專利名稱：用于底物的酶催化氧化的多成分系統(tǒng)及酶催化氧化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于底物的介體依賴性酶催化氧化的多成分系統(tǒng)及酶催化氧化方法。
用于底物的介體依賴性酶催化氧化的多成分系統(tǒng)及相應(yīng)的方法，基本上是已知的。就此而言，介體通常是可被氧化還原酶氧化的化合物，即首先也是酶氧化催化劑的底物。介體以介體的氧化的形式(經(jīng)活化的介體，例如介體游離基或介體陽(yáng)離子)而著名，它們具有足夠長(zhǎng)的壽命而能自氧化還原酶擴(kuò)散至氧化系統(tǒng)的實(shí)際底物并與其相互作用的。在經(jīng)活化的介體與底物的相互作用中，底物被介體氧化。借助于底物的氧化，介體可被再生(催化型氧化系統(tǒng))或被失活(化學(xué)計(jì)量氧化系統(tǒng))。若介體被再生，則可用于新的催化循環(huán)。在直接酶催化氧化方法中，通過(guò)介體自底物轉(zhuǎn)移至氧化還原酶的電子被轉(zhuǎn)移至終端電子受體，如氧或過(guò)氧化物。
在以過(guò)氧化物(直接或由前體釋放)作為終端電子受體的方法中，僅過(guò)氧化物酶可被用作氧化還原酶。雖然已知許多這樣的方法，但它們的缺點(diǎn)甚多在如紙張漂白或洗衣洗滌劑的工業(yè)方法中使用的過(guò)氧化物酶，其生產(chǎn)極為昂貴。再者，添加過(guò)氧化物酶亦成問(wèn)題，因?yàn)樵谑狗椒ㄓ行У臐舛认?，過(guò)氧化物使過(guò)氧化物酶失活。前述作為過(guò)氧化物酶介體的許多化合物不能在工業(yè)上使用，因?yàn)樗鼈兘?jīng)強(qiáng)烈著色，在毒理學(xué)或生態(tài)毒理學(xué)上是有害的，不能生物降解或僅能略微生物降解及供應(yīng)量不足或不足夠廉價(jià)。所以利用過(guò)氧化物作為終端電子受體的方法，目前尚不適于經(jīng)濟(jì)有利的工業(yè)用途。
在氧作為來(lái)自待氧化的底物的電子的終端電子受體的方法中，氧化酶被用作氧化還原酶。文獻(xiàn)中曾述及兩組可用于介體依賴性酶催化氧化方法的氧化酶漆酶(Boubonnais和Paice(1990)，F(xiàn)EBSLETTERS，第267卷(1)，第99至102頁(yè)，WO94/29510)及酪氨酸酶(WO94/29510)。與血紅素輔基作為氧化還原活性中心的過(guò)氧化物酶的情況相反，在漆酶及酪氨酸酶的情況中，電子轉(zhuǎn)移是由四個(gè)銅離子催化的，該銅離子與這些氧化酶(“藍(lán)銅”氧化酶)的四個(gè)相應(yīng)的銅結(jié)合位點(diǎn)配位。自介體順序取總共四個(gè)電子，之后在四電子轉(zhuǎn)移中將該四個(gè)電子轉(zhuǎn)移至分子氧上。分子氧被還原成水，氧化酶被再生用于新的反應(yīng)循環(huán)。舉例言之，在WO94/29510、WO97/06244、WO96/10079或WO95/01426中曾述及許多介體，它們催化自待氧化的底物至氧化酶的電子轉(zhuǎn)移。
這些包含氧化酶及氧的介體依賴性酶催化氧化方法用于煤液化(WO94/29510)，用于木漿漂白(WO94/29510)，用于有機(jī)合成(Potthast等(1995)，J.Org.Chem.，第60卷，第4320至4321頁(yè))，作為洗衣洗滌劑及洗碗洗滌劑的漂白系統(tǒng)(WO97/06244)，用于粗斜紋綿布漂白(WO96/12846)，用于洗滌過(guò)程中防止染料轉(zhuǎn)印(WO98/23716)或用于多環(huán)芳烴的裂解(Johannes等(1996)，Appl.Microbilo.Biotechnol.，第46卷，第313至317頁(yè))是已知的。
但是，因介體具有妨礙工業(yè)使用的性質(zhì)，利用氧化酶的酶催化氧化方法亦有重大缺點(diǎn)-在WO94/29510中被描述為特別有效的介體HBT不能生物降解(Amann(1997)，9th Int.Symp.On Wood and Pulp.Chem.，F(xiàn)4-1至F4-5)。-許多介體如HBT及紫尿酸的活性形式所使用的氧化酶失活(Amann(1997)，9th Int.Symp.On Wood and Pulp.Chem.，F(xiàn)4-1至F4-5)，所以在相應(yīng)方法中需要使用大量的酶。-一組活性甚高的介體的特征在于具有N-O基，所以每個(gè)介體分子含有至少一個(gè)氮原子(WO94/29510)。因此使用含有N-O的化合物具有與毒性及生物降解性有關(guān)的問(wèn)題。此外，紙漿制造業(yè)的生物廢水純化系統(tǒng)經(jīng)常不能處理額外的氮負(fù)荷量。-一些介體，例如ABTS，形成強(qiáng)烈著色的游離基，所以導(dǎo)致待氧化的底物的不期望的褪色。-大多數(shù)介體含有氮或硫原子，所以生產(chǎn)比較昂貴。
目前這些缺點(diǎn)也限制這些用于氧化底物的系統(tǒng)在工業(yè)上廣泛使用。
Archibald和Roy(Archibald和Roy(1992)，Appl.Environ.Microbiol.，第58卷，第1496至1499頁(yè))曾述及一種方法，其中由酚類及Mn2+/Mn3+組成的氧化還原級(jí)聯(lián)作為氧化酶與待氧化的底物間的介體。該系統(tǒng)利用氧作為終端電子受體。所用的氧化酶是漆酶。被漆酶氧化的初級(jí)底物，最初為酚類，如間羥基苯甲酸或間甲苯酚。在有絡(luò)合劑如焦磷酸根離子的存在下，在氧化的酚類的參與下，將Mn2+氧化成Mn3+的次級(jí)氧化可以發(fā)生。對(duì)該系統(tǒng)而言，并不能證實(shí)非酚類底物亦可被氧化。而且用僅用漆酶、Mn2+及絡(luò)合劑的系統(tǒng)進(jìn)行木質(zhì)素氧化，不能發(fā)現(xiàn)去木質(zhì)素作用。因該介體依賴性酶催化氧化系統(tǒng)不采用介體而改用酚類、絡(luò)合劑及錳離子的組合，且由于必須采用酚類介體，因毒理學(xué)原因而妨礙了該方法的使用，所以，就技術(shù)觀點(diǎn)而言，該系統(tǒng)較其它所述系統(tǒng)并無(wú)任何重大改進(jìn)。此外，該系統(tǒng)的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)超過(guò)15小時(shí)，妨礙了該系統(tǒng)的實(shí)際使用。
本發(fā)明的目的是提供用于底物的介體依賴性酶催化氧化的多成分系統(tǒng)，該系統(tǒng)無(wú)已知多成分系統(tǒng)的缺點(diǎn)，所以使待氧化的底物的簡(jiǎn)單及價(jià)廉的轉(zhuǎn)化成為可能。
借助于包括氧化催化劑、氧化劑及介體的多成分系統(tǒng)達(dá)到此目的，該多成分系統(tǒng)的特征在于a)氧化催化劑選自由錳氧化酶組成的組，b)氧化劑選自由氧及氧化合物所組成的組，c)介體選自由含有錳離子的化合物組成的組。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多成分系統(tǒng)包括選自由可以與錳離子絡(luò)合的絡(luò)合劑組成的組的絡(luò)合劑。
為達(dá)到本發(fā)明的目的，錳氧化酶被理解為是直接氧化錳或錳離子并將所得電子轉(zhuǎn)移至氧的氧化酶。優(yōu)選地，在氧及絡(luò)合劑的存在下，這種氧化酶能將Mn2+氧化成Mn3+。優(yōu)選為含有銅離子作為氧化還原活性催化基團(tuán)的錳氧化酶。
舉例而言，錳氧化酶可自已知的微生物中分離。為完成該項(xiàng)分離工作，這種微生物在它們形成錳氧化酶的條件下生長(zhǎng)。在本發(fā)明的組合物中，最簡(jiǎn)單的情況中所用的錳氧化酶可為微生物的含有全部錳氧化酶的酶催化或化學(xué)破壞的細(xì)胞制品。但亦可能采用含有錳氧化酶的培養(yǎng)物上清液或分離出來(lái)的錳氧化酶。
舉例而言，錳氧化酶是由生盤纖發(fā)菌、SG-1芽孢桿菌及假單胞菌種形成(Nealson等(1989)，Beveridge和Doyle(編著)，金屬離子及細(xì)菌，John Wiley and sons，Inc.，紐約，第383至411頁(yè))。用以編碼來(lái)自生盤纖發(fā)菌及SG-1芽孢桿菌的錳氧化酶的基因已經(jīng)被克隆并測(cè)序(Corstjens等(1997)，Geomicrobilo.Journal，第14卷，第91至108頁(yè)及Van Waasbergen等(1996)，Journal of Bacteriology，第178卷，12期，第3517至3530頁(yè))。兩種基因均編碼含有自“藍(lán)銅”氧化酶得知的銅結(jié)合序列的蛋白質(zhì)，且其錳氧化酶活性通過(guò)添加銅而增加。
除所述產(chǎn)生錳氧化酶的微生物外，其它微生物亦可用作錳氧化酶的來(lái)源。因此，舉例言之，在錳氧化酶累積于芽孢內(nèi)的微生物的情況中，例如SG-1芽孢桿菌，分離出來(lái)的芽孢亦可在本發(fā)明方法內(nèi)用作酶源。
再者，可以使用由重組體生產(chǎn)方法生產(chǎn)的錳氧化酶。在此情況中，重組體生產(chǎn)方法是指所有以下方法，其中編碼錳氧化酶的基因是自天然生產(chǎn)者分離出來(lái)，且然后以已知方法導(dǎo)入適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)菌株，該菌株亦可為原來(lái)的酶生產(chǎn)者。
錳離子在本發(fā)明的組合物中起介體作用。這些錳離子可以任何氧化態(tài)加入該方法內(nèi)。
優(yōu)選地，所用錳離子的氧化態(tài)為+2或+3。
氧化態(tài)為+2的錳優(yōu)選以硫酸錳或氯化錳的形式使用。
氧化態(tài)為+3的錳優(yōu)選以可溶性錳絡(luò)合物的形式使用。這種錳絡(luò)合物的實(shí)例是錳/甲酸鹽、錳/乳酸鹽、錳/草酸鹽或錳/丙二酸鹽。
介體(例如Mn3+離子)自待氧化的物質(zhì)取得一個(gè)電子。這樣該物質(zhì)被氧化，錳離子本身被還原(例如成為Mn2+離子)。這種形式的錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)電子，該電子被輸送至錳氧化酶并在那里被釋放，而錳被氧化回最初的氧化態(tài)(例如成為Mn3+離子)。氧作為錳氧化酶的氧化劑從而作為終端電子受體。
借助已知的化學(xué)或酶催化的氧發(fā)生系統(tǒng)，反應(yīng)中可直接產(chǎn)生氧。氧亦可由電解水產(chǎn)生，或者氧可以氣態(tài)或液態(tài)直接使用。
優(yōu)選地，氧是以氣態(tài)或液態(tài)氧的形式或以含氧氣體混合物例如空氣的形式直接使用。特別優(yōu)選地，氧以含氧氣體混合物例如空氣的形式引入。
優(yōu)選地，由錳氧化酶直接氧化Mn2+所形成的Mn3+在絡(luò)合劑的存在下起作用。
適當(dāng)?shù)慕j(luò)合劑優(yōu)選是絡(luò)合Mn3+從而將其穩(wěn)定化的化合物。
優(yōu)選地，使用不含氮的、易于生物降解的且在毒理學(xué)上無(wú)害的絡(luò)合劑。舉例而言之，這種絡(luò)合劑是甲酸鹽、乳酸鹽、丙二酸鹽或草酸鹽。
與已知系統(tǒng)相比，本發(fā)明的系統(tǒng)具有下列優(yōu)點(diǎn)-舉例而言，當(dāng)過(guò)氧化物用作電子受體時(shí)發(fā)生的氧化還原酶的失活問(wèn)題，在本發(fā)明的組合物內(nèi)不發(fā)生，這是因?yàn)檠跤米餮趸瘎┮蚨鳛榻K端電子受體。
-氧可以技術(shù)上簡(jiǎn)單的方法及足夠的量被加入。
-如已知的，與過(guò)氧化物酶及錳過(guò)氧化物酶不同，錳氧化酶的活性不需要輔基，例如血紅素基。因此錳氧化酶毫無(wú)問(wèn)題地以常規(guī)的生產(chǎn)系統(tǒng)在工業(yè)規(guī)模制備。
-本發(fā)明的系統(tǒng)不需要含氮或含硫的介體或著色或不易生物降解的或毒性的介體。惟一的氧化還原作用介體是錳離子，其在兩種氧化態(tài)之間轉(zhuǎn)換(優(yōu)選在氧化態(tài)2+及3+之間轉(zhuǎn)換)。與已知介體的失活不同，舉例言之，化學(xué)修飾不能使該錳介體失活。
本發(fā)明的組合物可用以氧化多數(shù)各種各樣的底物。優(yōu)選地，用以氧化可被錳離子氧化的底物。特別優(yōu)選地，它可用以氧化可被Mn3+離子氧化的底物。
舉例言之，本發(fā)明的多成分系統(tǒng)適于用作洗衣洗滌劑及洗碗洗滌劑的漂白系統(tǒng)、木漿漂白、粗斜紋棉布漂白、廢水處理、有機(jī)合成、洗滌過(guò)程中防止染料轉(zhuǎn)印或多環(huán)芳烴的裂解。其它可能的用途是，舉例言之，用于煤液化。
使用氧化酶及氧的介體依賴性酶催化氧化方法的已有技術(shù)上描述了相應(yīng)的方法。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，利用本申請(qǐng)所說(shuō)明的成分及方法條件以修飾相應(yīng)的已知方法及利用本發(fā)明的組合物以達(dá)到所述目的是容易的。
本發(fā)明另外涉及用以氧化底物的方法，其特征在于，在氧以及，如果適當(dāng)，錳離子的絡(luò)合劑的存在下，錳氧化酶直接氧化Mn2+形成Mn3+，該Mn3+離子氧化底物，其本身被還原為Mn2+，而又可以被錳氧化酶直接氧化。
在本發(fā)明的方法中，所用的底物優(yōu)選是水溶液、混合物或懸浮液的形式。
在本發(fā)明的方法中，每升反應(yīng)物所用活性錳氧化酶的量?jī)?yōu)選為0.001至50毫克。
加入反應(yīng)混合物的錳氧化酶，優(yōu)選為顆粒、溶液、懸浮液形式或帶有載體物質(zhì)。
特別優(yōu)選地，加入反應(yīng)混合物的錳氧化酶是懸浮液的形式，該懸浮液在非離子洗滌劑中包括0.5％至50％(重量)的酶。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，氧化態(tài)Mn2+或Mn3+的錳用作氧化還原介體。氧化態(tài)為2+或3+的錳離子可在此氧化態(tài)下直接使用，或可由其它氧化態(tài)的錳離子，例如Mn4+或Mn7+在該方法中制得。
氧化態(tài)為3+的錳優(yōu)選是可溶性錳絡(luò)合物的形式，例如錳/甲酸鹽、錳/乳酸鹽、錳/草酸鹽或錳/丙二酸鹽。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用氧化態(tài)為2+的錳。特別優(yōu)選使用硫酸錳或氯化錳。
在本發(fā)明的方法中，所用錳離子的濃度為0.005毫摩爾/升至50毫摩爾/升。所用錳離子的濃度優(yōu)選為0.05毫摩爾/升至5毫摩爾/升，且濃度特別優(yōu)選為0.1毫摩爾/升至1毫摩爾/升。
取決于具體的應(yīng)用，所需的錳可以已經(jīng)存在于待氧化的底物中。通常不需外加錳離子的本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)例是木漿漂白。木材及由其制得的紙漿經(jīng)常已經(jīng)天然含有本發(fā)明的氧化方法所需的足夠高量的錳離子。
在本發(fā)明的方法中，所用氧的分壓優(yōu)選為0.05至5巴。特別優(yōu)選地，所用氧的分壓為0.1至2.5巴。特別優(yōu)選地，所用氧的分壓為0.2至1巴。
在本發(fā)明的方法中，所述絡(luò)合劑的濃度優(yōu)選為1毫摩爾/升至500毫摩爾/升。優(yōu)選地，所用適當(dāng)?shù)慕j(luò)合劑的濃度為5毫摩爾/升至100毫摩爾/升，更優(yōu)選的濃度為10毫摩爾/升至50毫摩爾/升。
本發(fā)明的氧化方法可用以氧化所有可被Mn3+離子氧化的化合物。舉例言之，本發(fā)明的方法可用于造紙及木漿生產(chǎn)中木質(zhì)素的氧化、作為洗衣洗滌劑及洗碗洗滌劑的氧化系統(tǒng)、酶催化染料漂白、酶催化織物漂白、洗滌過(guò)程中防止染料轉(zhuǎn)印、有機(jī)合成過(guò)程中有機(jī)靶分子的特定氧化、氧化廢水處理、氯化烴類的降解、多環(huán)芳烴的裂解及煤液化。
下列實(shí)施例用以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
在氧化態(tài)錳離子Mn3+至Mn7+的存在下，在pH4-7，柏貝林藍(lán)(Berbelin blue)形成深藍(lán)色染料。在柏貝林藍(lán)濃度升高及適當(dāng)錳離子的存在下，在pH高達(dá)10形成藍(lán)色氧化產(chǎn)物。
為進(jìn)行平板篩選，將無(wú)色柏貝林藍(lán)(N，N′-二甲氨基-p，p′-三苯甲烷-O″-磺酸)加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)。在每100毫升營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中10-4至10-5克柏貝林藍(lán)的濃度范圍內(nèi)，未發(fā)生細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制。
為了分離異養(yǎng)錳氧化細(xì)菌，使用下列培養(yǎng)基3.5克/升Difco-Bacto-蛋白胨0.8克/升MnSO4·H2O100毫克/升FeSO4·7H2O15克/升Difco-Bacto-瓊脂750毫升海水245毫升蒸餾水10毫升柏貝林藍(lán)儲(chǔ)備溶液(4克/升)pH7.6以適當(dāng)?shù)南♂尪然驖舛葘⒑屑?xì)菌的樣品，如海水樣品、沉積物樣品、土壤樣品、來(lái)自礦床的土壤等施加在這種指示板上，使每個(gè)指示板上有100至300個(gè)個(gè)體菌落生長(zhǎng)。
細(xì)菌在這種指示板上培養(yǎng)5至10天之后，形成藍(lán)色菌落(即錳氧化活性被與細(xì)胞相關(guān)(cell-associated))，或在菌落周圍具有藍(lán)暈(即錳氧化酶被分泌至培養(yǎng)物上清液內(nèi))，對(duì)該細(xì)菌作進(jìn)一步的分析。1.b.柏貝林藍(lán)氧化微生物內(nèi)錳氧化酶的檢測(cè)如1a中所述分離的微生物可產(chǎn)生錳氧化酶，但錳過(guò)氧化物酶或Fe2+的氧化也導(dǎo)致染藍(lán)現(xiàn)象。根據(jù)Boogerd和de Vrind所述的方法(Boogerd和de Vrind(1987)，J.Bacteriol.，第169卷(2)，第489至494頁(yè))進(jìn)行錳氧化酶活性的特異性檢測(cè)首先，待測(cè)試微生物各自于分離所用的未添加瓊脂或柏具貝林藍(lán)的1升培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)10天。然后通過(guò)離心(15分鐘，10000xg，4℃)將細(xì)胞除去。在實(shí)施例1a中所述于指示板上形成藍(lán)色菌落的細(xì)胞的情況中，細(xì)胞團(tuán)粒用于下述凝膠電泳。在指示板上形成藍(lán)暈的細(xì)胞的情況中，在微粒滯留能力＞10000D的超濾膜上，通過(guò)超濾將無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液濃縮至其初始體積的五十分之一。將濃縮液或細(xì)胞團(tuán)粒與等體積的緩沖液(0.125摩爾/升Tris/Cl，pH6.8，20％甘油，2％SDS，10％2-巰基乙醇，0.01％溴酚藍(lán))混合。于10％聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離50微升該混合物的等分試樣。電泳后，用去離子水將凝膠洗滌四次，歷時(shí)15分鐘。之后，于pH7.5的在10毫摩爾/升Hepes中的100微摩爾/升二氯化錳內(nèi)保溫2小時(shí)。在此過(guò)程期間，在含有錳氧化酶的樣品中，電泳之后錳氧化酶被固定于凝膠內(nèi)的點(diǎn)，形成棕色氧化錳沉淀。因該混合物內(nèi)無(wú)過(guò)氧化物存在且除Mn2+之外亦無(wú)其它離子存在，因此觀察到的氧化錳形成在所有情況中都是由錳氧化酶直接氧化Mn2+所致。
以下實(shí)施例描述了在不再能夠成鞘且依照布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)DSM 12667保藏在德意志微生物保藏中心，不倫瑞克D-38124的生盤纖發(fā)菌(Leptothrix discophora)衍生菌的培養(yǎng)物上清液內(nèi)生產(chǎn)并自其中分離錳氧化酶。培養(yǎng)物為生產(chǎn)錳氧化酶，將生盤纖發(fā)菌培養(yǎng)在含有下列成分的培養(yǎng)基內(nèi)每升去離子水中0.25克/升Difco-蛋白胨0.25克/升Difco酵母提取物0.25克/升葡萄糖0.6克/升MnSO4·7H2O0.07克/升CaCl2·2H2O0.015克/升MgSO4·H2O在將培養(yǎng)高溫滅菌之前，用1摩爾/升氫氧化鈉將pH調(diào)至7.6。
為生產(chǎn)錳氧化酶，使45升所述的培養(yǎng)基與2升生盤纖發(fā)菌預(yù)培養(yǎng)物在同一培養(yǎng)基內(nèi)接種。在26℃及曝氣(每分鐘每單位體積培養(yǎng)基0.2體積的空氣)的條件下，培養(yǎng)40小時(shí)。自培養(yǎng)物上清液制備酶于40小時(shí)之后中止培養(yǎng)。通過(guò)離心將生盤纖發(fā)菌細(xì)胞自培養(yǎng)物上清液中分離出來(lái)。于微粒滯留能力＞10 000D的超濾膜上，通過(guò)超濾作用將無(wú)細(xì)胞、含有錳氧化酶的培養(yǎng)物上清液濃縮至0.5升。濃縮的培養(yǎng)物上清液用作下述實(shí)施例中的錳氧化酶源。
Mn3+離子能氧化無(wú)色化合物TMPD。氧化產(chǎn)物“沃斯特氏藍(lán)”具有深藍(lán)色，該顏色的加深可在波長(zhǎng)610納米處用光度法跟蹤。過(guò)程每次量測(cè)之前，新配2.1毫摩爾/升TMPD在蒸餾水中的TMPD儲(chǔ)備液。將待測(cè)定的酶制品用10毫摩爾/升HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸，pH7.5)稀釋，以使在下述活性測(cè)定中，于10分鐘測(cè)定時(shí)間之后，測(cè)得的OD610為0.5至1.5。
所用錳源是10毫摩爾/升硫酸錳在蒸餾水中的溶液。
為測(cè)定酶樣品內(nèi)的錳氧化酶活性，平行地將3毫升在HEPES內(nèi)的酶稀釋液(參見上文)與0.3毫升TMPD儲(chǔ)備液混合。于0分鐘時(shí)間點(diǎn)，各將10微升硫酸錳儲(chǔ)備液加入各平行測(cè)定溶液中。將兩個(gè)樣品均混勻并在40℃保溫10分鐘。10分鐘后，將樣品短暫離心(15秒；5000轉(zhuǎn)/分鐘)，隨后于1毫升各含硫酸錳的上清液內(nèi)測(cè)定OD 610。所用參比是無(wú)硫酸錳的參比樣品。在610納米波長(zhǎng)處，吸光度每增加1.0，即等于形成100微摩爾“沃斯特氏藍(lán)”。錳氧化酶的一個(gè)單位(IU)定義為于1分鐘內(nèi)導(dǎo)致由TMPD形成1微摩爾/升“沃斯特氏藍(lán)”所需酶的量。
為了隨后的測(cè)定，在所有情況下均使用來(lái)自實(shí)施例2b的含有錳氧化酶的濃縮培養(yǎng)物上清液及來(lái)自實(shí)施例2a的50微升芽孢殼懸浮液。測(cè)得的結(jié)果如下
實(shí)施例4作為錳濃度及絡(luò)合劑變化的函數(shù)的均勻存在的底物藜蘆基醇的氧化過(guò)程制備0.25克/毫升底物藜蘆基醇(3，4-二甲氧基芐醇)(Ardrich)在乙醇中的儲(chǔ)備液。
氧化反應(yīng)在45℃及輕微攪拌下進(jìn)行。為此在所有情況下均于22.23毫升含有絡(luò)合劑(50毫摩爾/升甲酸鹽、乳酸鹽、丙二酸鹽或草酸鹽；pH均為7.5)的溶液內(nèi)添加硫酸錳(0.00、0.05、0.50毫摩爾/升硫酸錳)。然后，在所有情況下均添加0.268毫升藜蘆基醇儲(chǔ)備液。在45℃下將混合物平衡10分鐘，隨后通過(guò)添加2.5毫升酶溶液(來(lái)自生盤纖發(fā)菌的錳氧化酶，10單位/毫升)以使反應(yīng)開始。8小時(shí)后通過(guò)高效液相色譜分析藜蘆醛的形成而研究反應(yīng)。為此，將0.4毫升H2SO4溶液(0.5摩爾/升)加入0.8毫升測(cè)試液內(nèi)。將20微升該樣品施加在LiChospher 60RP Select B分離柱(Merck 50940)上并用水/甲醇(65∶35)混合物洗脫。流速為1毫升/分鐘。洗脫液中的產(chǎn)物用UV檢測(cè)器在275納米處檢測(cè)。
下表顯示在本發(fā)明的方法中所述條件下于8小時(shí)內(nèi)將藜蘆基醇氧化成藜蘆醛的以％表示的量
實(shí)施例5木漿漂白將經(jīng)氧去木質(zhì)素、木質(zhì)素含量為k(kappa)16.5的軟木牛皮紙漿洗滌并用30毫摩爾/升草酸鈉緩沖液(pH 7.5)將其調(diào)整至紙漿密度為5％。隨后添加硫酸錳(0.5毫摩爾/升)。用適當(dāng)?shù)臄嚢杵鲗腋∫壕?0秒。之后，于兩份平行的溶液內(nèi)，以每克紙漿5單位的量添加錳氧化酶(生盤纖發(fā)菌、芽孢桿菌)。無(wú)酶的第三份溶液作為對(duì)照。將溶液再次均化60秒并將其引入容許氣體導(dǎo)入的控溫鋼質(zhì)高壓滅菌器內(nèi)。將該高壓滅菌器密封，施加3巴的氧氣壓，并在45℃將高壓滅菌器保溫4小時(shí)。之后將反應(yīng)液放出。在50℃下，用10體積的流水洗滌紙漿，之后，在70℃及堿性條件下，用氫氧化鈉水溶液將木質(zhì)素碎片自紙漿中萃取出來(lái)。萃取時(shí)，每千克紙漿使用20克氫氧化鈉。萃取后，在50℃下，再次用10體積的流水洗滌紙漿。依照“斯堪地那維亞紙漿及造紙會(huì)議”(Scandinavian Pulp and PaperBoard)的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試方法SCAN-C 177通過(guò)k值最后測(cè)定紙漿樣品的木質(zhì)素含量。
與對(duì)照樣品相比，當(dāng)使用本發(fā)明的氧化方法時(shí)，木質(zhì)素額外地去除10.9％至27.2％。
表內(nèi)所示數(shù)值表明，本發(fā)明的氧化系統(tǒng)適于防止所加染料轉(zhuǎn)印至棉質(zhì)樣品上。以品質(zhì)而言，其效果與商品洗滌劑相似。
為測(cè)定樣品與無(wú)錳氧化酶及硫酸錳的對(duì)照樣品在顏色上的差別，用色差計(jì)(CR-200，Minolta)測(cè)量風(fēng)干棉質(zhì)樣品的Y、y及x值。為評(píng)價(jià)本發(fā)明的方法的漂白效果，由所得數(shù)值確定Z值(Z＝(1－x－y)Y/y)。
下表顯示所測(cè)樣品白度與無(wú)酶且無(wú)硫酸錳對(duì)照樣品白度的比較。
由上表可看出，與無(wú)酶且無(wú)硫酸錳的樣品相比，含有錳氧化酶及硫酸錳的樣品的白度增加1.6至2.7點(diǎn)。
在該兩個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的氧化方法均成功地用于給定物質(zhì)的合成。所用的底物在這里僅試圖以例證方式證明方法的氧化能力，而并非試圖限制可以合成的產(chǎn)物的范圍。
使用CM 3700d型分光光度計(jì)(Minolta)并依照制造商的說(shuō)明書測(cè)定漂白度。測(cè)量在無(wú)光且無(wú)紫外線的條件下進(jìn)行。樣品的亮度以與白度標(biāo)準(zhǔn)(R 457)相比的全反射百分率而被測(cè)定。L*是亮度的量度(白＝100；黑＝0)。
經(jīng)處理的織物的數(shù)值與未經(jīng)處理的對(duì)照織物的數(shù)值相比。樣品與未經(jīng)處理的對(duì)照樣品相比的亮度變化(ΔL*)使用軟件PP2000(Opticontrol)計(jì)算得來(lái)。
亮度變化為5，已經(jīng)是肉眼可見的，即兩種氧化酶均完成了顯著的漂白作用。
權(quán)利要求
1.用于介體依賴性酶催化氧化的多成分系統(tǒng)，其包括氧化催化劑、氧化劑及介體，其特征在于a)氧化催化劑選自由錳氧化酶組成的組，b)氧化劑選自由氧及氧化合物組成的組，c)介體選自由含有錳離子的化合物組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的多成分系統(tǒng)，其特征在于，其另外包括選自由可以絡(luò)合錳離子的絡(luò)合劑組成的組的絡(luò)合劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多成分系統(tǒng)，其特征在于，介體為Mn2+或Mn3+離子。
4.如權(quán)利要求2或3所述的多成分系統(tǒng)，其特征在于，絡(luò)合劑不含氮、易于生物降解且在毒理學(xué)上無(wú)害。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的多成分系統(tǒng)，其特征在于，氧以氣態(tài)形式或液態(tài)氧形式直接存在或以含氧氣體混合物存在。
6.氧化底物的方法，其特征在于，在氧的存在下，以及如果適當(dāng)，在錳離子的絡(luò)合劑的存在下，錳氧化酶通過(guò)直接氧化Mn2+而形成Mn3+，以及Mn3+離子氧化底物，其自身被還原成Mn2+，而又可以被錳氧化酶直接氧化。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所用底物是水溶液、混合物或懸浮液的形式。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所用錳離子的濃度為0.005毫摩爾/升至50毫摩爾/升。
9.如權(quán)利要求6、7或8所述的方法，其特征在于，使用分壓為0.05至5巴的氧。
10.如權(quán)利要求6-9之一所述的方法，其特征在于，使用濃度為1毫摩爾/升至500毫摩爾/升的絡(luò)合劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及進(jìn)行介體依賴性酶催化氧化的多成分系統(tǒng),其包括氧化催化劑、氧化劑及介體,其特征在于:a)氧化催化劑選自由錳氧化酶組成的組;b)氧化劑選自由氧及含氧化合物組成的組;c)介體選自由含有錳離子的化合物組成的組。
文檔編號(hào)D21C5/00GK1341180SQ00804251
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月4日
發(fā)明者安東·坎杜西奧 申請(qǐng)人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)