專(zhuān)利名稱(chēng)：包含重組病毒載體的多價(jià)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA和病毒載體疫苗領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及重組DNA和攜帶編碼多價(jià)抗原的核酸的病毒載體和/或佐劑。
背景技術(shù)：
幾千年來(lái)，結(jié)核病(TB)在世界范圍內(nèi)一直是人類(lèi)健康的主要威脅。由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的TB是暴露于空氣傳播的結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌感染而引起的肺部感染性疾病。該菌具有強(qiáng)感染性，據(jù)估計(jì)，目前約有1/3的世界人口(20億人)受到感染。進(jìn)一步預(yù)計(jì)，TB每年已致超過(guò)2百萬(wàn)的世界人口死亡。只有5-10％的具有免疫能力的人群對(duì)TB敏感，并且其中超過(guò)85％的人群將發(fā)展成只在肺中的疾病，而HIV感染人群也能發(fā)展成更容易導(dǎo)致死亡的全身性疾病。
約90％的結(jié)核分枝桿菌感染的人群將不會(huì)發(fā)展成疾病。然而，在這些潛伏感染個(gè)體中，該細(xì)菌能存活許多年，并且在免疫系統(tǒng)變?nèi)醯那闆r下例如在HIV感染后能被重新激活。因?yàn)槠錆摲匦?，所以通常感染個(gè)體必須通過(guò)給予幾種抗生素12個(gè)月以上進(jìn)行治療，該治療通常不是非常有吸引力的治療，因?yàn)橘M(fèi)用和可能的多藥抗性的發(fā)生，該治療也不是一個(gè)在大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家中非常有效的治療。
一種相對(duì)成功的TB疫苗已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)卡介苗(BCG)疫苗在二十世紀(jì)早期產(chǎn)生，1921年首次將其給予個(gè)體。BCG疫苗是基于奶牛的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)細(xì)菌的減毒株。該疫苗相對(duì)安全，可以容易和相當(dāng)便宜的生產(chǎn)。在2000年，BCG疫苗覆蓋了86％的世界人群。然而，該疫苗似乎對(duì)成人肺TB不是特別有效，因?yàn)榘l(fā)展中國(guó)家的許多地區(qū)仍然有非常高的TB發(fā)生率，盡管進(jìn)行了BCG疫苗接種項(xiàng)目。據(jù)估計(jì)，BCG疫苗預(yù)防了僅5％的TB造成的所有疫苗可預(yù)防的死亡(Kaufmann，2000)。
由于BCG疫苗普遍相當(dāng)?shù)偷谋Ｗo(hù)率，以及由于針對(duì)兒童時(shí)期和散布TB的特異性保護(hù)，所以基于其它系統(tǒng)和其它領(lǐng)域例如抗其它熱帶感染疾病和HIV的疫苗所獲得的知識(shí)，更多的努力被用于開(kāi)發(fā)新的、應(yīng)用更加廣泛的抗TB疫苗上(Wang and Xing綜述，2002)。
不同方法被用來(lái)開(kāi)發(fā)新TB疫苗，范圍從亞單位疫苗和DNA疫苗到修飾的分枝桿菌菌株。此外，也產(chǎn)生了基于重組病毒的疫苗，該疫苗通過(guò)基因輸送載體例如修飾的Ankara痘苗(MVA)載體和復(fù)制缺陷型腺病毒載體能將結(jié)核分枝桿菌抗原轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞。
抗TB的裸DNA疫苗記載在WO96/15241中(也參見(jiàn)EP0792358)，同時(shí)許多報(bào)道記載了來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的多種抗原以重組或純化的形式應(yīng)用于疫苗WO 95/01441、WO 95/14713、WO96/37219、US 6,599,510、WO 98/31388、WO 98/44119、WO 99/04005、WO 99/24577、WO 00/21983、WO 01/04151、WO 01/79274、WO2004/006952、US 2002/0150592。也提示了應(yīng)用包含不同TB抗原的融合蛋白見(jiàn)WO 98/44119、EP 0972045以及EP 1449922，這些文獻(xiàn)公開(kāi)了ESAT-6和MPT59融合多肽的應(yīng)用(MPT59也稱(chēng)為Ag85B或85B抗原)。
盡管所有這些和其它產(chǎn)生抗結(jié)核病疫苗的努力以確保強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答以及長(zhǎng)效高保護(hù)率，但這樣的疫苗目前還沒(méi)有獲得。
附圖簡(jiǎn)述

圖1pAdApt35Bsu.myc圖譜圖2pAdApt35Bsu.TB.LM圖譜圖3pAdApt35Bsu.TB.SM圖譜圖4pAdApt35Bsu.TB.FLM圖譜圖5pAdApt35Bsu.TB.3M圖譜圖6pAdApt35Bsu.TB.4M圖譜圖7pAdApt35Bsu.TB.5M圖譜圖8pAdApt35Bsu.TB.6M圖譜圖9pAdApt35Bsu.TB.7M圖譜圖10.抗-TB抗原多克隆抗體與Ad35病毒感染A549細(xì)胞的裂解物的Western印記，所述Ad35病毒包含不同組TB抗原的核酸，具有myc-標(biāo)記(A)和不含myc-標(biāo)記(B)。(C)與(B)相似，有分子量標(biāo)記。參見(jiàn)表I注釋。
圖11.使用含不同組編碼結(jié)核抗原的核酸的7種不同腺病毒載體(DNA)的免疫方案的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
圖12.在不含肽的刺激下，干擾素-γ生產(chǎn)(IFNγ+)染色陽(yáng)性的抗原特異性脾細(xì)胞百分率(ACD4+細(xì)胞，BCD8+細(xì)胞)。
圖13.在Ag85A抗原相關(guān)肽刺激下，干擾素-γ生產(chǎn)(IFNγ+)染色陽(yáng)性的抗原特異性脾細(xì)胞百分率(ACD4+細(xì)胞，BCD8+細(xì)胞)。
圖14.在Ag85B抗原相關(guān)肽刺激下，干擾素-γ生產(chǎn)(IFNγ+)染色陽(yáng)性的抗原特異性脾細(xì)胞百分率(ACD4+細(xì)胞，BCD8+細(xì)胞)。
圖15.在TB10.4抗原相關(guān)肽刺激下，干擾素-γ生產(chǎn)(IFNγ+)染色陽(yáng)性的抗原特異性脾細(xì)胞百分率(ACD4+細(xì)胞，BCD8+細(xì)胞)。
圖16.ICN染色陽(yáng)性的CD4+和CD8+脾細(xì)胞百分率總述，該脾細(xì)胞獲自注射了三聯(lián)插入片段(triple insert)TB-L(A)和TB-S(B)的小鼠血清。
圖17.包含編碼Ag85A、Ag85B和Tb10.4抗原的核酸的不同劑量TB-S的劑量應(yīng)答效應(yīng)。Ag85A(A)、Ag85B(C)和TB10.4(E)的CD4反應(yīng)。Ag85A(B)、Ag85B(D)和TB10.4(F)的CD8反應(yīng)。(G)含校正肽庫(kù)(adjusted peptide pool)的Ag85B的CD8反應(yīng)(參見(jiàn)實(shí)施例6)左圖，TB-L感染；右圖，TB-S感染。
圖18.BCG引發(fā)且不同Ad-TB載體加強(qiáng)的CD4和CD8反應(yīng)。Ag85A(A)、Ag85B(C)和TB 10.4(E)的CD4反應(yīng)。Ag85A(B)、Ag85B(D)和TB10.4(F)的CD8反應(yīng)。
圖19.TB-LM的核苷酸序列圖20.TB-SM的核苷酸序列圖21.TB-FLM的核苷酸序列圖22.TB-LM的氨基酸序列圖23.TB-SM的氨基酸序列圖24.TB-FLM的氨基酸序列圖25.長(zhǎng)期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35-TB加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的Ag85A刺激。上部CD4反應(yīng)，下部CD8反應(yīng)。Ad35.E＝空Ad35病毒。
圖26.長(zhǎng)期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35-TB加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的Ag85B刺激。上部CD4反應(yīng)，下部CD8反應(yīng)。Ad35.E＝空Ad35病毒。
圖27.長(zhǎng)期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35-TB加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的TB10.4刺激。上部CD4反應(yīng)，下部CD8反應(yīng)。Ad35.E＝空Ad35病毒。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組病毒載體，優(yōu)選復(fù)制缺陷腺病毒，更優(yōu)選重組人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50，其中病毒載體包括異源核酸序列，該序列編碼來(lái)自一種或多種結(jié)核致病菌的至少兩種抗原的(融合)多肽。編碼的抗原可以直接連接，即形成一個(gè)單一多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原以前體多蛋白存在，在該情況下，他們通過(guò)由共表達(dá)的特異性蛋白酶識(shí)別的接頭序列連接。異源核酸可以包括編碼蛋白酶的基因。由于抗原存在在融合產(chǎn)物中，所以直接連接的融合蛋白可引發(fā)期望的免疫應(yīng)答，同時(shí)包含蛋白酶位點(diǎn)的蛋白被切割為分離的抗原形式，每一抗原也可產(chǎn)生期望的免疫應(yīng)答。蛋白酶優(yōu)選通過(guò)被細(xì)胞蛋白酶識(shí)別的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接至抗原。與使用僅包括單一轉(zhuǎn)基因編碼單位的病毒載體的免疫或治療相比，兩種方案提供了額外的或甚至是協(xié)同的作用。更通常地，本發(fā)明也涉及包括異源核酸序列的病毒載體，該序列編碼被蛋白酶特異切割位點(diǎn)分隔的多抗原?？梢岳斫猓@樣的抗原可以來(lái)自廣泛來(lái)源，包括但不限于感染物，例如病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)，因此，根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面，該抗原并不限于來(lái)自結(jié)核致病菌的抗原。來(lái)自結(jié)核分枝桿菌(Tuberculosis mycobacterium)的抗原作為非限制性的實(shí)例，以說(shuō)明這種多價(jià)病毒載體疫苗如何產(chǎn)生，在進(jìn)入宿主細(xì)胞之后該抗原如何分離，以及該抗原能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及病毒載體共表達(dá)的遺傳佐劑的應(yīng)用。這些佐劑由核酸編碼，該核酸是導(dǎo)入病毒載體基因組的異源核酸序列的一部分。佐劑與特異抗原共同表達(dá)，因此能刺激針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。具體地，編碼佐劑的序列可與編碼抗原的序列直接連接，但優(yōu)選地與編碼一個(gè)或多個(gè)抗原的序列由編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的接頭序列分隔。在后一情況中，佐劑與抗原分別存在在宿主中，其能與抗原一起提供免疫刺激效應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含重組病毒載體的多價(jià)疫苗。優(yōu)選的病毒載體是重組腺病毒(Ad)載體。本發(fā)明的重組腺病毒載體包括編碼至少兩種不同抗原的異源核酸序列?？乖晌挥趩我欢嚯闹?。這些決定簇可以是來(lái)自病毒、細(xì)菌和寄生病原體的抗原，或者宿主抗原，例如但不限于自身免疫抗原或腫瘤抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原來(lái)自結(jié)核(TB)致病菌，更優(yōu)選來(lái)自結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌(Mafricanum)或牛分枝桿菌(M.bovis)或者其組合。抗原可以是全長(zhǎng)天然蛋白，抗原與宿主蛋白或模擬物的嵌合融合體，源自病原體的抗原的一或多個(gè)片段，或者仍可引發(fā)期望免疫應(yīng)答的其它突變體。可典型地用于本發(fā)明病毒載體的編碼TB抗原的基因包括但不限于Ag85A(MPT44)、Ag85B(MPT59)、Ag85C(MPT45)、TB 10.4(CFP7)、ESAT-6、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP10A、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP26(MPT51)CFP27、CFP28、CFP29、CFP30A、CFP30B、CWP32、CFP50、MPT63、MTC28、LHP、MPB59、MPB64、MPT64、TB15、TB18、TB21、TB33、TB38、TB54、TB12.5、TB20.6、TB40.8、TB10C、TB15A、TB17、TB24、TB27B、TB13A、TB64、TB11B、TB16、TB16A、TB32、TB32A、TB51、TB14、TB27、HBHA、GroEL、GroES(WO95/01441、WO 98/44119、US 6,596,281、US 6,641,814、WO 99/04005、WO 00/21983、WO 99/24577)以及公開(kāi)在WO 92/14823、WO95/14713、WO 96/37219、US 5,955,077、US 6,599,510、WO 98/31388、US 2002/0150592、WO 01/04151、WO 01/70991、WO 01/79274、WO2004/006952、WO 97/09428、WO 97/09429、WO 98/16645、WO98/16646、WO 98/53075、WO 98/53076、WO 99/42076、WO 99/42118、WO 99/51748、WO 00/39301、WO 00/55194、WO 01/23421、WO01/24820、WO 01/25401、WO 01/62893、WO 01/98460、WO 02/098360、WO03/070187、US 6,290,969、US 6,338,852、US 6,350,456、US6,458,366、US 6,465,633、US 6,544,522、US 6,555,653、US 6,592,877、US 6,613,881、US 6,627,198中的抗原。特定用途的抗原融合體是本文首次公開(kāi)的那些(例如Ag85A-Ag85B-TB10.4及其組合)，但也已知如ESAT-6-MPT59和MPT59-ESAT-6這樣的融合體已經(jīng)公開(kāi)在WO98/44119和上述參考文獻(xiàn)中。
一個(gè)利用多抗原的方法可以通過(guò)單個(gè)載體中存在有兩個(gè)或多個(gè)分離的表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒包含各自感興趣的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。該方法具體有以下優(yōu)點(diǎn)，例如與載體空間利用度相關(guān)分隔的盒通常包括各自的啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)物以及各自的多腺苷酸化信號(hào)序列。這種盒通常在病毒載體中需要獨(dú)立位置，這將導(dǎo)致更繁瑣的克隆步驟，而稱(chēng)為“啟動(dòng)子干擾”或“壓制(squelching)”(啟動(dòng)子發(fā)揮作用所要求的細(xì)胞因素的有限可利用度)的現(xiàn)象可限制不同啟動(dòng)子的表達(dá)水平。
以本文公開(kāi)的涉及多TB抗原融合體的重組病毒載體為例，現(xiàn)在可以制備包含編碼多于一個(gè)抗原的多個(gè)核酸的重組腺病毒載體，其中病毒載體產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答，而應(yīng)用單一插入體引發(fā)有限效應(yīng)。具體地，這些載體編碼重組遺傳嵌合物，其在單順?lè)醋觤RNA中表達(dá)兩種或多種抗原，例如以融合蛋白形式。當(dāng)DNA疫苗或病毒載體用于激發(fā)對(duì)所載抗原的T細(xì)胞免疫時(shí)，該方法是有效的。然而，這種融合蛋白可能有其它不能事先預(yù)料的額外缺點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種融合體可能會(huì)扭曲免疫顯性模式而不能總是以相同潛能激發(fā)針對(duì)所有靶抗原的免疫，而遺傳融合體表達(dá)的第二個(gè)也可能更重要的缺點(diǎn)是由于融合配偶體緊密靠近或其它原因，各個(gè)成分不能折疊成天然構(gòu)象。由于這些原因，遺傳融合體可能引發(fā)針對(duì)無(wú)義表位的抗體應(yīng)答，這種抗體不能識(shí)別原始病原體所展示的天然表位，對(duì)抗擊感染較弱。
本發(fā)明人現(xiàn)在開(kāi)發(fā)了一種系統(tǒng)，其中多抗原由單一異源核酸序列編碼，其中表達(dá)的多蛋白被加工成分離的抗原多肽。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能使多抗原表達(dá)的病毒載體，所述多抗原被依次加工成分離的抗原，由此避免與遺傳融合體相關(guān)的可能限制，同時(shí)也不需要獨(dú)立的表達(dá)盒。迄今，還沒(méi)有記載能使病毒載體表達(dá)的遺傳融合體精確加工為分離抗原的組合物或方法。DNA或病毒載體包含的核酸編碼的多抗原的表達(dá)是利用蛋白酶(PR)例如禽類(lèi)白血病病毒(ALV；本文稱(chēng)為PR-ALV)編碼的病毒蛋白酶證明的，其中所述抗原接著被加工成分離的抗原。在ALV中，ALV-PR形成gag蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已知催化gag和gag-pol前體加工，這是ALV復(fù)制的關(guān)鍵步驟(Skalka綜述.1989)。
產(chǎn)生了獨(dú)特的ALV-PR定向加工系統(tǒng)。含有ALV-PR和給定抗原的多蛋白通過(guò)DNA或病毒載體表達(dá)，其中ALV-PR優(yōu)選形成多蛋白的N末端，后面緊接與ALV-PR消化位點(diǎn)連接的抗原序列。優(yōu)選兩個(gè)不同的切割位點(diǎn)用于該系統(tǒng)。一個(gè)切割位點(diǎn)(GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV；SEQ ID NO22)釋放ALV-PR，另一切割位點(diǎn)(PPSKSKKGGAAAMS SAIQPLVMAVVNRERDGQTG；SEQ ID NO21)則被ALV-PR所識(shí)別，用于分離在分離多肽中的其它被編碼的抗原。
或者，PR和其切割位點(diǎn)可由其它逆轉(zhuǎn)錄病毒所編碼或基于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和勞斯肉瘤病毒。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了包含編碼來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的多抗原的核酸序列的重組病毒載體，其中不同的核酸序列被編碼ALV蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列彼此分隔。在該情況下，分離的TB抗原以多蛋白的形式產(chǎn)生而后加工，這樣它們被切割成分離的抗原多肽，各自導(dǎo)致免疫應(yīng)答?？梢岳斫?，ALV蛋白酶系統(tǒng)不限于應(yīng)用TB-特異性抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解該系統(tǒng)有可能應(yīng)用其它抗原，這些抗原與TB抗原不同或與之組合，以及其可應(yīng)用于其它治療方案，例如基因治療及腫瘤免疫。
優(yōu)選地，包含被蛋白酶位點(diǎn)分隔的多抗原編碼序列的病毒載體是腺病毒載體。病毒載體可以是病毒顆粒本身，術(shù)語(yǔ)病毒載體也可以指編碼病毒顆粒的核酸。腺病毒載體優(yōu)選是重組載體，其基于或衍生于在低百分?jǐn)?shù)的靶群中遭遇中和活性的腺病毒種或血清型。這些腺病毒有時(shí)也稱(chēng)為“稀有”腺病毒，因?yàn)樗鼈兺ǔ２粫?huì)在人群中規(guī)律流行。因此，優(yōu)選的血清型是Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。
本文所用的“抗原”是指蛋白質(zhì)或其片段，在動(dòng)物或人類(lèi)細(xì)胞或組織中表達(dá)時(shí)，其能引發(fā)免疫應(yīng)答。例子包括但不限于病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、寄生物蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)劑以及治療劑?？乖梢允且吧偷鞍住⒃摰鞍椎慕囟绦问?、該蛋白的突變形式、或該蛋白的任何其它變體，在每種情況下，在接種的動(dòng)物或人宿主中表達(dá)時(shí)均能夠引發(fā)免疫應(yīng)答?？梢岳斫?，當(dāng)抗原直接融合時(shí)，該融合是重組分子生物學(xué)的結(jié)果；因此，本文所用的兩種抗原的直接融合體并不是指發(fā)生在自然界的單一野生型蛋白的兩個(gè)抗原部分。為了清楚起見(jiàn)，當(dāng)單一野生型蛋白的兩個(gè)抗原部分(兩部分通常直接連接于蛋白內(nèi))通過(guò)本文所公開(kāi)的接頭(例如通過(guò)ALV蛋白酶位點(diǎn)，如下文所述)連接時(shí)，該融合體也是本發(fā)明的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及直接連接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)蛋白酶位點(diǎn)連接的不同蛋白質(zhì)(有抗原活性)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼蛋白酶的基因與感興趣的蛋白相連，更優(yōu)選通過(guò)另一種蛋白酶位點(diǎn)相連。
不同抗原不需要來(lái)自同一病原物種。多物種不同抗原的組合也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中不同抗原由單一載體內(nèi)的核酸序列編碼。
“宿主抗原”是指存在在受體動(dòng)物細(xì)胞或組織的蛋白或其部分，例如但不限于細(xì)胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑或治療劑。
抗原可以由密碼子優(yōu)化的合成基因編碼，及用常規(guī)重組DNA方法構(gòu)建。
如上所述，包含ALV蛋白酶系統(tǒng)的重組病毒載體表達(dá)的抗原可以是在侵入動(dòng)物宿主、在動(dòng)物宿主內(nèi)建群或在動(dòng)物宿主內(nèi)復(fù)制之前或期間由任何病毒、細(xì)菌或寄生病原體表達(dá)的任何分子。這些病原體在人、家畜或野生動(dòng)物宿主中可以是感染性的。
病毒抗原來(lái)自的病毒病原體包括但不限于正粘病毒，例如流感病毒； 逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如RSV、HTLV-1和HTLV-II；皰疹病毒，例如EBV；CMV或單純皰疹病毒；慢病毒，例如HIV-1和HIV-2；彈狀病毒，例如狂犬病毒；小RNA病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒；痘病毒，例如痘苗病毒；輪狀病毒；以及細(xì)小病毒，例如腺伴隨病毒(AAV)。
病毒抗原的例子在下組可以找到，包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)抗原Rev、Pol、Nef、Gag、Env、Tat、Tat突變衍生物，例如Tat-A31-45、gp120的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞表位、HIV-I Env和gp120的嵌合衍生物，例如gp120與CD4的融合體、截短或修飾的HIV-I Env，例如gp140或HIV-1 Env和/或gp140的衍生物。其它例子是乙肝表面抗原、輪狀病毒抗原，例如VP4和VP7，流感病毒抗原，例如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白，以及單純皰疹病毒抗原，例如胸苷激酶。
細(xì)菌抗原衍生自的細(xì)菌病原體的例子包括但不限于分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella spp.)、志賀氏菌屬(Shigella spp.)、大腸桿菌(E coli)、立克次氏體屬(Rickettsia spp.)、李斯特氏菌屬(Listeria spp.)、肺炎軍團(tuán)菌(Legionella pneumoniae)、Fansicella spp.、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、弧菌屬(Vivrio spp.)以及布氏疏螺旋體(Borelliaburgdorferi)。
細(xì)菌病原體的保護(hù)性抗原的例子包括產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的菌體抗原，例如CFA/I菌毛抗原和熱不穩(wěn)定毒素的非毒性B亞基；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)pertactin、百日咳博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶-溶血素、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)破傷風(fēng)毒素C片段、布氏疏螺旋體OspA、普氏立克次氏體(Rickettsiaprowazekii)和斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsia typhi)保護(hù)性類(lèi)結(jié)晶表面層蛋白(protective paracrystalline-surface-layer proteins)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素(也稱(chēng)作″Llo″和″Hly″)和/或超氧化物岐化酶(也稱(chēng)為″SOD″和″p60″)、幽門(mén)螺桿菌的脲酶以及炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthrax)的致死毒素的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或保護(hù)性抗原。
寄生抗原衍生自的寄生病原體包括但不限于瘧原蟲(chóng)屬(Plasmodium spp.)，例如惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)；錐蟲(chóng)屬(Trypanosome spp.)，例如克氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)；賈第蟲(chóng)屬(Giardia spp.)，例如腸賈第蟲(chóng)(Giardia intestinalis)；牛蜱屬(Boophilus spp.)；巴倍蟲(chóng)屬(Babesia spp.)，例如田鼠巴倍蟲(chóng)(Babesiamicroti)；內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba spp.)，例如溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)；艾美蟲(chóng)屬(Eimeria spp.)，例如巨型艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria maxima)；利什曼原蟲(chóng)屬(Leishmania spp.)；血吸蟲(chóng)屬(Schistosome spp.)；Brugia屬(Brugia spp.)；Fascida屬(Fascidaspp.)；惡絲蟲(chóng)屬(Dirofilaria spp.)；吳策絲蟲(chóng)屬(Wuchereria spp.)；以及盤(pán)尾絲蟲(chóng)屬(Onchocerea spp.)。
寄生病原體的保護(hù)性抗原的例子包括瘧原蟲(chóng)屬的環(huán)子孢子蛋白(CS)或肝期特異性(LSA)抗原LSA-I和LSA-3，例如P.bergerii或惡性瘧原蟲(chóng)的那些或其免疫原性突變體；瘧原蟲(chóng)屬的裂殖子表面抗原、溶組織內(nèi)阿米巴的半乳糖特異性凝集素、利什曼原蟲(chóng)屬的gp63、碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)的gp46、Brugia malayi的副肌球蛋白、曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni)的丙糖磷酸異構(gòu)酶、蛇形毛圓線蟲(chóng)(Trichostrongylus colubriformis)的分泌的球蛋白樣蛋白、Frasciola hepatica、牛血吸蟲(chóng)(Schistosoma bovis)和日本血吸蟲(chóng)(S.japonicum)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶以及牛血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)的KLH。
如上所述，包含編碼ALV或ALV樣蛋白酶的核酸的重組病毒載體可編碼宿主抗原，其可以是任何細(xì)胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑、或治療劑或其部分，其可在受體細(xì)胞中表達(dá)，其包括但不限于腫瘤、移植物、和自身免疫抗原或者腫瘤、移植物、自身免疫抗原的片段和衍生物。因此，在本發(fā)明中，病毒載體可以編碼腫瘤、移植物或自身免疫抗原，或者其部分或衍生物?；蛘?，病毒載體可以編碼合成基因(如上所述制備)，所述合成基因編碼腫瘤特異的移植物或自身免疫抗原或其部分。這種抗原的實(shí)例包括但不限于前列腺特異抗原、MUC1、gp100、HER2、TAG-72、CEA、MAGE-1、酪氨酸酶、CD3以及IASβ鏈。
具體地，通過(guò)在單一多蛋白中導(dǎo)入多個(gè)多肽并在需要這些多個(gè)(分離)多肽的宿主中將該多蛋白加工成分離的多肽，本文公開(kāi)的ALV蛋白酶位點(diǎn)技術(shù)也可用于基因治療應(yīng)用。
作為進(jìn)一步增強(qiáng)病毒載體免疫原性的手段，編碼至少一個(gè)抗原和佐劑的表達(dá)盒被構(gòu)建，其能用于增強(qiáng)對(duì)所述病毒載體表達(dá)抗原的宿主應(yīng)答。該佐劑在本文中也稱(chēng)作“遺傳佐劑”，因?yàn)榛蚓幋a用作佐劑的蛋白。優(yōu)選的應(yīng)用如上所述應(yīng)用蛋白酶和連接蛋白酶位點(diǎn)，在翻譯后將抗原從佐劑切開(kāi)，盡管在某些實(shí)施方案中，佐劑也可直接與抗原連接。
病毒載體編碼的特定佐劑可以選自廣泛的遺傳佐劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，佐劑是霍亂毒素A亞基(CtxA；實(shí)例GenBank accessionno.X00171、AF175708、D30053、D30052)，或其功能部分和/或功能突變衍生物，例如Ctx的A亞基的A1結(jié)構(gòu)域(CtxAl；GenBankaccession no.K02679)?；蛘?，任何細(xì)菌腺苷二磷酸核糖外毒素家族成員的細(xì)菌毒素都可以使用。非限制性的實(shí)例是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素A亞基(EltA)和百日咳毒素S1亞基。其它的實(shí)例是腺苷酸環(huán)化酶-溶血素，例如百日咳博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)或副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)cyaA基因?；蛘?，特定的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是霍亂毒素A亞基(即CtxA)的任何衍生物或其部分(即Ctx A亞基的A1結(jié)構(gòu)域(即CtxAl))，所述霍亂毒素來(lái)源于任何經(jīng)典霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株(例如菌株395)或E1-Tor霍亂弧菌(例如菌株2125)，所述E1-Tor霍亂弧菌顯示出降低的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶催化活性但仍保留了結(jié)構(gòu)完整性，包括但不限于第7位的精氨酸被賴氨酸取代(R7K)、41位的絲氨酸被苯丙氨酸取代(S41F)、61位的絲氨酸被賴氨酸取代(S61K)、63位的絲氨酸被賴氨酸取代(S63K)、53位的纈氨酸被天冬氨酸取代(V53D)、97位的纈氨酸被賴氨酸取代(V97K)或104位的酪氨酸被賴氨酸取代(Y104K)或者其組合?；蛘?，特定的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是任何完全類(lèi)似的霍亂毒素的衍生物，但由于分別在催化位點(diǎn)或臨近催化位點(diǎn)的突變所致而已經(jīng)是無(wú)毒的蛋白。這樣的突變體可以通過(guò)下文所述的常規(guī)定點(diǎn)誘變方法制備。
在另一實(shí)施方案中，ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素是分離自任何腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素的A亞基(LtxA)的任何衍生物，所述腸產(chǎn)毒性大腸桿菌包括但不限于大腸桿菌菌株H10407，其顯示出降低的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶催化活性但仍保留了結(jié)構(gòu)完整性，包括但不限于R7K、S41F、S61K、S63K、V53D、V97K或Y104K或其組合?；蛘?，特定的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是任何完全類(lèi)似的霍亂毒素衍生物，所述衍生物由于在催化位點(diǎn)或臨近催化位點(diǎn)的突變而無(wú)毒。這樣的突變體可以通過(guò)下文所述的常規(guī)定點(diǎn)誘變方法制備。
雖然ADP-核糖基化毒素是有效的佐劑，但本發(fā)明的病毒載體編碼的佐劑也可以是來(lái)自病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物生物體的任何生物活性蛋白、免疫調(diào)節(jié)DNA、雙鏈RNA或小抑制RNA(本文稱(chēng)為siRNA)。特定的生物活性蛋白可以選自但不限于下列第1類(lèi).該類(lèi)佐劑通過(guò)抑制Rho——宿主小GTPase而誘導(dǎo)凋亡。抑制Rho已經(jīng)清楚與誘導(dǎo)凋亡相關(guān)。誘導(dǎo)凋亡是驅(qū)使旁觀者T細(xì)胞應(yīng)答的有用方法，也是誘導(dǎo)CTL的有效方法。至今，該策略還沒(méi)有在任何實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中被評(píng)估。SopE活性結(jié)構(gòu)域包含在氨基酸78-240中，它僅需要486bp基因用于表達(dá)。大腸桿菌CNF-1的催化結(jié)構(gòu)域可能有類(lèi)似特性。第2類(lèi).細(xì)菌膜孔蛋白已經(jīng)顯示出具有免疫調(diào)節(jié)活性。這些疏水同源三聚體蛋白形成允許Mr＜600Da分子通過(guò)膜的孔。膜孔蛋白的實(shí)例包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的OmpF、OmpC和OmpD蛋白。第3類(lèi).雙鏈RNA(dsRNA)激活宿主細(xì)胞，包括樹(shù)突狀細(xì)胞。編碼由內(nèi)含子或核酶所間隔的反向重復(fù)序列的mRNA的表達(dá)導(dǎo)致dsRNA的表達(dá)。第4類(lèi).肽基序(motive)[WYF]xx[QD]xx[WYF]已知可誘導(dǎo)CDld-限制性NK T細(xì)胞應(yīng)答(Kronenberg和Gapin，2002)。具有該基序融合到T4 fibritin卷曲一卷曲基序的肽的表達(dá)可產(chǎn)生三聚體肽，其將在CDld-限制性T細(xì)胞上交聯(lián)TCR，從而激活先天宿主應(yīng)答。第5類(lèi).siRNA可用于靶向宿主mRNA分子，抑制免疫應(yīng)答(例如kir)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答(例如B7.2)或阻止交叉呈遞(例如Rho)。第6類(lèi).SiRNA’s能用于靶向共刺激分子例如CD80和CD86的疫苗。抑制這些分子將阻止共刺激，從而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性。
驚奇地，如本文公開(kāi)的，已發(fā)現(xiàn)TB致病菌抗原例如TB10.4蛋白不僅本身能用作抗原，而且甚至能用作其它TB抗原例如Ag85A的佐劑在存在三聯(lián)插入片段的情況中(Ag85A-Ag85B-TB10.4)，驚奇地發(fā)現(xiàn)構(gòu)建體中TB10.4的存在刺激了針對(duì)Ag85A的免疫應(yīng)答，而TB10.4的缺失顯示出針對(duì)CD8+脾細(xì)胞的弱作用(參見(jiàn)實(shí)施例4和圖13B)。進(jìn)一步研究TB10.4佐劑效應(yīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)存在于三聯(lián)構(gòu)建體中時(shí)，TB10.4實(shí)際刺激了針對(duì)Ag85A的CD8細(xì)胞的活化，而各個(gè)編碼獨(dú)立抗原的獨(dú)立載體的感染沒(méi)有導(dǎo)致這種刺激，這強(qiáng)烈提示TB10.4抗原應(yīng)該存在于同一載體中或者存在于同一翻譯產(chǎn)物中。
本發(fā)明還涉及編碼通過(guò)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)融合的至少一個(gè)抗原和細(xì)胞因子的病毒載體。這種載體用于增加對(duì)所述病毒載體表達(dá)的裝載抗原的宿主應(yīng)答。病毒載體編碼的細(xì)胞因子的實(shí)例是白介素-4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、TGFβ和TNFα。
導(dǎo)入功能性表達(dá)盒以產(chǎn)生在真核細(xì)胞或組織中能表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑的病毒載體的重組DNA和RNA方法是本領(lǐng)域已知的。
本文描述了用于構(gòu)建表達(dá)多于一個(gè)的抗原的病毒載體的組合物和方法，所述抗原來(lái)自TB致病菌，優(yōu)選結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。優(yōu)選地，病毒載體是復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體。一個(gè)深入研究和經(jīng)常應(yīng)用的腺病毒血清型是腺病毒5(Ad5)。在小鼠和恒河猴研究中，抗Ad5免疫的存在顯示基本抑制了基于Ad5的疫苗的免疫原性。I期臨床實(shí)驗(yàn)的早期數(shù)據(jù)顯示該問(wèn)題也發(fā)生在人類(lèi)中。
為避開(kāi)先前感染了最常見(jiàn)的人腺病毒(例如Ad5)的個(gè)體中已存在免疫性的問(wèn)題，一個(gè)有前景的策略涉及開(kāi)發(fā)來(lái)自不會(huì)面臨這種已存在免疫性的腺病毒血清型的重組載體。被鑒定為特別有用的人腺病毒載體是基于血清型11、26、34、35、48、49和50，如WO 00/70071、WO 02/40665和WO 2004/037294所示(也參見(jiàn)Vogels et al.2003)。其他人發(fā)現(xiàn)腺病毒24(Ad24)也是特別有利的，因?yàn)樗境鍪窍∮醒逍?WO 2004/083418)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒載體是衍生自選自下組的血清型的腺病毒Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。這種選擇人腺病毒作為疫苗載體的優(yōu)點(diǎn)具體地在于人通常不會(huì)感染這些野生型腺病毒。因此，抗這些血清型的中和抗體在人群中大體上很少見(jiàn)。這與血清型5不同，因?yàn)槿私?jīng)常感染這種野生型血清型。當(dāng)用作隨后的重組疫苗載體時(shí)，例如一種利用腺病毒的抗瘧疾疫苗，親本野生型血清型感染過(guò)程中所引起的免疫應(yīng)答可對(duì)重組腺病毒血清型的效力產(chǎn)生負(fù)面影響。不同腺病毒血清型在世界范圍人群的傳播因地區(qū)不同而不同。通常，優(yōu)選的血清型在世界大多數(shù)地區(qū)的宿主中遇到低中和活性，如WO 00/70771所述。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒是猿猴、犬或牛腺病毒，因?yàn)檫@些病毒在給予重組病毒的(人類(lèi))宿主中不會(huì)遇到預(yù)先存在的免疫。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很好理解在人基因治療或疫苗中使用的猿猴腺病毒。此外，發(fā)現(xiàn)犬和牛腺病毒也可在體外感染人細(xì)胞，因此也可應(yīng)用于人類(lèi)。特別優(yōu)選的猿猴腺病毒是分離自黑猩猩的那些。合適的例子包括C68(也稱(chēng)為Pan 9；US 6,083,716)以及Pan 5、6和7(WO03/046124)；也參見(jiàn)WO 03/000851。
因此，在低比例需要免疫的人群中遇到中和活性的那些病毒影響重組載體的選擇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有多種。利用被認(rèn)為是安全的且能懸浮生長(zhǎng)至極高體積的細(xì)胞，并利用不含任何動(dòng)物或人來(lái)源成分的培養(yǎng)基，可以將重組病毒例如重組腺病毒生產(chǎn)至非常高的滴度。而且，已知重組腺病毒引發(fā)抗腺病毒基因組中異源核酸序列編碼的蛋白的強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明人意識(shí)到包含多抗原的疫苗將提供針對(duì)TB致病菌更強(qiáng)更廣泛的免疫應(yīng)答。此外，盡管單抗原本身也能在小鼠純系株中誘導(dǎo)保護(hù)，但是包含幾種抗原的混合物(cocktail)是令人信服的應(yīng)用于人類(lèi)的更好疫苗，因?yàn)樗苌倏赡軙?huì)在異源人群中遇到MHC相關(guān)的無(wú)應(yīng)答。
然而，從疫苗開(kāi)發(fā)的實(shí)踐立場(chǎng)來(lái)看，生產(chǎn)和配制由多個(gè)構(gòu)建體組成的疫苗是非常昂貴的。除了簡(jiǎn)化制備方法外，單一構(gòu)建體能保證抗原呈遞細(xì)胞對(duì)組分的等量吸收，由此產(chǎn)生廣泛特異性的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，復(fù)制缺陷型重組病毒載體包括編碼抗原決定簇的核酸序列，其中所述異源核酸序列是密碼子優(yōu)化的以提高在哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類(lèi)中的表達(dá)。密碼子優(yōu)化是基于需要的氨基酸含量、在感興趣的哺乳動(dòng)物中的常用優(yōu)化密碼子使用以及為確保正確表達(dá)應(yīng)該避免的諸多方面。這些方面可以是剪接供體或受體位點(diǎn)、終止密碼子、Chi-位點(diǎn)、poly(A)延伸序列、GC-和AT-富含序列、內(nèi)部TATA盒等等。哺乳動(dòng)物宿主的密碼子優(yōu)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可以在多處分子生物學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，其中所述異源核酸中腺嘌呤加胸腺嘧啶的含量與胞嘧啶加鳥(niǎo)嘌呤含量相比少于87％、優(yōu)選少于80％、更優(yōu)選少于59％及最優(yōu)選等于約45％。
攜帶異源基因的重組腺病毒載體的生產(chǎn)是本領(lǐng)域熟知的，典型地涉及利用包裝細(xì)胞系、連接物構(gòu)建體(adapter construct)和粘粒以及從腺病毒基因組的E1區(qū)缺失至少一個(gè)功能性部分(還可參見(jiàn)下文包裝系統(tǒng)和優(yōu)選的細(xì)胞系)。
本發(fā)明的疫苗典型容納在藥學(xué)可接受的載體或賦形劑中。藥學(xué)可接受的載體或賦形劑是本領(lǐng)域熟知的，并廣泛用于眾多的治療產(chǎn)品中。優(yōu)選地，應(yīng)用在疫苗中效果好的載體。更優(yōu)選地，疫苗進(jìn)一步包含佐劑。本領(lǐng)域已知佐劑可進(jìn)一步增強(qiáng)針對(duì)所應(yīng)用的抗原決定簇的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的試劑盒在治療、預(yù)防或診斷治療TB中的應(yīng)用。
本發(fā)明的包含TB抗原的重組病毒載體可用于疫苗接種方案，其中其與BCG組合使用。它們還可以用作引發(fā)劑或加強(qiáng)劑，分別在BCG接種之前或之后增加所需的免疫應(yīng)答。也可以預(yù)見(jiàn)，本文公開(kāi)的不同病毒載體可用于引發(fā)-加強(qiáng)方案中，其中一個(gè)載體在另一個(gè)之后。此外，包含直接連接的抗原的載體可以與包含由蛋白酶位點(diǎn)連接的抗原的載體如此組合。也可以預(yù)見(jiàn)引發(fā)-加強(qiáng)方案用一種腺病毒血清型作為引發(fā)劑，而用另一血清型用作加強(qiáng)劑(選自優(yōu)選的人、猿猴、犬或牛腺病毒)。本發(fā)明的病毒載體也可與包含純化(重組生產(chǎn)的)抗原的疫苗和/或包含編碼類(lèi)似或相同抗原的裸DNA或RNA的疫苗組合使用。
因此，本發(fā)明涉及包含編碼來(lái)自至少一種結(jié)核(TB)致病菌的兩種或多種抗原的核酸序列的重組復(fù)制缺陷型腺病毒?？梢岳斫猓嚯目梢园瑤讉€(gè)抗原部分或抗原片段(＝抗原)。而且，蛋白本身也可以被認(rèn)為是“抗原”。優(yōu)選地，所述重組腺病毒是人或猿猴腺病毒。更優(yōu)選地，用作本發(fā)明重組載體的腺病毒選自下組人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。提供優(yōu)選抗原的TB致病菌優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌，所述兩個(gè)或多個(gè)抗原優(yōu)選選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A、Ag85B、ESAT-6、f72和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原所組成的組中。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列編碼至少兩種抗原，所述抗原選自由結(jié)核分枝桿菌Ag85A、Ag85B和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原所組成的組中。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒包括編碼全長(zhǎng)蛋白Ag85A、Ag85B和TB10.4的核酸序列，其中更優(yōu)選這三種蛋白由包含下列序列的核酸所編碼，其中在所述序列中編碼各個(gè)蛋白的基因以5’至3’的順序克隆(Ag85A-Ag85B-TB10.4)。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒，其中至少兩種所述抗原表達(dá)自一個(gè)多蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少兩種所述抗原連接以形成融合蛋白。連接可以直接連接或通過(guò)至少一個(gè)氨基酸的連接接頭連接。當(dāng)接頭用于連接兩個(gè)獨(dú)立抗原以提供本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)抗原的融合蛋白時(shí)，優(yōu)選使用SEQ ID NO23的一個(gè)或多個(gè)接頭。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的重組腺病毒或本發(fā)明的重組多核苷酸載體的多價(jià)TB疫苗，其進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，任選擇地包括佐劑。許多藥學(xué)上可接受的賦形劑和佐劑是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及免疫哺乳動(dòng)物以預(yù)防或治療TB的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物本發(fā)明的重組腺病毒、多價(jià)TB疫苗或重組多核苷酸載體。一方面，本發(fā)明涉及免疫哺乳動(dòng)物以預(yù)防或治療TB的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物本發(fā)明的重組腺病毒、多價(jià)TB疫苗或重組多核苷酸載體用作引發(fā)免疫的步驟；以及給予所述哺乳動(dòng)物本發(fā)明的重組腺病毒、多價(jià)TB疫苗或重組多核苷酸載體用作加強(qiáng)免疫的步驟。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的重組腺病毒、多價(jià)TB疫苗或重組多核苷酸載體，它們其中一種用作藥物，優(yōu)選在結(jié)核預(yù)防、治療或診斷治療中應(yīng)用。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的重組腺病毒、多價(jià)TB疫苗或重組多核苷酸載體在制備預(yù)防或治療結(jié)核的藥物中的應(yīng)用。
在一個(gè)特定方面，本發(fā)明涉及包含編碼兩個(gè)或多個(gè)抗原及蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列的重組多核苷酸載體，其中所述抗原被表達(dá)為多蛋白，所述多蛋白包括分隔所述兩個(gè)或多個(gè)抗原中至少兩個(gè)抗原的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述多核苷酸載體是裸DNA載體、裸RNA載體、質(zhì)粒載體或病毒載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病毒載體包裝至復(fù)制缺陷型人或猿猴腺病毒中。可以理解，病毒載體可認(rèn)為是兩種實(shí)體編碼病毒的病毒DNA可用作核酸載體，而通過(guò)感染宿主細(xì)胞，病毒(包含病毒載體DNA)也可用于轉(zhuǎn)移感興趣的核酸至宿主細(xì)胞。因此，本文所用的“載體”是指轉(zhuǎn)移感興趣的基因或感興趣的多個(gè)基因至宿主的手段。其可以通過(guò)直接注射DNA、RNA、質(zhì)?；虿《竞怂彷d體實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)用重組病毒(此時(shí)其用作載體)感染宿主細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。如本文所示，病毒可用于免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠)，而DNA(例如以攜帶感興趣的基因和病毒DNA一部分的連接物質(zhì)粒(adapter plasmid)的形式)也可直接注射于哺乳動(dòng)物而免疫所述哺乳動(dòng)物?；诼鉊NA、RNA或質(zhì)粒的疫苗是本領(lǐng)域已知的，而基于重組病毒的疫苗也是已知的。為清楚起見(jiàn)，所有輸送感興趣的基因或感興趣的多個(gè)基因至宿主細(xì)胞的實(shí)體都被認(rèn)為是“載體”。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體中的核酸包括編碼蛋白酶的序列，其中優(yōu)選所述蛋白酶在表達(dá)時(shí)表達(dá)為多蛋白的一部分，并通過(guò)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)與至少一個(gè)所述抗原連接。特別地，優(yōu)選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO21或22所示序列。更優(yōu)選的是本發(fā)明的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶來(lái)自禽類(lèi)白血病病毒(ALV)。優(yōu)選地，通過(guò)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接的抗原來(lái)自于至少一種結(jié)核(TB)致病菌，其中所述TB致病菌優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。兩種或多種抗原優(yōu)選選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A、Ag85B、ESAT-6和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原所組成的組，其中最優(yōu)選所述異源核酸序列編碼選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A，Ag85B和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原所組成組的至少兩種抗原。更優(yōu)選的是本發(fā)明的多核苷酸，其中抗原是全長(zhǎng)Ag85A、Ag85B和TB10.4多肽，其所述編碼基因以5’至3’順序克隆。基于這些和其它結(jié)核抗原的融合蛋白在US 5,916,558、WO 01/24820、WO 03/070187和WO 2005/061534中描述。然而，編碼本文所公開(kāi)的融合蛋白的本發(fā)明核酸用于整合入重組腺病毒載體的用途沒(méi)有公開(kāi)。
另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼抗原和遺傳佐劑異源核酸序列的重組多核苷酸載體。術(shù)語(yǔ)“遺傳佐劑”指核酸序列編碼的蛋白質(zhì)分子(proteinaceous molecule)。所述抗原和所述遺傳佐劑可直接連接或者在另一實(shí)施方案中間接連接，例如通過(guò)包含第一蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行連接。在另一優(yōu)選方面，所述多核苷酸載體是裸DNA載體、裸RNA載體、質(zhì)粒載體或病毒載體。病毒載體優(yōu)選包裝至復(fù)制缺陷型人或猿猴腺病毒，其中所述腺病毒更優(yōu)選的選自由人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所組成的組。也優(yōu)選包括編碼蛋白酶的序列的核酸，其中所述蛋白酶優(yōu)選通過(guò)第二蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接于所述抗原和/或所述遺傳佐劑。優(yōu)選的第二蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO22所示序列，而優(yōu)選的第一蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO21所示序列。優(yōu)選的蛋白酶是來(lái)自禽類(lèi)白血病病毒(ALV)的蛋白酶，而抗原優(yōu)選來(lái)自至少一種結(jié)核(TB)致病菌，更優(yōu)選來(lái)自結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。優(yōu)選的抗原選自下組Ag85A、Ag85B、ESAT-6和TB10.4。最優(yōu)選的實(shí)施方案是下述載體，其中所述異源核酸序列編碼選自由結(jié)核分枝桿菌的抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4所組成組的至少兩種抗原，其中進(jìn)一步優(yōu)選含有下述融合多肽，所述融合多肽按N至C末端的順序包含全長(zhǎng)Ag85A、Ag85B和TB10.4蛋白。
如本文所公開(kāi)的，TB10.4有預(yù)想不到的佐劑活性，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其可刺激針對(duì)多蛋白中存在的其它抗原(特別是Ag85A)的免疫應(yīng)答。TB10.4佐劑是優(yōu)選的遺傳佐劑。因此，本發(fā)明也提供了包含編碼TB10.4抗原與至少一種其它抗原的核酸的重組載體，其中抗原優(yōu)選是結(jié)核抗原，更優(yōu)選Ag85A抗原。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括編碼TB10.4抗原和至少Ag85A和Ag85B抗原的核酸。如下所概括，TB10.4被認(rèn)為可增加多抗原翻譯產(chǎn)物至蛋白體的加工，從而致使CD8應(yīng)答顯著增加。很可能該效應(yīng)并不僅僅限于Ag85A和TB10.4，TB10.4抗原不只局限于結(jié)核疫苗，而有更廣泛的應(yīng)用。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及包含編碼TB10.4和至少一種其它抗原的核酸的重組載體，其中其它抗原不是分枝桿菌(Mycobacterium)抗原。本發(fā)明公開(kāi)了分枝桿菌TB10.4抗原用作遺傳佐劑的用途。此外，本發(fā)明公開(kāi)了TB10.4抗原在制備用于治療、診斷和/或預(yù)防除結(jié)核之外疾病的藥物中的應(yīng)用，并且至少在該疾病中針對(duì)感興趣的抗原的免疫應(yīng)答需要佐劑作用的刺激。因此，本發(fā)明公開(kāi)了結(jié)核分枝桿菌TB10.4中的抗原能用作其它抗原例如Ag85A的佐劑。因此，本發(fā)明也涉及應(yīng)用分枝桿菌抗原TB10.4作為遺傳佐劑。此外，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分枝桿菌抗原TB10.4在制備用于治療或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，其中宿主對(duì)某抗原或感興趣的治療組分的免疫應(yīng)答需要被刺激。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定針對(duì)給定感興趣抗原的免疫應(yīng)答水平，以及通過(guò)利用例如本文通過(guò)TB10.4所示的遺傳佐劑的佐劑的額外刺激是否對(duì)治療對(duì)象有益。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的重組多核苷酸載體，其中所述遺傳佐劑包括霍亂毒素(CtxAl)或其突變衍生物，所述突變衍生物包括63位氨基酸絲氨酸被賴氨酸所取代(A1K63)。本發(fā)明也涉及多價(jià)TB疫苗，所述疫苗包括本發(fā)明的重組多核苷酸載體，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，任選地包括佐劑。
實(shí)施例實(shí)施例1.構(gòu)建攜帶結(jié)核分枝桿菌抗原的基于Ad35的連接物質(zhì)粒在此記載了適合產(chǎn)生能夠表達(dá)單個(gè)或多個(gè)TB抗原的E1缺失的、基于Ad35載體的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建。例子涉及TB抗原Ag85A(Swissprot#P17944)、Ag85B(Swissprot#P31952)和TB10.4(Swissprot#O53693)作為利用基于腺病毒復(fù)制缺陷型載體產(chǎn)生單抗原和多抗原疫苗制品的非限制性實(shí)例的手段方法。如上所述，本文應(yīng)用的原理也可應(yīng)用于任何預(yù)防或治療多肽的組合。
構(gòu)建pAdApt35Bsu.mycpAdApt35Bsu連接物質(zhì)粒記載在申請(qǐng)人的申請(qǐng)WO 2004/001032中。該質(zhì)粒含有Ad35基因組的左側(cè)部分(包括左側(cè)反向末端重復(fù)(ITR))，進(jìn)一步缺失功能性E1區(qū)和包含插入至E1區(qū)的CMV啟動(dòng)子表達(dá)盒。該連接物也包括功能性pIX啟動(dòng)子和E1區(qū)下游的Ad35區(qū)域，該區(qū)域足夠與包含Ad35基因組剩余部分的粘粒發(fā)生同源重組，從而導(dǎo)致在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生重組復(fù)制缺陷型腺病毒，所述包裝細(xì)胞提供用于功能性復(fù)制及包裝產(chǎn)生的病毒的所有必要元件和功能。利用這種連接物質(zhì)粒產(chǎn)生重組腺病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。
pAdApt35Bsu用NheI和XbaI消化，按商品使用說(shuō)明用Qiaquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離含5kb載體的片段。雙鏈(ds)接頭從下列單鏈(ss)寡核苷酸制備(Sigma合成)Myc-oligo15′-CTA GCA AGA AAA CCG AGC AGA AGC TGA TCT CCG AGGAGG ACC TGT GAT AAT-3′(SEQ ID NO1)和Myc-oligo25′-CTAGAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG GAG ATC AGC TTC TGC TCGGTT TTC TTG-3′(SEQ ID NO2)。將兩個(gè)寡核苷酸用2μl的0.5μg/μl的貯存液混合于總體積20μl的退火緩沖液中(10mM Tris-HCl pH7.9，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇)，之后用PCR儀98℃溫育2min，接著以0.6℃/min速率冷卻至4℃。接著，將所得ds接頭與上述制備的pAdApt35Bsu載體在3×、6×、9×摩爾過(guò)量于接頭下連接。用NheI或XbaI消化檢測(cè)菌落的接頭序列的插入是否是正確的方向，這些位點(diǎn)只有方向正確時(shí)才能恢復(fù)。測(cè)序證實(shí)接頭由期望的序列組成。所得連接物質(zhì)粒命名為pAdApt35Bsu.myc(圖1)。
以下，提供了克隆多組不同構(gòu)建體的方法。所有構(gòu)建體及其相應(yīng)的插入片段綜述于表I。
表I.包括編碼TB抗原的核酸的構(gòu)建體名稱(chēng)及其相應(yīng)的插入片段。ALV＝禽類(lèi)白血病病毒蛋白酶；dig*＝細(xì)胞蛋白酶識(shí)別的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)；dig＝ALV蛋白酶識(shí)別的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)；X＝非蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的活動(dòng)接頭；myc＝myc-標(biāo)記
含有三種TB抗原的基于pAdApt35Bsu的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明的異源核酸以來(lái)自一個(gè)mRNA的多蛋白編碼三種結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4。所有標(biāo)示有′M′的融合序列含有myc表位(myc-標(biāo)記SKKTEQKLISEEDL；SEQ ID NO9)連接于序列的3’端，以允許在獨(dú)立的TB抗原特異性抗體不能正確識(shí)別融合體的情況下用myc特異性抗體來(lái)分析表達(dá)。因此，下文記載的所有構(gòu)建體命名中的′M′都與myc-標(biāo)記相關(guān)，而也制備了無(wú)myc-標(biāo)記的所有構(gòu)建體。
在第一實(shí)施方案中(TB-SM)，三種抗原以直接融合多蛋白表達(dá)Ag85A-Ag85B-TB10.4-myc(TB-S＝Ag85A-Ag85B-TB10.4)。
在第二實(shí)施方案中(TB-LM)，多蛋白前體含有蛋白酶，其在整合的消化位點(diǎn)處胞內(nèi)切割由所述消化位點(diǎn)分隔的三種抗原接頭/消化位點(diǎn)序列PPSKSKKGGAAAMSSAIQPLVMAVVNRERDGQTG(SEQ ID NO21)。該消化通過(guò)融合于融合蛋白N末端的序列特異性蛋白酶進(jìn)行。來(lái)自禽類(lèi)白血病病毒(ALV)的gag基因的這種蛋白酶也被酶切，蛋白酶消化后產(chǎn)生四個(gè)分離的蛋白。該多蛋白如下ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4-myc(其中′dig*′表示分隔蛋白酶與抗原的蛋白酶消化位點(diǎn)[GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV；SEQ ID NO22]，而′dig′表示抗原間的消化位點(diǎn)，參見(jiàn)上文；TB-L＝ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)。蛋白酶切割接頭和自切割接頭都可以用于本發(fā)明的載體中并包含在本文中。自加工切割位點(diǎn)的應(yīng)用在WO 2005/017149中有記載。
在第三實(shí)施方案中，多蛋白(TB-FLM)包括未被切割(如上述第二實(shí)施方案)的接頭序列分隔的上述結(jié)核分枝桿菌抗原，但允許三種抗原每一種正確獨(dú)立折疊Ag85A-X-Ag85B-X-TB10.4-myc(其中′X′表示柔性接頭GTGGSGGTGSGTGGSV；SEQ ID NO23)。用類(lèi)似構(gòu)建方法也制備了不帶myc-標(biāo)記的所有這些融合蛋白(分別指TB-S、TB-L和TB-FL)(參見(jiàn)下文)。
用上文公開(kāi)的結(jié)核分枝桿菌抗原的蛋白序列、Genbank公開(kāi)的ALV蛋白酶PR p15序列(Acc.No.CAA86524)和Genbank Acc.No.AAK13202氨基酸476-500所公開(kāi)的蛋白酶消化位點(diǎn)組裝所需的蛋白序列。接著，將這三種蛋白序列逆翻譯為優(yōu)化用于在人中表達(dá)的DNA編碼序列，然后合成、組裝并克隆至Geneart(Germany)的pCR-Script載體中。
提供了經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的TB-LM(Fig.19；SEQ ID NO3)、TB-SM(Fig.20；SEQ ID NO4)和TB-FLM(Fig.21；SEQ ID NO5)的DNA序列以及TB-LM(Fig.22；SEQ ID NO6)、TB-SM(Fig.23；SEQ ID NO7)和TB-FLM(Fig.24；SEQ ID NO8)的蛋白序列。myc表位包含于每個(gè)融合蛋白的C-末端序列SKKTEQKLISEEDL(SEQ ID NO9)中，該序列在TB-S、TB-L和TB-FL中分別不存在。
接著將克隆的融合基因用HindIII、XbaI和ApaLI消化，之后將2.7kb(TB-L)、2.2kb(TB-FL)和2.1kb(TB-S)片段從如上從瓊脂糖凝膠中分離。ApaLI消化可將質(zhì)粒載體切為片段以便更好與插入片段分離。將質(zhì)粒pAdApt35Bsu也用HindIII和XbaI消化，含載體片段如上述從凝膠中分離。分離的pAdApt35Bsu載體與各個(gè)含TB序列的分離片段在獨(dú)立的反應(yīng)中相連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌中(Invitrogen)。所得菌落用HindIII和XbaI消化分析，選擇含預(yù)期插入片段的質(zhì)粒克隆。獲得pAdApt35Bsu.TB.LM(圖2)、pAdApt35Bsu.TB.SM(圖3)和pAdApt35Bsu.TB.FLM(圖4)，所有克隆都含有myc-標(biāo)記。為產(chǎn)生表達(dá)無(wú)myc-標(biāo)記的融合基因的連接物質(zhì)粒，將插入片段先用下列引物和模板PCR擴(kuò)增片段TB-LALVprot.FW5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GCT GGC CAT GACCAT GG-3′(SEQ ID NO10)和10.4.RE.stop5′-GCT AGT CTA GATTAT CAG CCG CCC CAC TTG GC-3′(SEQ ID NO11)，以TB-LM作模板。
片段TB-FL和TB-S85A.F W5′-GCC CAA GCT TGC CAC CATGTTCAG C-3′(SEQ IDNO12)和10.4.RE.stop，以TB-FLM或TB-SM作模板。
按制造商使用說(shuō)明，用Phusion DNA聚合酶(Bioke)進(jìn)行擴(kuò)增。使用下列程序98℃2分鐘，接著30個(gè)循環(huán)(98℃20秒，58℃30秒和72℃2分30秒)，72℃10分鐘結(jié)束。所得片段用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化，用HindIII和XbaI消化。接著將消化片段如上述通過(guò)Qiaquick PCR純化柱純化，并與用相同酶消化且通過(guò)Qiaquick PCR純化柱純化的pAdApt35Bsu連接。轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌(Invitrogen)，用HindIII和XbaI作診斷酶選擇含正確插入片段的克隆，得到pAdApt35Bsu.TB-L、pAdApt35Bsu.TB-S和pAdApt35Bsu.TB-FL。這些構(gòu)建體不同于圖2、3和4提供的構(gòu)建體，因?yàn)檫@些構(gòu)建體在C末端不含myc表位。
含有兩種TB抗原的基于pAdApt35Bsu的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建使用Ag85A和Ag85B作為例子，本文還記載了含有兩種TB抗原的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，用本文概述的一般策略也可以制備其它組合和不同順序的結(jié)核分枝桿菌抗原。此處記載的融合體是TB-3MALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-myc和TB-4MAg85A-Ag85B-myc，以及沒(méi)有myc標(biāo)記的相同構(gòu)建體。設(shè)計(jì)特異性引物以從上述TB-LM和TB-SM融合蛋白擴(kuò)增Ag85A和Ag85B序列(參見(jiàn)下文)。產(chǎn)生如上有和沒(méi)有myc標(biāo)記的融合體(分別為T(mén)B-3和TB-4)。為此，使用不同的引物組及模板。
片段TB.3MALVprot.FW和85B.RE myc5′-GCC TAG CTA GCG CCG GCT CCCAGG CTG C-3′(SEQ ID NO13)，以TB-LM為模板。
片段TB.4M85A.FW.TB.L5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CAGACC CGG CCT G-3′(SEQ ID NO14)和85B.RE myc(參見(jiàn)上文)，以TB-SM為模板。
所有反應(yīng)按上文記載的條件用Phusion(Bioke)DNA聚合酶進(jìn)行。將PCR片段用Qiaquick PCR純化試劑盒純化，用HindIII和NheI消化，再用PCR純化試劑盒純化。然后將擴(kuò)增片段連接于用相同酶消化的pAdApt35Bsu.myc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α菌(Invitrogen)后，篩選含正確長(zhǎng)度的插入片段的克隆。獲得構(gòu)建體pAdApt35Bsu.TB.3M(圖5)和pAdApt35Bsu.TB.4M(圖6)。
用相同的上述用于片段TB.3M和TB.4M的正向引物和模板但用不同的反向引物85B.RE.stop5′-GCT AGT CTA GAT TAT CAG CCGGCT CCC AGG CTG C-3′(SEQ ID NO15)產(chǎn)生片段TB.3和TB.4。將擴(kuò)增片段如上述純化，用HindIII和XbaI消化，如其中記載的再次純化，并用HindIII和XbaI作為克隆位點(diǎn)克隆至pAdApt35Bsu。這樣就得到了僅不同于圖5和圖6的構(gòu)建體的pAdApt35Bsu.TB.3和pAdApt35Bsu.TB.4，因?yàn)樗鼈冊(cè)贑末端不含myc-表位。
本文有用但沒(méi)有詳細(xì)記載克隆過(guò)程的其它組合是ALV-dig*-Ag85B-dig-Ag85A-mycALV-dig*-Ag85A-dig-TB10.4-dig-Ag85B-mycALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85A-dig-Ag85B-mycALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85B-dig-Ag85A-mycALV-dig*-Ag85B-dig-Ag85A-dig-TB10.4-mycALV-dig*-Ag85B-dig-TB10.4-dig-Ag85A-mycALV-dig*-Ag85A-dig-TB10.4-mycALV-dig*-Ag85B-dig-TB10.4-mycALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85A-mycALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85B-mycAg85B-Ag84A-mycAg85A-TB10.4-myc
Ag85B-TB10.4-mycTB10.4-Ag85A-mycTB10.4-Ag85B-mycAg85A-X-Ag85B-mycAg85B-X-Ag85A-mycAg85A-X-TB10.4-mycAg85B-X-TB10.4-mycTB10.4-X-Ag85A-mycTB10.4-X-Ag85B-mycAg85A-X-TB10.4-X-Ag85B-mycAg85B-X-Ag85A-X-TB10.4-mycAg85B-X-TB10.4-X-Ag85A-mycTB10.4-X-Ag85A-X-Ag85B-mycTB10.4-X-Ag85B-X-Ag85A-mycDig*、dig、myc以及X都如上述表示相同特征?？梢岳斫庖部梢援a(chǎn)生無(wú)myc-標(biāo)記的這些構(gòu)建體。
含單TB抗原的基于pAdApt35Bsu的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建本文也記載了含單TB抗原的Ad35連接物質(zhì)粒。如上所述，蛋白以含或不含myc-標(biāo)記表達(dá)。為此，用特異性引物組從TB-L和TB-S模板擴(kuò)增合適的編碼區(qū)片段TB.5M85A.FW.TB.L和85A.RE myc5′-GCC TAG CTA GCG CCC TGGGGG G-3′(SEQ ID NO16)，用TB-LM作模板。
片段TB.6M85B.FW5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CCG GCCTGG CCT G-3′(SEQ ID NO17)和85B.RE myc，用TB-LM作模板。
片段TB.7M10.4.FW5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GAG CCA GAT CATGTA CAA CTA CCC-3′(SEQ ID NO18)和10.4.RE myc5′-GCTAGT CTA GAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG-3′(SEQ ID NO19)，用TB-LM作模板。
用相同的正向引物但不同的反向引物85A.RE.stop(TB.5)5′-GCT AGT CTA GAT TAT CAG CCC TGG GGG GCA G-3′(SEQ IDNO20)、85B.RE.stop(TB.6)和10.4.RE.stop(TB.7)產(chǎn)生無(wú)myc-標(biāo)記的片段。所有反應(yīng)如上所述用Phusion(Bioke)進(jìn)行。所有擴(kuò)增片段用Qiaquick PCR純化試劑盒純化。接著TB-5M和TB-6M片段用HindIII和NheI消化，如上所述純化之后，克隆至用相同酶消化過(guò)的pAdApt35Bsu.myc。將片段TB-7M、TB-5、TB-6和TB-7用HindIII和XbaI消化。如上純化之后，將片段連接至用如上所示的限制性酶消化過(guò)的pAdApt35Bsu。這樣獲得了pAdApt35Bsu.TB.5M(圖7)、pAdApt35Bsu.TB.6M(圖8)、pAdApt35Bsu.TB.7M(圖9)、pAdApt35Bsu.TB.5、pAdApt35Bsu.TB.6和pAdApt35Bsu.TB.7。后三種與圖7、8和9中的不同僅在于C末端沒(méi)有myc-標(biāo)記。
實(shí)施例2.產(chǎn)生攜帶編碼TB抗原的核酸的復(fù)制缺陷型Ad35病毒產(chǎn)生攜帶異源表達(dá)盒的穩(wěn)定的復(fù)制缺陷型重組的基于Ad35的腺病毒載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且已經(jīng)記載在公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)WO 00/70071、WO 02/40665、WO 03/104467和WO 2004/001032中。本實(shí)施例記載了用PER.C6細(xì)胞和Ad35病毒產(chǎn)生基于Ad35的TB載體，所述Ad35病毒包含在Ad35骨架中取代了同源E4-Orf6和6/7序列的Ad5衍生的E4-Orf6和E4-Orf6/7基因(通常記載于WO03/104467和WO 2004/001032)。對(duì)本發(fā)明而言，PER.C6細(xì)胞是指作為專(zhuān)利保藏物以保藏號(hào)96022940于1996年2月29日保藏于位于Centre of Applied Microbiology & Research(CAMR)，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG United Kingdom的歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC)的細(xì)胞。
本文記載了產(chǎn)生的含有不同TB抗原的連接物質(zhì)粒用Pi-PspI消化以從質(zhì)粒骨架釋放Ad35序列和轉(zhuǎn)基因盒(連接物片段)。將構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-EcoRV(參見(jiàn)WO 03/104467和WO 2004/001032)用NotI和EcoRV消化(片段2)，將構(gòu)建體pBr.Ad35.AE3.PR5Orf6(參見(jiàn)WO 03/104467和WO 2004/001032)用PacI和NotI消化(片段3)。將消化的DNA混合物在65℃溫育使酶失活。對(duì)每一轉(zhuǎn)染，將消化的連接物片段(360ng)、片段2(1.4μg)和片段3(1μg)混合至(最大)體積15μl，然后用DMEM(培養(yǎng)基，Invitrogen)調(diào)整至25μl。通過(guò)混合14.4μl Lipofectamine(Invitrogen)與10.6μl DMEM制備第二混合物，之后將兩混合物加在一起，輕拍管混勻。然后，將所獲DNA-Lipofectamine混合物室溫溫育30-40分鐘，之后向管中加入4.5ml DMEM。前一天PER.C6細(xì)胞以1.5x106細(xì)胞/孔接種于含10％FBS(Invitrogen/GIBCO)和10 mM MgCl2的DMEM的6孔板中，溫育期間，用DMEM洗滌細(xì)胞。接著，在頭兩孔加入0.5ml DMEM和0.5ml溫育的轉(zhuǎn)染混合物。在第二個(gè)兩孔，加入0.25ml培養(yǎng)基和0.75ml轉(zhuǎn)染混合物。最后二孔，則接受1ml的轉(zhuǎn)染混合物。將6孔板接著在37℃、10％CO2下溫育4h之后，如下覆蓋瓊脂覆層。4h溫育期結(jié)束之前30分鐘，制備含9ml 2×MEM(Invitrogen)、0.36ml FBS、0.18ml的1M MgCl2和1.3ml PBS的混合物，于37℃放置。將無(wú)菌預(yù)制的2.5％瓊脂糖(Seaplaque；Cambrex)在H2O中融化，也保溫于37℃(使用前至少15分鐘)。然后從細(xì)胞中除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并用PBS洗一次。接著，將7.5ml瓊脂溶液加入MEM培養(yǎng)基混合物，混和，每孔迅速加入3ml。允許該覆層在氣流中凝結(jié)，之后將板于37℃/10％CO2溫育至少7天。在足夠大時(shí)，用帶無(wú)菌過(guò)濾頭(20μl)的移液管從具有最低數(shù)量斑的孔中挑取單斑。將各挑取的斑在200μl培養(yǎng)基中混合，100μl用于接種6孔板中的PER.C6細(xì)胞。于CPE和病毒在T25瓶中的PER.C6細(xì)胞中再擴(kuò)增一次之后，收獲細(xì)胞和培養(yǎng)基，然后凍融一次，作為粗裂解物儲(chǔ)存。這些病毒貯存物用于通過(guò)對(duì)分離的病毒DNA進(jìn)行PCR來(lái)確證正確轉(zhuǎn)基因的存在并檢測(cè)表達(dá)。接著，按本領(lǐng)域已知的方法，用兩步CsCl純化法，選擇一擴(kuò)增斑以產(chǎn)生病毒種原種并用于生產(chǎn)的批量純化病毒。純化病毒的濃度通常按Shabramet al.(1997)記載的HPLC確定。
實(shí)施例3.Ad35病毒載體感染時(shí)TB抗原表達(dá)分析融合的TB抗原的表達(dá)用western印跡確定。為此，A549細(xì)胞用不同的含有編碼TB抗原的基因的Ad35病毒感染。感染48h后，將細(xì)胞用PBS(NPBI)洗二次，在裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.5％DOC，1％Tween-20于dH2O中，添加1％SDS和以丸劑(Roche)加入的蛋白酶抑制劑)中裂解并刮擦。在冰上于裂解緩沖液中5-10分鐘后，收集裂解物，離心除去雜質(zhì)。將等量的全細(xì)胞提取物用4-12％Bis-Tris NuPAGEPre-Cast Gels(Invitrogen)分級(jí)分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至Immobilon-P膜(Millipore)與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物濾過(guò)蛋白(Culture Filtrate Protein)的多克隆抗體溫育。該多克隆血清是從抗含分泌蛋白的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物的兔中制備。原則上，多克隆血清含有抗Ag85A、Ag85B和TB10.4的抗體，所述抗原都是分泌蛋白。二抗是辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體(Biorad)。Western印跡方法和溫育按本領(lǐng)域已知的一般方法進(jìn)行。按制造商所提供方法，將復(fù)合物用ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham)檢測(cè)。
圖10A顯示了使用攜帶如上所述的包括myc表位的TB編碼核酸的Ad35病毒的結(jié)果。圖10A的不同泳道顯示了使用的不同病毒載體，表I則顯示了名稱(chēng)與插入片段的對(duì)應(yīng)關(guān)系。以相同方式，也測(cè)量了不含myc表位的Ad35病毒的TB抗原的表達(dá)(圖10B)。圖10C顯示了相似的結(jié)果，分子量顯示在右邊。Ad35病毒所表達(dá)的特異性TB(融合)蛋白用此方法檢測(cè)，此外還有一些TB-3和TB-L的切割產(chǎn)物。從圖10A可以推斷包括所有三種TB抗原的多蛋白被表達(dá)，因?yàn)門(mén)B-LM道與TB-3M道相比有更高的條帶出現(xiàn)(而且TB-S道條帶比TB-4M特異性條帶高)。由于TB10.4是TB-LM和TB-SM多蛋白的最C末端多肽，這顯示整個(gè)多蛋白被翻譯。也應(yīng)該注意切割并不完全，盡管切割產(chǎn)物在TB-3M和TB-LM道中能看見(jiàn)。Ag85A和Ag85B抗原(分別為道TB-5(M)和TB-6(M))被表達(dá)。與TB10.4抗原相關(guān)的道TB-7(M)中發(fā)現(xiàn)沒(méi)有特異染色。這可能是抗原在western印跡中沒(méi)有被CFP多克隆識(shí)別，同時(shí)也可能該蛋白從凝膠跑出，或者當(dāng)存在于單表達(dá)構(gòu)建體(TB-7M)時(shí)該蛋白在A549細(xì)胞中少量表達(dá)，和存在于三聯(lián)構(gòu)建體(TB-LM、TB-L和TB-S)時(shí)。圖10A中，道TB-LM在最高帶(可能未裂解)下有一個(gè)稍短帶可見(jiàn)。這提示了從多蛋白剩余部分切割了TB10.4抗原。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該揭示了蛋白的物理存在，盡管已經(jīng)清楚TB10.4抗原對(duì)免疫應(yīng)答有貢獻(xiàn)(參見(jiàn)下文)，這強(qiáng)烈顯示該抗原存在并積極參與免疫應(yīng)答。
實(shí)施例4.小鼠中編碼結(jié)核分枝桿菌抗原的載體的免疫原性首先，在小鼠中研究實(shí)施例1所述的連接物質(zhì)粒(DNA構(gòu)建體)的免疫原性。該構(gòu)建體編碼一種、兩種或三種TB抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4。編碼多個(gè)TB抗原的DNA構(gòu)建體以如上所述的兩種方式設(shè)計(jì)，即表達(dá)包含直接融合體并且不含myc標(biāo)記的多蛋白以及表達(dá)包含編碼蛋白酶和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列的多蛋白，所述蛋白酶和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)使多蛋白(也不含myc標(biāo)記)切割為分離的多肽。使用下列DNA構(gòu)建體(參見(jiàn)實(shí)施例1)單抗原構(gòu)建體TB-5(Ag85A)、TB-6(Ag85B)和TB-7(TB10.4)雙抗原構(gòu)建體TB-3(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B)和TB-4(Ag85A-Ag85B直接融合)三抗原構(gòu)建體TB-L(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)和TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4直接融合)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖11所示。七組小鼠用各自的TB DNA構(gòu)建體免疫(兩次實(shí)驗(yàn)，參見(jiàn)下文)。對(duì)每次免疫，DNA肌內(nèi)注射三次(3×50μg)，間隔2.5周。作為陰性對(duì)照，將一組小鼠注射三次PBS。其它對(duì)照組則皮下注射單劑量的6×105cfu BCG(SSI1331株)。
最后一次DNA免疫后一周，及BCG免疫后六周，處死小鼠。分離脾臟以作為細(xì)胞免疫分析的細(xì)胞源。需要用于體液應(yīng)答分析的血清通過(guò)每組心臟穿刺采血匯集。
在體外用相應(yīng)抗原的肽庫(kù)重新刺激后，利用胞內(nèi)IFNγ染色(ICS)FACS分析，通過(guò)測(cè)量IFNγ+CD4+和IFNγ+CD8+脾細(xì)胞的頻率確定特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平。免疫血清用A549細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)，所述A549細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼相應(yīng)抗原的腺病毒。
進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的免疫實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，每組使用3只小鼠，對(duì)每只小鼠分別分析免疫應(yīng)答。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，每組8只小鼠用于DNA免疫，每組4只小鼠用于對(duì)照免疫。體外肽刺激之后，將相同組兩只-兩只小鼠的樣品混合，染色用于FACS分析。兩實(shí)驗(yàn)獲得相似結(jié)果，將數(shù)據(jù)匯總進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
胞內(nèi)IFNγ染色(ICS)如下進(jìn)行。在存在共刺激抗體最終稀釋為1∶1000的抗小鼠CD49d和抗小鼠CD28(Pharmingen)的情況下，用所示合適的肽庫(kù)(每肽的終濃度為2μg/ml)對(duì)脾細(xì)胞(106/孔，96孔板)進(jìn)行兩次刺激。如下文實(shí)施例6和7中所概述，肽庫(kù)由跨越全抗原的15-聚體(15-mer)肽組成，含有10聚體(Ag84B)或11聚體(Ag85A、TB10.4)重疊序列，或者調(diào)整為具有來(lái)自Ag85A的肽p1和p2的Ag85B。BCG和PBS免疫小鼠的樣品另外用CFP(培養(yǎng)物濾過(guò)蛋白；終濃度10μg/ml)和PPD(純化蛋白衍生物；終濃度10μg/ml)刺激，CFP和PPD是BCG免疫時(shí)體外刺激常用的抗原。作為陽(yáng)性對(duì)照，將樣品用PMA/離子霉素(終濃度分別為50ng/ml和2μg/ml)刺激，而與培養(yǎng)基的溫育作為陰性對(duì)照(無(wú)刺激)。37℃刺激1h后，加入分泌阻斷劑GolgiPlug(PhaFrmingen；終稀釋度1∶200)，繼續(xù)溫育另外5h。將相應(yīng)雙份樣品混合，進(jìn)行FACS分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞用含0.5％BSA的PBS洗滌，與FcR阻斷劑(Pharmingen；1∶50稀釋)冰上溫育10分鐘。洗滌步驟之后，將細(xì)胞與CD4-FITC(Pharmingen；1∶250稀釋)和CD8-APC(Pharmingen；1∶50稀釋)冰上溫育30分鐘。洗滌后，將細(xì)胞用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)冰上固定及permabilized 20分鐘，之后用Perm/Wash緩沖液(Pharmingen)洗滌。胞內(nèi)IFNγ用抗IFNγ-PE(Pharmingen；1∶100稀釋)冰上染色30min。終洗滌步驟后，將細(xì)胞重懸于CellFix(BD)，用流式細(xì)胞儀分析。每樣品測(cè)量至少10000個(gè)CD8+細(xì)胞。結(jié)果以表達(dá)IFNγ的CD4+或CD8+細(xì)胞的百分率表示。
體外再刺激樣品的概述示于表II。ICS結(jié)果提供在圖12-16中。
表II.體外再刺激樣品綜述
圖12A和B顯示細(xì)胞未被刺激時(shí)，背景水平相當(dāng)?shù)汀D13A顯示用Ag85A肽庫(kù)刺激后有高頻率的IFNγ+CD4+脾細(xì)胞。取自注射有攜帶Ag85B編碼基因的構(gòu)建體的小鼠的CD4+細(xì)胞有清楚的交叉反應(yīng)性，這不是不可預(yù)料的，因?yàn)锳g85A與Ag85B有高度的結(jié)構(gòu)同源性。與CD4+細(xì)胞所發(fā)現(xiàn)的相對(duì)照，來(lái)自注射了單獨(dú)編碼Ag85A或編碼Ag85B(泳道Ag85A、Ag85B、TB-3L和TB-4S)的構(gòu)建體的小鼠的細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到CD8+脾細(xì)胞的刺激(參見(jiàn)圖13B)。然而，注射三聯(lián)構(gòu)建體TB-L和TB-S的小鼠中IFNγ+CD8+脾細(xì)胞激增，清楚表明這些構(gòu)建體中存在的額外抗原(TB10.4)的重要作用。很顯然該組中，TB10.4抗原能強(qiáng)烈增加對(duì)Ag85A肽具有反應(yīng)性的CD8+脾細(xì)胞的頻率，而Ag85A單獨(dú)(或與Ag85B組合)則不能提供應(yīng)答。圖14A顯示Ag85B在所出現(xiàn)的所有組中均能增加IFNγ+CD4+脾細(xì)胞的頻率，而對(duì)IFNγ+CD8+脾細(xì)胞的作用很小(參見(jiàn)圖14B)。此處也發(fā)現(xiàn)了Ag85B和Ag85A如上所討論的交叉反應(yīng)性(圖14A)。圖15A顯示應(yīng)答TB10.4相關(guān)肽庫(kù)的IFNγ+CD4+脾細(xì)胞的頻率，其中在注射單獨(dú)具有TB10.4的構(gòu)建體或包含三聯(lián)插入序列的構(gòu)建體的小鼠之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)真正的差異。然而，如圖15B所示，注射包含編碼TB10.4抗原的基因的構(gòu)建體的小鼠的IFNγ+CD8+脾細(xì)胞頻率在用TB10.4相關(guān)肽刺激時(shí)激增，特別是使用三聯(lián)插入片段時(shí)(注意y軸，顯示平均1.5％的脾細(xì)胞有反應(yīng)性)。結(jié)果總結(jié)在圖16A(TB-L中的三聯(lián)插入片段有蛋白酶和蛋白酶消化位點(diǎn))和圖16B(TB-S直接連接的抗原)。具體地，不同抗原以不同方式貢獻(xiàn)于免疫應(yīng)答Ag85A誘導(dǎo)CD4和CD8應(yīng)答；Ag85B則僅誘導(dǎo)強(qiáng)CD4應(yīng)答，幾乎沒(méi)有任何CD8應(yīng)答。與Ag85B相反，TB10.4抗原激發(fā)強(qiáng)CD8應(yīng)答和很低的CD4應(yīng)答。這表明三聯(lián)插入片段中所述序列編碼的不同抗原有明顯有益的輔助作用。
BCG免疫沒(méi)有導(dǎo)致顯著的ICS應(yīng)答。然而，BCG免疫小鼠的脾細(xì)胞用CFP或PPD刺激72h后，用IFNγ ELISA試劑盒檢測(cè)，產(chǎn)生了高水平IFNγ，這表明小鼠被有效免疫(數(shù)據(jù)未顯示)。
為確定任何抗原特異性抗體是否都能在注射不同DNA構(gòu)建體的小鼠中實(shí)際產(chǎn)生，將A549細(xì)胞在96孔板中用編碼TB抗原的Ad35重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。腺病毒按實(shí)施例2所述產(chǎn)生。為此，每孔接種1×104細(xì)胞，以感染復(fù)數(shù)5000進(jìn)行病毒感染。感染兩天后，將細(xì)胞用Cytofix/Cytoperm固定(4℃20分鐘)，之后用Perm/Wash緩沖液洗滌。將細(xì)胞與以1∶2稀釋于Perm/Wash緩沖液的免疫小鼠的血清在37℃溫育1h。洗滌之后，加入1∶5稀釋于Perm/Wash緩沖液的山羊抗小鼠-FITC，37℃溫育30分鐘。終洗滌之后，用熒光顯微鏡分析細(xì)胞。
免疫熒光分析顯示獲自用TB-6(僅Ag85B)、TB-3(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B)、TB-4(Ag85A-Ag85B直接融合)以及TB-L(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)免疫的小鼠血清有強(qiáng)烈的細(xì)胞抗原特異性染色。TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4直接融合)免疫的小鼠的血清觀察到了弱染色，而TB-5(僅Ag85A)和TB-7(僅TB10.4)免疫獲得的血清沒(méi)有任何染色。這表明至少某些抗原能誘發(fā)抗體應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有確定多蛋白剩余部分的蛋白酶完全切割以及各抗原表達(dá)水平。
實(shí)施例5.構(gòu)建編碼抗原和佐劑的rAd載體本實(shí)施例構(gòu)建了新的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，在此命名為Ad35-X-AlK63，其共表達(dá)一種抗原(表示為X)和CtxAl突變衍生物，所述CtxAl突變衍生物在親代CtxAl的第63位氨基酸的絲氨酸被賴氨酸所取代(即本文表示為AlK63)。
通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法導(dǎo)入PCR擴(kuò)增的X并導(dǎo)入合適的克隆限制性位點(diǎn)構(gòu)建連接物質(zhì)粒，它適于產(chǎn)生能夠表達(dá)X和AlK63的E1缺失的基于Ad35的載體。將所得PCR產(chǎn)生的DNA片段用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化，然后退火至通常如上記載的用于Ag85A、Ag85和TB10.4的連接物質(zhì)粒。對(duì)克隆的PCR片段進(jìn)行另外的限制性內(nèi)切酶消化、PCR和測(cè)序分析，以確證DNA在構(gòu)建期間沒(méi)有被改變。
從包含CtxAl拷貝的pOGL1-A質(zhì)粒擴(kuò)增編碼AlK63的DNA。CtxAl的核苷酸序列獲自GenBank(Accession#A16422)，用賴氨酸密碼子AAA取代絲氨酸-63 TCA密碼子(nt 187-189)對(duì)其進(jìn)行修飾。突變衍生物用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)產(chǎn)生。定點(diǎn)誘變方法需要全質(zhì)粒PCR，用pOGLl-A1 DNA作模板，正向引物5′-TGTTTC CCA CCA AAATTA GTT TGA GAA GTG C-3′(SEQ ID NO24)和反向引物5′CAA ACT AATTTTGGT GGA AAC ATA TCC ATC-3′(SEQ ID NO25)。該過(guò)程通過(guò)將TCA密碼子用AAA密碼子取代而修飾187-189核苷酸(參見(jiàn)下劃線序列)。所得PCR產(chǎn)生的質(zhì)粒用DpnI消化以去除模板DNA，然后將消化的DNA通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)，30℃于瓊脂生長(zhǎng)16hr。選擇分離菌落，從過(guò)夜的液體培養(yǎng)物中抽提DNA。用AlK63特異性引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR以及進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以篩選合適的衍生物。接著將該突變插入片段克隆至含X的相同連接物質(zhì)粒中，在X上游或下游，并將腺病毒按上述生產(chǎn)。
實(shí)施例6.小鼠中Ad35.TB載體的劑量應(yīng)答對(duì)表達(dá)不同單個(gè)或融合TB抗原的Ad35重組病毒檢測(cè)小鼠中的抗原性。定量蛋白或肽庫(kù)刺激后產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)的T細(xì)胞的方法通常用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如WO 2004/037294、Sander etal.(1991)以及Jung et al.(1993)中所記載。具體如下所述。
將三聯(lián)插入片段載體TB-S用于劑量應(yīng)答免疫原性測(cè)試。將四種不同劑量的病毒顆粒(107、108、109、1010vp)肌內(nèi)注射至不同組C57BL/6小鼠(每組5只)，同時(shí)3只小鼠作為陰性對(duì)照，注射1010vp的空病毒載體。免疫兩周后將小鼠處死，分離脾細(xì)胞以作為細(xì)胞免疫研究的細(xì)胞源。使用胞內(nèi)IFNγ染色(ICS)FACS分析，如上所述測(cè)量IFNγCD4+和CD8+脾細(xì)胞頻率，確定抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平。結(jié)果顯示在圖17中。具體地，基于Ad35的TB-S載體以劑量依賴方式誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，特別涉及Ag85B特異性CD4細(xì)胞應(yīng)答的增加(圖17C)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)涉及TB10.4特異性CD4細(xì)胞的應(yīng)答(圖17E)，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)涉及Ag85B特異性CD8細(xì)胞的應(yīng)答(圖17D)。對(duì)Ag85A和TB10.4特異性CD8細(xì)胞，107和108劑量很難檢測(cè)到任何應(yīng)答(分別見(jiàn)圖17B和17F)，而用109和1010劑量則發(fā)現(xiàn)應(yīng)答顯著增加。107劑量在任意組中都沒(méi)有顯著效應(yīng)，而108劑量則導(dǎo)致了Ag85A和Ag85B特異性CD4細(xì)胞的增加(分別圖17A和17C)。用TB-L構(gòu)建體也發(fā)現(xiàn)相似數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在評(píng)估小鼠中結(jié)核分枝桿菌抗原CD8免疫顯性序列表位作圖發(fā)現(xiàn)Ag85A的稱(chēng)為p 1(FSRPGLPVEYLQVPS；SEQ ID NO26)和p2(GLPVEYLQVPSPSMG；SEQ ID NO27)的肽是C57BL/6小鼠的僅有的CD8免疫顯性表位。劃線部分應(yīng)該理論上適合C57BL/6小鼠的MHC分子。在蛋白該區(qū)域的Ag85A抗原序列(氨基酸1-19FSRPGLPVEYLQVPSPSMG；SEQ ID NO28)與相同區(qū)域的Ag85B的序列相同。然而，Ag85B庫(kù)的p1和p2肽盡管包括Ag85A肽的相同序列，但卻沒(méi)有任何CD8應(yīng)答(參見(jiàn)圖17D)。這提示來(lái)自Ag85B的肽p1和p2有異常，可能因?yàn)槭侵苽湓蚧蛘呶廴驹?。因此，進(jìn)行額外的劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，其中Ag85B體外刺激肽庫(kù)用來(lái)自Ag85A庫(kù)的p1和p2重構(gòu)(reconstituted)。用TB-S和TB-L載體以107、108、109和1010vp劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般如上所述，免疫兩周后確定T細(xì)胞應(yīng)答。作為陰性對(duì)照，一組小鼠用PBS注射，另一組用空Ad35病毒(1010vp)注射。CD8細(xì)胞相關(guān)結(jié)果提供在圖17G中(TB-L，左圖；TB-S，右圖)。顯然，在體外用調(diào)整的Ag85B庫(kù)刺激后，測(cè)定到CD8陽(yáng)性細(xì)胞，盡管來(lái)自Ag85A抗原的肽與來(lái)自Ag85B抗原的肽相同，而Ag85B抗原肽最初曾被使用但并沒(méi)有產(chǎn)生任何陽(yáng)性結(jié)果。然而這些結(jié)果顯示，在所述病毒感染后，基于Ad35的腺病毒編碼Ag85B蛋白也能誘導(dǎo)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例7.BCG引發(fā)后基于Ad35的TB載體用作加強(qiáng)劑在另一實(shí)驗(yàn)中，用表達(dá)TB抗原的Ad35載體作為BCG免疫的加強(qiáng)劑進(jìn)行測(cè)試。為此，按FDA發(fā)布方案(標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)部分CBER)，給每組小鼠皮下注射BCG疫苗(卡介苗；參考標(biāo)準(zhǔn)FDA，該疫苗是結(jié)核免疫領(lǐng)域常規(guī)已知的)。
四組小鼠(每組8只)用BCG皮下(6x105cfu/小鼠)引發(fā)十周之后，用攜帶三種直接連接的TB抗原的基于Ad35的腺病毒載體(TB-S)或者載有下列抗原組合的腺病毒Ad35載體感染-僅TB-4(包含Ag85A和Ag85B直接融合)-TB-4+TB-7(僅包含TB10.4)-TB-5(僅包含Ag85A)+TB-6(僅包含Ag85B)+TB-7兩對(duì)照組(每組4只)用PBS或BCG引發(fā)，之后，PBS組接受PBS模擬免疫，BCG引發(fā)對(duì)照組則接受109vp的空Ad35載體。基于Ad35的載體注射，在所有情況下都是用109vp肌內(nèi)注射。感染4周后(引發(fā)后14周)將小鼠處死，按上述方法分離使用脾細(xì)胞。結(jié)果顯示在圖18中。Ag85A抗原的存在導(dǎo)致了針對(duì)Ag85A特異性CD4細(xì)胞的顯著效應(yīng)(圖18A)。如所預(yù)料的(也參見(jiàn)圖13B)，三聯(lián)構(gòu)建體TB-S誘導(dǎo)了Ag85A特異性CD8應(yīng)答，而TB-4載體則不能誘導(dǎo)該應(yīng)答(圖18B)。類(lèi)似結(jié)果先前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(圖13B)，表明Ag85A單獨(dú)存在或與Ag85B組合存在都不能引起CD8應(yīng)答，而當(dāng)TB10.4存在時(shí)發(fā)現(xiàn)該應(yīng)答。有趣的是，當(dāng)各載體以單針注射時(shí)(圖18B中的TB-4/TB-7或TB-5/TB-6/TB-7)也沒(méi)有檢測(cè)到任何效應(yīng)，這表明當(dāng)共注射時(shí)，TB10.4抗原不能誘導(dǎo)Ag85A特異性CD8應(yīng)答，而當(dāng)抗原出現(xiàn)在同一構(gòu)建體或者至少同一細(xì)胞時(shí)就可以。TB10.4的佐劑效應(yīng)機(jī)理仍未知。
Ag85B抗原觀察到的效應(yīng)與先前發(fā)現(xiàn)的一致(圖18C和D)。必須注意，三聯(lián)構(gòu)建體TB-S中TB10.4抗原的存在并沒(méi)有引起Ag85B特異性CD8應(yīng)答，這與Ag85A中發(fā)現(xiàn)的相反。兩種抗原都很好地從構(gòu)建體表達(dá)，如圖10B所示。陰性效應(yīng)可能是因?yàn)橛糜跍y(cè)量針對(duì)Ag85B的任何CD8應(yīng)答的肽庫(kù)已被破壞(參見(jiàn)實(shí)施例6和下文)。
用TB10.4誘導(dǎo)的CD4+細(xì)胞非常少(圖18E)。使用分離載體中(TB-5/TB-6/TB-7)TB10.4的CD8+細(xì)胞誘導(dǎo)比較顯著(注意y軸刻度；也參見(jiàn)圖15B)。用TB-S的TB10.4特異性CD8細(xì)胞誘導(dǎo)極高(圖18F)，有平均約12％的IFNγ陽(yáng)性CD8細(xì)胞。
可以得出結(jié)論，TB10.4抗原能誘導(dǎo)針對(duì)抗原的CD8應(yīng)答，但當(dāng)作為單一構(gòu)建體時(shí)，其并不能引發(fā)CD8應(yīng)答(Ag85A)。已知CD8細(xì)胞激活需要比CD4細(xì)胞激活某些更高的抗原閾值，這至少部分是因?yàn)閰⑴cMHC I類(lèi)分子的抗原加工和呈遞的復(fù)雜機(jī)理(Storin andBachmann.2004)。在此，本文發(fā)現(xiàn)當(dāng)TB10.4與抗原Ag85A和Ag85B在三抗原構(gòu)建體中偶聯(lián)時(shí)，可引發(fā)強(qiáng)CD8應(yīng)答，該應(yīng)答不僅抗TB10.4自己而且也抗Ag85A。這可能是構(gòu)建體中TB10.4的物理存在增加了融合蛋白輸送至蛋白體的效率，所述蛋白體是有效呈遞至CD8細(xì)胞和CD8細(xì)胞激活所必需的。較高的TB10.4特異性CD8細(xì)胞應(yīng)答的原因最可能是因?yàn)榕c僅攜帶TB10.4抗原的載體相比，三聯(lián)構(gòu)建體的表達(dá)水平增加。雖然針對(duì)單獨(dú)TB10.4的CD8應(yīng)答也很顯著，但由于缺乏TB10.4特異性抗血清用于western印跡而沒(méi)有測(cè)量TB10.4表達(dá)水平。
靶向蛋白體的增加可能是TB10.4分子中有特異性位點(diǎn)的結(jié)果，所述位點(diǎn)例如是涉及結(jié)合泛素(或者其它負(fù)責(zé)標(biāo)記被加工的蛋白的分子)、或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列或者其它可增加MHCI類(lèi)分子的加工和呈遞的序列(Wang et al.2004)。或者，構(gòu)建體中TB10.4蛋白的存在可能使融合蛋白物理上去穩(wěn)定化，從而導(dǎo)致分子降解速率增加?？乖庸に皆黾油ǔ?dǎo)致CD8細(xì)胞激活增加。此外，如果很多蛋白在蛋白體中完成加工用于I類(lèi)呈遞，該蛋白在胞質(zhì)和胞外存在的就越少，由此不能激活B細(xì)胞。已經(jīng)報(bào)道，在抗原加工(即CD8激活)和抗原特異性抗體滴度之間存在反比關(guān)系(Delogu et al.2000)。有意思的是，在雙抗原構(gòu)建體免疫的小鼠血清中觀察到了比三抗原構(gòu)建體免疫小鼠更強(qiáng)很多的抗原免疫熒光。該結(jié)果提示我們的含有TB10.4的三抗原分子對(duì)蛋白體降解和CD8細(xì)胞激活是高度易感的，由此較少的用于抗體誘導(dǎo)。由于強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答是抗結(jié)核的優(yōu)選應(yīng)答，所以可以得出結(jié)論，包含編碼TB10.4抗原和至少一種其它TB抗原、優(yōu)選Ag85A、更優(yōu)選Ag85A和Ag85B的核酸的、基于Ad35的三抗原載體非常適合用于抗結(jié)核疫苗。如圖18顯示結(jié)果所示，通過(guò)用BCG作引發(fā)劑可以進(jìn)一步增加所發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)。
用具有Ag85A肽p1和p2加入的Ag85B新肽庫(kù)(如實(shí)施例6所述)，也可以重復(fù)BCG引發(fā)、Ad35-TB加強(qiáng)的引發(fā)/加強(qiáng)研究，盡管當(dāng)前脾細(xì)胞是從引發(fā)后26周被處死的小鼠中分離的(免疫后16周)。用PBS、Ad35.Empty、Ad35.TB-S或者Ad35.TB-L以109或1010vp各病毒載體免疫小鼠(每組8只)。結(jié)果顯示在圖25(Ag85A刺激)、26(Ag85B刺激)和27(TB10.4刺激)中。該結(jié)果清楚地表明時(shí)間期延長(zhǎng)后仍能檢測(cè)到顯著的CD4和CD8應(yīng)答。
實(shí)施例8.豚鼠的引發(fā)-加強(qiáng)-攻擊實(shí)驗(yàn)在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，將調(diào)查BCG引發(fā)之后再用基于Ad35的TB載體加強(qiáng)，是否能在攻擊程序中保護(hù)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染。
將豚鼠用通常如上所示的BCG進(jìn)行初始引發(fā)(6x105cfu/動(dòng)物)。14周后，將動(dòng)物用1010vp的Ad35.TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4)或Ad35.TB-4(Ag85A-Ag85B)重組病毒免疫，或者注射PBS(對(duì)照組)。8周后，每只動(dòng)物接受～100cfu結(jié)核分枝桿菌的攻擊。直至引發(fā)后約78周監(jiān)測(cè)動(dòng)物的存活情況。中間觀察提示BCG引發(fā)后用Ad35-TB加強(qiáng)確保了比單用BCG更高的存活率。
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PCT/RO/134表
權(quán)利要求
1.一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒，其包括編碼兩種或多種來(lái)自于至少一種結(jié)核病(TB)致病菌的抗原的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的重組腺病毒，其中所述腺病毒選自由人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所組成的組。
3.權(quán)利要求1或2的重組腺病毒，其中所述TB致病菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafiicanum)和/或牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組腺病毒，其中所述核酸序列編碼至少兩種抗原，所述抗原選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A、Ag85B、和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原組成的組。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的重組腺病毒，其中至少兩種所述抗原表達(dá)自一個(gè)多蛋白。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的載體，其中至少兩種所述抗原相連接以形成融合蛋白。
7.權(quán)利要求4的重組腺病毒，其中所述核酸序列編碼以5′至3′順序克隆的所有三種抗原Ag85A、Ag85B、和TB10.4。
8.一種重組多核苷酸載體，其包含編碼兩種或多種抗原及蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列，其中所述抗原表達(dá)為多蛋白，所述多蛋白包括將所述兩種或多種抗原中的至少兩種分隔開(kāi)的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求8的重組多核苷酸載體，其中所述多核苷酸載體包裝于復(fù)制缺陷型腺病毒中，其中所述腺病毒選自由人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所組成的組。
10.權(quán)利要求8或9的重組多核苷酸載體，其中所述核酸序列進(jìn)一步包括編碼蛋白酶的序列。
11.權(quán)利要求10的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶表達(dá)時(shí)表達(dá)為所述多蛋白的一部分，并通過(guò)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接于至少一種所述抗原。
12.權(quán)利要11的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO21或22的序列。
13.權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶來(lái)自禽類(lèi)白血病病毒(ALV)。
14.權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述抗原來(lái)自至少一種結(jié)核病(TB)致病菌。
15.權(quán)利要求14的重組多核苷酸載體，其中所述TB致病菌是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。
16.權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述核酸序列編碼至少兩種由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A、Ag85B、和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原。
17.權(quán)利要求16的重組多核苷酸載體，其中所述核酸序列編碼Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原，其中編碼所述抗原的核酸序列以5′至3′順序克隆。
18.一種重組多核苷酸載體，其包括編碼抗原和遺傳佐劑的核酸序列，其中所述抗原和所述遺傳佐劑連接，優(yōu)選通過(guò)第一蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接。
19.權(quán)利要求18的重組多核苷酸載體，其中所述多核苷酸載體包裝于復(fù)制缺陷型腺病毒中。
20.權(quán)利要求19的重組多核苷酸，其中所述腺病毒選自由人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所組成的組。
21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述核酸序列進(jìn)一步包括編碼蛋白酶的序列。
22.權(quán)利要求21的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶通過(guò)第二蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接于所述抗原和/或所述遺傳佐劑。
23.權(quán)利要求22的重組多核苷酸載體，其中所述第二蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO22的序列。
24.權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述第一蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括SEQ ID NO21的序列。
25.權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶來(lái)自禽類(lèi)白血病病毒(ALV)。
26.權(quán)利要求18-25任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述抗原來(lái)自結(jié)核病(TB)致病菌。
27.權(quán)利要求26的重組多核苷酸載體，其中所述TB致病菌是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌或牛分枝桿菌。
28.權(quán)利要求18-27任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述抗原選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A、Ag85B和TB10.4開(kāi)放讀框編碼的抗原所組成的組。
29.權(quán)利要求18-28任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，其中所述遺傳佐劑包含霍亂毒素(CtxAl)或其突變衍生物，所述突變衍生物包括第63位氨基酸絲氨酸被賴氨酸取代(AlK63)。
30.一種多價(jià)TB疫苗，包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組腺病毒或權(quán)利要求8-17任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體或權(quán)利要求18-29任一項(xiàng)的重組多核苷酸載體，還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑及任選地包括佐劑。
31.分枝桿菌(Mycobacterium)抗原TB10.4作為遺傳佐劑的應(yīng)用。
32.分枝桿菌抗原TB10.4在制備用于治療或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，其中需要刺激針對(duì)某抗原或感興趣的治療組分的宿主免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含重組載體例如重組腺病毒的疫苗。本載體包括編碼來(lái)自一種或多種結(jié)核病致病菌的至少兩種抗原的異源核酸。本發(fā)明也涉及特異性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)連接抗原的應(yīng)用，其中通過(guò)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，所編碼的抗原可被切割分離。切割后，抗原以獨(dú)立方式引起免疫應(yīng)答。重組載體可以包括編碼切割接頭和分離抗原的蛋白酶的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述重組載體編碼的遺傳佐劑的應(yīng)用，其中所述遺傳佐劑也可通過(guò)可切割的接頭及特異性蛋白酶的存在而切割。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101090974SQ200580039095
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者M·J·E·哈文加, R·福格爾斯, J·薩多夫, D·霍恩, Y·A·W·斯凱基, K·拉多塞維奇 申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司, Aeras全球肺結(jié)核疫苗基金會(huì)