專利名稱：提高木聚糖酶嗜熱性、嗜堿性和熱穩(wěn)定性的修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是通過蛋白質(zhì)工程修飾蛋白質(zhì)。具體來說，本發(fā)明涉及耐高溫和高pH的經(jīng)過修飾的木聚糖酶。木聚糖酶用于增強(qiáng)紙漿的漂白以制造白色的紙張。本發(fā)明使生產(chǎn)的木聚糖酶具有與家族11木聚糖酶相關(guān)的增強(qiáng)漂白能力，但在高溫和高pH時(shí)仍保持活性，比目前使用的木聚糖酶更適于紙漿廠的操作需要。
背景技術(shù)：
自從1991年以來，木聚糖酶一直用于增強(qiáng)紙漿的漂白以生產(chǎn)亮白的紙張。在紙漿漂白之前將這些酶加入紙漿，清除紙漿中的木聚糖部分。此程序使隨后的漂白試劑，包括氯氣，二氧化氯，過氧化氫，氧，臭氧和氫氧化鈉，比沒有木聚糖酶處理程序更有效地漂白紙漿。漂白效率的增強(qiáng)使得工廠減少了氯基試劑的用量，從而降低了工廠廢水中有毒有機(jī)氯化合物的量，使得能生產(chǎn)更白的紙漿或降低工廠在漂白劑方面的開支。木聚糖酶用于漂白的商業(yè)用途綜述于Tolan，et al，Pulp and PaperCanada，December 1995。
已有近100種微生物中報(bào)道存在木聚糖酶。木聚糖酶分屬于糖基水解酶40多個(gè)家族中的幾個(gè)。糖基水解酶，包括木聚糖酶，甘露聚糖酶，淀粉酶，β-葡聚糖酶，纖維素酶和其它碳水化合物水解酶，是根據(jù)諸如氨基酸序列，三維結(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)的幾何學(xué)等性質(zhì)進(jìn)行分類的(Gilkes，et al，(1991)Microbiol.Reviews 55303-315)。
對紙漿漂白有特殊用處的是歸類于家族11的酶。此家族中的所有酶均為木聚糖酶并以“家族11木聚糖酶”而著稱。它與一些出版物中使用的家族G木聚糖酶同義，但是我們將使用術(shù)語家族11。
表1列出了目前已知的家族11木聚糖酶。其中的大多數(shù)分子量約為21,000道爾頓。家族11木聚糖酶中的三個(gè)-糞堆梭菌(Clostridium stercorarium)XynA，變青鏈霉菌XynB，和褐色熱單胞XynA-具有31,000至50,000道爾頓的較高的分子量。但是，這些木聚糖酶與其它家族11木聚糖酶類似具有一個(gè)約21,000道爾頓的催化核心序列。家族11木聚糖酶的氨基酸序列(或者，對較大的酶來說，催化核心的序列)顯示高度的相似性(圖1)。來源于細(xì)菌，酵母或真菌的家族11木聚糖酶具有同樣的通用分子結(jié)構(gòu)(參見CAMPBELL等的美國專利5,405,769中的圖2)。
表1.家族11木聚糖酶微生物木聚糖酶黑曲霉 XynA川地曲霉 XynC塔賓曲霉 XynA環(huán)狀芽孢桿菌 XynA短小芽孢桿菌 XynA枯草芽孢桿菌 XynA糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi) XynD欽氏菌 Xyn丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌 XynB糞堆梭菌(Clostridium stercorarium) XynA產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes) XynCNeocallimastix patriciarum XynA達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei) XynII產(chǎn)黃瘤胃球菌 XynA群交裂褶菌 Xyn變青鏈霉菌 XynB變青鏈霉菌 XynC鏈霉菌36a號菌種Xyn嗜熱紫鏈霉菌 XynII褐色熱單胞 XynA哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Xyn里氏木霉(Trichoderma reesei) XynI里氏木霉 XynII綠色木霉 Xyn如果一個(gè)酶具有家族11的共有氨基酸，包括兩個(gè)作為關(guān)鍵催化殘基的谷氨酸(E)，那么這個(gè)酶就被歸類于家族11。這些E殘基按Trichoderma reesei xynII的編號是氨基酸86和177。通過一種本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的方法-氨基酸序列對比可以容易地確定其它家族11木聚糖酶的關(guān)鍵E殘基的相應(yīng)位置。家族11木聚糖酶共有的氨基酸用黑體字標(biāo)示于圖1(Wakarchuk，et al，Protein Science 3467-475(1994))。
在用于紙漿漂白時(shí)，家族11木聚糖酶有幾點(diǎn)優(yōu)于其它木聚糖酶。家族11木聚糖酶中的大多數(shù)都比其它家族的木聚糖酶小，與其它木聚糖酶相比較小的分子量可能有助于穿透紙漿纖維以從紙漿中釋放出木聚糖并增強(qiáng)漂白作用。就其催化活性而論，家族11木聚糖酶是“純的”木聚糖酶，與其它家族的木聚糖酶不同，這些酶只水解木聚糖而不水解纖維素。纖維素的水解破壞了紙漿，工廠不能接受。在家族11木聚糖酶中，用木材腐敗真菌木霉制造的木聚糖酶已經(jīng)被最廣泛地用于增強(qiáng)紙漿漂白。尤其是，Trichoderma reesei木聚糖酶II(Xyn II)已被廣泛使用，其分子量為21,000，等電點(diǎn)為9.1。
家族11木聚糖酶除了用于紙漿漂白的優(yōu)點(diǎn)外，這些酶還有顯著的缺點(diǎn)。這些酶對紙漿顯示活性的溫度和pH范圍是45℃-55℃和pH5.0-7.5。一小部分工廠按傳統(tǒng)的方法在這些范圍內(nèi)進(jìn)行操作。但是，典型的紙漿處于60℃-70℃和pH10-12。在一些工廠中溫度和pH的調(diào)節(jié)是可以接受的和常規(guī)的。但是，在很多工廠獲得期望的處理?xiàng)l件會引起嚴(yán)重的問題。
根據(jù)如何實(shí)施漂白，將紙漿冷卻到低于60℃的溫度會使漂白效率降低到一個(gè)不可接受的程度。例如，如果一個(gè)工廠正在完全用二氧化氯漂白并在氯化塔中保留時(shí)間少于20分鐘，那么充分漂白的最低溫度是60℃。如果這個(gè)工廠不能在酶處理和氯化之間加熱紙漿(這是經(jīng)常的情況)，那么降低溫度用于酶處理階段是不可接受的。
硫酸用于控制紙漿的pH。鑒于設(shè)備的金屬屬性，使用硫酸控制pH會腐蝕鋼管和其它設(shè)備，硫酸還危及安全。
另外一個(gè)在漂白中使用這些酶，尤其是Trichoderma reesei木聚糖酶的次要問題是低的熱穩(wěn)定性。貯存幾周后工廠中的溫暖的環(huán)境溫度有可能使這些酶失活。這個(gè)問題不如調(diào)整紙漿的溫度和pH的問題重要，但是也必須考慮使用冷凍貯存或在酶中加入穩(wěn)定劑化合物。
因此，希望的是使用在比Trichoderma reesei Xyn II更高pH和溫度范圍時(shí)有活性的木聚糖酶，尤其是家族11木聚糖酶。這將允許工廠能夠在木霉木聚糖酶的活性范圍之外運(yùn)轉(zhuǎn)以實(shí)施木聚糖酶處理并從本文理中獲得好處，還會使工廠用比目前狀況更少的硫酸和冷卻水來實(shí)施木聚糖酶處理，節(jié)省了生產(chǎn)消耗并提高了可控制性和貯存穩(wěn)定性。
在討論改進(jìn)木聚糖酶的性能所采用的方法之前，定義下列術(shù)語是有幫助的。
嗜熱性在本文被定義為在高溫時(shí)酶保持活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1比木聚糖酶#2能在更高的溫度中水解木聚糖，木聚糖酶#1就具有比木聚糖酶#2更高的嗜熱性。嗜熱性涉及有底物時(shí)的酶活性。在本發(fā)明中，底物可以是紙漿木聚糖或純的木聚糖。
為了定義嗜熱性，闡明底物是重要的。在較高溫度時(shí)大多數(shù)木聚糖酶水解純的木聚糖的效率高于紙漿處理。這是由于底物相關(guān)因子(即紙漿中存在的抑制劑)，處理時(shí)間，pH，和用于進(jìn)行測試程序的其它方面聯(lián)合起作用造成的。除非另有描述，本文所指的嗜熱性的定量測定是用純的木聚糖作底物。
熱穩(wěn)定性在本文被定義為待儲存的酶在不存在木聚糖底物時(shí)高溫溫育，當(dāng)回到標(biāo)準(zhǔn)分析狀態(tài)時(shí)顯示木聚糖酶活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1可在70℃保溫24小時(shí)并保留所有活性，而木聚糖酶#2經(jīng)過70℃24小時(shí)后失去所有活性，就可以說木聚糖酶#1的熱穩(wěn)定性高于木聚糖酶#2。與嗜熱性相反，熱穩(wěn)定性涉及無木聚糖底物溫育后保留的酶活性。
明確地定義這兩個(gè)術(shù)語以克服文獻(xiàn)中的混淆，文獻(xiàn)中經(jīng)常將這兩個(gè)術(shù)語用作同義語或互相代表。它們目前的用法與Mathrani and Ahring，Appl.Microbiol.Biotechnol.3823-27(1992)的一致。
嗜堿性在本文被定義為酶在高(堿性)pH時(shí)的保持活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1比木聚糖酶#2能在更高的pH中水解木聚糖，木聚糖酶#1就具有比木聚糖酶#2更高的嗜堿性。嗜堿性類似于嗜熱性，它涉及存在木聚糖底物時(shí)的酶活性。
為了改進(jìn)用于紙漿漂白的木聚糖酶，嗜熱性和嗜堿性比熱穩(wěn)定性更為重要。絕大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)的工作只集中在改進(jìn)熱穩(wěn)定性上。
可以采用兩個(gè)通用的途徑以使木聚糖酶具有較高的pH和溫度范圍。它們是(1)篩選具有期望特性的天然的木聚糖酶，和(2)使用蛋白質(zhì)工程改進(jìn)已知的木聚糖酶的性能。
在天然的木聚糖酶中，已經(jīng)從諸如生長在80-100℃的Caldocellumsaccharolyticum，Thermatoga maritima和Thermatoga菌株FjSS3-B.1的嗜熱微生物中分離到了熱穩(wěn)定的酶(Lüthi et al.1990；Wenterhalter et al.1995；Simpson et al.1991)。但是所有酶都相當(dāng)大，分子量為35-120kDa(320-1100個(gè)殘基)。這些木聚糖酶中的一些(C.saccharolyticum木聚糖酶A)不屬于家族11并同時(shí)具有木聚糖酶和纖維素酶活性(Lüthi et al.1990)。這種纖維素酶活性在紙漿漂白中是不希望的。另外，在非常高的溫度發(fā)揮正常功能的超高熱穩(wěn)定性木聚糖酶在紙漿漂白中的相對較低的溫度時(shí)活性限低。
家族11木聚糖酶的大多數(shù)在45℃到55℃范圍內(nèi)對紙漿漂白有效。但是，家族11還包括至少兩個(gè)熱穩(wěn)定的木聚糖酶，兩個(gè)酶正巧有比其它家族11木聚糖酶更高的分子量。這兩個(gè)酶是296個(gè)氨基酸、分子量為32,000Da的褐色熱單胞木聚糖酶(又稱為TfxA)(Irwin et al.(1994)Appl.Environ.Micorbiol.60763-770；Wilson et al.1994，WO 95/12668)和511個(gè)氨基酸、分子量為56,000Da、最適溫度為70℃的Clostridiumstercorarium木聚糖酶A(Sakka et al.(1993)Biosci.Biotech.Biochem.57273-277)。
這些熱穩(wěn)定的木聚糖酶的有些性質(zhì)在紙漿漂白應(yīng)用中是潛在的問題。首先，大分子量可能限制酶穿透進(jìn)入紙漿纖維。其次，這些酶具有其它家族11木聚糖酶中沒有的至少一個(gè)單拷貝的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。位于TfxA的延伸的C-末端的CBD可引起貯存中蛋白的沉淀和活性的喪失。
因此，這些天然的木聚糖酶有局限。
一個(gè)替代的途徑是對熟知的木聚糖酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。通過蛋白質(zhì)工程手段，可以在蛋白上進(jìn)行特定的改變以改進(jìn)一個(gè)期望的性能，諸如溫度或pH范圍，而不改變諸如蛋白可溶性的其它性質(zhì)。
當(dāng)實(shí)施蛋白質(zhì)工程以修飾蛋白性質(zhì)時(shí)，我們必須選擇通用的方法，然后是特異性位點(diǎn)和要進(jìn)行的修飾。通用的方法包括(1)定點(diǎn)誘變，(2)隨機(jī)誘變，(3)嵌合修飾，(4)二聚體形成，和(5)糖基化。這些通用的方法中的每一個(gè)都有大量的選擇可以用來對蛋白質(zhì)進(jìn)行特定修飾。不同突變對酶特性包括嗜熱性和嗜堿性的的影響常常是不可預(yù)知的。通常，在所有可能的修飾中只有很少的部分(如果有的話)產(chǎn)生顯著的益處。因此，通過蛋白質(zhì)工程來改進(jìn)一個(gè)蛋白的性質(zhì)是一個(gè)艱難的冒險(xiǎn)，目前在家族11木聚糖酶上取得的有限成功反映了這一點(diǎn)。修飾木聚糖酶的工作描述如下。
定點(diǎn)誘變方法包括一個(gè)蛋白中特定氨基酸的修飾。以定點(diǎn)誘變?yōu)榛A(chǔ)的修飾被稱為點(diǎn)突變。家族11木聚糖酶的定點(diǎn)誘變已經(jīng)被用來生產(chǎn)熱穩(wěn)定性稍有改進(jìn)的木聚糖酶。CAMPBELL等(U.S.專利5,405,769)描述了通過兩種類型的修飾改進(jìn)一種家族11的木聚糖酶-環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(縮寫為BcX)的方式。它們是(i)分子內(nèi)二硫鍵，和(ii)在N-末端的定點(diǎn)誘變。
CAMPBELL等描述了如何在氨基酸#98和#152，#100和#148，及#-1和#187之間插入二硫鍵，上述氨基酸編號是根據(jù)環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶的編號。二硫鍵修飾提高了木聚糖酶在62℃的穩(wěn)定性。但是，這些二硫鍵修飾的酶在嗜熱性方面沒有提高(Wakarchuck et al.(1994)Protein Engineering 71379-1386)。因此，熱穩(wěn)定性和嗜熱性不一定是相伴的。
CAMPBELL等還描述在接近BcX的N-末端的三個(gè)修飾(命名為T3G，D4Y(F)和N8Y(F))產(chǎn)生了在57℃有熱穩(wěn)定性的突變木聚糖酶，熱穩(wěn)定性只提高了2℃。與CAMPBELL等相關(guān)的PCT公開出版物WO94/24270中，描述了為改進(jìn)BcX的第四個(gè)有益的修飾，即S22P。這套四個(gè)修飾(在文件中被命名為TS19a)顯示了比BcX更高的熱穩(wěn)定性和嗜熱性。但是，某些因素限制了這些BcX的修飾在其它家族11木聚糖酶中的應(yīng)用。這些將殘基-3，4，8和22(BcX氨基酸編號)相應(yīng)地轉(zhuǎn)變成甘氨酸，酪氨酸(或苯丙氨酸)，酪氨酸(或苯丙氨酸)和脯氨酸的突變與家族11木聚糖酶的大多數(shù)不相關(guān)，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)擁有了這些“好的”殘基(參見圖1)。這些修飾不足之處的最好說明是Trichoderma reesei的XynII，它擁有所有四個(gè)“好的”殘基，但是在嗜熱性和嗜堿性方面仍是中等。
隨機(jī)誘變包括在整個(gè)蛋白內(nèi)的隨機(jī)的氨基酸修飾。這個(gè)方法被ARASE等((1993)FEBS Lett.316123-127)用來產(chǎn)生熱穩(wěn)定性提高的家族11木聚糖酶，他們描述了通過在殘基-12，26，38，48和126(根據(jù)BpX的氨基酸編號)的修飾使短小芽孢桿菌木聚糖酶(縮寫為BpX)的熱穩(wěn)定性有了中等的提高。但是，ARASE等沒有報(bào)道其特定修飾對嗜熱性或嗜堿性的任何改進(jìn)。ARASE等的BpX木聚糖酶最大改進(jìn)的例子獲得的熱穩(wěn)定性提高是很小的，在57℃溫育20分鐘后，只保留40％的殘留酶活性。另外兩個(gè)其它的在N-末端附近的殘基12和26修飾的BpX木聚糖酶，溫育后殘留的活性相應(yīng)為1和11％。另外，殘基26修飾的BpX木聚糖酶還有其它修飾，所以這個(gè)單一的修飾對熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)，如果有的話，根據(jù)ARASE等報(bào)道也是不清楚的。
嵌合修飾包括用另外一個(gè)蛋白的氨基酸序列替換一個(gè)蛋白的氨基酸的一部分。根據(jù)我們了解，這種方法還沒有在任何家族11木聚糖酶上實(shí)施。
二聚體形成包括將兩個(gè)分子合并成一個(gè)蛋白。此技術(shù)已經(jīng)被用來通過分子間二硫鍵連接兩個(gè)BcX分子(Wakarchuk，et al，Protein Engineering(1994))，得到的二聚體BcX在熱穩(wěn)定性上只顯示不顯著的提高，比上面描述的帶有分子內(nèi)二硫鍵的BcX還要小。
眾所周知，自然的糖基化作用，即碳水化合物結(jié)合到蛋白質(zhì)上，有時(shí)會提高蛋白質(zhì)包括Trichoderma reesei xyn II的熱穩(wěn)定性。合成糖基化作用還沒有被用來改進(jìn)家族11木聚糖酶的這些性能。
不管使用哪種蛋白質(zhì)工程方法，一個(gè)關(guān)鍵的方面是確定修飾哪個(gè)氨基酸，因?yàn)閮H有幾個(gè)選擇可以改進(jìn)酶的性能。Sung，et al，Biochem.Cell Biol.73253-259(1995)的工作說明了這一點(diǎn)，他們將Trichoderma reesei木聚糖酶II的#19氨基酸從天冬酰胺修飾成賴氨酸。這個(gè)修飾降低了3℃的酶的嗜熱性。
因此，盡管在家族11木聚糖酶上花費(fèi)了大量的努力，還是沒有研制出嗜熱性和嗜堿性顯著改進(jìn)的經(jīng)修飾的家族11木聚糖酶。這種酶，具體來說Trichoderma reeseixyn II的工程化的版本應(yīng)可以馬上應(yīng)用于商業(yè)操作，在滿足工廠工藝條件的同時(shí)降低漂白化學(xué)試劑的需要來生產(chǎn)漂白的紙漿。這種酶在其它領(lǐng)域也有潛在的應(yīng)用價(jià)值，這種應(yīng)用的一些例子是作為給動物喂食的添加劑以增強(qiáng)飼料的可消化性，其中飼料的高溫顆?；鼓壳暗拿冈诤芏嗲闆r下不適合；和加工小麥與玉米以生產(chǎn)淀粉，其中的高溫過程破壞目前的酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及修飾某些特定的家族11木聚糖酶以改進(jìn)嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。本發(fā)明在創(chuàng)造使紙漿廠獲得增強(qiáng)漂白益處的酶方面有特殊用途，已知這些酶與家族11木聚糖酶相關(guān)聯(lián)，但它們在更適于最佳工廠操作參數(shù)的比目前使用的任何木聚糖酶都要高的溫度和pH條件下發(fā)揮漂白作用。
本發(fā)明的用途特異地針對具有下列兩個(gè)重要性質(zhì)的家族11木聚糖酶(i)從木霉，芽孢桿菌，曲霉或鏈霉菌制備的酶。
(ii)在Trichoderma reesei木聚糖酶的位置14，或根據(jù)用于命名(i)中的其它木聚糖酶的常規(guī)編號系統(tǒng)的相對應(yīng)位置上包括酪氨酸或苯丙氨酸的酶。
對同時(shí)擁有這些性質(zhì)的家族11木聚糖酶來說，下面兩類修飾中的任何一個(gè)都會驚人地提高酶的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性(1)定點(diǎn)誘變對那些選擇的在N-末端從位置10(按Trichoderma reesei木聚糖酶II編號)開始的上游有至少8個(gè)氨基酸殘基的木聚糖酶來說，修飾包括用另一個(gè)氨基酸取代氨基酸10。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是除了用一個(gè)不同的氨基酸取代氨基酸10的關(guān)鍵步驟外，還用纈氨酸，甲硫氨酸，異亮氨酸或亮氨酸取代氨基酸27和29。一個(gè)最佳的實(shí)施方案是用組氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸相應(yīng)地取代位置10，27和29的天然氨基酸。
(2)嵌合修飾用一段來自褐色熱單胞木聚糖酶A(Tfx)的相應(yīng)位置的序列置換N-末端區(qū)域內(nèi)的一段氨基酸序列。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是用一個(gè)甘氨酸-精氨酸-精氨酸三肽或來源于丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(CaX)N-末端的一段多至10個(gè)的氨基酸序列，從N-末端開始向上游延伸嵌合的酶。
出乎意料的是，根據(jù)本發(fā)明修飾的木聚糖酶比未修飾的酶具有改進(jìn)很大的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。這些修飾的木聚糖酶中的一些展示了比天然木聚糖酶提高28℃的嗜熱性，和提高2個(gè)pH單位的嗜堿性。另外，一些修飾的木聚糖酶在85℃和pH9的條件下發(fā)揮作用的能力明顯好于任何一個(gè)經(jīng)確認(rèn)的嗜熱的家族11木聚糖酶，包括TfxA。
發(fā)明人相信以前的報(bào)道中沒有一個(gè)家族11木聚糖酶的修飾如此驚人地提高家族11木聚糖酶的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明的修飾的環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶特別是在比ARASE等(該文中涉及BpX)和CAMPBELL等(該文中涉及BcX)所揭示的那些修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的60-70℃的溫度范圍更高的溫度時(shí)有活性。
另外，本發(fā)明的修飾的木聚糖酶顯示了驚人提高的解決紙漿處理問題的性能。修飾的木聚糖酶在處理紙漿方面還展示出家族11木聚糖酶在最適條件時(shí)的典型的整體潛力，但在其它木聚糖酶中沒有觀察到。
本文所講授的蛋白修飾對家族11木聚糖酶來說以前沒有報(bào)道，且現(xiàn)有技術(shù)也沒有提示本文講授的改進(jìn)可以提高嗜熱性，嗜堿性，或熱穩(wěn)定性。
ARASE等((1993)FEBS Lett.316123-127)描述了通過在殘基12，26，38，48和126(根據(jù)BpX的氨基酸編號)的修飾使短小芽孢桿菌木聚糖酶(縮寫為BpX)的熱穩(wěn)定性有了中等的提高，這些殘基分別對應(yīng)于Trichoderma reesei xynII的殘基11，26，38，48和121，但不是依據(jù)本發(fā)明原則的殘基。另外，與本發(fā)明的發(fā)明人不同，依據(jù)Arase講授的內(nèi)容其沒有報(bào)道嗜熱性或嗜堿性的任何改進(jìn)。Arase改進(jìn)最大的BpX熱穩(wěn)定性的提高是很小的，在57℃溫育20分鐘后，只保留40％的殘留酶活性。對另外兩個(gè)其它的在殘基12(在xynII中為11)和26修飾的BpX木聚糖酶，熱穩(wěn)定性的提高表現(xiàn)在貯存后殘留的活性相應(yīng)為1和11％。另外，殘基26修飾的BpX木聚糖酶還有其它修飾，所以這個(gè)單一的修飾對熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)，如果有的話，也是不清楚的。
CAMPBELL等和CAMPBELL等的PCT出版物，闡述了四個(gè)可以在環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(BcX)中進(jìn)行的修飾(命名為T3G，D4Y(F)，N8Y(F)，和S22P)。這些變化對應(yīng)于Trichoderma reesei木聚糖酶編號的氨基酸12，13，17，和31。CAMPBELL等所講授的氨基酸在木霉木聚糖酶和大多數(shù)其它家族11木聚糖酶中已存在，因此可以認(rèn)為這些氨基酸實(shí)質(zhì)上與這些木聚糖酶的性能的改進(jìn)無關(guān)。
CAMPBELL等對環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶的修飾也沒有象本發(fā)明的修飾的環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶那樣多地改進(jìn)酶的性能。實(shí)施例6和10顯示本發(fā)明的修飾的環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶比CAMPBELL等的最好的木聚糖酶具有更高的嗜熱性(+14℃)和更高的嗜堿性(+1.5pH單位)。此外，在最適溫度時(shí)，本發(fā)明的修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的活性三倍于CAMPBELL等修飾的木聚糖酶。
以前沒有報(bào)道表明氨基酸10，27，和29對家族11木聚糖酶的性能是重要的。令人吃驚的是，本發(fā)明人顯示在木霉xyn II上將這些氨基酸相應(yīng)地修飾成組氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸可顯著提高此酶的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。
應(yīng)該注意到盡管三個(gè)天然的家族11木聚糖酶(由短小芽孢桿菌，Clostridiumstercorarium(xyn A)，和褐色熱單胞產(chǎn)生的木聚糖酶)在這些位置具有這些特定的氨基酸，但這三個(gè)木聚糖酶中沒有一個(gè)顯示本發(fā)明下面結(jié)果講授的期望特性的組合。沒有理由預(yù)期嗜熱性是因?yàn)檫@三個(gè)氨基酸的存在所致，并且天然的木聚糖酶沒有強(qiáng)調(diào)這三個(gè)氨基酸對酶的性能是關(guān)鍵的。盡管梭狀芽孢桿菌和熱單胞木聚糖酶是嗜熱的，但B.pumilis木聚糖酶不是嗜熱的，因?yàn)槠渥罴褱囟鹊陀?0℃(Nissen，et al，1992)。除了上面提到的三個(gè)共有位置以外，這三個(gè)木聚糖酶在超過75個(gè)位置具有相同的氨基酸。與其它家族的木聚糖酶一樣，梭狀芽孢桿菌和熱單胞木聚糖酶都含有被推測為賦予熱穩(wěn)定性的獨(dú)特的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Fontes，et al，1995，Biochem.J.307151-158)。
在權(quán)利要求書中本發(fā)明人無意要求在位置10，27，和29擁有優(yōu)選殘基的三個(gè)天然家族11木聚糖酶中的任何一個(gè)。本發(fā)明限定在那些在T.reesei xyn II的位置14，或其它木聚糖酶的相應(yīng)位置具有酪氨酸或苯丙氨酸的木聚糖酶，這不包括在位置14具有天冬氨酸的短小芽孢桿菌木聚糖酶。本發(fā)明還限定在由木霉，鏈霉菌，曲霉，和芽孢桿菌產(chǎn)生的木聚糖酶，這不包括熱單胞和梭狀芽孢桿菌木聚糖酶。
除了這三個(gè)木聚糖酶外，其它兩個(gè)家族11中的木聚糖酶在位置27具有甲硫氨酸和在位置29具有亮氨酸，它們是丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(最適溫度43℃)和變青鏈霉菌xynC(最適溫度55℃)。但是，這兩個(gè)酶中沒有一個(gè)是嗜熱的，因此都沒有提示修飾位置27和29是有用的。
在位置10，27，和29特異性選擇組氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸會提高Trichodermareesei xyn II的穩(wěn)定性。鑒于這個(gè)事實(shí)，現(xiàn)在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到大量氨基酸中的任何一個(gè)取代進(jìn)入位置10都將改進(jìn)此酶的性能。鑒于在位置27和29的甲硫氨酸和亮氨酸的改進(jìn)作用，還應(yīng)該認(rèn)識到任何疏水的中等大小的氨基酸，包括纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和甲硫氨酸在這些位置都是有益的。
本發(fā)明的這方面的重要發(fā)現(xiàn)是位置10，27，和29對Trichoderma reesei xynII的穩(wěn)定性是重要的。基于這一點(diǎn)講授的內(nèi)容，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到這種修飾將有益于某些其它的家族11木聚糖酶，并且為了從這種修飾得到益處家族11木聚糖酶必須滿足兩個(gè)條件。
首先，家族11木聚糖酶在位置10的上游必須擁有至少8個(gè)氨基酸殘基。幾個(gè)家族11木聚糖酶具有截短的N-末端。位置10的修飾與具有截短的N-末端的木聚糖酶無關(guān)。
其次，家族11木聚糖酶在Trichoderma reesei木聚糖酶II編號的位置14，或其它木聚糖酶的相應(yīng)位置必須擁有亮氨酸或苯丙氨酸。在位置14的亮氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈直接指向此蛋白的活性位點(diǎn)。亮氨酸和苯丙氨酸大小相似且都具有一個(gè)六元芳香環(huán)，當(dāng)結(jié)合到一個(gè)木聚糖底物上時(shí)它可能潛在地參與與木糖環(huán)的堆積互作。在此位置上存在其它氨基酸會對此蛋白的整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的改變。因此，只有那些在位置14具有亮氨酸或苯丙氨酸的家族11木聚糖酶適于進(jìn)行位置10的修飾，而在相應(yīng)位置具有其它殘基的家族11木聚糖酶不受這種修飾的影響。
在已知的木霉，鏈霉菌，芽孢桿菌，和曲霉的家族11木聚糖酶中，只有Trichoderma reesei xyn II，Trichoderma harzainum xyn，綠色木霉xyn，變青鏈霉菌xynB，和變青鏈霉菌xynC滿足這兩個(gè)條件。因此，根據(jù)本文的講授只有這些酶是目前已知的適合在位置10，27，和29進(jìn)行修飾的酶。
本發(fā)明的嵌合木聚糖酶以前還沒有被報(bào)道過，且沒有任何出版物提示這些特定的嵌合木聚糖酶有益于木聚糖酶的性能。更為意外的是，在某些情況下，嵌合木聚糖酶的嗜熱性和嗜堿性好于組成嵌合木聚糖酶的任何一個(gè)單獨(dú)的木聚糖酶的嗜熱性和嗜堿性。這些酶的例子是實(shí)施例7和11中的修飾的木聚糖酶NI-BX6和NI-BX7。
本發(fā)明的這方面的重要發(fā)現(xiàn)是用褐色熱單胞木聚糖酶A嵌合修飾Trichodermareesei木聚糖酶II或環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶A的N-末端區(qū)的片段可以增加這些酶的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。
基于這一點(diǎn)講授的內(nèi)容，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到假定滿足一個(gè)條件，用褐色熱單胞xynA和來自木霉，曲霉，鏈霉菌和芽孢桿菌的其它家族11木聚糖酶可以形成性能改進(jìn)的嵌合木聚糖酶。家族11木聚糖酶必須在Trichoderma reesei木聚糖酶II的位置14，或其它木聚糖酶的相應(yīng)位置擁有酪氨酸和苯丙氨酸，位置14的酪氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈直接指向此蛋白的活性位點(diǎn)。亮氨酸和苯丙氨酸大小相似且都具有一個(gè)六元芳香環(huán)，當(dāng)結(jié)合到一個(gè)木聚糖底物上時(shí)六元芳香環(huán)可能潛在地參與與木糖環(huán)的堆積互作。褐色熱單胞木聚糖酶A在此位置上具有苯丙氨酸。只有那些在位置14具有酪氨酸或苯丙氨酸的家族11木聚糖酶適合與褐色熱單胞木聚糖酶A形成嵌合木聚糖酶。在相應(yīng)位置上具有其它殘基的家族11木聚糖酶不適合這種修飾。
在已知的木霉，鏈霉菌，芽孢桿菌，和曲霉的家族11木聚糖酶中，只有Trichoderma reesei xyn II，Trichoderma harzainum xyn，綠色木霉xyn，Trichodermareesei xyn I，變青鏈霉菌xyn B，變青鏈霉菌xyn C，環(huán)狀芽孢桿菌xyn A，枯草芽孢桿菌xyn A，黑曲霉xyn A，川地曲霉xyn A和塔賓曲霉xyn A滿足這個(gè)條件。因此，根據(jù)本文的講授只有這些酶是目前已知的適合進(jìn)行嵌合修飾的酶。
以前從來沒有報(bào)道過蛋白的上游延伸可以增強(qiáng)家族11木聚糖酶的性能，也沒有報(bào)道過它對其它酶的益處。沒有理由預(yù)期在N-末端的上游增加氨基酸可以提高嗜熱性，嗜堿性或熱穩(wěn)定性。
沒有理由預(yù)期用三個(gè)氨基酸甘氨酸-精氨酸-精氨酸延伸上游會改進(jìn)酶的性能。這套三氨基酸在任何天然的木聚糖酶中都是沒有的。天然家族11木聚糖酶中有兩個(gè)，短小芽孢桿菌和Clostridium stercorarium，直接在N-末端的上游有一個(gè)單一的精氨酸，這兩個(gè)木聚糖酶都不具有對修飾的BcX和TrX的改進(jìn)的嗜熱性有重要作用的精氨酸和甘氨酸。梭狀芽孢桿菌酶是嗜熱的，但芽孢桿菌酶不是嗜熱的，所以天然的木聚糖酶沒有定向于這種修飾。
沒有理由預(yù)期用來源于丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xyn B(CaX)的一個(gè)10個(gè)氨基酸序列進(jìn)行N-末端上游的延伸會改進(jìn)其它家族11木聚糖酶的嗜熱性。CaX最適溫度僅為43℃，并不比其它的家族11木聚糖酶更好。因此，從這個(gè)酶而來的氨基酸序列可以改進(jìn)其它木聚糖酶的嗜熱性是出乎意料的。
用褐色熱單胞木聚糖酶A的N-末端序列取代進(jìn)入來自T.reesei的木聚糖酶II和來自環(huán)狀芽孢桿菌的木聚糖酶A形成的嵌合木聚糖酶說明了本文描述的上游延伸。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到所說的上游延伸將改進(jìn)嵌合木聚糖酶的性能，嵌合木聚糖酶可以通過將褐色熱單胞木聚糖酶A的N-末端序列取代進(jìn)入木霉，曲霉，鏈霉菌和芽孢桿菌來源的家族11木聚糖酶而形成。
總之，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了對處理紙漿以改進(jìn)其漂白作用具有商用價(jià)值的具有期望特性的獨(dú)特的酶。


圖1顯示幾個(gè)家族11木聚糖酶中多個(gè)氨基酸序列的對比。每個(gè)字母代表一個(gè)氨基酸，選用的是標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸縮寫。分成的幾部分是任意選擇以適合頁面的字母排列，與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并無關(guān)聯(lián)。標(biāo)示出了Trichoderma reesei xyn II的1到30位氨基酸編號。在至少80％所列家族11木聚糖酶中是相同的氨基酸用黑體標(biāo)出。所有家族11木聚糖酶都相同的殘基下有下劃線。Clostridium stercorarium，變青鏈霉菌(xynB)，和褐色熱單胞的木聚糖酶只列出了其催化核心序列。
圖2顯示真菌Trichoderma harzianum木聚糖酶(ThX)和細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(BcX)的主鏈結(jié)構(gòu)。
圖3顯示為了在質(zhì)粒pXYbc(3-190)中構(gòu)建編碼木霉木聚糖酶的基因序列而合成的寡核苷酸。
圖4顯示為了在質(zhì)粒pXYbc中構(gòu)建編碼環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶BcX的基因序列而合成的寡核苷酸。
圖5顯示溫度對NI-TX突變體木聚糖酶的酶活性的影響。以40℃的酶活性作參照將酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6顯示溫度對NI-BX突變體木聚糖酶的酶活性的影響。以40℃的酶活性作參照將酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。還提供了Campbell等的BcX突變體TS19a的曲線。
圖7顯示65℃時(shí)pH對NI-TX修飾的木霉木聚糖酶的酶活性的影響，以最大酶活性作參照將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8顯示65℃時(shí)pH對NI-BX修飾的木霉木聚糖酶的酶活性的影響，還提供了BcX突變體TS19a的曲線。以最大酶活性作參照將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。
圖9顯示50℃時(shí)pH對修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的酶活性的影響。包括了Wilson等(PCT，1995)公布的TfxA數(shù)據(jù)。為了便于與TfxA進(jìn)行比較，以pH8的結(jié)果作參照將所有的修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖10顯示53℃時(shí)修飾的木霉木聚糖酶NI-TX1，NI-TX5，NI-TX10，NI-TX11，TvX(3-190)和天然的TrX的熱穩(wěn)定性。以溫育0分鐘的酶活性作參照將酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖11顯示68℃時(shí)嵌合木聚糖酶NI-TX2，NI-TX5，NI-TX8，NI-TX9和天然TrX的熱穩(wěn)定性。為了比較還包括了53℃時(shí)天然TrX的曲線。以溫育0分鐘的酶活性作參照將酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖12顯示70℃時(shí)NI-BX和BcX的熱穩(wěn)定性。以溫育0分鐘的酶活性作參照將酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖13顯示溫度對NI-TX木聚糖酶，重組和天然TrX的增強(qiáng)紙漿漂白的性能的影響(測試由Iogen公司進(jìn)行)。
圖14顯示溫度對NI-BX1木聚糖酶和野生型BcX的增強(qiáng)紙漿漂白的性能的影響(測試由Iogen公司進(jìn)行)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明包括展示增強(qiáng)的對紙漿漂白應(yīng)用很重要的性能的修飾的家族11木聚糖酶，這些性能即嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性。修飾的木聚糖酶表現(xiàn)出相對于天然木聚糖酶增強(qiáng)的性能。天然木聚糖酶選自木霉，芽孢桿菌，鏈霉菌，和曲霉來源的家族11木聚糖酶。天然木聚糖酶的選擇進(jìn)一步限定在那些Trichoderma reesei木聚糖酶II氨基酸編號的位置14，或其它家族11木聚糖酶的相應(yīng)位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸的木聚糖酶。
對所選擇的木聚糖酶的修飾包括下述修飾的一種或兩種，本文的描述是根據(jù)Trichoderma reesei木聚糖酶II的氨基酸編號并適用于其它所選擇的家族11木聚糖酶的相應(yīng)對比的氨基酸(1)對所選擇的從N-末端位置10開始的上游有至少8個(gè)氨基酸殘基的木聚糖酶，用另外一個(gè)氨基酸取代氨基酸10。
(2)用來自褐色熱單胞木聚糖酶A(Tfx)的相應(yīng)位置的序列置換N-末端區(qū)域的一段氨基酸序列以形成一個(gè)嵌合木聚糖酶，并用另外一個(gè)木聚糖酶的多至10個(gè)氨基酸的序列延伸蛋白N-末端的上游。
本發(fā)明涉及修飾的木聚糖酶，對天然的木聚糖酶沒有權(quán)利要求。
在實(shí)施本發(fā)明中，起始點(diǎn)是一個(gè)家族11木聚糖酶。如果一個(gè)酶擁有與家族11共有的氨基酸，包括兩個(gè)作為重要催化殘基的谷氨酸(E)殘基，那么這個(gè)酶即被歸類為家族11。這些E殘基以Trichoderma reesei xyn II編號為氨基酸86和177。通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的對比氨基酸序列程序可以很容易地確定其它家族11木聚糖酶的關(guān)鍵E殘基的相應(yīng)位置。家族11木聚糖酶所共有的氨基酸在圖1中用黑體標(biāo)出。(Wakarchuck，et al，Protein Science 3467-475(1994)。
用于實(shí)施本發(fā)明的天然家族11木聚糖酶必須是那些由木霉，芽孢桿菌，鏈霉菌，和曲霉產(chǎn)生的家族11木聚糖酶。此酶也必須在木霉木聚糖酶II編號的位置10，或其它木聚糖酶的相應(yīng)位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸。Trichoderma reesei xyn II的氨基酸編號顯示于圖1。
氨基酸10的取代指的是Trichoderma reesei木聚糖酶II的這個(gè)氨基酸。權(quán)利要求只是針對那些所選擇的在與N-末端氨基酸10相對應(yīng)的位置上游至少有8個(gè)氨基酸殘基的木聚糖酶的修飾。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所選擇的用于這種修飾的木聚糖酶包括T.reesei xynII，T.harzianum xyn，綠色木霉xyn，變青鏈霉菌xyn B，或變青鏈霉菌xyn C。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，除了用另外一個(gè)氨基酸取代氨基酸10外，還用甲硫氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，或纈氨酸取代氨基酸27和29。如氨基酸10一樣，用圖1所示的Trichoderma reesei木聚糖酶II編號認(rèn)定氨基酸27和29。
在一個(gè)更為優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基酸10，27，和29被相應(yīng)地取代成組氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸。這種被修飾的木聚糖酶在實(shí)施例中被認(rèn)定為NI-TX11，NI-TX12和NI-TX13。
木聚糖酶的嵌合修飾包括從所選擇的木聚糖酶的N-末端區(qū)域刪除一段氨基酸序列并用褐色熱單胞木聚糖酶A的N-末端區(qū)域的一段氨基酸序列代替。
本文所用的描述本發(fā)明的術(shù)語“N-末端區(qū)域”指的是Trichoderma reesei木聚糖酶II最靠近N-末端的前31個(gè)氨基酸。對其它家族11木聚糖酶來說，N-末端區(qū)域包括當(dāng)進(jìn)行序列對比時(shí)與Trichoderma reesei木聚糖酶II的前31個(gè)氨基酸相對應(yīng)的氨基酸。本領(lǐng)域使用的N-末端區(qū)域的一般定義是蛋白質(zhì)最靠近N-末端的前1/3部分。本發(fā)明中使用的N-末端區(qū)域的定義與一般的定義一致，但必須更為精確。
被刪除的氨基酸的置換是通過用位于同樣位置的來源于兩個(gè)微生物的木聚糖酶的N-末端的一段氨基酸序列來進(jìn)行的。而在兩個(gè)木聚糖酶有不同數(shù)目的氨基酸的地方，當(dāng)排列兩個(gè)酶的氨基酸序列以盡可能的互相匹配時(shí)，氨基酸的置換序列位于與原始氨基酸序列一致的位置。這種氨基酸的序列對比是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的并在圖1中演示了一些家族11木聚糖酶的氨基酸序列對比。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TrX的氨基酸10到29的序列或另外一個(gè)家族11木聚糖酶的等價(jià)對比的氨基酸序列用褐色熱單胞木聚糖酶A的相應(yīng)對比的氨基酸序列取代。這種修飾的木聚糖酶的一個(gè)例子在實(shí)施例中被認(rèn)定為NI-TX4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TrX的氨基酸1到29的序列或另外一個(gè)家族11木聚糖酶的等價(jià)對比的氨基酸序列用褐色熱單胞木聚糖酶A的相應(yīng)對比的氨基酸序列取代。這種修飾的木聚糖酶的一個(gè)例子在實(shí)施例中被認(rèn)定為NI-TX3。
在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(BcX)的1到22的氨基酸序列被取代成Tfx的1到31的氨基酸序列。這兩個(gè)序列是基于圖1的序列進(jìn)行對比的。這種修飾的木聚糖酶的一個(gè)例子在實(shí)施例中被認(rèn)定為NI-BX2。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所選擇的用于這種修飾的木聚糖酶包括Trichodermareesei xyn II，Trichoderma harzianum xyn，綠色木霉xyn，變青鏈霉菌xyn B，變青鏈霉菌xyn C，環(huán)狀芽孢桿菌xyn A，枯草芽孢桿菌xyn A，黑曲霉xyn A，川地曲霉xyn A或塔賓曲霉xyn A。
上游延伸包括在低分子量的家族11木聚糖酶N-末端的上游加上一段多至10個(gè)氨基酸的序列。這種上游延伸是與本文描述的用褐色熱單胞木聚糖酶A對所選擇的家族11木聚糖酶進(jìn)行嵌合修飾聯(lián)合進(jìn)行的。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將一個(gè)包括甘氨酸-精氨酸-(精氨酸或賴氨酸)的三肽加到家族11木聚糖酶的N-末端上游延伸中，并且這種延伸是與嵌合修飾聯(lián)合進(jìn)行的。具有這些修飾的木聚糖酶的例子是NI-TX9和NI-BX7。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將1到3個(gè)堿性氨基酸加到家族11木聚糖酶Clostridiumacetoburylicum xynB(CaX)的N-末端和一段5到9個(gè)氨基酸的序列之間，并且這種延伸是與嵌合修飾聯(lián)合進(jìn)行的。具有這些修飾的木聚糖酶的例子是實(shí)施例例中的NI-TX8，NI-BX5和NI-BX6。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將氨基酸ASAR或ASAK的序列加在N-末端的上游，并且這種延伸是與嵌合修飾聯(lián)合進(jìn)行的。具有這些修飾的木聚糖酶的例子是NI-TX7，NI-BX3，和NI-BX4。
另外一套優(yōu)選實(shí)施方案包括用本發(fā)明的修飾的酶處理紙漿并改進(jìn)其漂白性能。所說的酶處理在55℃到75℃的溫度下進(jìn)行，這個(gè)溫度范圍不是使用天然的家族11木聚糖酶來增強(qiáng)紙漿漂白可以接受的范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所說的酶處理在7.5到9.0的pH下進(jìn)行，這個(gè)pH范圍不是使用天然的家族11木聚糖酶來增強(qiáng)紙漿漂白可以接受的范圍。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知本發(fā)明的木聚糖酶可以用于除了紙漿漂白之外其它方面。例如，這些酶可以用作動物食品添加劑以增強(qiáng)飼料的可消化性，其中飼料的高溫顆?；鼓壳暗拿冈诤芏嗲闆r下不適合。另外，這些酶還可以用于小麥與玉米淀粉生產(chǎn)的過程，其中加工過程的高溫破壞目前的酶。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知在這些或其它的應(yīng)用中，本發(fā)明的修飾的木聚糖酶可以在其它酶存在的情況下使用，這些其它酶包括但不限于纖維素酶，甘露聚糖酶，β-葡聚糖酶，和淀粉酶。
通過下面實(shí)施例的詳細(xì)描述將進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)施例不是限制本發(fā)明。根據(jù)這些實(shí)施例的修飾的木聚糖酶列于表2和表3。
表2.Trichoderma reesei木聚糖酶


表3.環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶

根據(jù)本發(fā)明，此后的例1至例3將要描述修飾的木聚糖酶的產(chǎn)生和純化。在實(shí)施例4至實(shí)施例13中，修飾的木聚糖酶NI-TX1至NI-TX11和NI-BX1至NI-BX7的驚人增強(qiáng)的嗜熱性，嗜堿性，和熱穩(wěn)定性是用木聚糖作底物來證明的。眾所周知，木聚糖酶對木聚糖底物的性能與實(shí)際紙漿處理時(shí)觀察到的性能有良好的相關(guān)。實(shí)施例14和實(shí)施例15用選擇的修飾木聚糖酶提供了在漂白之前使用本發(fā)明修飾的木聚糖酶進(jìn)行紙漿處理產(chǎn)生的驚人的增強(qiáng)的性能的證據(jù)。
實(shí)施例1Trichoderma Reesei修飾的木聚糖酶NI-TX的構(gòu)建諸如質(zhì)粒制備，限制酶消化，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，寡核苷酸磷酸化，連接，轉(zhuǎn)化和DNA雜交等的基本重組DNA方法是根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的成熟的方法(Sung et al.，1986)或根據(jù)酶或試劑盒的制造商推薦的方法進(jìn)行的。很多酶的緩沖液作為一個(gè)試劑盒的一部分提供或根據(jù)制造商的建議重新配制。限制酶，T4多核苷酸激酶和T4DNA連接酶是從New England BioLabs LTD，Mississauga，Ont購買。GeneAmp PCR試劑盒是從Perkin-Elmer公司購買。起始質(zhì)粒pXYbc是一個(gè)插入環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶基因的pUC類型的質(zhì)粒，在此之前已經(jīng)制備好并已經(jīng)發(fā)表(Sung etal，1993；Campbell et al，US專利5,405,769，1995年4月11日授權(quán))。一個(gè)通用的大腸桿菌菌株，HB101(Clonetech Lab，Palo Alto，CA)用作所有基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化和表達(dá)的宿主。樺木木聚糖是從Sigma公司(St.Louis，Mo)購買。對羥苯甲酸酰肼(HBAH)從Aldricht公司購買。寡核苷酸是用一個(gè)Applied Biosystem DNA synthesizer model380B制備。木聚糖酶分析是在一個(gè)溫度波動范圍為±0.1℃的加蓋的循環(huán)水浴(Haaketype F 4391)中進(jìn)行。水浴的溫度是用一個(gè)熱電偶確定。
A.起始質(zhì)粒pTvX(3-190)的構(gòu)建所有隨后突變用的起始質(zhì)粒pTvX(3-190)在此之前已經(jīng)制備好并且其構(gòu)建體也已經(jīng)發(fā)表(Sung et al，1995)。這個(gè)質(zhì)粒是通過用一個(gè)新組裝的木霉木聚糖酶基因取代pXYbc上的環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶基因從pXYbc質(zhì)粒衍生而來。這個(gè)木霉木聚糖酶和隨后描述的其它突變體木聚糖酶的表達(dá)是在lac啟動子的控制之下。木霉木聚糖酶基因的完整組裝需要兩個(gè)階段，首先是(92-190)區(qū)域，然后是(1-92)區(qū)域。此基因的構(gòu)建方法是常規(guī)的且與很多其它基因構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)程序相同，使用編碼木聚糖酶的重疊的合成寡核苷酸的酶促磷酸化，然后將其與一個(gè)適當(dāng)酶切的質(zhì)粒連接。
首先仿效大腸桿菌的密碼子使用頻率設(shè)計(jì)10個(gè)編碼TvX(92-190)序列的重疊寡核苷酸(XyTv-101至110)(圖3)。兩個(gè)末端寡核苷酸的SalI和BglII粘性末端使10個(gè)片段可以酶促連接到SalI-BglII線性化的質(zhì)粒pXYbc上。在含有10X標(biāo)準(zhǔn)激酶緩沖液(0.4μL)，1mM ATP(4μL)，T4 DNA激酶(5個(gè)單位)，和水(3μL)的混合物中使編碼木霉木聚糖酶(92-190)區(qū)的10個(gè)寡核苷酸XyTv-101至XyTv-110(50pmol，每個(gè)1μL)磷酸化，磷酸化反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時(shí)。然后合并溶液并加熱至70℃維持10分鐘。緩慢冷卻至室溫后，將合并的溶液加入4mM ATP(3.5μL)，SalI-BglII線性化的質(zhì)粒pXYbc(0.1pmol)和T4 DNA連接酶(3.5μL)的混合物中12℃溫育20小時(shí)。連接混合物的等分樣品用于轉(zhuǎn)化在含有氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板上的大腸桿菌HB101。
為了制備雜交探針，用32P-ATP(10pmol，3μL)在T4 DNA激酶(1μL)，10X激酶緩沖液(1μL)和水(4μL)的混合物中37℃溫育1小時(shí)對寡核苷酸XyTv-110(10pmol，1μL)進(jìn)行磷酸化。
隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化體進(jìn)行雜交分析。菌落在加有氨芐青霉素的YT平板上的尼龍膜上生長過夜。然后用0.5N NaOH-1.5M NaCl(10分鐘)將其變性并用0.5N Tris-HCl(pH7.0)-1.5M NaCl(10分鐘)中和。用254nm的紫外線照射8分鐘后，用6X SSC-0.05％ TritonX-100洗滌尼龍膜30分鐘。完全刮除細(xì)胞碎片。在新鮮溶液中再次洗滌30分鐘后，將復(fù)制的膜分別轉(zhuǎn)入分離的6X SSC-1％硫酸葡聚糖-0.05％ TritonX-100-1X Denhardt’s雜交液混合物中。將32P標(biāo)記的探針加到膜上，45℃16小時(shí)后，用6X SSC-0.05％ TritonX-100在室溫洗滌尼龍膜兩次，每次5分鐘，然后65℃保溫30分鐘。通過放射自顯影分析鑒定具有中間質(zhì)粒pBcX.TvX的陽性雜交克隆。
上述的方法，包括合成的重疊寡核苷酸的酶促磷酸化和與一個(gè)線性化質(zhì)粒的連接，也用在了TX(1-92)區(qū)的組裝和本發(fā)明描述的幾個(gè)隨后產(chǎn)生的突變體系列NI-TX和NI-BX的盒式突變。
為了組裝TX(1-92)區(qū)以完成全長的木霉基因，用NheI和KpnI內(nèi)切酶將中間質(zhì)粒pBcX.TvX線性化以釋放BcX(1-83)的DNA插入片段。通過上面描述的方法用NheI和KpnI粘性末端將編碼發(fā)表的TvX(3-91)序列的10個(gè)重疊寡核苷酸(XyTv-1到-10)連接到線性化的質(zhì)粒pBcX.TvX上，因此新質(zhì)粒pTvX(3-190)就包含了一個(gè)合成的TvX(3-190)基因。與天然的TrX相比，重組的TvX(3-190)具有5個(gè)不同的殘基Ala-1，Ser-2，Gly-4，Phe-9，Thr-65和Thr-143。
為了比較，編碼天然TrX的基因也以同樣的方式組裝而帶有5個(gè)天然的殘基，此內(nèi)容也已經(jīng)發(fā)表(Sung et al，1995)。此基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)TrX的重組版本(rec.TrX)。如下面指出和Sung et al(1995)的報(bào)道那樣，TvX(3-190)和rec.TrX的特性是相同的。但是，大腸桿菌表達(dá)的這兩個(gè)木聚糖酶的嗜熱性和熱穩(wěn)定性都比天然的TrX(natl TrX)差，可能是因?yàn)槿狈ο筇烊籘rX那樣的翻譯后修飾。
B.質(zhì)粒pNI-TX1的構(gòu)建包括下面描述的NI-TX和NI-BX系列的所有突變體木聚糖酶基因都是通過盒式突變的方法構(gòu)建的，盒式突變的方法與上面充分描述的基因組裝方法相同。這種盒式突變包括(i)重疊的合成寡核苷酸的酶促磷酸化，(ii)與線性化的質(zhì)粒連接，(iii)轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞，(iv)通過用標(biāo)記的寡核苷酸作探針雜交來鑒定突變的轉(zhuǎn)化體，和(v)通過雙脫氧核苷酸測序確定突變。
突變體NI-TX1與具有單一突變Q162H的TvX(3-190)相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX1的構(gòu)建是通過將寡核苷酸TX-162H-1和TX-162H-2(下面所示)連接進(jìn)入NsiI/AvrII線性化的質(zhì)粒pTvX(3-190)完成的。
TX-162H-1158 159 160 161 162 163 164 165 166AWAQHGLTL5′-TGG GCA GAG CAC GGG TTA ACCA CGT ACC CGT GTC GTG CCC AAT TGG GAT C-5′NsiI AvrIITX-162H-2C.質(zhì)粒pNI-TX2的構(gòu)建突變體NI-TX2是NI-TX1的修飾版本，是(i)用Tfx(1-29)序列取代NI-TX1的(1-29)序列和(ii)用四肽ASHA在位置-4至-1延伸N-末端的上游。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX2是通過將編碼Tfx(1-29)序列的重疊寡核苷酸Tfx-1，-2，-3和-4連接到NheI/ApaI線性化的pNI-TX1質(zhì)粒上而構(gòu)建的。
Tfx-1Tfx-4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12A S H A A V T S N E T G Y HDG5′-CT AGC CAC GCG GCC GTA ACT TCA AAT GAA ACC GGT TAT CATGAC GGCGGTG CGC CGG CAT TGA AGT TTA CTTTGG CCAATA GTACTG CCG NheITfx-3PinAITfx-213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2627 28Y F Y S F W T D A P G T V SMETAT TTC TAC AGC TTC TGG ACC GAT GCA CCG GGA ACT GTG TCCATG GAGATA AAG ATG TCG AAG ACC TGG CTA CGT GGC CCT TGA CAC AGGTAC CTCTfx-429 30 31L G PCTC GGG CCGAGCApaI
D.質(zhì)粒pNI-TX3的構(gòu)建NI-TX3是NI-TX2的修飾版本，只是沒有象后者的從位置(-4)到(-1)的額外的四肽ASHA。通過用一個(gè)新的TrX(1-6)減去額外的上游殘基的密碼序列取代NI-TX2基因中的Tfx(1-6)密碼序列來制備質(zhì)粒pNI-TX3。在一個(gè)盒式突變中，這是通過將寡核苷酸Tfx(1-6)-1和Tfx(1-6)-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-TX2上來完成的。
Tfx(1-6)-1Tfx 12345678fmet AVTSNETG5-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG GCA GTA ACA TCA AAT GAA AGATT CCT CC GAC GTC TAC CGT CAT TGT AGT TTA CTTTGG-CCNheI Tfx(1-6)-2 PinAIE.質(zhì)粒pNI-TX4的構(gòu)建NI-TX4是NI-TX1的修飾版本，是用Tfx(10-29)序列取代NI-TX1的(10-29)序列。通過用TrX(1-6)的密碼序列取代NI-TX2基因中的Tfx(1-6)密碼序列來制備質(zhì)粒pNI-TX4。在一個(gè)盒式突變中，這是通過將寡核苷酸TX-1f和TX-8f連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-TX2上來完成的。
TX-1fTx 1 2 3 4 5 6 7st Q T I Q P G T5′-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA A3′-GATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCNheI TX-8f PinAIF.質(zhì)粒pNI-TX5和pTX-28E-29L-162H的構(gòu)建除了將NI-TX1的(26-29)區(qū)內(nèi)的四肽TYTN氨基酸序列用Tfx的(26-29)區(qū)內(nèi)的相應(yīng)的四肽SMEL替換外，突變體NI-TX5與NI-TX1相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX5的構(gòu)建是通過將異源雙鏈寡核苷酸TX-26SMEL-1和TX-28E/29L-1(下面所示)連接到NcoI/ApaI線性化的質(zhì)粒pNI-TX1上完成的。質(zhì)粒制備物的亞克隆產(chǎn)生兩個(gè)目標(biāo)質(zhì)粒。
TX-26SMEL-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V S M E L G P5′-CAT GGT GGT GTG AGC ATG GAG CTC GGG CCCA CCA CAC TGG ATG CTC GAGC-5′NCoI T YApaITX-28E/29L-1因?yàn)閮蓚€(gè)寡核苷酸是異源雙鏈，用TX-26SMEL-1和TX-28E/29L-1進(jìn)行亞克隆和雜交產(chǎn)生兩個(gè)質(zhì)粒，(i)在(26-29)區(qū)具有SMEL的pNI-TX5，和(ii)在位置28和29具有E和L的pTX-28E-29L-162H。
G.質(zhì)粒pNI-TX6的構(gòu)建除了具有兩個(gè)單一的突變Y27M和N29L外，突變體NI-TX6與NI-TX1相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX6的構(gòu)建是通過將寡核苷酸TX-27M/29L-1和TX-27M/29L-2(下面所示)連接到NcoI/Apal線性化的質(zhì)粒pNI-TX1上完成的。
TX-27M/29L-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V T M T L G P5′-CAT GGA GGC GTC ACA ATG ACT CTG GGG CCCT CCG CAG TGT TAC TGA GACCNcoI ApaITX-27M/29L-2H.質(zhì)粒pTX-27M-162H的構(gòu)建除了具有一個(gè)額外的突變Y27M外，突變體TX-27M-162H與NI-TX1相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒是通過將雙鏈寡核苷酸TX-27M-1和TX-27M-2(下面所示)連接到NcoI/ApaI線性化的質(zhì)粒pNI-TX1上構(gòu)建成的。
TX-27M-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V T M T N G P5′-CAT GGA GGC GTC ACA ATG ACT AAT GGG CCCT CCG CAG TGT TAC TGA TTACNcoI ApaITX-27M-2
I.質(zhì)粒pNI-TX7的構(gòu)建突變體NI-TX7是NI-TX3的修飾版本，在-4到-1位置上具有四肽ASAR。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX7的構(gòu)建是通過將寡核苷酸Tf-(-1)R-1和Tf-(-1)R-2(下面所示)連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-TX2上完成的。
Tf-(-1)R-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A R A V T S N E T G5′-CT AGC GCA AGA GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT TCT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheI PinAITf-(-1)R-2J.質(zhì)粒pNI-TX8的構(gòu)建突變體NI-TX8是NI-TX3的修飾版本，是(i)用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列從(-10)至(-2)位置和(ii)用精氨酸殘基在(-1)位置(Tfx氨基酸編號)延伸NI-TX3的N-末端的上游。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX8的構(gòu)建是通過將寡核苷酸CaTf-(-1)R-1和CaTf-(-1)R-2連接到NheI/PinAI線性化的pNI-TX2質(zhì)粒上而完成的。
CaTf-(-1)R-1CaX Tfx-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5A S A F N T Q A A P R A V T S N5′CT AGC GCA TTC AAC ACA CAG GCC GCT CCT CGA GCT GTC ACC AGC AACGCGT AAG TTG TGT GTC CGG CGA GGA GCT CGA CAG TGG TCG TTGNheICaTf-(-1)R26 7 8E T GGAG ACTCTGG CCPinAIK.質(zhì)粒pNI-TX9的構(gòu)建突變體NI-TX是NI-TX3的修飾版本，是用三肽GRR從(-3)至(-1)位置(Tfx氨基酸編號)延伸NI-TX3的N-末端的上游。
構(gòu)建PCR引物以在(-3)至(-1)位置引入三肽GRR。5’和3’引物如下所示
5’引物，GRR-Tf(1-6)-1TfX-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8st G R R A V T S N E T G5′ACTCTG CAGATG GGA AGA AGG GCC GTA ACT TCA AAT GAA ACC GGTPstI9 10 11YHDTAT CAT GAC3’引物，Uni-PCR-1r5′GAA AAG TGC CAC CTG ACG TCC CAA GCT THindIII使用質(zhì)粒pNI-TX2作為PCR模板。反應(yīng)溶液中含有質(zhì)粒pNI-TX2 DNA(50ng，15μL)，5μL的10X緩沖液(100mM KCl，100mM硫酸銨，200mM Tris-HCl pH 8.8，40mM硫酸鎂，1％TritonX-100，100μg/mlBSA)，5μL的5mM dNTP，5’引物溶液(25pmol，2.5μL)，3’引物溶液(25pmol，2.5μL)，和水(19μL)。
反應(yīng)用石蠟油(50μL)覆蓋以防止蒸發(fā)。將反應(yīng)混合物不加酶預(yù)溫至94℃ 5分鐘，然后將反應(yīng)混合物冷卻至72℃，然后加入DNA聚合酶(1μL，1單位)。將反應(yīng)在熱循環(huán)儀上保溫30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，和72℃2分鐘。得到的PCR產(chǎn)物是一個(gè)約1μg的600bp片段。用瓊脂糖凝膠純化此片段。
用限制酶PstI和HindIII酶切獲得的PCR產(chǎn)物，并在一個(gè)盒式突變中，將其連接到PstI/HindIII線性化的質(zhì)粒pNI-TX3上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101可獲得質(zhì)粒pNI-TX9。
L.質(zhì)粒pNI-TX10的構(gòu)建除了具有兩個(gè)單一的突變H10N和D11N外，突變體NI-TX10與NI-TX1相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX10的構(gòu)建是通過將寡核苷酸TX10HD-1和TX10HD-2(下面所示)連接到PinAI/Apal線性化的質(zhì)粒pNI-TX1上完成的。
TX10HD-27 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22T G F H D G Y F Y S Y W N D G H5′CC GGT TTC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAC GGC CATAAAG GTG CTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTG CCG GTAPinAI TX10HD-123 24 25 26 27 28 29 30 31G G V T Y T N G PGGA GGA GTA ACT TAC ACC AAT GGG CCCCT CCT CAT TGA ATG TGG TTACApaIM.質(zhì)粒pNI-TX11和pNI-TX12的構(gòu)建突變體NI-TX11和NINI-TX12除了分別具有三個(gè)和四個(gè)單一突變外，與NI-TX1相同。NI-TX11具有三個(gè)突變N10H，Y27M和N29L。NI-TX12具有四個(gè)突變N10H，N11D，Y27M和N29L。
通過用質(zhì)粒pNI-TX6作模板進(jìn)行PCR構(gòu)建了期望的基因。5’和3’PCR引物TX10HD/N-1和Uni-PCR-1r，和引入三肽GRR的PCR方法在pNI-TX9的構(gòu)建中已經(jīng)描述。
用限制酶PinAI和HindIII酶切獲得的PCR產(chǎn)物，并在一個(gè)盒式突變中，將其連接到PinAI/HindIII線性化的質(zhì)粒pNI-TX1上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101可獲得質(zhì)粒pNI-TX11和pNI-TX12。通過核苷酸測序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。
5’引物 TX10HD/N-17 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20T G Y H D/N G Y F Y S Y W ND5′GAAACC GGTTAC CAC XAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GATPin AI21 22G HGGC CX＝G+AN.質(zhì)粒pNI-TX13的構(gòu)建除了具有在NI-TX11中描述的三個(gè)突變體N10H，Y27M和N29L外，NI-TX13與重組的野生型TrX相同。這個(gè)突變體的產(chǎn)生需要將突變體NI-TX11位置1-4的殘基轉(zhuǎn)變成TrX位置1-4的殘基。突變體NI-TX11中的三個(gè)殘基Ala-1，Ser-2，Gly-4相應(yīng)地轉(zhuǎn)變成Gln，Thr和Gln。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-TX13的構(gòu)建是通過將寡核苷酸TrX1f和TrX8f(下面所示)連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-TX11上完成的。
TrX1fTrX 1 2 3 4 5 6 7 8fmet Q T I Q P G T G5-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA AGATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCNheI TrX8f PinAI實(shí)施例2環(huán)狀芽孢桿菌突變體木聚糖酶NI-BX的構(gòu)建真菌木霉木聚糖酶的修飾NI-TX2，NI-TX3，NI-TX7，NI-TX8和NI-TX9也在細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(BcX)中再現(xiàn)。起始質(zhì)粒pXYbc在此之前已經(jīng)制備好并已經(jīng)發(fā)表(Sung et al，1993；Campbell et al，US專利5,405,769，1995年4月11日授權(quán))，在此只作簡要描述。按上面描述的用于pXyTv(3-190)相同的方法，通過用T4DNA激酶酶促磷酸化并通過T4 DNA連接酶將重疊的合成寡核苷酸連接到一個(gè)線性化的質(zhì)粒上來組裝編碼環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(BcX)的合成基因(圖4)(Sung et al，1993)。
A.質(zhì)粒pNI-BX1的構(gòu)建NI-BX1的修飾方法已經(jīng)在制備NI-TX2中使用。突變體NI-BX1是BcX的修飾版本，是用Tfx(1-31)序列取代BcX的(1-22)區(qū)。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-BX1的構(gòu)建是通過將編碼Tfx(1-31)序列的重疊寡核苷酸Tfx-1，-2b，-3和-4b連接到NheI/BspEI線性化的質(zhì)粒pXYBc上完成的。
Tfx-2b11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26D G Y F Y S F W T D A P G T V SACC GAT GCC CCG GGA ACT GTG AGT3′-G CCG ATA AAG ATG TCG AAG ACC TGG CTA CGG GGC CCT TGA CAC TCATfx-4b27 28 29 30 31M E L G PATG GAG CTC GGC CTAC CTC GAG CCGGGG CCBspEI
B.質(zhì)粒pNI-BX2的構(gòu)建NI-BX2的修飾方法已經(jīng)在制備NI-TX3中使用。突變體NI-BX2是NI-BX1的修飾版本，但是沒有NI-BX1中的從(-4)到(-1)位置的額外殘基。質(zhì)粒pNI-BX2是通過用一個(gè)新的減上游額外殘基的TrX(1-6)密碼序列替換NI-BX1基因中的Tfx(1-6)的密碼序列來制備的。在一個(gè)盒式突變中，這是通過將寡核苷酸Tfx(1-6)-1和Tfx(1-6)-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-BX1上完成的。
C.質(zhì)粒pNI-BX3的構(gòu)建NI-BX3的修飾方法已經(jīng)在制備NI-TX7中使用。突變體NI-BX3是NI-BX1的修飾版本，但是在(-1)位置用一個(gè)精氨酸殘基延伸了N-末端。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-BX3的構(gòu)建是通過將寡核苷酸Tf-(-1)R-1和Tf-(-1)R-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-BX1上完成的。
D.質(zhì)粒pNI-BX4的構(gòu)建除了在(-1)位置用一個(gè)賴氨酸殘基代替了精氨酸殘基外，突變體NI-BX4與NI-BX3相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-BX4的構(gòu)建是通過將寡核苷酸Tf-(-1)K-1和Tf-(-1)K-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-BX1上完成的。
Tf-(-1)K-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A K A V T S N E T G5′-CT AGC GCA AAA GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT TTT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheIPinAITf-(-1)K-2E.質(zhì)粒pNI-BX4-K(-1)D和pNI-BX4-K(-1)E的構(gòu)建除了在(-1)位置用一個(gè)酸性殘基Asp或Glu替換堿性殘基外，突變體NI-BX4-K(-1)D和NI-BX4-K(-1)E與NI-BX4或NI-BX3相同。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒的構(gòu)建是通過將異源雙鏈寡核苷酸Tf-(-1)D-1和Tf-(-1)E-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-BX1上完成的，制備的質(zhì)粒的亞克隆產(chǎn)生目標(biāo)質(zhì)粒。
Tf-(-1)D-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A D A V T S N E T G5′-CT AGC GCA GAT GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT CTT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheIE PinAITf-(-1)E-2F.質(zhì)粒pNI-BX5的構(gòu)建NI-BX5的修飾方法已經(jīng)在制備NI-TX8中使用。突變體NI-BX5是(i)其(1-29)序列被Tfx(1-29)氨基酸序列取代，(ii)在(-1)位置(Tfx氨基酸編號)用一個(gè)精氨酸殘基延伸，和(iii)在(-10)到(-2)位置用丙酮丁醇棱狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列進(jìn)一步延伸上游。在一個(gè)盒式突變中，質(zhì)粒pNI-BX5的構(gòu)建是通過將寡核苷酸CaTf-(-1)R-1和CaTf-(-1)R-2連接到NheI/PinAI線性化的質(zhì)粒pNI-BX1上完成的。
G.質(zhì)粒pNI-BX6的構(gòu)建構(gòu)建PCR引物以在NI-BX5的位置(-3)和(-2)產(chǎn)生變異?；旌系膲A基編碼位置(-3)的殘基Ser和Gly，和位置(-2)的殘基Pro，Ala，Gly和Arg.5’和3’引物如下所示5’引物，CaTf-PCR-1CaX -3 -2 Tfx-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 P/A -1 1 2 34A S A F N T Q A S/G G/R R A V T S5′CCCGCT AGCGCA TTC AAC ACA CAA GCA XGT YYA AGG GCC GTA ACT TCANheI5 6 7 8 9N E T G YAAT GAA ACC GGT T其中X＝A和G混合物Y＝G和C混合物BcX 3’引物，Xy-14a49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 613′GCA TGC TAG TTG ATG TTG CGA CCG CAA ACC CGG GGC TTA-5′質(zhì)粒pNI-BX1用作PCR的模板，PCR方法已經(jīng)在NI-TX9的構(gòu)建中被描述。得到的PCR產(chǎn)物是一個(gè)約1μg的200bp片段，用瓊脂糖凝膠純化此片段。
用限制酶NheI和BamHI酶切獲得的PCR產(chǎn)物，并在一個(gè)盒式突變中，將其連接到NheI/BamHI線性化的質(zhì)粒pXYBc中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101可產(chǎn)生攜帶在(-3)和(-2)位置編碼不同殘基的不同的木聚糖酶基因的質(zhì)粒。在下面的實(shí)施例中研究了所表達(dá)的木聚糖酶的酶學(xué)特性后，改進(jìn)最大的突變體是NI-BX6。NI-BX6的雙脫氧核苷酸測序揭示在位置(-3)和(-2)的殘基相應(yīng)為Gly和Arg。
H.質(zhì)粒pNI-BX7的構(gòu)建突變體NI-BX7是NI-BX2的修飾版本，具有用一個(gè)三肽GRR從(-3)到(-1)位置(Tfx氨基酸編號)向上游延伸的N-末端。
期望的基因通過用質(zhì)粒pNI-BX1作模板進(jìn)行PCR來構(gòu)建。PCR引物GRR-Tf(1-6)-1和Uni-PCR-lr，和引入三肽GRR的PCR方法在NI-TX9的構(gòu)建中已經(jīng)描述。
用限制酶PstI和HindIII酶切獲得的PCR產(chǎn)物，并在一個(gè)盒式突變中，將其連接到PstI/HindIII線性化的質(zhì)粒pNI-TX3上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101可產(chǎn)生質(zhì)粒pNI-TX7。
實(shí)施例3修飾的木聚糖酶的產(chǎn)生和分析(A)木聚糖酶的產(chǎn)生培養(yǎng)條件與用于其它的大腸桿菌表達(dá)的木聚糖酶生產(chǎn)的成熟方法相同。將5ml在含有氨芐青霉素(100mg/L)的2YT培養(yǎng)基(16g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，5gNaCl，1L水)中的過夜培養(yǎng)物加入含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中(1L)。37℃振蕩培養(yǎng)(200rpm)，16小時(shí)后，收獲細(xì)胞。
(B)修飾的木聚糖酶的純化從細(xì)胞制備蛋白樣品，首先用25g鋁粉研磨10g細(xì)胞樣品以制備細(xì)胞提取物。研磨成均勻混合物后，加入少量(5mL)冰冷的緩沖液A(10mM乙酸鈉，pH5.5，用于BcX突變體)或緩沖液B(10mM乙酸鈉，pH4.6，用于TX突變體)，在每次加液之間劇烈研磨混合物。將混合物以8000xg離心30分鐘以除去鋁粉和細(xì)胞碎片。
在柱層析之前，修飾的木聚糖酶的上清(25mL)按下面的方式之一進(jìn)行預(yù)處理(1)NI-BX1，NI-BX2，NI-TX1，NI-TX2，NI-TX3，NI-TX4，NI-TX6，NI-TX7，NI-TX10，NI-TX11，NI-TX12，NI-TX13。
用透析袋(3500分子量截留)在4℃對3L緩沖液A透析過夜，透析袋中形成的少量沉淀用8000xg離心15分鐘除去。
(2)NI-BX3，NI-BX4，NI-BX5，NI-BX6，NI-BX7
60℃加熱20分鐘，然后68℃加熱30分鐘并離心去除形成的大量沉淀。將上清pH值調(diào)到4.6，-20℃冷凍過夜，融化并離心以除去更多的沉淀。
(3)NI-TX8，NI-TX960℃加熱20分鐘并離心去除形成的大量沉淀，將上清pH值調(diào)到4.6，-20℃冷凍過夜，融化并離心以除去更多的沉淀。
(4)NI-TX5不進(jìn)行透析或加熱，將粗提上清直接調(diào)pH值到4.6，-20℃冷凍過夜，融化并離心以除去更多的沉淀。
完成上述預(yù)處理后，將細(xì)胞抽提物泵入用緩沖液A平衡的50mL床體積的快流S-sepharose陽離子交換柱(Kabi-Pharmacia，Canada)。用300mL在緩沖液A中的0-0.3MNaCl線性梯度，以3mL/min的流速洗脫木聚糖酶。分部收集物在SDS-PAGE上檢查，收集具有大量木聚糖酶的部分，并用分子量3000道爾頓截留的膜(Amicon YM3)進(jìn)行超濾以濃縮樣品。然后將濃縮的樣品加到用50mM乙酸銨pH6平衡的1.5cm×85cmTSK-HW50S凝膠過濾柱上，以90到100mL的體積洗脫木聚糖酶。這些分部收集物用SDS-PAGE分析，并將峰值樣品作為純的木聚糖酶合并。用280nm處的消光系數(shù)對蛋白進(jìn)行定量。從10g細(xì)胞中典型的純化產(chǎn)量是25mg木聚糖酶。所有的NI-TX和NI-BX木聚糖酶在沒有甘油的乙酸銨緩沖液中都有良好的可溶性。
(C)酶活性測定的標(biāo)準(zhǔn)分析定量分析可以測定可溶性木聚糖產(chǎn)生的還原糖末端的量，這種分析的底物是將5％的樺木木聚糖懸濁液(Sigma Chemical Co.)溶于水的樺木木聚糖部分。除去不溶的部分后，將上清凍干并貯存于干燥器中。按下述進(jìn)行比活的測定。含有提前用分析緩沖液(50mM檸檬酸鈉，pH5.5或所測試的木聚糖酶的最佳pH)稀釋的100μL的30mg/mL木聚糖，150μL分析緩沖液，50μL用分析緩沖液稀釋的酶的反應(yīng)混合物在40℃溫育。在不同的時(shí)間段取出50μL反應(yīng)液并用1mL的5mM NaOH稀釋以終止反應(yīng)。用對羥苯甲酸酰肼試劑(HBAH)測定還原糖的量(Lever，1972，Analytical Biochem 47273-279)。一個(gè)酶活單位被定義為在40℃ 1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol還原糖的用量。
為了在修飾的和天然的木聚糖酶之間進(jìn)行比較(表4和表5)，以天然木聚糖酶的比活性作參照將木聚糖酶的比活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
表4.NI-TX木聚糖酶的相對活性

*以770U/mg的天然TrX的比活性為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
表5.NI-BX木聚糖酶的相對活性

*以330U/mg的BcX的比活性為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
在NI-TX(表4)和NI-BX(表5)木聚糖酶中，40℃時(shí)修飾的木聚糖酶的比活性與天然木聚糖酶沒有顯著的差異。
實(shí)施例4修飾的木霉木聚糖酶的溫度/活性曲線這是為了測定溫度對木聚糖酶水解可溶性木聚糖的酶活性的影響。除了改變溫育溫度和時(shí)間外，測定方法與標(biāo)準(zhǔn)分析法相同。將酶(15μg/mL)和溶于pH5.5的50mM檸檬酸鈉緩沖液的可溶性木聚糖混合并在不同溫度的循環(huán)水浴中溫育。30分鐘后，用HBAH測定從木聚糖釋放出來的還原糖的量并以40℃時(shí)的值為100％計(jì)算出相對活性。
溫度對木聚糖水解的影響如圖5所示，大腸桿菌表達(dá)的TvX(3-190)在55℃或更高溫度時(shí)顯示比天然TrX低得多的活性。和Sung et al 1995報(bào)道的一樣，大腸桿菌表達(dá)的TrX顯示了低的嗜熱性。
天然TrX在高至60℃時(shí)還具有高活性。這個(gè)酶的耐熱性優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)的酶的原因可能是木霉宿主的翻譯后修飾的結(jié)果。
具有突變Q162H的突變體NI-TX1的活性/溫度曲線與TvX(3-190)的相同。
將NI-TX2的(1-29)區(qū)用Tfx(1-29)的相應(yīng)序列取代并用四肽ASHA在(-4)至(-1)位置延伸N-末端產(chǎn)生了NI-TX2。如果有效作用溫度定義為允許150％相對活性(以40℃時(shí)的活性為參照計(jì)算)的溫度，這個(gè)突變體顯示了比TvX(3-190)或NI-TX1高10℃的改進(jìn)。
具有用Tfx(1-29)取代但沒有和NI-TX2一樣的用殘基ASHA在(-4)至(-1)位置延伸N-末端的突變體木聚糖酶NI-TX3的溫度/活性曲線與NI-TX2的相同。
另外一個(gè)具有用較短的Tfx(10-29)序列取代的突變體NI-TX4的嗜熱性稍低于NI-TX2和NI-TX3。
具有用Tfx的四肽在(26-29)區(qū)替換的嵌合木聚糖酶NI-TX5顯示了比TvX(3-190)或NI-TX1高5℃的改進(jìn)。
具有Y27M和N29L雙突變的突變體NI-TX6在高至60℃時(shí)保留了顯著的酶活性。它的溫度/活性曲線與NI-TX5的相同。
另外一個(gè)突變體NI-TX7具有與NI-TX2相同的嗜熱性。NI-TX7除了在-4到-1位置用四肽ASAR延伸N-末端外，其具有與NI-TX3相同的氨基酸序列。雖然這個(gè)突變體和NI-TX2都顯示用這些四肽的延伸對嵌合的木霉木聚糖酶的溫度范圍沒有明顯的影響，但還是探索研究了其它的N-末端延伸。
NI-TX8是合成的，它顯示了比TvX(3-190)或NI-TX1高13℃，和比天然TrX高約10℃的改進(jìn)。除了具有一個(gè)額外的用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列在(-10)到(-2)位置延伸上游的N-末端外，NI-TX8與NI-TX7的結(jié)構(gòu)相同。
構(gòu)建了突變體NI-TX9以測試是否可以將NI-TX8上游延伸中的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列用一個(gè)更短的三肽序列GRR代替。在下述的NI-BX7的研究中確認(rèn)了此三肽。較小的新突變體NI-TX9顯示了與NI-TX8相同的溫度/活性曲線。
在木聚糖酶的N-末端向上游延伸可以增強(qiáng)酶的性能是首次報(bào)道。
為了確認(rèn)其它殘基對家族11木聚糖酶嗜熱性的貢獻(xiàn)，制備了突變體NI-TX10，它是從NI-TX1衍生而來，具有雙重突變N10H和N11D。新突變體NI-TX10與其前體NI-TX1相比有效作用溫度提高了6℃。
最后構(gòu)建了兩個(gè)突變體木聚糖酶NI-TX11和NI-TX12，它們是NI-TX1的衍生物，分別具有三個(gè)突變(N10H Y27M N29L)和四個(gè)突變(N10H N11D Y27M N29L)。它們用于測定(i)突變N10H和N11D的各自貢獻(xiàn)，和(ii)與上面確認(rèn)的其它兩個(gè)有益突變Y27M和N29L的聯(lián)合作用。兩個(gè)突變體NI-TX11和NI-TX12都顯示相同的溫度/活性曲線且有效作用溫度提高了13℃。這個(gè)結(jié)果顯示N11D突變對TrX的嗜熱性沒有影響。將NI-TX11位置(1-4)的殘基轉(zhuǎn)變成野生型TrX的殘基產(chǎn)生了NI-TX13。NI-TX13和NI-TX11的溫度/活性曲線相同。
NI-TX11或NI-TX13達(dá)到150％相對活性的有效作用溫度的提高(+13℃)高于單個(gè)突變N10H(+6℃，在NI-TX11中)和Y27M/N29L(+4℃，在NI-TX2中)的理論總和。如在嵌合突變體NI-TX2(+10℃)，NI-TX3(+10℃)和NI-TX4(+9℃)中所示，這種改進(jìn)還高于通過用可能具有三個(gè)突變的任何天然Tfx序列進(jìn)行直接取代所獲得的任何改進(jìn)。另外，與在嵌合酶中的用TfX序列31-20個(gè)殘基的取代相比，NI-TX11或NI-TX13中3個(gè)殘基的三個(gè)突變是一個(gè)很小的修飾，這可以間接地減少其它不需要的木霉木聚糖酶一般性質(zhì)的改變。
實(shí)施例5修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的溫度/活性曲線分析方法大致與實(shí)施例4中NI-TX木聚糖酶的分析方法相同。溫度對溶于pH5.5的50mM檸檬酸鈉緩沖液的NI-BX木聚糖酶水解可溶性木聚糖的影響如圖6所示。
天然的BcX在溫度高至60℃時(shí)是有活性的。
用Tfx(1-31)序列替換BcX的N-末端的BcX(1-22)序列得到的突變體NI-BX1在溫度高至82℃時(shí)仍有很高的活性。和NI-TX部分中討論的一樣，有效作用溫度定義為允許150％相對活性(以40℃時(shí)的活性為參照計(jì)算)的溫度。在這種情況下，NI-BX1的嗜熱性大約提高22℃。突變體NI-BX2，沒有NI-BX1中的(-4)到(-1)位置的額外殘基ASHA，顯示了相同的溫度/活性曲線。
在NI-BX3和NI-BX5中(-1)位置插入一個(gè)精氨酸殘基的進(jìn)一步修飾使其嗜熱性比NI-BX1和NI-BX2提高了2.5℃。
在(-1)位置具有另外一個(gè)堿性氨基酸Lys的NI-BX4中也觀察到了同樣的提高。用酸性殘基Glu或Asp替換使最大作用溫度降低約10℃(數(shù)據(jù)未示出)，因此，這些結(jié)果證明了在(-1)位置用堿性氨基酸(Arg，Lys)延伸對耐熱性的貢獻(xiàn)，但存在中性(His)和酸性(Asp，Glu)殘基則相反。
突變體NI-BX6顯示了比NI-BX3提高2.5℃或比NI-BX1提高5℃的改進(jìn)。因此，通過在(-10)至(-4)位置加入丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-29)序列，在(-3)位置加入Gly和在(-2)和(-1)位置均加入Arg來延伸N-末端可以進(jìn)一步提高嗜熱性。
構(gòu)建了突變體NI-BX7以測試是否可以將NI-BX6上游延伸中的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列用一個(gè)更短的三肽序列GRR代替。雖然NI-BX6和NI-BX7似乎有相同的有效作用溫度或高溫限，但較小的NI-BX7顯示了比NI-BX6更廣的酶活性溫度范圍。和上面描述的突變體NI-TX9一樣，不使用CaX序列，同樣的三肽也成功地提高了木霉木聚糖酶的有效作用溫度。
總之，成功地提高了真菌木霉木聚糖酶嗜熱性的修飾大致可以用于細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶。
實(shí)施例6NI-BX木聚糖酶的嗜熱性與Campbell等現(xiàn)有技術(shù)的比較Campbell等現(xiàn)有技術(shù)中改進(jìn)最大的環(huán)狀芽孢桿菌(BcX)突變體TS19a是修飾了氨基酸3，4，8，和22(根據(jù)BcX編號系統(tǒng))。將這個(gè)修飾的木聚糖酶與NI-BX木聚糖酶使用上面描述的方法相比，得到的結(jié)果如圖6所示。NI-BX木聚糖酶的最佳溫度比TS19a的最佳溫度高8-14℃。另外，在最佳溫度時(shí)，本發(fā)明的NI-BX6和NI-BX7木聚糖酶的活性比Campbell等的高3倍。這套結(jié)果說明本發(fā)明的修飾的木聚糖酶的性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于Campbell等的木聚糖酶性能。
實(shí)施例7NI-BX6和NI-BX7的嗜熱性與天然梭狀芽孢桿菌木聚糖酶和褐色熱單胞木聚糖酶的比較突變體木聚糖酶NI-BX6的N-末端結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)來自丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(CaX)的一段短序列的延伸。突變體木聚糖酶NI-BX7的N-末端結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)三肽GRR的延伸。NI-BX6和NI-BX7的一段氨基酸序列用一個(gè)來自褐色熱單胞的熱穩(wěn)定木聚糖酶TfxA的短序列取代。通過與發(fā)表的關(guān)于天然熱單胞和梭狀芽孢桿菌木聚糖酶的數(shù)據(jù)比較來評估NI-BX6和NI-BX7的嗜熱性。
在溫度高至85℃時(shí)仍有很高活性的突變體NI-BX6和NI-BX7優(yōu)于具有低的多的最適溫度43℃的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(CaX)(Zappe et al.1987，Zappe et al.1990)。
沒有關(guān)于褐色熱單胞木聚糖酶TfxA的溫度曲線的數(shù)據(jù)。關(guān)于褐色熱單胞的發(fā)酵上清的嗜熱性有發(fā)表的數(shù)據(jù)可用(Casimir-Schenkel et al.1992)，這個(gè)上清包括6個(gè)木聚糖酶，TfxA是其中之一。根據(jù)分析褐色熱單胞的發(fā)酵上清的描述的方法(Casimir-Schenkel et al.1992)，測定溫度對NI-BX6和NI-BX7活性的影響．這包括在溶于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7)的木聚糖中加入突變體木聚糖酶并在70，80和90℃精確保溫10分鐘。
數(shù)據(jù)顯示嵌合的芽孢桿菌木聚糖酶表現(xiàn)出比褐色熱單胞木聚糖酶上清更高的嗜熱性，并因此很可能高于TfxA(表6)。
這個(gè)實(shí)施例顯示了出人意料的結(jié)果，即在嵌合修飾中短片段的插人可以使木聚糖酶的耐熱性提高得遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過作為短片段來源的嗜熱木聚糖酶。
表6.pH7.0時(shí)溫度對相對酶活性的影響 *70℃的酶活性計(jì)算為100％。
**Casimir-Schenkel et al.1992發(fā)表的數(shù)據(jù)，在此引為參考文獻(xiàn)。
與野生型的酶相比，除了酶活性發(fā)揮作用的更高的溫度外，一些新的突變體還獲得了更高的酶活性。一些NI-BX木聚糖酶(NI-BX6，NI-BX7)在其相應(yīng)的最佳溫度(75℃)時(shí)的相對活性四倍于野生型BcX在最佳溫度(55℃)時(shí)的相對活性(參見圖6)。
總之，成功地提高了真菌木霉木聚糖酶嗜熱性的修飾大致可以用于細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶。
實(shí)施例8修飾的木霉木聚糖酶的pH/活性曲線這是為了測定不同的pH對木聚糖酶水解可溶性木聚糖的酶活性的影響。除了改變溫育溫度和時(shí)間外，測定方法與標(biāo)準(zhǔn)分析法相同．將木霉酶(15μg/mL)和溶于pH4-8的50mM檸檬酸鈉緩沖液的可溶性木聚糖在65℃共同溫育，30分鐘后，用HBAH測定從木聚糖釋放出來的還原糖的量并以最佳pH時(shí)的值為100％計(jì)算出相對活性。
pH對不同NI-TX木聚糖酶的酶活性的影響如圖7所示。
天然TrX，NI-TX1，NI-TX5，NI-TX6顯示相同的pH/活性曲線，在高至pH5.5時(shí)具有很高的活性，在pH6時(shí)活性顯著下降。
在突變體NI-TX2，NI-TX3和NI-TX8中用Tfx(1-29)的取代導(dǎo)致在pH6.0時(shí)仍保持全部活性，并在pH7時(shí)有明顯的活性。這表示比天然TrX增加了1個(gè)pH單位。突變體NI-TX9顯示了與NI-TX8相同的pH/活性曲線，因此說明上游的CaX序列可以用三肽GRR替換。
具有雙重突變(N10H N11D)的類似物NI-TX10與其前體NI-TX1相比，酶活性的pH上限提高了0.5pH單位。NI-TX11，NI-TX12和NI-TX13提高了0.6pH單位。
實(shí)施例9修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的pH曲線測試方法與實(shí)施例8中的修飾的木霉木聚糖酶的測試方法相同。將環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶與溶于檸檬酸鈉緩沖液(pH4-8)和硼酸鈉緩沖液(pH9.5和10)的可溶性木聚糖在65℃保溫。如圖8所示，在高至pH6.0時(shí)天然BcX保留完整活性。
在突變體NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX5，NI-BX6，和NI-BX7中用Tfx(1-33)的長序列的取代使酶活性延伸到超過pH7.0(圖8)，這說明比BcX提高了1.5-2pH單位。
實(shí)施例10修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的pH/活性曲線與Campbell等的木聚糖酶的pH/活性曲線的比較根據(jù)實(shí)施例8中描述的方法測定并比較了NI-BX木聚糖酶與Campbell等現(xiàn)有技術(shù)中改進(jìn)最大的木聚糖酶TS19a的pH范圍，結(jié)果如圖8所示。NI-BX木聚糖酶的最佳pH比TS19a的最佳pH提高了1-1.5個(gè)單位，而TS19a本身只比天然BcX稍有提高(0.5pH單位)。這個(gè)結(jié)果說明本發(fā)明的木聚糖酶的性能優(yōu)于Campbell等的木聚糖酶。
實(shí)施例11修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的pH/活性曲線與天然的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌和褐色熱單胞木聚糖酶的pH/活性曲線的比較因?yàn)镹I-BX木聚糖酶的N-末端結(jié)構(gòu)域由丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(CaX)和褐色熱單胞的木聚糖酶TfxA的短序列組成，所以將修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的pH范圍和這兩個(gè)天然的木聚糖酶的發(fā)表數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。
在65℃，pH高至7.0時(shí)有最大活性(圖8)的NI-BX突變體木聚糖酶，比43℃最適pH6.0的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(CaX)(Zappe et al.1987，Zappe et al.1990)有更高的最大pH。
對褐色熱單胞木聚糖酶TfxA來說，其pH范圍已經(jīng)被披露(Wilson et al，PCT/1995)。為了比較研究，根據(jù)測定TfxA時(shí)描述的方法(Wilson et al，PCT/1995)測定pH對NI-BX木聚糖酶的酶活性的影響。這包括將木聚糖酶加入到溶于pH8-10的0.05M甘氨酸鈉緩沖液的木聚糖中并在50℃保溫30分鐘。如圖9所示，芽孢桿菌木聚糖酶NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX6，和NI-BX7都顯示最佳pH為9，而TfxA的最佳pH為8。
這個(gè)實(shí)施例顯示了出人意料的結(jié)果，即本發(fā)明的木聚糖酶比用于提供氨基酸短序列的兩個(gè)木聚糖酶都具有較高的pH范圍。
實(shí)施例12修飾的木霉木聚糖酶的熱穩(wěn)定性這是為了測定在沒有木聚糖存在的情況下，在一系列溫度中貯存的木聚糖酶的耐性。下列參數(shù)通用于NI-TX和NI-BX木聚糖酶。將在分析緩沖液(50mM檸檬酸鈉，pH5.5或4.5)中的木聚糖酶(150μg/mL)在一系列溫度下溫育。以固定的間隔分部取樣。冷卻至20℃后，通過實(shí)施例3的HBAH分析測定在40℃時(shí)被加熱樣品的殘留酶活性。以“0分鐘”溫育樣品的酶活性為參照將測得的酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。
圖10顯示在53℃時(shí)嵌合木聚糖酶NI-TX5，NI-TX10，和NI-TX11的貯存穩(wěn)定性高于天然的TrX。以NI-TX5為例，用Tfx的SMEL四肽序列替換(26-29)區(qū)使其在溫育60分鐘后仍保留全部的酶活性。
在大腸桿菌中表達(dá)的NI-TX1，Tv(3-190)，和TrX與天然的TrX相比熱穩(wěn)定性沒有改進(jìn)。
在更高的溫育溫度68℃時(shí)，天然的TrX，NI-TX1和NI-TX5在不到10分鐘內(nèi)喪失全部酶活性(圖11)。
在同樣的溫度時(shí)，嵌合木聚糖酶NI-TX2在10分鐘后保留了40％的酶活性。
嵌合木聚糖酶NI-TX8在60分鐘后保留了55％的活性，因此說明它對貯存溫度的耐性比天然的TrX提高了約15℃。
總之，在NI-TX2，NI-TX8，和NI-TX9中的嵌合修飾，即用Tfx(1-29)序列替換木霉木聚糖酶的(1-29)區(qū)，用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-31)序列在(-10)至(-2)位置和用精氨酸在(-1)位置，或用三肽GRR進(jìn)行上游延伸，進(jìn)一步提高了熱穩(wěn)定性。
實(shí)施例13修飾的芽孢桿菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性將修飾的芽孢桿菌木聚糖酶NI-BX和BcX在70℃和pH5.5溫育(圖12)。不出所料天然木聚糖酶BcX在不到10分鐘內(nèi)喪失全部酶活性，相反，突變體NI-BX1在20到30分鐘后保留大部分活性，這說明可以通過用Tfx(1-31)序列替換BcX(1-22)序列來提高環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。在NI-BX3，NI-BX5，NI-BX6，和NI-BX7中，用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌xynB(23-29)序列在(-10)至(-4)位置，用甘氨酸在(-3)位置和用精氨酸在(-2)和(-1)位置或用三肽GRR進(jìn)行N-末端延伸可進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性。對NI-BX6和NI-BX7來說，熱穩(wěn)定性比天然的BcX酶提高了約15℃。因此成功地提高了真菌木霉木聚糖酶熱穩(wěn)定性的修飾大致可以用于細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶。
實(shí)施例14修飾的木霉木聚糖酶在紙漿處理中性能的評估上面實(shí)施例3至實(shí)施例13中描述的分析方法包括可溶性木聚糖的水解并且這個(gè)方法在NI-TX和NI-BX系列中嗜熱的修飾木聚糖酶的鑒定中是成功的。但是，在漂白過程的紙漿預(yù)處理中，木聚糖酶將與紙漿中的不溶性木聚糖相互作用。因此證實(shí)用可溶性木聚糖底物鑒定到的性能增強(qiáng)也可以在紙漿處理中觀察到是很重要的。因此，測定了修飾的木聚糖酶在漂白前的褐紙漿處理中的性能。
將天然的和修飾的木聚糖酶樣品送到Iogen Corporation of Ottawa，Canada以進(jìn)行在紙漿上的測試，Iogen制造并向紙漿工業(yè)提供木聚糖酶并發(fā)展了測試技術(shù)以評價(jià)木聚糖酶在處理紙漿中的性能。測試方法包括在紙漿中加入酶并維持一段特定的時(shí)間，然后測定酶對隨后的紙漿可漂白性的影響。測試是用商品化的Kappa number 25.6的軟木牛皮紙紙漿進(jìn)行的。
木霉木聚糖酶的Iogen紙漿測試結(jié)果如圖13所示，在pH6.0時(shí)(天然TrX在處理紙漿時(shí)的最佳pH)，在高至52℃時(shí)仍有良好的性能。在pH6.5時(shí)天然TrX對紙漿沒有活性。
在溫度高于40℃時(shí)，大腸桿菌表達(dá)的具有一個(gè)單一點(diǎn)突變Q162H的NI-TX1對紙漿沒有作用。相反，在pH6.5時(shí)，突變體NI-TX5，NI-TX2和NI-TX8可以在相應(yīng)地高至60，61，和65℃時(shí)起作用。
雖然酶在紙漿中耐受的絕對溫度低于在可溶性木聚糖的水解中的溫度，但是修飾的木聚糖酶在紙漿處理中溫度(+8至13℃)和pH(+0.5單位)的改進(jìn)與實(shí)施例4和實(shí)施例8中描述的在木聚糖水解中的嗜熱性和嗜堿性的改進(jìn)是一致的。
基于這些初步測試，這些酶在紙漿處理中可耐受的溫度和pH范圍是令人鼓舞的。使用不同的紙漿和處理技術(shù)更進(jìn)一步地測試溫度和pH范圍將有可能提高修飾的木聚糖酶對紙漿起作用的溫度和pH范圍。
實(shí)施例15修飾的芽孢桿菌木聚糖酶在紙漿處理中性能的評估Iogen Corporation還測試了環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶在紙漿處理中的性能(圖14)。
在pH8.0時(shí)，天然BcX在溫度高于40℃時(shí)性能很差。當(dāng)pH降到7時(shí)，BcX只能在最高不超過50℃時(shí)有作用。
相反，突變體NI-BX1在pH8.0，溫度高至75℃時(shí)仍有活性。
雖然NI-BX1酶在紙漿中耐受的絕對溫度低于在可溶性木聚糖的水解中的溫度，但是修飾的木聚糖酶在紙漿處理中溫度(+28℃)和pH(+1單位)的改進(jìn)與實(shí)施例5和實(shí)施例9中描述的在木聚糖水解中的溫度耐性和pH范圍的改進(jìn)是一致的。
基于這些初步測試，這些酶在紙漿處理中可耐受的溫度和pH范圍是令人鼓舞的。使用不同的紙漿和處理技術(shù)更進(jìn)一步地測試溫度和pH范圍將有可能提高修飾的木聚糖酶對紙漿起作用的溫度和pH范圍。
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演示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案后，本發(fā)明由所附的權(quán)利要求書的范圍限定。
序列表(1)一般信息(i)申請者宋L榮，矢口誠，石川和彥(ii)發(fā)明名稱提高木聚糖酶嗜熱性，嗜堿性和熱穩(wěn)定性的修飾(iii)序列數(shù)54(iv)通訊地址(A)收信人Fitzpatric，Cella，Harper，和Scinto(B)街道277 Park Ave。
(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵政編碼10172-0194(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)歸檔日期IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/709,912(B)申請日1996年9月9日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Olsen Mr，Warren E(B)登記號27290(C)卷號/文檔號1039.2000(viii)電訊信息(A)電話(212)758-2400(B)電傳(212)758-2982
(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度184個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體黑曲霉，awamori變種(x)出版信息(A)作者M(jìn)oat Dr，JDr Roga，MDr Verbakel，JStam，HSantos da silva，MJEgmond，MRHagemans，M.L.DGorcom，R.F.M.V.
Hessing，J.G.M.
Hondel，C.A.M.J(C)雜志Xylan and Xylanase(F)頁數(shù)349-360(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp1 5 10 15Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp20 25 30Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser35 40 45Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser50 55 60Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gly Ala Glu Tyr65 70 75 80Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr85 90 95
Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr100 105 110Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr115 120 125Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr130 135 140Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser145 150 155 160Asp Phe Asn Tyr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala GlySer Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser180(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度185個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體塔賓曲霉(x)出版信息(A)作者de Graaff，L.H.
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Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gln Asn Leu Gly Asp1 5 10 15Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp20 25 30Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Gly Trp Thr Thr Gly35 40 45Ser Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser50 55 60Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu65 70 75 80Tyr Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala85 90 95Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys100 105 110Thr Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe115 120 125Thr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val130 135 140Thr Val Ala Asn His phe Asn Phe Trp Ala His His Gly Phe His Asn145 150 155 160Ser Asp Phe Asn Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala165 170 175Gly Ser Ala Ala Val Thr Ile Ser Ser180 185
(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度185個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體環(huán)狀芽孢桿菌(x)出版信息(A)作者Yang，R.C.A.
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Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr115 120 125Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile130 135 140Thr Phe Thr Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu145 150 155 160Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser165 170 175Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp180 185(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度201個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體短小芽孢桿菌(x)出版信息(A)作者Fukusaki，EPanbangred，WShinmyo，AOkada，H(C)雜志FEBS Letters(D)卷號171(F)頁數(shù)197-201(G)日期1984(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Thr Ile Thr Asn Asn Glu Met Gly Asn His Ser Gly Tyr Asp Tyr1 5 10 15Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly20 25 30
Gly Ala Phe Ser Ala Gly Trp Asn Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg35 40 45Lys Gly Lys Lys Phe Asp Ser Thr Arg Thr His His Gln Leu Gly Asn50 55 60Ile Ser Ile Asn Tyr Asn Ala Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ser Tyr65 70 75 80Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Gln Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile85 90 95Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Ala Tyr Lys Gly Ser100 105 110Phe Tyr Ala Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Val115 120 125Asn Gln Pro Ser Ile Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser130 135 140Val Arg Gln Thr Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His145 150 155 160Phe Arg Lys Trp Glu Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu165 170 175Thr Ala Phe Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val180 185 190Met Thr Asn Gln Leu Phe Ile Gly Asn195 200(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度185個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體Bacillus subtilus(x)出版信息(A)作者Parce，M.G.
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(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度211個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體丙酮丁醇棱狀芽孢桿菌P262(B)株系Xyn B(x)出版信息(A)作者Zappe，HJones，W.A.
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(C)雜志Nucleic Acids Res.
(D)卷號18(F)頁數(shù)2719(G)日期1990(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Ala Phe Asn Thr Gln Ala Ala Pro Lys Thr Ile Thr Ser Asn Glu1 5 10 15Ile Gly Val Asn Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly20 25 30Asn Thr Ser Met Thr Leu Lys Asn Gly Gly Ala Phe Ser Cys Gln Trp35 40 45Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Asp50 55 60Thr Gln Thr Tyr Lys Gln Leu Gly Asn Ile Ser Val Asn Tyr Asn Cys65 70 75 80Asn Tyr Gln Pro Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr85 90 95Ser Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly Ser Trp100 105 110Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Lys Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly115 120 125
Ile Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Ile Asn Gln Pro Ser Ile Gln130 135 140Gly Asn Thr Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr Lys Arg145 150 155 160Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Lys His Phe Ala Ala Trp Glu Ser165 170 175Lys Gly Met Pro Leu Gly Lys Met His Glu Thr Ala Phe Asn Ile Glu180 185 190Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Lys Ala Asp Val Asn Ser Met Ser Ile Asn195 200 205Ile Gly Lys210(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度206個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)起源(A)有機(jī)體Clostridium stercorarium(B)株系Xyn A(x)出版信息(A)作者Sakka，KKojima，YKondo，TKarita，SOhmiya，KShimada，K(C)雜志Biosci.Biotech，Biochem(D)卷號57(F)頁數(shù)273-277(G)日期1993(xi)序列描述SEQ ID NO7
Gly Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp1 5 10 15Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ile Met Glu Leu Asn Asp20 25 30Gly Gly Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe35 40 45Arg Lys Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly50 55 60Asp Ile Val Val Glu Tyr Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser65 70 75 80Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Phe Leu Val Glu Tyr Tyr85 90 95Ile Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys100 105 110Gly Thr Ile Thr Gln Trp Met Ala Gly Thr Tyr Glu Ile Tyr Glu Thr115 120 125Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Ala Thr Phe Gln Gln130 135 140Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val145 150 155 160Thr Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys165 170 175Met Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr180 185 190Ala Asn Val Tyr Lys Asn Glu Ile Arg Ile Gly Ala Asn Pro195 200 205
(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度211個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體產(chǎn)黃瘤胃球菌(x)出版信息(A)作者Zhang，JFlint，H.J.
(C)雜志EMBL數(shù)據(jù)庫入藏號Z11127(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO8Ser Ala Ala Asp Gln Gln Thr Arg Gly Asn Val Gly Gly Tyr Asp Tyr1 5 10 15Glu Met Trp Asn Gln Asn Gly Gln Gly Gln Ala Ser Met Asn Pro Gly20 25 30Ala Gly Ser Phe Thr Cys Ser Trp Ser Asn Ile Glu Asn Phe Leu Ala35 40 45Arg Met Gly Lys Asn Tyr Asp Ser Gln Lys Lys Asn Tyr Lys Ala Phe50 55 60Gly Asn Ile Val Leu Thr Tyr Asp Val Glu Tyr Thr Pro Arg Gly Asn65 70 75 80Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Met Glu Tyr85 90 95Tyr Ile Val Glu Gly Trp Gly Asp Trp Arg Pro Pro Gly Asn Asp Gly100 105 110Glu Val Lys Gly Thr Val Ser Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Asp Ile Arg115 120 125Lys Thr Met Arg Tyr Asn Gln Pro Ser Leu Asp Gly Thr Ala Thr Phe130 135 140Pro Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Thr Ser Gly Ser Ala Asn Asn Gln145 150 155 160
Thr Asn Tyr Met Lys Gly Thr Ile Asp Val Ser Lys His Phe Asp Ala165 170 175Trp Ser Ala Ala Gly Leu Asp Met Ser Gly Thr Leu Tyr Glu Val Ser180 185 190Leu Asn Ile Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Val Lys Ser195 200 205Val Ser Val210(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度197個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)起源(A)有機(jī)體群交裂褶菌(B)株系木聚糖酶A(x)出版信息(A)作者Oku，TYaguchi，MParse，MJurasek，L(C)雜志Canadian Fed.Biol.Soc.annual meeting(F)頁數(shù)摘要#676(G)日期1988(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Gly Thr Pro Ser Ser Thr Gly Thr Asp Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ser1 5 10 15Trp Trp Thr Asp Gly Ala Gly Asp Ala Thr Tyr Gln Asn Asn Gly Gly20 25 30Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Trp Ser Gly Asn Asn Gly Asn Leu Val Gly35 40 45Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ala Ala Ser Arg Ser Ile Ser Tyr Ser50 55 60Gly Thr Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp65 70 75 80
Thr Arg Ser Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Ser85 90 95Tyr Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ser His Lys Gly Ser Val Thr Cys Asn100 105 110Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Leu Ser Thr Trp Arg Tyr Asn Ala Pro Ser115 120 125Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Glu Gln Phe Trp Ser Val Arg Asn Pro130 135 140Lys Lys Ala Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Thr Val Asp Val Gln Cys145 150 155 160His Phe Asp Ala Trp Lys Gly Leu Gly Met Asn Leu Gly Ser Glu His165 170 175Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ala180 185 190Thr Ile Thr Val Thr195(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度191個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體變青鏈霉菌(B)株系Xyn B(x)出版信息(A)作者Shareck，F(xiàn)Roy，CYaguchi，MMorosoli，RKluepfel，D(C)雜志Gene(D)卷號107(F)頁數(shù)75-82(G)日期1991
(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Thr Val Val Thr Thr Asn Gln Glu Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr1 5 10 15Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ser Gln Gly Thr Val Ser Met Asn Met Gly20 25 30Ser Gly Gly Gln Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val35 40 45Ala Gly Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Gln Tyr Ser50 55 60Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp65 70 75 80Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr85 90 95Tyr Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly100 105 110Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Va1 Asn Lys Pro Ser Val Glu115 120 125Gly Thr Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg130 135 140Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Ala Gly Met Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ile Asn Val Gly Gly180 185 190
(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度191個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體變青鏈霉菌(B)株系Xyn C(x)出版信息(A)作者Shareck，F(xiàn)Roy，CYaguchi，MMorosoli，RKluepfel，D(C)雜志Gene(D)卷號107(F)頁數(shù)75-82(G)日期1991(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Thr Thr Ile Thr Thr Asn Gln Thr Gly Thr Asp Gly Met Tyr Tyr1 5 10 15Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly20 25 30Gly Gly Ser Tyr Ser Thr Gln Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala35 40 45Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Asp Gly Asn Val Arg Tyr Asn Gly Tyr50 55 60Phe Asn Pro Val Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Gln Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Gly Thr115 120 125
Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140Gly Ser Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Ala Gly Met Asn Met Gly Gln Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly180 185 190(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度189個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體鏈霉菌菌株36a(x)出版信息(A)作者Nagashima，MOkumoto，YOkanishi，M(C)雜志Trends in Actinomycetologia(F)頁數(shù)91-96(G)日期1989(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Thr Thr Ile Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Asp Gly Met Tyr Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly Gly20 25 30Gly Ser Tyr Ser Thr Arg Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Arg Tyr Thr Gly Trp50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg85 90 95
Pro Thr Gly Glu Thr Arg Gly Thr Val His Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Ala Pro115 120 125Ala Ala Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr Glu Gly165 170 175Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser Gly180 185(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度189個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體褐色熱單胞(B)株系Tfx A(x)出版信息(A)作者Irwin，DJung，E.D.
Wilson，D.B.
(C)雜志Appl.Environ.Microbiol.
(D)卷號60(F)頁數(shù)763-770(G)日期1994(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly20 25 30
Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Met Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr115 120 125Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Ala Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly145 150 155 160Met His Leu Gly Thr His Asp Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr165 170 175Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser180 185(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度190個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體Thrichoderma harzianum(x)出版信息(A)作者Yaguchi，M
Roy，CWatson，D.C.
Rollin，F(xiàn)Tan，L.U.L.
Senior，D.J.
Saddler，J.N.
(C)雜志Xylan and Xylanase(F)頁數(shù)435-438(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO14Gln Thr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Tyr Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Ala Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Gly Gly20 25 30Gly Ser Phe Thr Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190
(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度178個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體Trichoderma reesei(B)株系Xyn I(x)出版信息(A)作者Torronene，AMach，R.L.
Messner，R.
Gonzalez，R.
Kalkkinen，AKubicek，，C.P.
(C)雜志Biotechnology(D)卷號10(F)頁數(shù)1461-1465(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly Gln Val Ser1 5 10 15Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn Thr Gln Asp20 25 30Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala Pro Ile35 40 45Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu Ser50 55 60Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu65 70 75 80Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly Thr Val Thr85 90 95Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Val Asn Glu100 105 110
Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Val Arg115 120 125Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn130 135 140Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Met Asn Tyr Gln Val145 150 155 160Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gln Ser Val165 170 175Ser Asn(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度190個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體Trichoderma reesei(B)株系Xyn II(x)出版信息(A)作者Torronene，AMach，R.L.
Messner，RGonzalez，RKalkkinen，NHarkki，AKubicek，C.P.
(C)雜志Biotechnology(D)卷號10(F)頁數(shù)1461-1465(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO16Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly
20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度190個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部的(vi)最初來源(A)有機(jī)體綠色木霉(x)出版信息(A)作者Yaguchi，MRoy，C
Ujie，MWatson，D.C.
Wakarchuk，W.
(C)雜志Xylan and Xylanase(F)頁數(shù)149-154(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO17Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190
(2)SEQ ID N018信息(i)序列特征(A)長度573個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)環(huán)狀(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆pTvX(3-190)(xi)序列描述SEQ ID NO18CTAGCATAGG ACCAGGAACC GGTTTCAACA ACGGTTACTT TTACAGCTAT TGGAACGATG 60GCCATGGTGG TGTTACCTAT ACAAACGGGC CCGGAGGCCA ATTTAGCGTC AATTGGTCTA120ACTCCGGAAA CTTCGTAGGT GGAAAAGGTT GGCAACCCGG GACCAAAAAT AAGGTGATCA180ACTTCTCTGG ATCTTATAAT CCGAATGGGA ATTCATACTT AAGCGTCTAT GGCTGGTCTA240GAAACCCACT GATTGAATAT TACATTGTCG AAAATTTCGG TACCTACAAT CCGAGTACCG300GCGCCACAAA ATTAGGCGAA GTCACTAGTG ATGGATCCGT ATATGATATC TACCGTACCC360AACGCGTTAA TCAGCCATCG ATCATTGGAA CCGCCACCTT TTATCAGTAC TGGAGTGTTA420GACGTACGCA TCGGAGCTCC GGTTCGGTTA ATACTGCGAA TCACTTTAAT GCATGGGCAC480AGCAAGGGTT AACCCTAGGT ACAATGGATT ATCAAATCGT AGCGGTGGAA GGCTACTTCT540CGAGTGGTTC CGCTAGTATT ACAGTGAGCT AAA 573(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度579個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)環(huán)狀(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆pXYbc(viii)在基因組中的位置
(C)單位bp(xi)序列描述SEQ ID NO19GCTAGCACAG ATTACTGGCA AAACTGGACA GACGGTGGCG GTATCGTTAA TGCCGTGAAC 60GGCTCCGGAG GCAACTACAG CGTGAATTGG TCTAATACTG GGAACTTCGT AGTCGGAAAA120GGTTGGACGA CAGGATCCCC GTTCCGTACG ATCAACTACA ACGCTGGCGT TTGGGCCCCG180AATGGTAACG GTTACCTGAC ACTGTATGGC TGGACGCGTT CGCCACTGAT TGAATATTAC240GTTGTCGACT CTTGGGGAAC GTACCGTCCG ACTGGAACCT ACAAAGGCAC AGTCAAAAGC300GATGGTGGTA CCTATGACAT CTACACCACC ACAAGATACA ACGCACCTTC CATCGATGGC360GATCGGACCA CCTTTACTCA GTATTGGAGT GTTAGACAAT CTAAGCGGCC GACTGGTTCG420AACGCCACCA TTACGTTCAC CAATCACGTG AATGCATGGA AATCCCACGG TATGAACCTA480GGTTCTAATT GGGCTTATCA AGTAATGGCG ACCGAAGGCT ACCAGAGCTC TGGTTCTTCC540AACGTTACAG TGTGGTAAAG ATCTTGAAGC TTGGGACGT 579(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-162H-1(xi)序列描述SEQ ID NO20TGGGCACAGC ACGGGTTAAC C21(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”
(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-162H-2(xi)序列描述SEQ ID NO21CTAGGGTTAA CCCGTGCTGT GCCCATGCA 29(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)長度65個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-1(xi)序列描述SEQ ID NO22CTAGCCACGC GGCCGTAACT TCAAATGAAA CCGGTTATCA TGACGGCTAT TTCTACAGCT 60TCTGG 65(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度38個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-2(xi)序列描述SEQ ID NO23ACCGATGCAC CGGGAACTGT GTCCATGGAG CTCGGGCC 38
(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度39個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-3(xi)序列描述SEQ ID NO24TCATGATAAC CGGTTTCATT TGAAGTTACG GCCGCGTGG 39(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度56個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-4(xi)序列描述SEQ ID NO25CGAGCTCCAT GGACACAGTT CCCGGTGCAT CGGTCCAGAA GCTGTAGAAA TAGCCG 56(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”
(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx(1-6)-1(xi)序列描述SEQ ID NO26CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGGCAGTAAC ATCAAATGAA A41(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx(1-6)-2(xi)序列描述SEQ ID NO27CCGGTTTCAT TTGATGTTAC TGCCATCTGC AGCCTCCTTA G41(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-1f(xi)序列描述SEQ ID NO28CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A41(2)SEQ ID NO29信息
(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-8f(xi)序列描述SEQ ID NO29CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTTA G 41(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-26SMEL-1(xi)序列描述SEQ ID NO30CATGGTGGTG TGAGCATGGA GCTCGGGCC 29(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無
(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-28E/29L-1(xi)序列描述SEQ ID NO31CGAGCTCGTA GGTCACACCA C 21(2)SEQ ID NO32信息(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-27M/29L-1(xi)序列描述SEQ ID NO32CATGGAGGCG TCACAATGAC TCTGGGGCC 29(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-27M/29L-2(xi)序列描述SEQ ID NO33CCAGAGTCAT TGTGACGCCT C 21(2)SEQ ID NO34信息(i)序列特征
(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-27M-1(xi)序列描述SEQ ID NO34CATGGAGGCG TCACAATGAC TAATGGGCC 29(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX-27M-2(xi)序列描述SEQ ID NO35CATTAGTCAT TGTGACGCCT C 21(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否
(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)R-1(xi)序列描述SEQ ID NO36CTAGCGCAAG AGCAGTAACA AGTAACGAGA30(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)R-2(xi)序列描述SEQ ID NO37CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTCTTGCG30(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特征(A)長度47個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆CaTf-(-1)R-1(xi)序列描述SEQ ID NO38CTAGCGCATT CAACACACAG GCCGCTCCTC GAGCTGTCAC CAGCAAC 47(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)長度51個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆CaTf-(-1)R2(xi)序列描述SEQ ID NO39CCGGTCTCGT TGCTGGTGAC AGCTCGAGGA GCGGCCTGTG TGTTGAATGC G 51(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)長度54個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆GRR-Tf(1-6)-1(xi)序列描述SEQ ID NO40ACTCTGCAGA TGGGAAGAAG GGCCGTAACT TCAAAATGAAA CCGGTTATCA TGAC 54(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源
(B)克隆Uni-PCR-1r(xi)序列描述SEQ ID NO41GAAAAGTGCC ACCTGACGTC CCAAGCTT 28(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特征(A)長度73個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX10HD-2(xi)序列描述SEQ ID NO42CCGGTTTCCA CGACGGTTAC TTTTACAGCT ATTGGAACGA CGGCCATGGA GGAGTAACTT60ACACCAATGG GCC 73(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特征(A)長度65個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX10HD-1(xi)序列描述SEQ ID NO43CATTGGTGTA AGTTACTCCT CCATGGCCGT CGTTCCAATA GCTGTAAAAG TAACCGTCGT60GGAAA65(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特征
(A)長度49個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TX10HD/N-1(xi)序列描述SEQ ID NO44GAAACCGGTT ACCACRACGG TTACTTTTAC AGCTATTGGA ACGATGGCC49(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆TrX1f(xi)序列描述SEQ ID NO45CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A41(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否
(vii)最近來源(B)克隆TrX8f(xi)序列描述SEQ ID NO46CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTIA G41(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特征(A)長度37個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-2b(xi)序列描述SEQ ID NO47ACCGATGCCC CGGGAACTGT GAGTATGGAG CTCGGCC37(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特征(A)長度63個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tfx-4b(xi)序列描述SEQ ID NO48CCGGGGCCGA GCTCCATACT CACAGTTCCC GGGGCATCGG TCCAGAAGCT GTAGAAATAG60CCG 63(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特征
(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)K-1(xi)序列描述SEQ ID NO49CTAGCGCAAA AGCAGTAACA AGTAACGAGA 30(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)K-2(xi)序列描述SEQ ID NO50CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTTTGCG 30(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否
(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)D-1(xi)序列描述SEQ ID NO51CTAGCGCAGA TGCAGTAACA AGTAACGAGA30(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Tf-(-1)E-2(xi)序列描述SEQ ID NO52CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTCTGCG30(2)SEQ ID NO53信息(i)序列特征(A)長度61個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆CaTf-PCR-1(xi)序列描述SEQ ID NO53CCCGCTAGCG CATTCAACAC ACAAGCARGT SSAAGGGCCG TAACTTCAAA TGAAACCGGT60T61(2)SEQ ID NO54信息(i)序列特征
(A)長度39個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(vii)最近來源(B)克隆Xy-14a(xi)序列描述SEQ ID NO54ATTCGGGGCC CAAACGCCAG CGTTGTAGTT GATCGTACG 39
權(quán)利要求
1.一種修飾的木聚糖酶，選自如下一組木霉、曲霉、鏈霉菌和芽孢桿菌的家族11木聚糖酶，其在根據(jù)里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸編號的位置14或其它木聚糖酶的在氨基酸對比時(shí)相應(yīng)的位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸，所說的木聚糖酶已經(jīng)被修飾以展示增強(qiáng)的嗜熱性，嗜堿性或熱穩(wěn)定性，所作的修飾是將所說的木聚糖酶的N-末端區(qū)的一段氨基酸序列用褐色熱單胞木聚糖酶A的一段對比相應(yīng)的氨基酸序列取代以形成一個(gè)嵌合木聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶選自如下一組里氏木霉木聚糖酶I，里氏木霉木聚糖酶II，哈茨木霉木聚糖酶，綠色木霉木聚糖酶，環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶A，枯草芽孢桿菌木聚糖酶A，黑曲霉木聚糖酶A，川地曲霉木聚糖酶C，塔賓曲霉木聚糖酶A，變青鏈霉菌木聚糖酶B和變青鏈霉菌木聚糖酶C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中包括氨基酸1-29的氨基酸序列用褐色熱單胞木聚糖酶A的相應(yīng)對比的氨基酸序列取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所說的木聚糖酶選自NI-TX2，NI-TX3，NI-TX4，NI-TX5，NI-TX7，NI-TX8，NI-TX9，NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX4，NI-BX5，NI-BX6或NI-BX7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸1-29或另外一個(gè)家族11木聚糖酶的相應(yīng)對比的序列用另外一個(gè)家族11木聚糖酶的相應(yīng)對比的氨基酸序列取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，其中里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸1-29或另外一個(gè)家族11木聚糖酶的相應(yīng)對比的序列用褐色熱單胞木聚糖酶A的相應(yīng)對比的氨基酸序列取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)在紙漿的漂白中有卓越性能的木聚糖酶，更具體地說，本發(fā)明涉及比天然木聚糖酶顯示更高的嗜熱性，嗜堿性和熱穩(wěn)定性的修飾的家族11木聚糖酶。修飾的木聚糖酶包含下述三種類型的修飾中的任何一種(1)改變里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II的氨基酸10，27，和29或另外一個(gè)家族11木聚糖酶的相應(yīng)的氨基酸；(2)用來自另外一個(gè)木聚糖酶的氨基酸取代N－末端區(qū)的氨基酸；(3)N－末端的多至10個(gè)氨基酸的上游延伸。
文檔編號D21C9/10GK1550548SQ20041003518
公開日2004年12月1日 申請日期1997年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月9日
發(fā)明者宋·L·榮, 宋 L 榮, 彥, 矢口誠, 石川和彥 申請人:加拿大國立研究院