移至一個12ml的聚苯乙烯試管中，靜置(以沉降)12-24小時。沉降后從上層透明相中取約1-2g進行P分析。
P分析按“油、脂肪及其衍生物分析的標準方法，第7版(1987)”中2．421方案進行稱100mg Mgo(leicht，Merck #5862)置于在瓷皿中，用燃氣噴燈加熱。加入1-2g油，用燃氣噴燈點燃，產(chǎn)生黑色、堅硬的物質。在Vecstar加熱爐中于850℃加熱2小時，形成白灰。將該灰溶于5ml 6M硝酸中，加入20ml混合試劑(reagent mix)。靜置20分鐘。測量460nm處的吸光度(使用空白(5ml HNO3+20ml混合試劑)調零)。利用標定曲線進行計算。
取2ml油包水乳液，與2ml MilliQ水混合。待相分離后，用移液管吸去上部油層。用pH電極Orion測量水相中的pH。用下式將測量值轉換成“真實”pH值pH真實=pH測得值-0．38。
標定曲線是通過將0．6g檸檬酸一水合物溶于27g DI水中而得到的；用pH電極Orion測量該溶液的pH(pH真實)。取100μl與2ml MilliQ水混合，用pH電極Orion測量該溶液的pH(pH測得值)。通過添加NaOH溶液而逐漸改變檸檬酸溶液的pH，對于每次調整來說，如上進行稀釋以及pH測定。
實施例2對水脫膠的菜籽油的脫膠處理(I)實驗均按以上實施例1所述的“進行酶促脫膠的一般方法”進行。
油水脫膠的菜籽油來自丹麥的Arhus Oliefabrik(AOM)。批號C00730／B01700和C00730／B01702，含磷量231-236ppm。含水量≤0．1％w／w。
酶具有SEQ NO 1所示氨基酸序列的尖孢鐮孢菌的PL(磷脂酶)。批號F-9702027，估計濃度0．75mg／ml。
此酶如EP專利申請?zhí)?7610056．0所述進行重組表達及純化。
實驗A(含水量5．3％)將0．6L(560g)wdg(水脫膠)的菜籽油加入設備中并加熱至40℃。在t=0分鐘時，加入由0．6g檸檬酸一水合物溶于27g水中而成的溶液。在t=30分鐘時，加入1．07ml(4．3毫摩爾)4M NaOH溶液，使pH為5左右。在t=35分鐘時，加入1ml(0．75mg)尖孢鐮孢菌磷脂酶的純化溶液。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表3中。
表3．wdg菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量5．3％。
實驗B(含水量1．3％)
如以上實驗A，不同的是，在t=0分鐘時，加入由0．6g檸檬酸一水合物溶于5．0g水中而成的溶液，在t=30分鐘時，加入0．71ml(2．86毫摩爾)4M NaOH溶液，使pH為5左右。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表4中。
表4．wdg菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量1．3％。
實驗C(含水量0．3％)如以上實驗A，不同的是，t=0分鐘時，加入0．6g檸檬酸一水合物粉末，t=30分鐘時，不加入NaOH溶液，使pH為5左右。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表5中。
表5．wdg菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量0．3％。
實驗D(含水量0．3％)如以上實驗C所述，不同的是，t=0分鐘時，加入由0．5g檸檬酸一水合物和0．14g檸檬酸三鈉二水合物粉末組成的混合物，使pH為5左右。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表6中。
表6．wdg菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量0．3％。
實施例3對粗菜籽油(壓榨的和提取的混合物)的脫膠處理(II)實驗均按以上實施例1所述的“酶促脫膠的一般方法”進行。
油粗菜籽油來自MILO Olomouk，Czechrep。批號C00745／B02042，含磷量263ppm。含水量0．17％w／w。
表7．實驗E和F中的水含量；粗菜籽油
實驗E(含水量5．4％)將0．6L(560g)粗菜籽油加入設備中并加熱至40℃。在t=0分鐘時，加入由0．6g檸檬酸一水合物溶于27g水中而成的溶液。在t=30分鐘時，加入1．07ml(4．3毫摩爾)4M NaOH溶液，使pH為5左右。在t=35分鐘時，加入1ml(0．75mg)尖孢鐮孢菌磷脂酶的純化溶液。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表8中。
表8．粗菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量5．4％。
實驗F(含水量1．4％)如以上實驗E，不同的是，t=0分鐘時，加入由0．6g檸檬酸一水合物溶于5．0g水中而成的溶液，t=30分鐘時，加入0．71ml(2．86毫摩爾)4MNaOH溶液，使pH為5左右。離心后測得的油相含磷量以及水相pH值示于表9中。
表9．粗菜籽油用尖孢鐮孢菌磷脂酶脫膠的結果，含水量1．4％。
實施例4適用于本發(fā)明的油脫膠方法中的磷脂酶的鑒定試驗磷脂酶活性試驗磷脂酶活性(PHLU)是通過測量磷脂酰膽堿所釋放的游離脂肪酸而測定的。加入4％ L-α-磷脂酰膽堿(得自Avanti，USA的植物磷脂酰膽堿)，4％Triton X-100，5mM CaCl2的50mM HEPES溶液(pH 7)，使50μl酶溶液在50mM HEPES溶液(pH 7)中稀釋至適當濃度。樣品于30℃溫育10分鐘，離心(在7000rpm下5分鐘)前先在95℃終止反應5分鐘。用Wako ChemicalsGmbH的NEFA C試劑盒測定游離脂肪酸；將25μl反應混合物加入250μl試劑A中并在37℃溫育10分鐘。然后加入500μl試劑B，再次使樣品在37℃溫育10分鐘。用HP 8452A二極管陣列分光光度計測量550nm處的吸光度。樣品均至少一式兩份進行。底物和酶的盲試(預處理的酶樣品(95℃ 10分鐘)+底物)也包括在內。將油酸作脂肪酸標準物。1 PHLU等于能在這些條件下每分鐘釋放1μmol游離脂肪酸的酶量。
可供選擇地，該試驗可在37℃的20mM檸檬酸鹽緩中液，pH 5(Ca2+依賴性)或20mM Britton-Robinson緩沖液中進行(pH分布／溫度分布／穩(wěn)定性)。
磷脂酶A1活性(PLA1)是用1-(硫-癸?；?-2-癸?；?1-硫代-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(D3761分子探針)為底物而測量的。在200μl的比色杯中，向190μl底物(100μl D3761(2mg／ml，溶于乙醇中)+50μl 1％ Triton X-100+1．85ml 50mM HEPES，0．3mM DTNB，2mM CaCl2，pH7)中加入10μl酶，在HP8452A二極管陣列分光光度計上在室溫下測量作為時間的函數(shù)的4l0nm處的吸光度。計算線性范圍內的曲線斜率作為活性。PLA1等于能在這些條件下每分鐘釋放1μmol游離脂肪酸的酶量。
磷脂酶A2活性(PLA2)是用1-十六?；?2-(1-芘癸酰基)-錫-甘油基-3-膽堿磷酸(H361分子探針)而測量的。向2ml比色杯中的2ml底物(50μl 1％Triton X-100+25μl 0．1％H361的甲醇溶液+10ml 50mM HEPES，pH 7)中在攪拌下加入10μl酶，用Perkin Elmer LS50裝置測量作為時間的函數(shù)(以1秒的間隔)的376nm處的芘熒光發(fā)射量(在340nm處激發(fā))。在Triton X-100／磷脂膠束中，調整磷脂的濃度使之具有受激子的結構(在480nm處發(fā)射)。經(jīng)裂解，使含芘基團的2-位的脂肪酸釋放至水相中，導致單體發(fā)射量增加。PLA2為等濃度下線性范圍內的曲線斜率。
序列表&#60110&#62NOVO NORDISK A／S&#60120&#62一種酶促油脫膠方法&#60130&#625570-WO&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#621&#60170&#62PatentIn 2．0版&#60210&#621&#60211&#62346&#60212&#62PRT&#60213&#62尖孢鐮孢菌&#60400&#621Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala Val Ala Ser1 5 10 15Pro Val Ala Leu Asp Asp Tyr Val Asn Ser Leu Glu Glu Arg Ala Val20 25 30Gly Val Thr Thr Thr Asp Phe Ser Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln His35 40 45Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Ile50 55 60Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Gly Asn Gly Ala Thr65 70 75 80Ile Val Thr Ser Phe Val Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Val85 90 95Ala Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser100 105 110Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gln Glu Asp115 120 125Cys Ser Leu Val Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Arg Ala130 135 140Trp Asn Glu Ile Ser Ser Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Ser Ala Arg145 150 155 160Lys Ala Asn Pro Ser Phe Ash Val Ile Ser Thr Gly His Ser Leu Gly165 170 175Gly Ala Val Ala Val Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly Thr180 185 190Pro Val Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Ala Gln195 200 205Leu Ser Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Val Thr210 215 220His Ala Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly Tyr225 230 235 240Arg His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys245 250 255Val Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala Asn260 265 270Leu Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala His Leu275 280 285His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe Ser Trp290 295 300Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp Lys Arg Ala Thr Met Thr305 310 315 320Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Gln Met Asp Lys325 330 335Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser340 34權利要求
1．一種減少食用油中含磷成分的含量的方法，該食用油中含磷量為每百萬份50-10，000份(ppm)，該方法包括使pH 1．5-8的上述油與磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)或磷脂酶B(PLB)的已乳化在油中的水溶液相接觸，直至油中含磷量減至12ppm以下，然后從處理過的油中分離水相，其中上述方法的特征在于，上述乳化條件是利用占油重0．01-1．5％的水，優(yōu)選占油重0．01-1．0％的水，最優(yōu)選占油重0．01-0．5％的水而形成的。
2．權利要求1的方法，其中上述油是已事先除去粘膠且含磷量為50-250ppm的油。
3．權利要求1或2的方法，其中所述磷脂酶是得自微生物的磷脂酶，優(yōu)選得自絲狀真菌、酵母或細菌。
4．權利要求3的方法，其中所述絲狀真菌屬于鐮孢屬，如大刀鐮孢、異孢鐮孢、茄病鐮孢的菌株，或尤其是尖孢鐮孢的菌株。
5．權利要求3的方法，其中所述絲狀真菌屬于曲霉屬，如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉的菌株，或尤其是米曲霉的菌株。
6．前述權利要求中任一項的方法，其中所述磷脂酶是實質上不依賴于Ca2+濃度的磷脂酶，這種磷脂酶是作為相對磷脂酶活性在磷脂酶活性試驗中在5mM EDTA和5mM Ca2+下測得的，該試驗是在包含2％磷脂酰膽堿、2％Triton X-100、20mM檸檬酸鹽，pH 5的緩沖液中；37℃溫育10分鐘，然后于95℃終止反應5分鐘，測量磷脂酰膽堿中釋放的游離脂肪酸；其中5mMEDTA／5mM Ca2+下的相對磷脂酶活性的比例大于0．25，更優(yōu)選大于0．5。
7．前述權利要求中任一項的方法，其中所述磷脂酶是具有能夠釋放至少7μmol游離脂肪酸／分鐘／mg酶；更優(yōu)選至少15μmol游離脂肪酸／分鐘／mg酶的磷脂酶活性的磷脂酶，該磷脂酶以其磷脂酶活性的形式在試驗中測量，該試驗是在包含2％磷脂酰膽堿、2％Triton X-100、20mM檸檬酸鹽，pH 5的緩中液中；37℃溫育10分鐘，然后于95℃終止反應5分鐘，測量磷脂酰膽堿中釋放的游離脂肪酸。
8．前述權利要求中任一項的方法，其中所述磷脂酶是具有選自下列組的多肽序列的磷脂酶(a)具有示于SEQ ID NO 1中第31-346位的氨基酸序列的多肽；(b)具有示于SEQ ID NO 1中第31-303位的氨基酸序列的多肽；(c)與(a)或(b)中所定義的上述多肽具有至少70％同源性的多肽；以及(a)，(b)或(c)的片段。
全文摘要
一種酶促減少食用油中含磷成分的含量的改進方法。該方法包括使用磷脂酶和少量水。
文檔編號C11B3/00GK1293706SQ99804005
公開日2001年5月2日 申請日期1999年4月7日 優(yōu)先權日1998年4月8日
發(fā)明者金·克勞森 申請人:諾維信公司