專利名稱：漂白酶和含有它們的洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及漂白酶。本發(fā)明特別涉及能生成漂白化學(xué)物質(zhì)并且對存在于織物污點(diǎn)中的無色化合物有高結(jié)合親合力的漂白酶。本發(fā)明還涉及含有所述酶的洗滌劑組合物，和漂白織物上的污點(diǎn)的方法。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)含有漂白酶的洗滌劑組合物在現(xiàn)有技術(shù)中已有記載。例如，GB-A-2 101 167(Unilever)公開了呈過氧化氫生成系統(tǒng)形式的酶漂白組合物，其中包含C1-C4鏈烷醇氧化酶和C1-C4鏈烷醇。這樣的酶漂白組合物可用在洗滌織物的洗滌劑組合物中，在洗滌劑組合物中，酶漂白組合物可提供低溫酶漂白系統(tǒng)。在洗滌液體中，鏈烷醇氧化酶催化溶解的分子氧與鏈烷醇之間的反應(yīng)以形成醛和過氧化氫。為了在低溫例如在15-55℃獲得顯著的漂白效果，必須利用漂白活化劑將過氧化氫激活。現(xiàn)在最常用的漂白活化劑是四乙?；叶?TAED)，TAED通過與過氧化氫反應(yīng)而生成過乙酸，過乙酸是實(shí)際起作用的漂白劑。
雖然現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提出了這種以及其它幾種酶漂白系統(tǒng)，但是仍然需要可供選擇的或改進(jìn)的酶漂白系統(tǒng)。特別是，酶漂白系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能夠漂白否則難以除去的污點(diǎn)—所謂的“難處理污點(diǎn)”例如番茄、茶葉、黑莓汁、或紅酒。這種污點(diǎn)需要大量漂白劑來除去它們，這可能會給衣服的顏色帶來不利影響。
在常規(guī)洗衣漂白系統(tǒng)中，不論“難處理污點(diǎn)”存在與否，織物都是均勻地暴露于相同濃度的漂白劑下。此外，用可能包含相當(dāng)高濃度漂白劑的常規(guī)漂白系統(tǒng)反復(fù)洗滌有可能損害衣服例如使衣服褪色。
因此本發(fā)明的目的是，提供可供選擇的或改進(jìn)的酶漂白系統(tǒng)，所述酶漂白系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)特別能夠漂白否則難以除去的污點(diǎn)，并且優(yōu)選在其漂白作用方面有更強(qiáng)的選擇性。本發(fā)明的另一目的是提供漂白織物污點(diǎn)的可供選擇或改進(jìn)的酶促方法。
我們已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明漂白酶可以控制酶促漂白過程中的漂白反應(yīng)，本發(fā)明漂白酶能生成漂白化學(xué)物質(zhì)，并且對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力，所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000的分子量。甚至更優(yōu)選的是，所述無色化合物具有至少為5000的分子量，無色化合物特別優(yōu)選具有至少為10000的分子量。本發(fā)明漂白酶優(yōu)選包含偶聯(lián)到對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的試劑上的、能夠生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。
本發(fā)明新的漂白酶可特別用于處理僅偶而存在的“難處理污點(diǎn)”例如水果和蔬菜汁。這些污點(diǎn)在大多數(shù)衣服上未存在，并且當(dāng)其存在時，它們可能存在于和平常污點(diǎn)例如在衣領(lǐng)和袖口存在的污點(diǎn)不同的部位上。依據(jù)本發(fā)明，可將新的漂白酶的使用濃度最佳化，以使得僅在存在污點(diǎn)時才達(dá)到漂白劑的閾值濃度，并且新的漂白酶結(jié)合并積聚到所述污點(diǎn)上。當(dāng)這樣時，高的局部酶濃度在接近污點(diǎn)處產(chǎn)生高的局部漂白劑濃度，由此在需要漂白的部位施加選擇性的漂白作用。因此，衣服的未沾污部分(通常是大部分)沒有暴露于高水平的漂白劑下，從而保護(hù)了織物不受與漂白劑有關(guān)的破壞。此外，當(dāng)同一件衣服又一次被沾污例如具有水果或蔬菜污點(diǎn)時，其可能在該衣服的不同部位。因此，這樣是將衣服的不同部位暴露于高水平漂白劑下。這樣可減輕或完全消除與常規(guī)漂白系統(tǒng)中數(shù)次洗滌有關(guān)的問題例如褪色。這與其中在每次洗滌中，不論難處理污點(diǎn)存在與否都將所有衣服均勻地暴露于高濃度漂白劑下的常規(guī)洗滌系統(tǒng)形成了鮮明對照。
本發(fā)明的定義依據(jù)本發(fā)明第一個方面，本發(fā)明提供了能生成漂白化學(xué)物質(zhì)并對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的漂白酶，所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000的分子量。本發(fā)明漂白酶優(yōu)選包含偶聯(lián)到對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的試劑上的、能夠生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。
依據(jù)第二個方面，本發(fā)明提供了含有一種或多種表面活性劑和本發(fā)明漂白酶的酶漂白組合物。
依據(jù)第三個方面，本發(fā)明提供了漂白織物上存在的污點(diǎn)的方法，其中將沾污的織物與包含本發(fā)明漂白酶的溶液接觸。
本發(fā)明的描述1.漂白酶在第一個方面，本發(fā)明涉及能生成漂白化學(xué)物質(zhì)并對織物上存在的污點(diǎn)有高親和力的漂白酶。本發(fā)明漂白酶優(yōu)選包含偶聯(lián)到對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的試劑上的、能夠生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000、更優(yōu)選至少為5000的分子量。所述無色化合物特別優(yōu)選具有至少為10000的分子量。1.1能生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。
漂白化學(xué)物質(zhì)可以是由酶生成的過氧化氫。用于生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶或者酶促過氧化氫生成系統(tǒng)可大體上選自在現(xiàn)有技術(shù)中公開的多種酶促過氧化氫生成系統(tǒng)。例如，可使用胺氧化酶和胺；氨基酸氧化酶和氨基酸；膽固醇氧化酶和膽固醇；尿酸氧化酶和尿酸；或者黃嘌呤氧化酶與黃嘌呤。或者，可使用C1-C4鏈烷醇氧化酶和C1-C4鏈烷醇的組合，甲醇氧化酶與乙醇的組合是特別優(yōu)選的。甲醇氧化酶優(yōu)選從過氧化氫酶陰性多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)菌株分離得到(參見例如EP-A-244 920(Unilever))。優(yōu)選的氧化酶是葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和醇氧化酶。
過氧化氫生成酶可以與生成過乙酸的活化劑聯(lián)合使用。這樣的活化劑是本領(lǐng)域眾所周知的。其實(shí)例包括四乙?；叶?TAED)和壬酰氧基苯磺酸鈉(SNOBS)。Grime和Clauss在Chemistry＆Industry(1990，10，15)647-653中更詳細(xì)地描述了這些和其它相關(guān)化合物?；蛘?，可以將過渡金屬催化劑與過氧化氫生成酶聯(lián)合使用以提高漂白效力。Hage等人(1994)Nature 369，637-639中描述了錳催化劑的實(shí)例。
或者，漂白化學(xué)物質(zhì)是次鹵酸鹽，酶部分相應(yīng)地為鹵素過氧化物酶。優(yōu)選的鹵素過氧化物酶是氯過氧化物酶。相應(yīng)的漂白化學(xué)物質(zhì)是次氯酸鹽。尤其優(yōu)選的氯過氧化物酶是釩氯過氧化物酶，例如得自不等彎孢(Curvularia inaequalis)的釩氯過氧化物酶。
或者，可使用過氧化物酶或漆酶。當(dāng)使用這樣的酶時，漂白分子得自與該酶反應(yīng)的增強(qiáng)劑分子。WO-A-95/01426中公開了漆酶/增強(qiáng)劑系統(tǒng)的實(shí)例。WO-A97/11217中描述了過氧化物酶/增強(qiáng)劑系統(tǒng)的實(shí)例。1.2具有高結(jié)合親和力的部分。
本發(fā)明新的漂白酶對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力，所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000、更優(yōu)選至少為5000道爾頓的分子量。應(yīng)當(dāng)理解，所述無色化合物還可具有至少為10000、100000或甚至1000000道爾頓或更多的更高分子量?？赡苁瞧酌傅囊徊糠侄嚯逆?zhǔn)沟闷渚哂薪Y(jié)合親和力，也可能漂白酶包含偶聯(lián)到對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的試劑上的、能夠生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。對于第一種情形，漂白酶可以是包含可通過連接頭偶聯(lián)的兩個結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。對于第二種情形，具有高結(jié)合親和力的試劑可通過二價偶聯(lián)劑例如戊二醛共價偶聯(lián)到生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分上。Greg T.Hermanson在″Bioconjugate techniques″，Academic Press Inc(1986)中描述了關(guān)于適用于偶聯(lián)兩個生物分子的化學(xué)的全面綜述?；蛘?，如果具有高結(jié)合親和力的試劑是肽或蛋白，其也可以通過構(gòu)建融合蛋白來偶聯(lián)到酶上。在這樣的構(gòu)建物中，在結(jié)合試劑與酶之間一般有肽接頭。Ducancel等人在Bio/technology 11，601-605中描述了酶與結(jié)合試劑融合的實(shí)例。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有高結(jié)合親和力的試劑是雙特異性試劑，其中包含一個對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物的特異性，所示無色化合物具有至少為1000、優(yōu)選至少為5000、更優(yōu)選為至少10000的分子量。這樣的試劑可通過下述方式滿足酶在污點(diǎn)上積聚的需要將所述試劑與酶一起作為預(yù)形成的非共價復(fù)合物來提供，或者單獨(dú)提供二者，并使它們在洗滌液體中或者在污點(diǎn)上自我裝配。
本發(fā)明新的漂白酶的基礎(chǔ)是存在對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的部分，所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000、更優(yōu)選至少為5000的分子量。
分子A與另一分子B結(jié)合的程度一般可通過得自下述反應(yīng)的化學(xué)平衡常數(shù)Kd表示[A]+[B]⇔[A≡B]]]>化學(xué)平衡常數(shù)Kd如下得出Kd=[A]×[B][A≡B]]]>通過比較分子與沾污材料(即處理材料以結(jié)合到污點(diǎn)組分上)的結(jié)合(Kd值)相對于分子與未沾污(即未處理)材料的結(jié)合之間的差異，可判斷該分子與織物污點(diǎn)中存在的無色化合物的結(jié)合是特異性的還是非特異性的。對于在洗衣中的應(yīng)用，所述材料是織物例如棉花或聚酯。然而，在其它材料例如聚苯乙烯微量滴定板或分析生物傳感器中的特化表面上測定Kd值和Kd值差異通常更方便。這兩個結(jié)合常數(shù)之間的差異應(yīng)當(dāng)最小為10，優(yōu)選大于100，更優(yōu)選大于1000?；衔镆话銘?yīng)當(dāng)以低于10-4M、優(yōu)選低于10-6M的Kd結(jié)合污點(diǎn)或沾污的材料，并且該Kd可以為10-10M或甚至更低。較高的結(jié)合親和力(Kd低于10-5M)和/或較大的無色物質(zhì)與本底物質(zhì)結(jié)合之間的差異可提高漂白過程的選擇性。而且可提高整個洗滌劑組合物中的分子量效率，并需要較少量的分子。
可想到能特異性結(jié)合欲漂白污點(diǎn)中存在的無色化合物的幾類分子。在下文中我們給出具有這種能力的分子的多個實(shí)例，但這并非窮舉。1.2.1.抗體。
抗體是能特異性結(jié)合它們所抗的化合物的分子的眾所周知的實(shí)例?？贵w可源自幾個來源。從小鼠中可獲得具有非常高的結(jié)合親和力的單克隆抗體。由這些抗體可制得保持其結(jié)合特性的Fab、Fv或scFv片段。這樣的抗體或片段可經(jīng)由重組DNA技術(shù)通過微生物發(fā)酵而制得。用于制備抗體及其片段的眾所周知的宿主是酵母、霉菌或細(xì)菌。
一類值得特別關(guān)注的抗體是通過如在駱駝科動物例如駱駝或美洲駝中發(fā)現(xiàn)的重鏈抗體形成的。這些抗體的結(jié)合域由一個多肽片段，即重鏈多肽的可變區(qū)(HC-V)構(gòu)成。與之相反，在典型抗體(鼠、人等)中，結(jié)合域由兩條多肽鏈(重鏈(Vh)和輕鏈(Vl)的可變區(qū))組成。WO-A-94/04678(Casterman和Hamers)和WO-A94/25591(Unilever和Free University of Brussels)中描述了從駱駝科動物獲得重鏈免疫球蛋白或其(功能化)片段的方法。
或者，結(jié)合域可通過稱為″camelization″的方法從典型抗體的Vh片斷獲得。據(jù)此通過替代多個氨基酸將標(biāo)準(zhǔn)Vh片斷轉(zhuǎn)化成HC-V樣片斷，從而保持了其結(jié)合特性。Riechmann等人在多個出版物(J.Mol.Biol.(1996)259，957-969；Protein.Eng.(1996)9，531-537，Bio/Technology(1995)13，475-479)中描述了該方法。如WO-A-94/29457(Unilever)所述，HC-V片斷可通過重組DNA技術(shù)在多種微生物宿主(細(xì)菌、酵母、霉菌)中制得。
制備包含酶和抗體或者包含酶和抗體片斷的融合蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。Neuberger和Rabbits(EP-A-194 276)描述了一種方法。WO-A-94/25591中描述了制備包含酶和得自駱駝科動物抗體的抗體片斷的融合蛋白的方法。Holliger等人在(1993)PNAS90，6444-6448中描述了制備雙特異性抗體片斷的方法。
抗體結(jié)合行為特別有吸引力的特征是據(jù)報道其結(jié)合一″類″在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的能力。例如，Gani等人(J.Steroid Biochem.Molec.Biol.48，277-282)描述了之所以產(chǎn)生是為了抗孕酮、但是也結(jié)合在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的甾體化合物、孕二酮、孕烷醇酮和6-羥基孕酮的抗體。因此，使用同一方法，可分離到能結(jié)合所有的一″類″污點(diǎn)發(fā)色團(tuán)(例如如下所述的多元酚、卟啉或類胡蘿卜素)的抗體?？墒褂脧V譜作用抗體例如上述這種抗體以與漂白酶偶聯(lián)來處理幾種不同污點(diǎn)。1.2.2.肽。
肽對目的物質(zhì)的結(jié)合親和力通常比抗體低。雖然如此，仔細(xì)選擇或設(shè)計(jì)的肽結(jié)合能力可足以在氧化過程中提供所需的選擇性。能選擇性地結(jié)合欲氧化物質(zhì)的肽可例如由已知能結(jié)合特定物質(zhì)的蛋白制得。這樣的肽的實(shí)例可以是從抗這種物質(zhì)的抗體萃取獲得的結(jié)合區(qū)。其它實(shí)例是已知能結(jié)合葡萄酒中的多元酚的富含脯氨酸的肽。
或者，結(jié)合這種物質(zhì)的肽可通過使用肽組合文庫來獲得。這樣的文庫可包含最高達(dá)1010個肽，從中可分離到具有所需結(jié)合特性的肽(R.A.Houghten，Trends in Genetics，Vol 9，no&，235-239)?，F(xiàn)有技術(shù)中已描述了該方法的幾個實(shí)施方案(J.Scott等人，Science(1990)249，386-390；Fodor等人，Science(1991)251，767-773；K.Lam等人，Nature(1991)354，82-84；R.A.Houghten等人，Nature(1991)354，84-86)。
合適的肽可通過有機(jī)合成，使用例如Merrifield方法(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)制得?；蛘?，肽可通過重組DNA技術(shù)在微生物宿主(酵母、霉菌、細(xì)菌)中制得(K.N.Faber等人。(1996)Appl.Microbiol.Biotechnol.45，72-79)。1.2.3.肽模擬物。
為了改善肽的穩(wěn)定性和/或結(jié)合性質(zhì)，可通過摻入非天然氨基酸和/或氨基酸之間的非天然化學(xué)連接將肽分子修飾。這樣的分子稱為肽模擬物(H.U.Saragovi等人。(1991)Bio/Technology 10，773-778；S.Chen等人。(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5872-5876)。這種化合物的制備受化學(xué)合成的限制。1.2.4.其它有機(jī)分子。
可很容易想到，可以找到具有所需結(jié)合特性、能選擇性地結(jié)合欲氧化物質(zhì)、無需與肽、蛋白或其衍生物相關(guān)的其它分子結(jié)構(gòu)。例如，據(jù)表明一些聚合RNA分子能結(jié)合小的合成染料分子(A.Ellington等人.(1990)Nature 346，818-822)。這樣的結(jié)合化合物可通過組合方法，例如關(guān)于肽的組合方法(L.B.McGown等人。(1995)，Analytical Chemistry，663A-668A)獲得。
該方法還可應(yīng)用于純的非聚合有機(jī)化合物。現(xiàn)有技術(shù)中描述過關(guān)于這樣的化合物的組合合成方法和對所需結(jié)合性質(zhì)的選擇(Weber等人。(1995)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34，2280-2282；G.Lowe(1995)，Chemical Society Reviews 24，309-317；L.A.Thompson等人。(1996)Chem.Rev.96，550-600)。一旦確定了合適的結(jié)合化合物，即可通過有機(jī)合成以較大規(guī)模制備它們。1.3織物污點(diǎn)中存在的無色化合物對于洗衣應(yīng)用，可想得出準(zhǔn)備將其漂白的幾類有色物質(zhì)，特別是在織物上作為污點(diǎn)存在的有色物質(zhì)可作為漂白對象。人們發(fā)現(xiàn)，漂白酶不直接以這樣的有色污點(diǎn)為目標(biāo)，而是以自身無色、但是參與污點(diǎn)形成的大分子化合物為目標(biāo)是有利的。這樣的大分子化合物的優(yōu)點(diǎn)是它們可具有更強(qiáng)的致免疫性質(zhì)，即更易于產(chǎn)生抗它們的抗體。此外，它們比分子量通常很小的有色物質(zhì)更接近污點(diǎn)的表面。需要著重強(qiáng)調(diào)的是，雖然許多污點(diǎn)是由不同成分形成的，但是在各種各樣的污點(diǎn)中通常都存在一些無色化合物。
在本發(fā)明上下文中，無色化合物定義為在下述條件下光密度(或吸附)低于0.2、優(yōu)選低于0.05的化合物以純化形式在溶液中，并且在校正效應(yīng)例如光散射后，對于可見光譜中的所有波長(即325nm-900nm)，并且對于1cm的光程，以1mg/ml的濃度在溶液中。
本發(fā)明重要的實(shí)施方案是使用能結(jié)合一類″污點(diǎn)物質(zhì)″中的幾種不同的但是在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的無色分子的結(jié)合分子(如上所述)。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是能使一種酶結(jié)合(并漂白)幾種不同的污點(diǎn)。參與污點(diǎn)形成的無色化合物的幾類實(shí)例如下1.3.1.果膠。
果膠是一組富含D-半乳糖醛酸的不同種類的多糖。果膠是植物細(xì)胞的細(xì)胞壁基質(zhì)中最重要的成分。關(guān)于果膠的綜述參見A.Jauneau等人.(1998)Int.J.Plant Sci.159(1)1-13。1.3.2.β-乳球蛋白β-乳球蛋白(BLG)是各種動物包括牛、綿羊、山羊、馬、和豬的奶中的主要乳清蛋白。關(guān)于β-乳球蛋白的綜述參見J.Godovac-Zimmermann和G.Braunitzer(1987)Milchwissenschaft 42(5)294-297。2.洗滌劑組合物。
本發(fā)明漂白酶可用于特別適于污點(diǎn)漂白的衣服洗滌組合物中，這構(gòu)成了本發(fā)明的第二個方面。為此，組合物包含一種或多種表面活性劑并任選包含其它常用洗滌組分。在第二個方面，本發(fā)明提供了酶洗滌劑組合物，其中包含占洗滌劑組合物總重量0.1-50％的一種或多種表面活性劑。該表面活性劑體系可包含0-95％重量的一種或多種陰離子表面活性劑和5-100％重量的一種或多種非離子表面活性劑。該表面活性劑體系還可包含兩性或兩性離子洗滌化合物，但是由于其較高的成本這不是正常需要。人們發(fā)現(xiàn)，在這種組合物中還加入陽離子表面活性劑是有利的。WO-A-97/03160和WO-A-98/17767(Procter＆Gamble)中給出了合適的陽離子表面活性劑的實(shí)例。
一般，該表面活性劑體系的非離子和陰離子表面活性劑可選自在″Surface Active Agents″Vol.1，Schwartz&Perry；Interscience1949，Vol.2 Schwartz，Perry＆Berch；Interscience 1958，Manufacturing Confectioners Company出版的當(dāng)前版本的″McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents″，或″Tenside-Taschenbuch″，H.Stache，2nd Edn.，Carl Hauser Verlag，1981中描述的表面活性劑。
可使用的合適的非離子洗滌化合物特別包括具有疏水基團(tuán)和反應(yīng)性氫原子的化合物例如脂族醇、酸、酰胺或烷基苯酚與烯化氧尤其是單獨(dú)的氧化乙烯或者氧化乙烯和氧化丙烯的反應(yīng)產(chǎn)物。特定的非離子洗滌化合物是C6-C22烷基苯酚-氧化乙烯縮合物，通常每個分子有5-25個E0，即5-25個氧化乙烯單元，和脂族C8-C18伯或仲直鏈或支鏈醇與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物，通常每個分子有5-40個EO。
可使用的合適的陰離子洗滌化合物通常是具有包含約8-約22個碳原子的烷基的有機(jī)硫酸酯和磺酸酯的水溶性堿金屬鹽，所用術(shù)語烷基包括高級酰基的烷基部分。合適的合成陰離子洗滌化合物的實(shí)例有烷基硫酸鈉和鉀，尤其是通過將由例如牛脂或椰子油制得的高級C8-C18醇硫酸化而獲得的這樣的洗滌化合物，烷基C9-C20苯磺酸鈉和鉀，特別是直鏈仲烷基C10-C15苯磺酸鈉；和烷基甘油基醚硫酸鈉，尤其是得自牛脂或椰子油的高級醇和得自石油的合成醇的這樣的醚。優(yōu)選的陰離子洗滌化合物是C11-C15烷基苯磺酸鈉和C12-C18烷基硫酸鈉。還適用的有例如在EP-A328 177(Unilever)中描述的表現(xiàn)出抗鹽析作用的表面活性劑，在EP-A-070 074中描述的烷基多糖苷表面活性劑，和烷基單糖苷。
優(yōu)選的表面活性劑體系是陰離子與非離子洗滌活性物質(zhì)的混合物，特別是在EP-A-346 995(Unilever)中指出的陰離子和非離子表面活性劑的組和實(shí)例。C16-C18伯醇硫酸酯的堿金屬鹽與C12-C15伯醇3-7 EO乙氧基化物的混合物是特別優(yōu)選的表面活性劑體系。
非離子洗滌劑優(yōu)選以占表面活性劑體系重量的10％以上、例如25-90％的量存在。陰離子表面活性劑可以以例如占表面活性劑體系重量的約5％-約40％的量存在。
本發(fā)明洗滌劑組合物可呈任意合適的物理形式，例如粉末、片、含水或非水液體、糊或凝膠。本發(fā)明酶漂白洗滌組合物一般是在水中稀釋至約0.05-2％后再使用。
在本發(fā)明中使用的漂白酶可以以任意合適的形式，即顆粒組合物的形式、酶的液體或漿液的形式，或者與載體材料(例如EP-A-258 068中描述的載體，和Novo Nordisk的Savinase(TM)以及Lipolase(TM)產(chǎn)品)一起有用地加到洗滌劑組合物中。將漂白酶加到液體洗滌劑產(chǎn)品中的良好途徑是以在乙氧基化醇非離子表面活性劑例如在EP-A-450 702(Unilever)中描述的非離子表面活性劑中含有0.5-50％重量漂白酶的漿液的形式加入。
本發(fā)明酶漂白組合物含有約0.001-10毫克活性漂白酶/升。洗滌劑組合物含有約0.001％-1％活性酶(w/w)。
酶活性可以以單位表示。例如，對于葡萄糖氧化酶，1個單位將在pH 6.5和30℃把1μmol β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2/分鐘。加到酶漂白組合物中的酶活性為約2.0-4000個單位/升(洗滌液體)。
在下述非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。在這些實(shí)施例中，描述了兩類分析實(shí)驗(yàn)。第一類實(shí)驗(yàn)(如在實(shí)施例1、2和5中描述的)包括使用專門設(shè)計(jì)用來研究抗體結(jié)合的表面微量滴定板。這些實(shí)驗(yàn)研究在污點(diǎn)的其它成分存在下，污點(diǎn)的無色成分例如水果和蔬菜中的果膠或奶飲料中的β-乳球蛋白是否被抗體特異性地結(jié)合。在這些實(shí)驗(yàn)中，有時將沾污物質(zhì)稀釋許多倍以使抗體結(jié)合特異性最佳化。當(dāng)采用微量滴定板分析進(jìn)行時這是標(biāo)準(zhǔn)操作，因?yàn)樵摷夹g(shù)的靈敏度非常高，并且當(dāng)使用少量樣本時其運(yùn)行得非常好。此外，由于微量滴定板的表面已被專門設(shè)計(jì)用來吸附生物活性物質(zhì)并具有非常低的非特異性結(jié)合作用，這些實(shí)驗(yàn)?zāi)芴貏e好地檢查抗體特異性。
在第二類分析實(shí)驗(yàn)(如實(shí)施例4和6所述)中，用沾污材料例如蕃茄醬或奶茶在很象“真正的”沾污、即未稀釋沾污材料的條件下將棉花布片樣本沾污。這些實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)結(jié)合到棉花多孔結(jié)構(gòu)上時無色成分是否易于被抗體結(jié)合，以及將棉花浸泡在表面活性劑中后無色成分是否仍然保持與棉花的結(jié)合。與有色成分相反，僅通過視覺觀察不能斷定無色分子是否結(jié)合到棉花上。因此，需要特定的結(jié)合探針(例如抗體)來確定無色分子是否存在。不象微量滴定板，棉花沒有專門設(shè)計(jì)用來免疫測定，因此預(yù)計(jì)背景信號可能會更高。雖然如此，但是對于在洗衣產(chǎn)品中的應(yīng)用，分析置于棉花上的沾污標(biāo)記分子仍然極其重要。
將這兩類實(shí)驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合在一起，我們發(fā)現(xiàn)(在我們看來令人驚奇)常見沾污的一些無色成分易于吸附到表面上，并且可被抗體特異性地結(jié)合，即使在充分洗滌和浸泡在表面活性劑中之后亦是如此。此外，本文描述的這兩個實(shí)驗(yàn)方法由于a)易于被抗體結(jié)合，和b)在表面活性劑存在下仍能保持附著在表面上而可用于定義其他可用于本發(fā)明的污點(diǎn)中的無色標(biāo)記分子。
最后，由于已經(jīng)確定了在表面活性劑存在下特定的標(biāo)記分子易于并保持附著在棉花上，因此可以評價使用對所述標(biāo)記分子有特并結(jié)合親和力的抗體/氧化酶偶聯(lián)物處理污點(diǎn)的效果。實(shí)施例8中描述了這樣的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1果膠特異性抗體結(jié)合到用番茄產(chǎn)品致敏的微量滴定板上。
使用對果膠有特異性、并稱為“JIM5”的大鼠單克隆抗體(K.A.VandenBosch等人。EMBO Journal vol.8 no.2 pp.335-342，1989；J.P.Knox等人。Planta(1990)181512-521)。然而，也可以使用能結(jié)合果膠的其它抗體。如果通過接種產(chǎn)生抗體的方法是已知的。參見例如上述K.A.VandenBosch等人的文獻(xiàn)，和F.Liners等人。Plant Physiol.(1989)91，1419-1424。在該實(shí)施例中使用的抗體制備物是培養(yǎng)物上清液，該上清液是John Innes Centre，Norwich，U.K.贈送的。
將蕃茄醬(H.J.Heinz Co Ltd.Hayes，U.K.)和過篩的番茄(Valfrutta)在磷酸鹽緩沖鹽水—pBS
中稀釋大約1000倍。把稀釋的番茄樣本加到微量滴定板(高容量，平底ELISA板；Greiner Labortechnik)的孔中，用氣密塑料封條密封，在37℃培養(yǎng)48小時。僅用PBS處理一些孔以用作陰性對照。
使用自動微量滴定板洗滌器用PBST[PBS＋0.15％吐溫20(Sigma)]洗滌這些致敏的平板。然后將一系列稀釋的JIM5制備物(在PBST中稀釋)加到孔中，并在室溫培養(yǎng)1小時。用陰性培養(yǎng)物上清液(不含JIM5)或者僅用PBST處理對照孔。
如上所述洗滌平板，然后將綿羊抗-大鼠IgG/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Serotec Product No AARO2A)加到孔中。將偶聯(lián)物在PBST中稀釋1000倍，并在孔中于室溫培養(yǎng)1小時。
如上所述洗滌平板，然后加入底物緩沖液[1mg/ml對硝基苯基磷酸鹽(pNPP)，在1M二乙胺(pH 9.8)中；1mM MgCl2]。5分鐘后，在自動平板計(jì)數(shù)器中于405nm讀取信號。
所得結(jié)果如下表1所示，結(jié)果是在405nm記錄的光密度或“信號”—信號越強(qiáng)，結(jié)合到表面上的抗體就越多。
表1施加的抗體試劑

JIM5/10＝在PBST中稀釋10倍的JIM5培養(yǎng)物JIM5/100＝在PBST中稀釋100倍的JIM5培養(yǎng)物JIM5/1000＝在PBST中稀釋1000倍的JIM5培養(yǎng)物NC/10＝在PBST中稀釋10倍的陰性培養(yǎng)物這些結(jié)果表明，JIM5可特異性地結(jié)合吸附在微量滴定板上的這兩種番茄產(chǎn)品。因此，從中可推知，即使用含有表面活性劑的液體(PBST)洗滌表面后，果膠也以易于被結(jié)合的形式保持結(jié)合在表面上。
實(shí)施例2果膠特異性抗體結(jié)合到用橙汁致敏的微量滴定板上.
將純的未加糖橙汁(Safeway)在磷酸鹽緩沖鹽水—PBS
中稀釋大約1000倍。把稀釋的橙汁樣本加到微量滴定板(Greiner，高容量)的孔中，用氣密塑料封條密封，在37℃培養(yǎng)。僅用PBS處理一些孔以用作陰性對照。
使用自動微量滴定板洗滌器用PBST[PBS＋0.15％吐溫20(Sigma)]洗滌這些致敏的平板。然后將一系列稀釋的JIM5制備物(在PBST中稀釋)加到孔中，并在室溫培養(yǎng)1.5小時。用陰性培養(yǎng)物上清液(不含JIM5)、在PBS中稀釋至最高達(dá)4μg/ml的非特異性大鼠單克隆抗體(Serotec產(chǎn)品PRPO4)或者僅用PBST處理對照孔。
如上所述洗滌平板，然后將綿羊抗-大鼠IgG/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Serotec Product No AARO2A)加到孔中。將偶聯(lián)物在PBST中稀釋1000倍，并在孔中于室溫培養(yǎng)1小時。如上所述洗滌平板，然后加入底物緩沖液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2]。40分鐘后，在自動平板計(jì)數(shù)器中于405nm讀取信號。
所得結(jié)果如下表2和3所示，結(jié)果是在405nm記錄的光密度或“信號”—信號越強(qiáng)，結(jié)合到表面上的抗體就越多。
表2施加的抗體試劑

JIM5/10＝在PBST中稀釋10倍的JIM5培養(yǎng)物JIM5/40＝在PBST中稀釋40倍的JIM5培養(yǎng)物JIM5/160＝在PBST中稀釋160倍的JIM5培養(yǎng)物JIM5/640＝在PBST中稀釋640倍的JIM5培養(yǎng)物表3施加的陰性對照

無＝僅PBSTNC/10＝在PBST中稀釋10倍的陰性培養(yǎng)物NAb＝在PBST中濃度為4μg/ml的非特異性大鼠單克隆抗體實(shí)施例3從培養(yǎng)物上清液中純化JIM5.
用裝配有超濾膜(Amicon PM30)的攪拌池(Amicon)將500ml澄清的培養(yǎng)物濃縮至大約12ml。將該濃縮物加到G蛋白″Hi-Trap″柱(Pharmacia)上。然后用PBS洗滌該柱以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)。然后通過用0.1M甘氨酸緩沖液(pH2.5)洗滌該柱來特異性地洗脫JIM5抗體。立即用1/20體積的3M tris(pH8.8)將解吸的級分中和。把中和的級分在PBS中透析。通過在280nm測定吸收度來確定收集的抗體，假定對于1mg/ml蛋白的濃度，消光系數(shù)為1.4。
實(shí)施例4純化的果膠特異性抗體結(jié)合到用番茄沾污的棉花布片樣本上。
從白色脫漿(desized)棉花織物上剪下18塊1cm×1cm棉花布片樣本，并用″B″型鉛筆作上標(biāo)志以使其可以區(qū)分。通過把6片布片樣本浸在蕃茄醬(Heinz)中并在密封的Petri皿中于37℃培養(yǎng)過夜來將其沾污。通過把6片布片樣本浸在過篩的番茄(Valfrutta)中并在密封管中于37℃培養(yǎng)過夜來將其沾污。6片布片樣本未沾污。
將沾污的布片樣本預(yù)洗滌，以使得污點(diǎn)變成典型的“殘留污點(diǎn)”，即模糊但是持久的污點(diǎn)。根據(jù)污點(diǎn)類型，將布片樣本分6批預(yù)洗滌，以將不同批之間的沾污材料的交叉沾污降到最低限度。用蒸餾水清洗布片樣本以除去過剩的番茄，然后將其在3×100ml洗滌緩沖液(PBS+0.2％Co-Co 6.5EO)中劇烈洗滌。用茶葉過濾器從各洗滌液中回收它們。洗滌3次后，將其在紙巾上吸干。
然后將布片樣本置于含有2ml其中的抗體濃度為5μg/ml的洗滌緩沖液的塑料管中。抗體是純化的JIM5(如實(shí)施例3中所述的)或同一亞類的非特異性大鼠單克隆抗體(Serotec產(chǎn)品號PRPO4)。根據(jù)污點(diǎn)類型，將每一類型布片樣本保持分隔以把交叉沾污降到最低限度。由此總共有6個管，每個管中包含3片布片樣本，如下表4所述，在各個管中的每片布片樣本接受相同處理。
表4

將管在室溫培養(yǎng)2小時。用3×100ml洗滌緩沖液洗滌它們，吸干，然后置于偶聯(lián)物中。偶聯(lián)物是在洗滌緩沖液中稀釋了1000倍的綿羊抗大鼠IgG/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Serotec產(chǎn)品號AARO2A)。將管在室溫再培養(yǎng)2小時。同樣將沾污與未沾污的布片樣本保持分隔以把沾污材料的交叉沾污降到最低限度。
如上所述將布片樣本洗滌并干燥，然后獨(dú)立地置于1ml底物緩沖液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2)]。將底物加到24-孔培養(yǎng)板(Costar，Cambridge USA)的孔中，把布片樣本在室溫培養(yǎng)30分鐘，然后取出200μl來在微量滴定板讀數(shù)器中讀數(shù)。
所得結(jié)果如下表5所示，結(jié)果是在405 nm記錄的光密度或“信號”—信號越強(qiáng)，結(jié)合到棉花上的抗體就越多。給出的結(jié)果是平行測定的布片樣本的結(jié)果，因此計(jì)算平均數(shù)值。
表5

所得結(jié)果表明，果膠特異性抗體結(jié)合被番茄沾污的布片樣本的能力遠(yuǎn)大于結(jié)合未沾污布片樣本的能力。因此可以推斷，在沾污過程中果膠結(jié)合到棉花上，甚至在含有表面活性劑的緩沖液中洗滌數(shù)次后仍然有很大的量保持著結(jié)合。此外，當(dāng)結(jié)合或者進(jìn)入棉花的多孔結(jié)構(gòu)中時，果膠肯定易于被抗體結(jié)合。
實(shí)施例5乳球蛋白特異性抗體結(jié)合到用奶茶致敏的微量滴定板上使用兔子多克隆試劑。這種試劑是如下所述制得的用β-乳球蛋白B或者″BLG″(Signa產(chǎn)品號L8005)給兔子接種，采集免疫血清，通過抗原親合色譜法純化乳球蛋白特異性抗體。S.C.Williams等人[J.Immunological Methods 213(1998)1-17]出版了如何進(jìn)行該操作的方法。
通過把沸水倒入茶葉袋(Typhoo)上，然后加入奶(Co-op半脂奶)來制備奶茶。將奶茶冷卻，然后加到微量滴定板(Greiner，高容量)的孔中，用氣密封條密封，在37℃培養(yǎng)48小時。
使用自動微量滴定板洗滌器，用PBST(PBS＋0.15％吐溫20)洗滌致敏的平板。然后將一系列稀釋的乳球蛋白特異性抗體(在PBST稀釋)加到孔中，并在室溫培養(yǎng)2小時。用非特異性兔子抗體，即生成來抗不同抗原的抗體(Dako兔子抗小鼠產(chǎn)品號Z259，Dako A/S，Glostrup，Denmark)處理對照孔。其它對照孔僅用PBST處理。
如上所述洗滌平板，然后將山羊抗-兔子IgG/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Zymed Laboratories Inc，San Fransisco，Product No 62-6122)加到孔中。將該偶聯(lián)物在PBST中稀釋1000倍，然后在室溫培養(yǎng)1小時。如上所述洗滌平板，然后加入底物緩沖液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2]。30分鐘后，在自動平板計(jì)數(shù)器中于405nm讀取信號。所得結(jié)果如下表6所示，結(jié)果是在405nm記錄的光密度或“信號”—信號越強(qiáng)，結(jié)合到表面上的抗體就越多。
表6施加的抗體試劑

抗BLG＝兔子抗-乳球蛋白NAb＝非特異性兔子抗體無＝僅PBST所得結(jié)果表明，當(dāng)在茶存在下吸附到表面上時，抗-乳球蛋白抗體可結(jié)合乳球蛋白(都是特異性結(jié)合，并且以劑量依賴方式結(jié)合)。
實(shí)施例6乳球蛋白特異性抗體結(jié)合到用奶茶沾污的棉花布片樣本上從白色脫漿(desized)棉花織物上剪下18塊1cm×1cm棉花布片樣本，并用″B″型鉛筆作上標(biāo)志以使其可以區(qū)分。通過把9片布片樣本浸在奶茶(用Typhoo茶葉袋和Co-op半脂奶制得的)中并在密封管中于37℃培養(yǎng)過夜來將其沾污。9片布片樣本未沾污。
將沾污的布片樣本預(yù)洗滌，以使得污點(diǎn)變成典型的“殘留污點(diǎn)”，即模糊但是持久的污點(diǎn)。將其在3×100ml洗滌緩沖液(PBS+0.2％Co-Co 6.5EO)中劇烈洗滌。用茶葉過濾器從各洗滌液中回收它們。洗滌3次后，將其在紙巾上吸干。
然后將布片樣本置于含有2ml其中的抗體濃度為5μg/ml的洗滌緩沖液的塑料管或僅含洗滌緩沖液的陰性對照管中?？贵w是兔子抗乳球蛋白(如實(shí)施例5中所述的″抗-BLG″)或非特異性兔子抗體(Dako兔子抗-小鼠，產(chǎn)品號Z259)。根據(jù)處理類型，將每一類型布片樣本保持分隔以把試劑的交叉沾污降到最低限度。由此總共有6個管，每個管中包含3片布片樣本，如下表7所述，在各個管中的每片布片樣本接受相同處理。
表7

將管在室溫培養(yǎng)1.5小時。用3×100ml洗滌緩沖液洗滌它們，吸干，然后置于偶聯(lián)物中。偶聯(lián)物是在洗滌緩沖液中稀釋了1000倍的山羊抗大鼠IgG/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(Zymed產(chǎn)品號62-6122)。將管在室溫再培養(yǎng)1.5小時。同樣將沾污與未沾污的布片樣本保持分隔以把沾污材料的交叉沾污降到最低限度。
如上所述將布片樣本洗滌并干燥，然后獨(dú)立地置于1ml底物緩沖液[1mg/ml pNPP，在1M二乙胺(pH9.8)中；1mM MgCl2)]。將底物加到24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)的孔中，把布片樣本在室溫培養(yǎng)20分鐘，然后取出200μl來在微量滴定板讀數(shù)器中讀數(shù)。
所得結(jié)果如下表8所示，結(jié)果是在405nm記錄的光密度或“信號”—信號越強(qiáng)，結(jié)合到棉花上的抗體就越多。給出的結(jié)果是平行測定的布片樣本的結(jié)果，因此計(jì)算平均數(shù)值。
表8

所得結(jié)果表明，乳球蛋白特異性抗體結(jié)合被奶茶沾污的棉花布片樣本的能力遠(yuǎn)大于結(jié)合未沾污布片樣本的能力。因此可以推斷，在沾污過程中乳球蛋白結(jié)合到棉花上，甚至在含有表面活性劑的緩沖液中洗滌數(shù)次后仍然有很大的量保持著結(jié)合。此外，當(dāng)結(jié)合或者進(jìn)入棉花的多孔結(jié)構(gòu)中時，乳球蛋白肯定易于被抗體結(jié)合。
實(shí)施例7果膠特異性抗體與葡萄糖氧化酶的偶聯(lián)使用大體按照在Carlsson等人.(1978)Biochem.J.173，723-737和″生物偶聯(lián)技術(shù)″Greg T Hermanson，Academic Press(1996)，第70-71頁中描述的方法的方案將抗體化學(xué)偶聯(lián)到酶上。還有幾種用于偶聯(lián)兩種活性蛋白的本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的其它方法。所用精確方案的詳述在下面的實(shí)施例中給出。用″SAMSA″衍化抗體將純化的JIM5抗體(如實(shí)施例3中所述的)濃縮至6.4mg/ml，并用″Centricon 30″超濾管(Millipore)在0.1 M NaH2PO4，pH6.5中進(jìn)行緩沖交換。將40μl該抗體制備物置于玻璃反應(yīng)瓶中。配制″SAMSA″[S-乙?；鶐€基琥珀酸酐(Sigma產(chǎn)品號A1251)]溶液。該SAMSA溶液是在DMF[二甲基甲酰胺]中的10mg/ml溶液。將2μl該SAMSA溶液加到抗體中，把該混合物在室溫21℃±1劇烈攪拌30分鐘。30分鐘后，以5分鐘的間隔加入下述溶液(i)20μl EDTA以穩(wěn)定衍化的抗體。(ii)100μl 0.1M Tris pH 7.0以調(diào)節(jié)pH。(iii)100μl 1M NH2OH pH 7.0以把SAMSA脫保護(hù)并暴露出硫氫基。
45分鐘后，將該混合物補(bǔ)足至2.5ml(用0.1 M NaH2PO4，pH6.5)，并用在0.1 M NaH2PO4＋5mM EDTA pH 6.5中預(yù)平衡的PD10柱(Pharamacia)脫鹽。通過用3.2ml緩沖液(在0.1 M NaH2PO4＋5mMEDTA pH 6.5中)洗脫該柱來收集衍化的抗體。用＂SPDP＂衍化葡萄糖氧化酶在0.1 M NaH2PO4(pH 7.5)中配制葡萄糖氧化酶(或″Gox″)XS[Genencor OxyGo HPL 5000(商品級)]，使其濃度為12.8mg/ml。在攪拌下將62.5μl該酶制備物(0.8mg)置于反應(yīng)瓶中，加入0.5ml 0.1 M NaH2PO4pH 7.5。配制″SPDP″[3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma產(chǎn)品號P-3415)]的溶液。SPDP在DMSO[二甲基亞砜]中的溶液的濃度為13.15mg/ml。將30.4μl該SPDP溶液加到反應(yīng)瓶中，將該混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。然后將該混合物補(bǔ)足至2.5ml(用0.1 MNaH2PO4，pH7.5)，并用在0.1 M NaH2PO4pH 6.5中預(yù)平衡的PD10柱(Pharamacia)脫鹽。通過用3.2ml緩沖液(0.1 M NaH2PO4pH 6.5)洗脫該柱來收集衍化的酶。衍化的抗體與衍化的葡萄糖氧化酶的反應(yīng)將抗體和Gox制備物吸移到單獨(dú)的centricon 30管(Millipore)內(nèi)，并以4000 RPM的轉(zhuǎn)速離心直至制備物濃縮至約400μl的體積為止(起始體積為3.2ml)。將135μl Gox制備物與抗體制備物(400μl)在玻璃瓶中混合。將玻璃瓶在4℃放置過夜以進(jìn)行偶聯(lián)。
實(shí)施例8用果膠特異性抗體/GOx偶聯(lián)物漂白番茄污點(diǎn)將脫漿白色棉布浸泡在過篩的番茄(Valfrutta)中并煮沸1小時來將沾污。用冷水洗滌棉布，并在37℃干燥過夜。把干燥的棉布剪成2×2cm的正方形布片樣本，并用″洗滌緩沖液II″[PBS+0.0375％Coco 6.5EO，0.0375％Las(pH8.0)]預(yù)洗滌以留下殘余污點(diǎn)。
向4個玻璃瓶中每瓶加入6片相同的布片樣本。然后用1ml不同溶液處理各個玻璃瓶瓶1僅用洗滌緩沖液II處理；瓶2用在洗滌緩沖液II中稀釋的葡萄糖氧化酶″Gox″XS[Genencor OxyGo HPL5000(商品級)]處理；瓶3用在洗滌緩沖液II中稀釋的果膠特異性抗體/Gox偶聯(lián)物(在實(shí)施例7中制得的)處理；瓶4用在洗滌緩沖液II中稀釋的非特異性抗體/Gox偶聯(lián)物(包含不結(jié)合果膠的抗體)處理。這些酶制備物和偶聯(lián)物都已經(jīng)稀釋過，因此它們均含有大約等于2.8μg未偶聯(lián)Gox的酶活性。將玻璃瓶在室溫培養(yǎng)2分鐘。然后向各瓶中加入8ml洗滌緩沖液II，之后加入90μl 1M葡萄糖。將玻璃瓶反轉(zhuǎn)以把其中的內(nèi)容物混合，并在37℃放置35分鐘(這時瓶2-4含有大約等于300ng/ml未偶聯(lián)Gox的酶活性)。
取出布片樣本并用蒸餾水沖洗。將各組布片樣本在保溫箱中于37℃干燥3小時。通過分光光度分析法(使用″Color Eye 7000″分光光度計(jì)，Macbeth)分析干燥的棉布。污點(diǎn)消除以ΔR440和ΔE表示，其是對比著沾污的未處理的對照讀取的。所得結(jié)果如下。表9-用果膠特異性抗體/GOx偶聯(lián)物去除番茄污點(diǎn)


這些結(jié)果表明，果膠特異性偶聯(lián)物去除的污點(diǎn)比非特異性偶聯(lián)物或未偶聯(lián)的酶多。
權(quán)利要求
1.能生成漂白化學(xué)物質(zhì)并對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的漂白酶，其特征在于，所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000、更優(yōu)選至少為5000的分子量。
2.權(quán)利要求1的酶，其中所述酶包含偶聯(lián)到對無色化合物有高結(jié)合親和力的試劑上的、能夠生成漂白化學(xué)物質(zhì)的酶部分。
3.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述酶部分是氧化酶，并且漂白化學(xué)物質(zhì)是過氧化氫。
4.權(quán)利要求3的酶，其中所述氧化酶選自葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和醇氧化酶。
5.權(quán)利要求1-2的酶，其中所述酶部分是鹵素過氧化物酶，并且漂白化學(xué)物質(zhì)是次鹵酸鹽。
6.權(quán)利要求5的酶，其中所述酶部分是氯過氧化物酶，并且漂白化學(xué)物質(zhì)是次氯酸鹽。
7.權(quán)利要求6的酶，其中所述氯過氧化物酶是釩氯過氧化物酶。
8.權(quán)利要求7的酶，其中所述釩氯過氧化物酶是不等彎孢的氯過氧化物酶。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述酶部分是漆酶或過氧化物酶，并且漂白分子得自與酶反應(yīng)的增強(qiáng)劑分子。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述酶部分偶聯(lián)到當(dāng)果膠或β-乳球蛋白吸附在表面上時對果膠或β-乳球蛋白有高結(jié)合親和力的試劑上。
11.權(quán)利要求10的酶，其中所述表面是棉花、聚酯、或聚酯/棉花織物。
12.權(quán)利要求10或11的酶，其中所述酶能結(jié)合到織物上存在的番茄污點(diǎn)上。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述具有高結(jié)合親和力的試劑是蛋白或肽。
14.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述具有高結(jié)合親和力的試劑是抗體、抗體片斷、或它們的衍生物。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述酶是融合蛋白，所述融合蛋白包含漂白酶和全部或部分重鏈免疫球蛋白，所述重鏈免疫球蛋白是在駱駝科動物中產(chǎn)生的并且對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有特異性，所述無色化合物具有至少為5000、優(yōu)選至少為10000的分子量。
16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的酶，其中所述具有高結(jié)合親和力的試劑對所述物質(zhì)的化學(xué)平衡常數(shù)Kd低于10-4M、優(yōu)選低于10-6M。
17.權(quán)利要求16的酶，其中所述化學(xué)平衡常數(shù)Kd低于10-7M。
18.具有至少一個針對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物的特異性和針對一種或多種漂白酶的其它特異性的多特異性抗體或抗體片斷或類似結(jié)構(gòu)，所述無色化合物具有至少為5000、優(yōu)選至少為10000的分子量。
19.權(quán)利要求18的抗體或抗體片斷或結(jié)構(gòu)類似物，它們具有一個針對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物的特異性和一個針對漂白酶的特異性。
20.一種漂白酶，它包含權(quán)利要求18-19的抗體或抗體片斷。
21.一種酶漂白組合物，它包含權(quán)利要求1-17或20的漂白酶和一種或多種表面活性劑。
22.權(quán)利要求21的酶漂白組合物，其中所述酶產(chǎn)生過氧化氫，并且組合物包含產(chǎn)生過乙酸的活化劑。
23.權(quán)利要求21的酶漂白組合物，其中所述酶產(chǎn)生過氧化氫，并且組合物包含過渡金屬催化劑。
24.漂白織物上存在的污點(diǎn)的方法，其中是將沾污的織物與包含權(quán)利要求1-17的漂白酶的溶液接觸。
25.漂白織物上存在的污點(diǎn)的方法，其中是將沾污的織物與權(quán)利要求21-23的酶漂白組合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了能生成漂白化學(xué)物質(zhì)并對織物污點(diǎn)中存在的無色化合物有高結(jié)合親和力的漂白酶,所述無色化合物具有至少為100、優(yōu)選至少為1000、更優(yōu)選至少為5000的分子量。本發(fā)明還提供了包含所述漂白酶和表面活性劑的酶漂白組合物,以及漂白織物上存在的污點(diǎn)的方法。
文檔編號C11D3/386GK1332797SQ99814139
公開日2002年1月23日 申請日期1999年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月11日
發(fā)明者M·J·貝里, D·科文特斯, P·J·達(dá)維斯, M·J·吉德利, C·P·E·范德洛特 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司