專利名稱：天然來源的蛋白質(zhì)及由其制備的材料的制作方法
天然來源的蛋白質(zhì)及由其制備的材料本發(fā)明涉及天然來源的蛋白質(zhì)及由其制備的材料，特別是來自其的 線、纖維、泡沫和凝膠。本發(fā)明還提供這些蛋白質(zhì)/線和材料用在生物技術(shù) 和/或藥物領(lǐng)域中，特別是用在制備傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)，縫線材料和在制 備替代材料，優(yōu)選地人工軟骨或腱材料，以及在其它商業(yè)應(yīng)用中的應(yīng)用。蜘蛛拖絲(Spider dragline)的絲具有由其作為半晶體聚合物(2)的組成 引起的特別的性質(zhì)(l)，所述聚合物包含被包埋在無定形基質(zhì)中的晶體區(qū) 域。X射線衍射和NMR顯示晶體區(qū)域由賦予了線以強(qiáng)度的聚丙氨酸序列 的e折疊片組成(3，4)，同時無定形基質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)是提供彈性的富含 甘氨酸的3,螺旋(5)。新鮮分泌的絲蛋白作為液體晶體粘稠物(7， 8)以高濃 度貯存(6)，其在它通過吐絲導(dǎo)管的過程中，通過離子組成，pH(從pH6.9 至'J6.3)的改變(9，10)和水提取(IO，U)而變化從而最終通過外延流動(12) 轉(zhuǎn)化為固體的線。至今研究的所有的拖絲的絲由至少兩種不同的蛋白質(zhì)組成，所述蛋白 質(zhì)具有多到數(shù)百kDa的分子量(13)。十字園蛛(」ra^w力'^fewa&力的兩種 主要的拖絲的絲蛋白，ADF-3和ADF-4對拖絲線裝配和結(jié)構(gòu)的分別的作 用迄今尚未得到確定。分析一級結(jié)構(gòu)揭示ADF-3和ADF-4(14,15)具有類似 的脯氨酸含量和聚丙氨酸基序，但是它們在谷氨酰胺和絲氨酸含量上以及 在富含甘氨酸的區(qū)域的長度上有所不同。重要的是，絲線的性質(zhì)不能從基 礎(chǔ)的蛋白質(zhì)序列推導(dǎo)出來。盡管絲線的質(zhì)量基于涉及的蛋白質(zhì)的一級結(jié) 構(gòu)，其還取決于絲裝配的過程(8)，這使對結(jié)構(gòu)和裝配性質(zhì)的實驗分析成為 必要。科學(xué)和商業(yè)利益促進(jìn)了蜘蛛絲的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的研究。由于蜘蛛的同 種相殘，天然的蜘蛛絲生產(chǎn)是不切實際的，而人工生產(chǎn)在獲得足夠的蛋白 質(zhì)產(chǎn)量和出眾的線-裝配中遇到問題。細(xì)菌的表達(dá)產(chǎn)生低蛋白水平(16)，這 可能是由于細(xì)菌和蜘蛛的不同的密碼子選擇導(dǎo)致的。具有適應(yīng)于表達(dá)宿主 的密碼子選擇的合成基因?qū)е赂叩漠a(chǎn)量(13，17)，但是其合成的蛋白質(zhì)顯示與天然蜘蛛絲不同的性質(zhì)。部分拖絲的絲cDNAs在哺乳動物細(xì)胞系中 的表達(dá)確實產(chǎn)生了絲蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式紡(spin)為"絲 樣"的線，盡管在品質(zhì)上仍舊很差(18)。WO03060099涉及將生物絲蛋白旋轉(zhuǎn)為纖維的方法和裝置。本發(fā)明特 別用于從水溶液中旋轉(zhuǎn)重組的絲蛋白，并增加纖維的強(qiáng)度和制品的實用性 從而使這些纖維的商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用是可實踐的。其中，公開了在哺乳動物 細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)基因的山羊乳腺細(xì)胞中表達(dá)蜘蛛絲蛋白。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供改善的原材料，即蛋白質(zhì)，用于以高產(chǎn)率 和優(yōu)越的品質(zhì)制備蜘蛛絲線，纖維和其它材料。另外的目標(biāo)是提供新的蛋 白質(zhì)/線和基于蜘蛛絲蛋白的另外的材料和/或其它天然衍生的材料用于生 物技術(shù)，藥物和其它的商業(yè)目的。這些目的通過獨立權(quán)利要求的主題而得以解決。優(yōu)選的實施方案在從 屬權(quán)利要求中提出。關(guān)于涉及蜘蛛絲蛋白和由其衍生的線的生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)方法的缺陷， 可以使用合成真正的蜘蛛絲蛋白的不同的更有效的路徑。顯示特別的強(qiáng)度和韌性的蜘蛛拖絲的絲主要有兩種相關(guān)蛋白組成，其 在線裝配中的作用和對于拖絲的線的機(jī)械性質(zhì)的作用大部分還是未知的。為了闡明該作用，本發(fā)明人使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來在宿主昆蟲細(xì)胞 中產(chǎn)生重組的ADF-3和ADF-4，花園蜘蛛十字園蛛的兩種主要的拖絲的 絲蛋白。據(jù)顯示ADF-4，而不是ADF-3容易地在細(xì)胞的胞質(zhì)中自我裝配 為絲。這些ADF-4的絲顯示特別的化學(xué)穩(wěn)定性，其對于真正的蜘蛛拖絲的 絲線是典型的。結(jié)果，ADF-4的性質(zhì)顯示其在拖絲的絲中作為結(jié)構(gòu)關(guān)鍵參 與者的作用。迄今，關(guān)于蜘蛛拖絲絲線的兩種主要的蛋白質(zhì)組分之間的結(jié)構(gòu)，功能 和可能的相互影響知道的很少。本發(fā)明人觀察到盡管它們在一級結(jié)構(gòu)上的 相似性，ADF-3和ADF-4顯示令人驚訝的不同的性質(zhì)。同時ADF-3在其 本質(zhì)上是可溶的蛋白，ADF-4在所用的實驗條件下實際上是不可溶的，并 在s/9細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成絲狀團(tuán)聚體，其具有可與天然拖絲的線比較的 化學(xué)穩(wěn)定性。在ADF-4絲和天然拖絲的絲線之間的相似性顯示ADF-4是
在拖絲的線中提供其化學(xué)和物理強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)"關(guān)鍵參與者"。由于線形成必須快到l-10cm/s的自然巻繞速度(19)，容易裝配的化合物，諸如ADF-4 對于絲形成是必需的。然而，ADF-4聚合的傾向顯示可能在旋轉(zhuǎn)粘稠物中 需要其它因素來避免腺體中的過早聚合。這些因素可能是翻譯后修飾諸如 磷酸化作用和糖基化作用。另外，ADF-4的溶解性可以被共分泌并且也儲 存在粘稠物的蛋白質(zhì)所影響。盡管ADF-3在昆蟲細(xì)胞的胞質(zhì)中不影響 ADF-4的溶解性，其仍舊可以在蜘蛛腺體分泌的過程或其后在調(diào)節(jié)ADF-4 的溶解性中起重要作用。在蜘蛛腺體細(xì)胞以及在腺體內(nèi)腔中的分泌途徑中 存在的特定條件可導(dǎo)致在ADF-3和ADF-4之間的相互作用，其調(diào)節(jié)絲線 裝配。蜘蛛絲可以被視為未來聚合物設(shè)計的基準(zhǔn)點，這不僅是由于它們優(yōu)越 的品質(zhì)，還因為它們可以以經(jīng)濟(jì)的并且以與環(huán)境相容的方式在環(huán)境溫度和 環(huán)境壓力下從水性溶劑中產(chǎn)生而被優(yōu)選。然而，主要的障礙存在于我們與 天然絲纖維生產(chǎn)過程匹配的能力。本文提供的結(jié)果構(gòu)成闡明蜘蛛絲拖絲蛋白例如園蛛拖絲的絲的兩種主要的成分，ADF-3和ADF-4的功能和相互 作用的必要基礎(chǔ)。這些知識對于從重組蛋白質(zhì)中旋轉(zhuǎn)絲線和生產(chǎn)新一代的 纖維材料是必要的。在本發(fā)明的背景中，可以使用產(chǎn)生來自主要的壺腹?fàn)钕袤w的蜘蛛絲拖 絲蛋白的方法，這包括下列步驟a) 提供編碼一種或多種蜘蛛拖絲蛋白的核酸序列，b) 將在a)中提供的核酸序列引入昆蟲細(xì)胞中，c) 表達(dá)所述拖絲蛋白；和d) 回收所述拖絲蛋白。因此，如上提及，由該方法提供的一個主要的優(yōu)勢存在于提供用于蜘 蛛絲拖絲蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，即在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。如上所釋，令人驚奇 地證實，那些蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)比在其它細(xì)胞，如，例如細(xì)菌細(xì)胞 和哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)越。這種改善等價地影響品質(zhì)，即機(jī)械性質(zhì)等， 以及蜘蛛絲拖絲蛋白的產(chǎn)率。作為實例，按照參考文獻(xiàn)16的方法，獲得4mg/l的細(xì)胞，其不能旋 轉(zhuǎn)成線，，在參考文獻(xiàn)18中，獲得25 mg/l的細(xì)胞(獲得線，但是具有非常 差的品質(zhì))。通過本發(fā)明的方法，可以獲得〉30mg/l的細(xì)胞(自我裝配，穩(wěn)定 的線)。優(yōu)選地，由在上述方法的步驟a)中提供的核酸序列編碼的拖絲蛋白優(yōu) 選地選自球-網(wǎng)蜘蛛(園蛛科(Araneidae))的拖絲蛋白。這樣的拖絲蛋白可以來自下列蜘蛛的一種或多種希氏尾園蛛 (Arachnura higginsi)， Araneus circulissparsus，十字園蛛，Argiope picta，條 帶園蛛(Banded Garden Spider)(三帶蜘蛛(Argiope trifasciata))，(BatikSpider) (Batik Golden Web Spider )(Nephila antipodiana)， Beccari's Tent Spider (Cyrtophora beccarii), 鳥類蛛 (Bird-dropping Spider)(Celaenia excavata),黑白棘蛛(Black-and-White Spiny Spider)(庫氏 棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑白園蛛(Black-and-yellow Garden Spider )(Argiope aurantia),流星錘蛛(Bolas Spider) (Ordgarius ftircatus)，流 星錘蛛-巨蜘蛛(Bolas Spider -Magnificent Spider) (Ordgarius magnificus),棕 色水手蛛(Brown Sailor Spider )(嗜水新園蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛 (Brown-Legged Spider )(Neoscona rufofemorata); Capped Black-Headed Spider (帆楚蛛(Zygiella calyptrata)),普通園蛛(Common Garden Spider) (Parawixia dehaani)， 普通園蛛(Common Orb Weaver ) (Neoscona oxancensis), 蟹樣棘園蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver) (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), Curved Spiny Spider (Gasteracantha arcuata),皿云 斑蛛(Cyrtophora moluccensis)， Cyrtophora pamasia， Dolophones conifera, Dolophones turrigera， Doria's Spiny Spider (Gasteracantha doriae),雙點棘蛛 (Double-Spotted Spiny Spider) (Gasteracantha mammosa), Double-Tailed Tent Spider (方格云斑蛛(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蛛 (Aculeperia ceropegia) ， Eriophom pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), Four-spined Jewel Spider (Gasteracantha quadrispinosa)， 園網(wǎng) 蛛(Garden Orb Web Spider )(Eriophora transmarina)， Giant Lichen Orbweaver (Araneus bicentenarius),金色網(wǎng)蛛(Golden Web Spider )(Nephila maculata)， Hasselt's棘蛛(Hasselt's Spiny Spider) (Gasteracantha hasseltii)， Tegenaria atrica， Heurodes turrita, Island Cyclosa Spider (島艾蛛(Cyclosa insulana)), Jewel or Spiny Spider (Astracantha minax)， 腎形園妹(Kidney
Garden Spider)(卵園蛛(Araneus mitificus))， Laglaise's 園蛛(Laglaise's Garden Spider) (Eriovixia laglaisei), Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa bifida), Malabar Spider (Nephilengys malabarensis)， Multi-Coloured St Andrew's Cross Spider (多色金蛛(Argiope versicolor)),觀賞性樹干蛛 (Ornamental Tree-Trunk Spider )(裂腹蟲朱(Herennia omatissima))， Oval St. Andrew's Cross Spider (好勝金蛛(Argiope aemula))， Red Tent Spider (單色云 斑蛛(Cyrtophora unicolor))， Russian Tent Spicier (Cyrtophora hirta)， Saint' Andrew's Cross Spider (凱氏金蛛(Argiope keyserlingi))，猩紅阿秋蛛(猩紅 阿秋蛛(Acusilas coccineus)), 銀色金蛛 (Argiope argentata)， Spinybacked Orbweaver (Gasteracantha cancriformis),斑點園蛛(Spotted Orbweaver) (Neoscona domiciliorum)， St. Andrews Cross (Argiope aetheria), St. Andrew's Cross Spider (Argiope Keyserlingi)， Tree-Stump Spider (無鱗波蛛(Poltys illepidus))， Triangular Spider (Arkys clavatus)， Triangular Spider (Arkys lancearius) ， Two-spined Spider (Poecilopachys australasia),絡(luò)新婦蛛屬(Nephila)物種，例如Nephila clavipes, Nephila senegalensis， Nephila madagascariensis和更多(對于另夕卜的蜘蛛物禾中，還見 下)。十字園蛛是最優(yōu)選的。優(yōu)選地，通過該方法生產(chǎn)的拖絲蛋白質(zhì)是拖絲蛋白質(zhì)野生型ADF-3, ADF-4, MaSp I，禾口/或MaSp II。術(shù)語ADF-3/-4用在由十字園蛛產(chǎn)生的 MaSp蛋白質(zhì)的背景下(十字園蛛絲心蛋白-3/-4)。兩種蛋白質(zhì)ADF-3和~4 屬于MaSp II蛋白質(zhì)類(主要的壺腹?fàn)顂pidroin 11)。可以通過此(即，單獨的或組合以其它蛋白質(zhì))生產(chǎn)的另外的蜘蛛絲 蛋白和它們的數(shù)據(jù)庫登記號是spidroin 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272主要的壺腹?fàn)钕袤w拖絲絲蛋白質(zhì)-1 [大腹園蛛(Araneus ventricosus)] gi|27228957主要的壺腹?fàn)钕袤w拖絲絲蛋白質(zhì)-2 [大腹園蛛]gi |27228959 壺腹?fàn)顂pidroin 1 [Nephila madagascariensis]gi 113562006 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 1 [Nephila senegalensis]gi卩3562010
主要的壺腹?fàn)顂pidroin 1 [Latrodectus geometricus]gi| 13561998 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 1 [三帶金蛛]gil13561984 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 1 [Argiope aurantia〗gi| 13561976 拖絲絲蛋白spidroin 2 [棒絡(luò)新婦蛛(Nephila clavata)]gij 16974791 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 2 [Nephila senegalensis]gi| 13562012 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 2 [Nephila madagascariensis]gi| 13562008 主要的壺腹?fàn)顂pidroin 2 [Latrodectus geometricus]gi| 13562002本發(fā)明特別涉及下面的方面和實施方案按照第一個方面，本發(fā)明涉及蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)，其由SEQ ID NO: 1 或2的核酸序列，或那些核酸序列的變體編碼，所述變體每個被限定為與 SEQ ID NO: 1或2的序列比較，具有一個或多個取代，插入和/或缺失， 在所述變體在適度嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO: 1或2的序列的核酸雜 交的條件下，或在所述變體包含由于遺傳密碼子的簡并性所造成的核酸變 化的條件下，其編碼與SEQ ID NO: 1或2的核酸序列相同或功能上等價 的氨基酸。
術(shù)語"核酸序列"指這些核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。術(shù)語 "核酸"和"多核苷酸"在本文交互地使用來指核苷酸的雜聚物。
雜交的嚴(yán)格性，用于本文時，指這樣的條件下，在所述條件下，所述 多核苷酸雙鏈體是穩(wěn)定的。如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的，雙鏈體的穩(wěn)定 性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(見，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory,(1989))。用于雜 交的嚴(yán)格性水平可以容易地由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來改變。
用于本文時，短語"適度嚴(yán)格條件"指這樣的條件，其容許DNA結(jié) 合于互補(bǔ)核酸，所述互補(bǔ)核酸與所述DNA具有約60%的同一性，優(yōu)選地 約75%的同一性，更優(yōu)選地約85%的同一性；其中與所述DNA大于約90% 的同一性是尤其優(yōu)選的。優(yōu)選地，適度嚴(yán)格條件是這樣的條件，其等價于 在50%甲酰胺，5 xDenhart's溶液，5 x SSPE， 0.2% SDS中于42。C進(jìn)行 雜交，隨后在0.2 x SSPE, 0.2% SDS，于65'C進(jìn)行洗滌。
注意到，本發(fā)明意欲兩種不同種類的ADF-3和ADF-4編碼序列:第一，ADF-3和ADF-4已經(jīng)公開的序列(本文"野生型"序列)和第二，其變體， 由SEQIDNO: 1 (ADF-3)和2 (ADF-4)編碼。野生型序列已經(jīng)公開并且可 以在登記號U47855和U47856(SEQ ID NO: 3和4)下獲得。二如上解釋，絲纖維具有P-折疊的晶體區(qū)域，其間散布類似于液體晶 體聚合物的彈性無定形片段。這兩種片段由兩種不同的蛋白質(zhì)，由不同的 基因編碼的MaSp I (主要的壺腹?fàn)顂pidroin I)和MaSp II (主要的壺腹?fàn)?spidroin II)代表。本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選地是ADF-3, ADF-4(SEQ ID NO: 1和2)或其變 體。SEQ ID NO: 3和4顯示野生型序列的相應(yīng)的氨基酸序列。按照優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的方法提供由聚合物組成的蜘蛛絲蛋白， 其構(gòu)件被限定為一個或多個如上定義的蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的變體。本發(fā) 明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列還涵蓋通過氨基酸插入、缺失和置換而與本文公 開的序列不同的所有的序列。優(yōu)選地，氨基酸"置換"是一種氨基酸被具有類似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì) 的另一種氨基酸取代，即保守性氨基酸取代的結(jié)果。氨基酸置換可以在涉 及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的類似 性基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，非極性(疏水)氨基酸包括，丙氨酸，亮氨酸，異亮 氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸 包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺； 帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸；帶負(fù)電荷(酸性) 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"典型地在約1-5個氨基酸，優(yōu)選地約1， 2或3 個氨基酸范圍內(nèi)。氨基酸添加典型地不超過100，優(yōu)選地不超過80，更優(yōu) 選地不超過50，最優(yōu)選的不超過20個氨基酸，其添加在本發(fā)明的蛋白質(zhì) 上和/或插入其中。注意到本發(fā)明僅意欲那些的添加，其不會對本文公開的 蛋白質(zhì)的機(jī)械和其它的性質(zhì)具有不利影響。可以使用重組DNA技術(shù)并分析得到的重組變體的活性，通過在蛋白 質(zhì)中系統(tǒng)性進(jìn)行氨基酸的插入，缺失或置換來對容許的改變進(jìn)行實驗性確 定。這不需要本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行超出常規(guī)的實驗。按照優(yōu)選的實施方案，將上述限定的一個或多個核酸序列包含在載體
中。優(yōu)選地，該載體是表達(dá)載體，其包含編碼上述定義的一個或多個拖絲 蛋白的核酸序列和一個或多個調(diào)節(jié)序列。這些調(diào)節(jié)序列可以優(yōu)選地包括啟 動子p10和/或多角體蛋白，但是也可以使用其它的晚期和極晚期的桿狀病 毒啟動子。
所述載體更優(yōu)選地是病毒載體，最優(yōu)選地是桿狀病毒載體系統(tǒng)或痘苗 病毒載體系統(tǒng)。還可以在本發(fā)明中使用另外的病毒載體系統(tǒng)。根據(jù)不同的 情況，可能需要對載體進(jìn)行修飾。另外的病毒載體的實例是腺病毒和所有
的負(fù)鏈RNA-病毒，例如狂犬病毒，麻瘆病毒，RSV，等。
作為昆蟲細(xì)胞，可以優(yōu)選地使用鱗翅目昆蟲細(xì)胞，更優(yōu)選地來自
Spod叩tera frugiperda和來自粉夜蛾(Trichoplusia ni)的細(xì)胞。最優(yōu)選地，所 述昆蟲細(xì)胞是Sf9， Sf21或高效(highfive)細(xì)胞。
昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如相對于細(xì)菌系統(tǒng)的一個優(yōu)勢在于這樣的事 實，即產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被糖基化，由此作為微生物降解的靶標(biāo)。這種性質(zhì)例 如在藥物領(lǐng)域，只要絲蛋白質(zhì)傾向于其中需要生物降解的體內(nèi)應(yīng)用，可能 是是重要的。該性質(zhì)可以特別應(yīng)用在縫線材料和傷口閉合和覆蓋系統(tǒng)中。
按照另一個優(yōu)選實施方案，表達(dá)的拖絲蛋白僅是由野生型ADF-4或 由SEQ ID NO: 2編碼的ADF-4。
作為備選，表達(dá)的拖絲蛋白僅是野生型ADF-3或作為拖絲蛋白的由 SEQIDNO: 1的核酸編碼的氨基酸。
本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)的概念相反，兩種已知的主要 的拖絲蛋白中只有一種(優(yōu)選地ADF-4)是生產(chǎn)和裝配拖絲絲線所需要的。 因此，制備拖絲的絲的已知方法可以通過使用僅一種成分來制備拖絲的絲 取代用兩種成分來制備拖絲的絲，來將拖絲的絲的制備大大簡化，如本領(lǐng) 域已知的。因此，僅由ADF-3，并且優(yōu)選地僅由ADF-4組成的拖絲的絲 是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
MaSpI類可以通過氨基酸脯氨酸的含量來從MaSpII中區(qū)分出來。在 MaSpII類中，不存在另外的正式的分類。然而，ADF-3和ADF-4彼此在
它們的氨基酸谷氨^y安的含量和在聚丙氨酸區(qū)域的間隔和長度中不同。因
此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定在MaSpII中，分別對應(yīng)于ADF-3和 ADF-4的區(qū)域。
優(yōu)選地，所述拖絲蛋白的表達(dá)通過分泌表達(dá)發(fā)生。對于進(jìn)一步的解釋， 見實施例章節(jié)。備選地，表達(dá)通過胞質(zhì)生產(chǎn)而發(fā)生。如在實施例中顯示， 在昆蟲細(xì)胞中用于表達(dá)的條件導(dǎo)致令人驚訝的結(jié)果-如上提及-蜘蛛絲蛋白 以高產(chǎn)量和良好的品質(zhì)表達(dá)，并且此外，那些蛋白質(zhì)自裝配為線已經(jīng)在胞 質(zhì)中發(fā)生，而不需要另外的生產(chǎn)步驟。
在本發(fā)明的背景中，可以使用用于生產(chǎn)蜘蛛拖絲蛋白的方法，所述方 法包括下列步驟
a) 表達(dá)如上所限定的蜘蛛拖絲蛋白，
b) 回收所述蛋白，禾口
c) 通過適合的方法將所述蛋白旋轉(zhuǎn)(spining)為線。 在步驟c)中，可以使用本身為本領(lǐng)域已知的旋轉(zhuǎn)方法。例如，蜘蛛絲
蛋白的粘稠物溶液通過吐絲器擠壓形成生物絲。得到的生物絲可以牽引或 伸長。只要分子的晶體和無定形排列存在于生物絲中，牽引或伸長將施加 足以使分子定向使它們更加平行于絲壁的切應(yīng)力并增加生物絲的拉伸強(qiáng) 度和韌性。
粘稠物溶液可以包含來自一種或多種蜘蛛物種的絲蛋白，或來自不同 產(chǎn)絲種屬的絲蛋白的混合物，例如來自蜘蛛和B. mori的絲蛋白的混合物。 在大多數(shù)優(yōu)選的實施方案中，所述的絲蛋白是來自N.clavipes或A. diadematus的拖絲的絲，尤其是蛋白MaSpI, MaSpII， ADF-3，和ADF-4。在 備選實施方案中，粘稠物溶液包含絲蛋白和一種或多種合成聚合物或天然 或合成生物絲蛋白的混合物。
優(yōu)選地，粘稠物溶液是至少1%， 5%，， 10%， 15X重量/體積(w/v)絲 蛋白。更優(yōu)選地，所述粘稠物溶液是多到20%, 25%， 30%, 35%, 40%， 45%， 或50。/。w/v的絲蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，粘稠物溶液包含基本純的蜘 蛛絲蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，粘稠物具有約6.9的pH。
所謂"粘稠物溶液"指包含絲蛋白的任何液體混合物，并且易于擠壓 來形成生物絲或薄膜鑄塑。除了蛋白質(zhì)單體之外，粘稠物溶液還可以包含 更高級的團(tuán)聚體，其包括，例如二聚體，三聚體和四聚體。通常，粘稠物 溶液是pH 4.0-12.0的水溶液并具有少于40%的有機(jī)或離液序列高的試劑 (w/v)。優(yōu)選地，所述粘稠物溶液不包含任何有機(jī)溶劑或離液序列高的試劑，
但是可以包括添加劑來增加溶液的防腐性、穩(wěn)定性或可使用性。
至于"絲"，是指不確定長度的纖維，范圍在極微的長度到一英里或
更長的長度。絲(silk)是天然的絲，而尼龍和聚酯作為合成絲的實例。
至于"生物絲"指從蛋白質(zhì)產(chǎn)生(例如，紡)的絲，所述蛋白質(zhì)包括重
組產(chǎn)生的蜘蛛絲蛋白。
關(guān)于怎樣紡織(spin)蜘蛛絲蛋白纖維的另外的信息可以見于
WO03060099 (Karatzas et al.)，其公開于2003年7月24日，將其并入本文
作為參考。
本發(fā)明還包括蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)或線，其包括由SEQ ID NO: 1和/或2 的核酸編碼的氨基酸序列；或其變體。
在優(yōu)選的實施方案中，所述蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)/線僅包括野生型ADF-4 或由SEQ IDNO:2的核酸編碼的氨基酸作為拖絲蛋白質(zhì)。
作為備選，所述蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)/線僅包括野生型ADF-3或由SEQ ID NO: 1的核酸編碼的氨基酸作為拖絲蛋白質(zhì)。
按照另一個方面，本發(fā)明提供包括上述定義的蛋白質(zhì)或由其組成的凝 膠或泡沫。作為怎樣產(chǎn)生這些泡沫和凝膠的實例可以見于實施例，見下面 的"蜘蛛絲衍生蛋白質(zhì)的裝配"章節(jié)。
此外，本發(fā)明涉及用于植入物和斯滕特固定模的涂層，所述涂層包含 上述定義的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或由其組成。根據(jù)不同的用途，所述涂層可以 由可溶的蛋白質(zhì)、薄膜、凝膠、泡沫、納米纖維和線制備。 一般而言，在 非生物材料諸如陶瓷、金屬、塑料等上的蛋白質(zhì)涂層"隱藏"非生物表面， 預(yù)防炎癥反應(yīng)或身體的排斥。所述蛋白質(zhì)涂層將容許細(xì)胞結(jié)合，這將封住 非生物的材料。此外，植入-相關(guān)炎癥的減少可以通過選擇那些移植物材料 來實現(xiàn)，所述移植物材料與以前用在斯滕特固定模-植入物裝置中的那些相 比，固有地更具生物相容性。常規(guī)移植物材料諸如PET聚酯和尼龍具有高 溶解性因素，其顯示所述材料傾向于在天然脈管(vessel)中更高速率地 溶解并因此更易于發(fā)生炎癥反應(yīng)。
本發(fā)明的材料顯示理想的特性，其抑制在其它在斯滕特固定模-移植 物應(yīng)用中常用的聚合物材料中觀察到的炎癥反應(yīng)。
本發(fā)明還提供線或纖維，其包括如上定義的蛋白質(zhì)，線或纖維和非蜘
蛛來源的另外的材料或纖維，優(yōu)選地是植物來源的材料或纖維。例如，蜘 蛛絲蛋白和棉花的混和的纖維可以是有利的。
待用的另外的纖維包括尼龍、芳族聚酰胺，芳綸，羊毛，碳纖維，膠 原蛋白纖維，纖維素，角蛋白纖維，彈性蛋白纖維，樹膠等的一種或多種。
作為另外的方面，本發(fā)明提供載體，其包含編碼作為唯一的拖絲蛋白
質(zhì)的野生型ADF-4的核酸或其包含SEQ ID NO: 1禾Q/或SEQ ID NO: 2的 核酸。
在另一個方面中，提供桿狀病毒載體，其包含編碼一種或多種拖絲蛋 白質(zhì)的核酸，優(yōu)選地拖絲蛋白質(zhì)ADF-3， ADF-4(野生型)，ADF-3(SEQID NO:l)禾口/或ADF-4(SEQIDNO:2)的核酸。
如已經(jīng)在上面解釋，本文定義的蛋白質(zhì)/線可以用在生物技術(shù)和/或藥 物的領(lǐng)域中，優(yōu)選地用于制備傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)，用在神經(jīng)外科手術(shù)或 眼科外科手術(shù)中的縫線材料。
令人驚訝地，證實本發(fā)明的蛋白質(zhì)和由其制備的纖維、線和另外的材 料顯示抗微生物，特別是抗細(xì)菌的性質(zhì)。由于它們的固有的可生物降解性， 它們對于在人或動物中的體內(nèi)應(yīng)用具有理想的特性。因此，通過使用本發(fā) 明的蛋白質(zhì)和由其衍生的材料，在外科手術(shù)中對身體的有害影響可以被最 小化，另外的外科手術(shù)可以避免并且可以加速在外科手術(shù)后的逐漸康復(fù) (reconvalescence) 0
此外，蛋白質(zhì)/線可以優(yōu)選地用于制備替代材料，優(yōu)選地人造軟骨或腱 材料。
另外的應(yīng)用是人造替換物，優(yōu)選地人造替換肺的穩(wěn)定。 另外，本發(fā)明的線/纖維可以用于制備醫(yī)學(xué)裝置諸如醫(yī)學(xué)粘附帶，皮膚 移植物，替代的韌帶，和外科手術(shù)網(wǎng)眼；和用于制備廣泛范圍的工業(yè)和商 業(yè)產(chǎn)品諸如衣服織物，防彈衣襯里，容器織物，包或錢包帶，纜，繩，粘 附性結(jié)合材料，非粘附性結(jié)合材料，皮帶材料，交通工具覆蓋物和零件， 建筑材料，混凝土，顏料，聚硅氧烷，耐候性材料，柔性分割材料，運動 設(shè)備；和事實上高拉伸強(qiáng)度和彈性是需要的特性的纖維或織物的任何應(yīng)用 中。本發(fā)明還意欲以其它形式存在的穩(wěn)定的纖維產(chǎn)品，諸如干的噴霧劑涂 層，珠子樣顆粒的適應(yīng)性和應(yīng)用，或在與其它的組合物的混合物中的使用。
除非另外指出，本文所用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員公知的具有相同的含義。將所有的出版物，專利申請，專 利，和其它的本文提及的參考文獻(xiàn)全部內(nèi)容并入本文作為參考。如有沖突， 本說明書，包括定義將進(jìn)行控制。此外，所述材料，方法和實施例僅是舉 例說明性的，而不傾向于限制。
現(xiàn)在，本發(fā)明還通過實施例和附圖進(jìn)行舉例說明，所述附圖顯示如下:


圖1 (SEQ NO:l)和(SEQ NO: 2)在^ /P細(xì)胞中的表達(dá)。(A) ADF-3和ADF-4在合成后的溶解度。細(xì)胞裂解物的可溶(S)和不可溶的成 分(P)通過沉降進(jìn)行分離。用抗-His6抗體通過免疫印跡法來檢測蛋白質(zhì)。(B) 在"#-4表達(dá)細(xì)胞中的絲，如用光學(xué)顯微鏡(上板)和在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)后 用熒光顯微鏡(中板)觀察到的。將另一種細(xì)胞的在免疫細(xì)胞化學(xué)后的另 外的共焦熒光圖像顯示在下板中。標(biāo)尺:10Pm。 (C)共合成的ADF-3和 ADF-4的溶解度?？扇?S)的細(xì)胞成分通過沉降從不可溶(P)的細(xì)胞成分中 分離出來。在蛋白質(zhì)印跡后，用S-蛋白質(zhì)-過氧化物酶綴合物檢測ADF-3， 并用抗-T7-標(biāo)記抗體來檢測ADF-4。 (D)用me/-/^y6-^^病毒感染在混懸 液中的S/9細(xì)胞。在指定的時間(在感染后的天數(shù))，將等價于6X10"細(xì)胞 的等分試樣取自培養(yǎng)基，將其進(jìn)行離心來去除細(xì)胞并進(jìn)行SDS-PAGE，隨 后進(jìn)行免疫印跡。(E)將用附￡/-/^6-^//-4病毒感染達(dá)3天的細(xì)胞進(jìn)行免疫 熒光。在細(xì)胞表面上的分泌小泡能夠被清楚地檢測到。標(biāo)尺10Mm。
圖2ADF-4絲和團(tuán)聚體的形態(tài)學(xué)。(A)在純化的絲上的掃描電鏡觀察。 標(biāo)尺5tai(B)在純化的絲上的透射電鏡觀察。標(biāo)尺:500nm(C)使用小鼠抗 -HiS6抗體，隨后用金-綴合的抗-小鼠抗體在純化的絲上的免疫電鏡觀察。 標(biāo)尺:500nm(D，E)原子力顯微鏡(AFM)觀察(D)高度圖像(E)偏轉(zhuǎn)圖像。 絲的高度是0.7tai。標(biāo)尺5tai。
圖3 ADF-4絲和拖絲絲線的化學(xué)穩(wěn)定性。(A)如指示對ADF-4絲進(jìn)行 變性。未溶解的絲和團(tuán)聚體沒有進(jìn)入凝膠。使用抗-HiS6抗體通過免疫印跡 法對溶解的ADF-4進(jìn)行檢測。還對用6M GdmSCN進(jìn)行處理的樣品進(jìn)行 銀染(GdmSCN/S)。 (B)用如指示的 0.1 u 1的每種溶液將在云母上的風(fēng)干 的ADF-4的絲和在聚丙烯上的拖絲的絲線進(jìn)行溫育達(dá)30秒。用水漂洗后， 通過光學(xué)顯微鏡來檢查樣品。標(biāo)尺25tai。 圖4 (A)通過光學(xué)顯微鏡來觀察在Sf9細(xì)胞中形成的沒有HiS6-標(biāo)記的
ADF-4的絲。(B)在用掃描電鏡研究a,3(SEQNO: 1)禾Q ^/^(SEQNO: 2)的雙重表達(dá)后獲得的絲的形態(tài)學(xué)。(C)用光學(xué)顯微鏡來使表達(dá) (SEQNO: l)的S/P細(xì)胞成像。(D) ADF-3的細(xì)胞定位。將被(SEQNO: l)病毒感染3天的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光分析。(E)通過掃描電鏡觀察到的體 外復(fù)性后，ADF-4團(tuán)聚體形成。(F)體外形成的ADF-4團(tuán)聚體的化學(xué)穩(wěn)定 性。如所示，在用變性劑處理后，通過免疫印跡法來檢測溶解的ADF-3。 標(biāo)尺5Pm(B,E)和10Pm(A,C，D)。
圖5:蜘蛛絲蛋白的裝配形式。(A)通過掃描電衛(wèi)SEM沐觀察的由基 于ADF-4的蛋白質(zhì)形成的球體。(B)通過原子力顯微鏡觀察的由基于 ADF-4的蛋白質(zhì)形成的納米纖維(高度信息)。(C， D)通過SEM研究由基 于ADF-3的蛋白質(zhì)形成的微纖維(C).對于切割纖維并隨后觀察截面，使用 聚焦的Ca+離子束(D)。 (E)產(chǎn)生自基于ADF-3的蛋白質(zhì)溶液的泡沫。(F)產(chǎn) 生自基于ADF-4的溶液的泡沬。(G)由ADF-4納米纖維形成的交聯(lián)的凝 膠。在圖5中描述的ADF- 3和ADF-4分別對應(yīng)于SEQ ID NO: 1禾口 2。
圖6:產(chǎn)生自本發(fā)明的蜘蛛絲蛋白的薄膜。將ADF-3衍生的蛋白質(zhì)以 20 mg/ml的濃度溶解在1，1,1，3,3,3-六氟-2-丙醇中。將200ul的溶液分散 在聚苯乙烯表面上(約20cm2)。在將溶劑蒸發(fā)后，可以得到透明的蛋白質(zhì) 薄膜。
^本文提供的改善基于這樣的觀念，即同時表達(dá)和研究十字園蛛的拖絲 的絲的兩種主要的蛋白質(zhì)成分。由于昆蟲屬于與蜘蛛相同的門，本發(fā)明人 選擇昆蟲細(xì)胞系Sf9(來自秋黏蟲Spodoptera frugiperda)，使用桿狀病毒作 為載體進(jìn)行。#-3和的表達(dá)。產(chǎn)生包含a^-3和W/一的部分cDNAs
的重組桿狀病毒""。為了監(jiān)測合成，提供具有HiS6-標(biāo)記的兩種蛋白質(zhì)。 為了排除由所述標(biāo)記所導(dǎo)致的人工序列，還使用無HiS6-標(biāo)記的形式。
將重組病毒用于感染S"細(xì)胞以在胞質(zhì)中產(chǎn)生蜘蛛絲蛋白。3天溫育 后，通過超聲波處理來將昆蟲細(xì)胞裂解并將不可溶的細(xì)胞內(nèi)容物通過沉降 從可溶的材料中分離出來。在進(jìn)行免疫印跡分析之前，將所述沉降物溶解
在硫氰酸胍(GdmSCN)中。
盡管發(fā)現(xiàn)ADF-3的大量級分是可溶的，在所用條件(圖1A)和不存在 His6-標(biāo)記(圖4A)的情況下，在感染后3天ADF-4幾乎完全不可溶。令人 驚奇的是，研究在表達(dá)a^-4(SEQNO:2)的細(xì)胞中的團(tuán)聚體揭示穿過胞質(zhì) 巻曲的絲，其中大多數(shù)細(xì)胞僅包含均一寬度的一條或極少的絲(圖1B)。 與此相反，用對照病毒感染的細(xì)胞或a^^(SEQNO: l)編碼的病毒從不產(chǎn) 生這樣的絲(圖4C， D)。使用抗His6抗體在被感染的細(xì)胞上進(jìn)行的免疫熒 光顯示所述絲的特異性染色因此證實所述絲由ADF-4組成(圖1B)。
接下來，本發(fā)明人研究ADF-3和ADF-4是否可以共裝配成絲。本發(fā) 明人使用pFastbacDUAL供體質(zhì)粒，產(chǎn)生在不同的和獨立的啟動子下，包 含"#-3(SEQNO: l)和W/-《SEQNO: 2)的重組桿狀病毒。用該病毒感染 細(xì)胞導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)的合成，并且與單獨由ADF-4的合成形成的絲相 比，蛋白質(zhì)絲的形成顯示相似的外觀(圖4B)。有趣的是，在雙重表達(dá)系統(tǒng) 中裝配的絲全部由ADF-4形成，而沒有結(jié)合或與其穩(wěn)定締合的ADF-3 (圖 1C并且數(shù)據(jù)未顯示)。
為了研究表觀自裝配是否僅基于ADF-4的性質(zhì)或是否涉及另外的因 素或變化，本發(fā)明人產(chǎn)生編碼HiS6-ADF-4的分泌形式的重組桿狀病毒。 用該病毒感染細(xì)胞導(dǎo)致ADF-4在細(xì)胞的培養(yǎng)基中的聚集(圖1D)。免疫熒 光揭示在被感染的細(xì)胞的細(xì)胞表面包含ADF-4的分泌小泡的豐度(圖1E)。 顯著地，本發(fā)明人在宿主細(xì)胞的區(qū)室和在培養(yǎng)基中都沒有觀察到ADF-4 絲的任何形成。
絲線的形成一般取決于蛋白質(zhì)的濃度以及另外的因素。有趣的是，在 絲線裝配前，Sf9細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH6.3對應(yīng)于在紡絲粘稠物中的pH(19)。 在胞質(zhì)環(huán)境中的ADF-4絲裝配所需要的另外的因素仍是難以捉摸的。體外 研究ADF-4的自裝配的性質(zhì)強(qiáng)調(diào)另外的因素的重要性。通過將絲溶解在6 M GdmSCN中來容易地獲得可溶的ADF-4。在通過透析或稀釋去除 GdmSCN后，溶解的ADF-4迅速聚集。然而，體外形成的ADF-4團(tuán)聚體 既沒有顯示纖維結(jié)構(gòu)，也沒有顯示在S/P細(xì)胞內(nèi)部形成的ADF-4絲的化學(xué) 穩(wěn)定性(見下面和圖4E， F)。上述發(fā)現(xiàn)顯示特定的胞質(zhì)環(huán)境的重要性，其 可以包括另外的，至今尚未確定的對于控制自裝配而言是重要的胞質(zhì)因
素。
接下來，發(fā)明人對ADF-4絲的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。絲的直徑范圍在
200 nm到lnm，然而對于每條單絲，發(fā)現(xiàn)直徑是不變的。此外，所述絲 顯示多到100um的長度，并且經(jīng)常終止于結(jié)、分支或形成閉合的環(huán)(圖 2A， D, E)。絲顯示平滑的表面并且經(jīng)常與納米纖維(直徑 5nm)和其它的 蛋白質(zhì)團(tuán)聚體(圖2)相關(guān)。免疫印跡法和免疫電鏡顯示絲和相關(guān)的裝配形 式由ADF-4組成(圖2C, 3A)。如通過SDS-PAGE分析隨后通過銀染觀察到 的(圖3A)，除了ADF-4之外，在絲中不能檢測到其它的豐富的蛋白質(zhì)。 每個細(xì)胞的少量的絲和幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)ADF-4聚集成團(tuán)聚體顯示 ADF-4在S/P細(xì)胞中的自裝配可能是具核的過程，這在以前也在家蠶蛾 (Bom&x woh)的紡絲過程中被建議(26i;。
在S/P細(xì)胞中形成的絲的大小似乎被產(chǎn)生它們的細(xì)胞的體積限制得過 短而不能進(jìn)行對于絲線而言是典型的機(jī)械力測量(21)。然而，發(fā)明人能夠 與十字圓蛛的天然的拖絲的絲線比較來分析濕和干的ADF-4絲的化學(xué)穩(wěn) 定性。已經(jīng)報道拖絲的線在許多變性劑中是不可溶的(22)。應(yīng)用2%的十二 烷基硫酸鈉(SDS)和8 M的尿素在30秒的暴露后，沒有對ADF-4的絲和 拖絲的線的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響(圖3并且數(shù)據(jù)未顯示)。將絲浸沒在6M 的氯化胍(GdmCl)中沒有導(dǎo)致ADF-4絲或拖絲的線的溶解，盡管其導(dǎo)致拖 絲的絲的溶脹。這種溶脹可能是由于纖維的過收縮所引起(2/)，這以前對 于將蜘蛛絲浸沒在水溶液中描述過，并且由在無定形基質(zhì)中的氫鍵的再形 成所導(dǎo)致(27)。與上面提及的變性劑相反，小滴的6MGdmSCN在數(shù)秒內(nèi) 將ADF-4絲以及拖絲的線徹底溶解(圖3)。結(jié)果，發(fā)明人得出結(jié)論，兩 種結(jié)構(gòu)具有分子相互作用，其對針對特定變性劑的化學(xué)抗性負(fù)責(zé)。
方法
質(zhì)粒構(gòu)建
將SEQ NO: 1禾卩2的cDNAs克隆入來自Invitrogen的pFastBac 供體
質(zhì)粒。將編碼肽標(biāo)記的序列于5'末端提供給基因片段。對于扭56-標(biāo)記的 蛋白質(zhì)，利用*"/屈0/將基因從宿主載體上切下來并連接以同樣消化的 pFastBacTMHTa。對于T7-標(biāo)記(23)的蛋白質(zhì)，首先利用屈o/和￡coi /將基
因克隆入pET21。隨后用Bg///和lo/切除包括T7-標(biāo)記編碼區(qū)的插入片 段并連接以用Sam/77/屈o/消化的pFastBacTMl 。為了共表達(dá)(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)，將兩種基因克隆入pFasBacTMDUAL并提供以編 碼T7-和S-標(biāo)記(24)的序列。用6g/// /lo/將(SEQ NO: 2)從 pET21-a#-4 (SEQ NO: 2)上切下來并連接以用TWze/z^w ///裂解的 pFasBacTMDUAL。將兩種合成性寡核苷酸(MWG Biotech)進(jìn)行退火以提供 S-標(biāo)記編碼序列，其得到具有雖J/5謹(jǐn)/7/相容性單鏈延伸的雙鏈DNA:GCACATGGACAGCGGTCGG-3，(SEQ ID NO: 5)GGTTTCTTTCATCCCGGG-3，(SEQ ID NO:6)用7V/2e//5am///消化pET213(SEQ NO: l)以除去T7-標(biāo)記編碼區(qū)。 隨后將載體連接以S-標(biāo)記編碼DNA。利用屈o/7Xma/將S-標(biāo)記的 3(SEQ NO: l)克隆入pFasBacTMDUAL-a#-4 (SEQ NO: 2)。在雙重構(gòu)建 體中，^//^和^/-4在獨立的？10(25)和多角體蛋白(26)啟動子的控制之 下。利用pMIB/V5-HisA載體(Invitrogen)作為模板和包含Q o/限制酶切 位點的下列引物通過PCR擴(kuò)增蜜蜂蜂毒肽的分泌信號的編碼序列用Q7o/剪切得到的PCR產(chǎn)物并連接入同樣消化的pFasBaCTMHTa-"#-4 (SEQ NO: 2)中。通過測序?qū)﹃栃钥寺z查方向和正確性。細(xì)胞培養(yǎng)在BIOINSECT-l無血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(Biological Industries)中于27 。C增殖s/P(5^^o/7tem^M^penfo; ATCC#: CRL-1711)細(xì)胞。將s/P細(xì)胞作 為單層培養(yǎng)于6孔板中的蓋玻片上或生長于80rpm振蕩的搖瓶中。包含m//-J(SEQ NO: l)和"#-4 (SEQ NO: 2)的重組桿狀病毒的生產(chǎn)根據(jù)生產(chǎn)商的方案(Invitrogen)使用包含bacmid (桿狀病毒穿梭載體質(zhì) 粒)和輔助質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌DHIOBAC細(xì)胞來產(chǎn)生重組bacmids。通
過PCR來證實基因插入bacmid 。在6孔板中用ESCORT轉(zhuǎn)染試劑 (Sigma-Aldrich)以重組bacmid DNA轉(zhuǎn)染s/P細(xì)胞。將細(xì)胞于27"溫育5h， 漂洗，并再溫育72h。收集培養(yǎng)基，離心，并通過斑測定法滴定包含病毒 的上清液。fl^/^和fl#-4的表達(dá)以0.1-10范圍的各種MOIs (感染復(fù)數(shù))用重組病毒感染細(xì)胞(3 Xl()S細(xì)胞/ml)。感染后(PI)三天，通過于500xg離心5min收集細(xì)胞。ADF-3和ADF-4的檢測和溶解性以1.2x 1()7細(xì)胞/ml將細(xì)胞重懸于100 mMNaCl, 20 mM,(2-羥基乙基) 哌嗪—iV'-(2-乙磺酸)(HEPES)， pH 7.5中并通過超聲波處理進(jìn)行裂解。通過 于125，000xg離心30min分離可溶的和不可溶的組分。為了進(jìn)一步的分析， 將沉淀物重懸于6MGdmSCN并針對8M尿素進(jìn)行透析。將源自1.5x105 細(xì)胞的上清液和沉淀物加樣在還原性條件下的10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰 胺凝膠上并點印到PVDF膜(Millipore)上。使用小鼠抗His6單克隆抗體 (Sigma-Aldrich, 1:10,000)或小鼠抗T7單克隆抗體(Novagen, 1:10，000)和 抗小鼠IgG過氧化物酶綴合物(Sigma-Aldrich, l:5,000)作為二抗來檢測蜘 蛛絲蛋白。使用S-蛋白過氧化物酶綴合物(Novagen, 1:5,000)來直接檢測S-標(biāo)記的ADF-3。免疫細(xì)胞化學(xué)用包含W/-3(SEQ NO: l)或(SEQ NO: 2)的重組病毒于MOI=10 來感染50%匯合的生長在蓋玻片上的細(xì)胞。感染后(PI)三天將細(xì)胞用甲醇 于-2(TC固定。用1: 300稀釋的小鼠抗His6單克隆抗體(Roche)溫育蓋玻片， 隨后用1: 500稀釋的得克薩斯紅綴合的抗小鼠二抗IgG來進(jìn)行溫育。用 Olympus BX51熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并用Magnafire SP相機(jī)照相或通過 共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。ADF-4-絲純化將細(xì)胞以1.2xl()7細(xì)胞/ml重懸于100 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5，并通過加入2% w/v十二垸基硫酸鈉隨后于95。C溫育5 min來進(jìn)行裂 解。將線于5，000xg進(jìn)行沉降隨后用8M尿素和Water bidest洗滌。原子力顯微鏡(AFM)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)將純化的絲重懸于Waterbidest中并在新裂解的云母(AFM)上溫育3 分鐘或加載到Thermanox⑧塑料蓋玻片(Nalgene Nunc)上(SEM)。對于AFM， 用Waterbid^漂洗樣品四次并在利用Multimode SPM (Veeco)連接模式成像 之前進(jìn)行風(fēng)干。對于SEM,在除去溶液后將樣品風(fēng)干，真空涂布以金層并 用JSM-5900LV (JEOL Ltd,)于20 kV上進(jìn)行分析。對于TEM (JEOL Ltd.) 分析，將絲吸附到透明塑膠涂布的載網(wǎng)上并以乙酸雙氧鈾進(jìn)行負(fù)染色。對 于免疫染色，將纖維與小鼠抗-His6抗體一起溫育，隨后用18mm金綴合的 山羊抗小鼠IgG進(jìn)行標(biāo)記。沒有Hi"標(biāo)記的ADF-4的線形成為了排除His6標(biāo)記對于絲形成的可能影響，在S 細(xì)胞中合成T7-標(biāo) 記的ADF-4。T7-標(biāo)記的ADF-4的絲形成顯然與His6標(biāo)記的ADF-4的絲形 成沒有區(qū)別(圖4A)。在flrf/-J(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)共表達(dá)細(xì)胞中的線形成在共表達(dá)和的Sf9細(xì)胞中，與在只產(chǎn)生ADF-4的細(xì)胞中 形成的絲相比，可以檢測出顯示明顯無區(qū)別形態(tài)的絲(圖4B)。在Sf9細(xì)胞中W/-3(SEQ NO: l)的表達(dá)盡管免疫細(xì)胞化學(xué)揭示了在表達(dá)a^^(SEQ NO: l)的細(xì)胞中的熒光聚 焦，但并不能觀察到絲樣的結(jié)構(gòu)(圖4C，D)。重要的是，在Sf9細(xì)胞中合成 的ADF-3是非常易溶的。所以聚焦形成代表了亞細(xì)胞積聚而不是蛋白質(zhì)聚集。ADF-4的體外裝配
ADF-4在通過透析除去變性劑或在稀釋入水性緩沖液之后聚集。得到的團(tuán)聚體并不顯示任何纖維狀的形態(tài)(圖4E)。測試化學(xué)穩(wěn)定性顯示與在細(xì) 胞質(zhì)中形成的ADF-4絲相反，體外形成的團(tuán)聚體可溶于2%SDS或8 M 尿素(圖4F)。蜘蛛絲來源的蛋白質(zhì)的裝配進(jìn)行下列實驗以證明來自蜘蛛絲序列ADF-3 (SEQ ID NO:l)或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的蛋白質(zhì)能夠裝配成形態(tài)不同的形式。如在B/oc&m&o; 2004 Vol.43 pp.13604-11362 (27)中所述來在水溶液中構(gòu)建、產(chǎn)生和制備基 于ADF-3和ADF-4的蛋白質(zhì)。如果沒有另外提及，蛋白質(zhì)溶液包含10mM 的Tris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)pHS.O。1. 球體通過將0.8 M的硫酸銨加入0.2% (w/v)的基于ADF-4的蛋白質(zhì)溶液來 產(chǎn)生顯示直徑范圍在0.5到2tai之間(圖5a)的蛋白質(zhì)球體。2. 納米纖維通過將1% (w/v)基于ADF-4的蛋白質(zhì)溶液在室溫溫育2周來形成顯 示直徑在0.7和4nm之間(圖5b)的納米纖維。3. 微纖維為了形成微纖維，將5-10W的25% (w/v)的基于ADF-3的蛋白質(zhì)溶液 緩慢注射到0.5M的磷酸鉀pH8.0中，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)溶液液滴。在溫 育1分鐘后，使用鑷子將蛋白質(zhì)液滴從溶液中去除。在空氣中再溫育1分 鐘后，使用第二組鑷子可以將蛋白質(zhì)纖維從蛋白質(zhì)液滴中以約2cm/s的速 率從蛋白質(zhì)液滴中抽提。所述纖維顯示具有4tai的直徑的圓形截面(圖 5c,d)。4 .泡沫將蛋白質(zhì)泡沬(圖5e， f)產(chǎn)生自包含2.5 mM的過二硫酸銨(APS)， IOOWV[的tris(2，2'-二吡啶基)二氯釕(n) (Rubpy)和10% (w/v)的基于ADF-3 的蛋白質(zhì)或2%0/力的基于ADF-4的蛋白質(zhì)的溶液。所述蛋白質(zhì)溶液用空 氣發(fā)泡。為了穩(wěn)定得到的泡沫結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)通過暴露于來自鎢燈的可見 光達(dá)1分鐘來進(jìn)行交聯(lián)(28)。隨后在95"C對泡沫進(jìn)行干燥。5. 凝膠在1。/。(w/v沐度的基于ADF-4的納米纖維(見節(jié)2)顯示凝膠樣的外觀， 其可容易地通過攪拌或剪切而被破壞。為了改善凝膠的機(jī)械性質(zhì)，容許 APS和Rubpy通過擴(kuò)散進(jìn)入凝膠來產(chǎn)生10mMAPS禾B 100WVI Rubpy的終 濃度。在光誘導(dǎo)交聯(lián)后(見，節(jié)4)，可以獲得在尺寸上穩(wěn)定的凝膠(圖5g)。6. 薄膜將ADF-3衍生的蛋白質(zhì)以20 mg/ml的濃度溶解在1,1,1,3，3,3-六氟-2-丙醇中。將200iil的溶液分散在聚苯乙烯表面上(約20cm2)。在將溶劑蒸 發(fā)后，可以得到透明的蛋白質(zhì)薄膜(見，圖6)。
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權(quán)利要求
1一種蜘蛛拖絲蛋白，其包含由SEQ ID NO1或2的核酸序列，或那些核酸序列的變體編碼的氨基酸，所述變體每個被限定為與SEQ ID NO1或2的序列比較，具有一個或多個取代，插入和/或缺失，在所述變體在適度嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO1或2的序列的核酸雜交的條件下，或在所述變體包含由于遺傳密碼子的簡并性所造成的核酸變化的條件下，其編碼與SEQ ID NO1或2的核酸序列相同或功能上等價的氨基酸。
2. —種蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)或線，其包含權(quán)利要求l的蜘蛛拖絲蛋白。
3. 權(quán)利要求1或2的蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)/線，其僅包含野生型ADF-4或由SEQ ID NO:2的核酸編碼的氨基酸;或作為拖絲蛋白的SEQ ID NO: 4的氨基酸。
4. 權(quán)利要求1或2的蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)/線，其僅包含野生型ADF-3或由SEQ ID NO:l的核酸編碼的氨基酸;或作為拖絲蛋白的SEQ ID NO: 3的氨基酸。
5. —種凝膠或泡沫，其包含權(quán)利要求1-4中一項或多項的蛋白質(zhì)或由其組 成。
6. 用于植入物和斯滕特固定模的涂層，其包含權(quán)利要求1-4中一項或多項 的蛋白質(zhì)或由其組成。
7. —種線或纖維，其包含權(quán)利要求1-4中一項或多項的蛋白質(zhì)/線和另外 的纖維，所述纖維不是蜘蛛來源的，并且優(yōu)選地是植物來源的纖維或合成 纖維。
8. —種薄膜，其包含權(quán)利要求l-4中一項或多項的蛋白質(zhì)或由其組成。
9. 傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)，縫線材料，替換材料，優(yōu)選地人造軟骨或腱材料， 其可使用權(quán)利要求1-4的一項或多項的線/蛋白質(zhì)獲得。
10. —種載體，其包含編碼作為唯一的拖絲蛋白的野生型ADF-3禾口/或 ADF-4的核酸或包含SEQ ID NO: 1禾口/或SEQ ID NO: 2的核酸。
11. 一種桿狀病毒載體，其包含編碼一種或多種拖絲蛋白的核酸，優(yōu)選地拖 絲蛋白ADF-3, ADF-4 (野生型)，ADF-3 (SEQ ID NO:l)和/或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的核酸。
12. 權(quán)利要求1-4的一項或多項的蛋白質(zhì)/線在技術(shù)、生物技術(shù)和/或藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。
13. 權(quán)利要求1-4中一項或多項的蛋白質(zhì)/線用于制備傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)， 優(yōu)選地用于制備縫線材料的應(yīng)用，所述縫線材料更優(yōu)選地傾向于用在神經(jīng) 外科手術(shù)或眼外科手術(shù)中。
14. 權(quán)利要求l-4中一項或多項的蛋白質(zhì)/線用于制備替換材料，優(yōu)選地人 造軟骨或腱材料的應(yīng)用。
15. 權(quán)利要求l-4中一項或多項的蛋白質(zhì)/線用于穩(wěn)定人造替換物，優(yōu)選地人造替換肺的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然來源的蛋白質(zhì)和由其制備的材料，特別是由其衍生的線、纖維、泡沫和凝膠。本發(fā)明還提供將這些蛋白質(zhì)/線和材料用在技術(shù)、生物技術(shù)和/或藥物領(lǐng)域中，特別是用在制備傷口閉合系統(tǒng)或覆蓋系統(tǒng)，縫線材料中和在制備替換材料，優(yōu)選地人造軟骨或腱材料以及其它的商業(yè)應(yīng)用中的應(yīng)用。
文檔編號D01F4/02GK101133080SQ200580024375
公開日2008年2月27日 申請日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者D·許梅里希, T·沙伊貝爾 申請人:慕尼黑技術(shù)大學(xué)