專利名稱：一種殼聚糖基納米纖維的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖基納米纖維 的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
天然高分子殼聚糖具有低毒性、良好的生物相容性和生物可降解 性，在生物醫(yī)用領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 一方面，殼聚糖的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)
(ECMs)中的糖胺聚糖有相似之處，能制備成具有不同微觀形貌的 宏觀形狀，并且具有一定力學(xué)強(qiáng)度適應(yīng)不同部位的組織缺損修復(fù)要求 的三維多孔支架，可作為細(xì)胞的三維載體，用于組織工程領(lǐng)域，修復(fù) 或重建病損組織；另一方面，可負(fù)載藥物及生物活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)其緩 慢釋放或控制釋放，用于藥物/生物活性物質(zhì)的緩控釋放體系。而特 別是在組織工程、創(chuàng)傷修復(fù)及藥物/生物活性物質(zhì)釋放等領(lǐng)域，納米 制備技術(shù)的應(yīng)用可以進(jìn)一步改進(jìn)殼聚糖的生物醫(yī)用性能[M. N. V. Ravi Kumar, R. A. A. Muzzarelli, C. Muzzarelli， H. Sashiwa， A. J. Domb， Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives, Chem. Rev. 104， 6017 6084 (2004).]。
殼聚糖納米粒子的制備可以采用共價(jià)交聯(lián)法、去溶劑法和離子交 聯(lián)法等。其中離子交聯(lián)技術(shù)是利用多價(jià)陰離子，如三聚磷酸鈉、海藻
酸鈉、聚丙烯酸等，與殼聚糖陽離子之間的靜電作用而產(chǎn)生交聯(lián)，從 而實(shí)現(xiàn)納米化。由于離子交聯(lián)法具有制備條件溫和，工藝簡單，不涉 及化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑的使用，而且可以調(diào)節(jié)尺寸和表面特性，可以 較好地負(fù)載多肽、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，并保持其生物活性等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此離子交聯(lián)技術(shù)已被成功應(yīng)用于殼聚糖納米粒子的制備， 以實(shí)現(xiàn)藥物及其他生物活性物質(zhì)，如多肽、蛋白質(zhì)和基因等的緩控制
釋放[K. A. Janes， P. Calvo， M.J. Alonso， Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for macromolecules， Adv. Drag Deliv. Rev. 47， 83 97 (2001).]。
細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生存的微環(huán)境(細(xì)胞外基質(zhì))大多是由直徑為 50 150nm的蛋白多糖和膠原纖維構(gòu)成的三維納米支架，因此具有與 天然細(xì)胞外基質(zhì)相似的組成及結(jié)構(gòu)的殼聚糖納米纖維是構(gòu)造組織工 程支架的優(yōu)良材料。高分子納米纖維的制備方法主要有靜電紡絲、 自組裝和相分離等，目前使用較多的是采用靜電紡絲技術(shù)來制備殼聚 糖納米纖維及殼聚糖納米復(fù)合纖維[l. K. Ohkawa， D. Cha， H. Kim， et al. Electrospinning of Chitosan. Macromol. Rapid Commun. 25， 1600 1605 (2004). 2. Bhattaai N， Edmondson D， Veiseh O， et al Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility, Biomaterials， 26， 6176 6184 (2005).]。但通常，靜電紡絲技術(shù)需要專門設(shè)備且工 藝較復(fù)雜，而且制備得到的納米纖維直徑約為數(shù)百納米，與天然細(xì)胞 外基質(zhì)的納米纖維相比偏大。
如果能改進(jìn)離子交聯(lián)技術(shù)制備出仿生模擬的具有良好生物相容 性的殼聚糖基納米纖維，并負(fù)載上藥物或生長因子等生物活性物質(zhì)， 實(shí)現(xiàn)緩釋和控制釋放，則能極大地開闊殼聚糖基納米纖維在組織工 程、臨床創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用離子交聯(lián) 技術(shù)制備負(fù)載藥物或生物活性物質(zhì)的生物可降解的殼聚糖基納米纖 維的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述制備方法的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種殼聚糖基納米纖維的制備方法，包括如下步驟
(1) 將生物活性物質(zhì)溶解或分散在殼聚糖的稀酸溶液中，再加入
明膠或膠原溶解；
(2) 將生物降解性聚陰離子完全溶解于去離子水中；
(3) 將步驟(1)所得溶液緩慢加入步驟(2)所得溶液中，室溫 攪拌均勻；
(4) 將步驟(3)所得溶液經(jīng)離心、洗滌、冷凍干燥，即得負(fù)載 生物活性物質(zhì)的殼聚糖基納米纖維產(chǎn)物。
上述步驟(1)中，生物活性物質(zhì)為藥物、生長因子等，如消炎 藥物、激素、骨形成發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-p)、成纖 維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF)、表皮生長因子(EGF) 等，生物活性物質(zhì)與殼聚糖的質(zhì)量比為0 k4。
上述步驟(1)中，殼聚糖優(yōu)選脫乙酰度為70 100%、分子量 為2000 150萬的殼聚糖；殼聚糖在稀酸溶液中的濃度為0.01 3% Cg/mU c
上述步驟(l)中，稀酸為己二酸，稀酸濃度為0.5 5% (g/mL)。 上述步驟(l)中，膠原或明膠含量控制在殼聚糖質(zhì)量的0% 20% 以內(nèi)。
上述步驟(2)中，生物降解性聚陰離子是三聚磷酸鹽、海藻酸 鹽、透明質(zhì)酸鹽、及酸性殼聚糖衍生物等，如羧甲基殼聚糖、丁二酸 化殼聚糖、殼聚糖硫酸酯、殼聚糖磷酸酯，生物降解性聚陰離子在去 離子水中的濃度與殼聚糖在己二酸溶液中的濃度相同。上述步驟(3)中，步驟(1)所得溶液與步驟(2)所得溶液的 體積比為1:1 4:1;步驟(1)所得溶液加入步驟(2)所得溶液中時(shí)， 加入速度為0.1 lmL/min;將兩份溶液攪拌均勻后混合液體系的pH 值為3 6。
上述步驟(4)中，離心處理速度盡量高，可為10000 50000rpm， 優(yōu)選離心速度為20000rpm;離心時(shí)間為10 30min;洗滌采用0.01 lmol/L的NaOH溶液及去離子水，優(yōu)選0.05 0.1mol/L的NaOH溶
液及去離子水；冷凍干燥的預(yù)冷凍溫度盡量低，可為-2(TC -20(TC， 優(yōu)選-8(TC;冷凍千燥時(shí)間為8h 48h。
本發(fā)明制備的殼聚糖基納米纖維可應(yīng)用于組織工程、創(chuàng)傷修復(fù)、 藥物及生物活性物質(zhì)釋放等領(lǐng)域。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的制備方 法中，膠原或明膠的加入可改善納米纖維的細(xì)胞相容性及調(diào)控生物活 性物質(zhì)的釋放速度；2.本發(fā)明通過改進(jìn)離子交聯(lián)技術(shù)制備負(fù)載藥物或 生物活性物質(zhì)的生物可降解的殼聚糖基納米纖維，制備得到的殼聚糖 基納米纖維不僅能夠在形態(tài)上實(shí)現(xiàn)對(duì)天然細(xì)胞外基質(zhì)的仿生模擬，表 現(xiàn)出良好的細(xì)胞和組織相容性，而且可以保持所負(fù)載藥物或生長因子 等生物活性物質(zhì)的生物活性，實(shí)現(xiàn)其緩釋和控制釋放；3.本發(fā)明的制 備方法工藝簡單，制備得到的殼聚糖基納米纖維在組織工程、臨床創(chuàng) 傷修復(fù)等領(lǐng)域中的應(yīng)用前景廣闊。


圖1為殼聚^/三聚磷酸鈉納米纖維的透射電鏡照片； 圖2為殼聚糖/海藻酸鈉納米纖維的透射電鏡照片； 圖3為膠原/殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的透射電鏡照片； 圖4為明膠/殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的透射電鏡照片；圖5為負(fù)載地塞米松的殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的藥物體外 釋放曲線圖6為負(fù)載牛血清白蛋白(BSA)的殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維 的體外釋放曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的制備
殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的制備方法，包括如下步驟
(1) 稱取0.003克殼聚糖(脫乙酰度85 % )溶于30毫升2 % ( g/mL ) 的己二酸溶液中，配制濃度為0.01% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液；
(2) 稱取0.001克三聚磷酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成濃 度為0.01% (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將0.01% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液 以lmL/min的速度加入至0.01 % (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液中，保 持并控制混合液總體系pH為3 6之間直至滴加結(jié)束，再攪拌1小 時(shí)；
(4) 將上述步驟(3)所得溶液經(jīng)20000rpm離心30min，去上清 收集沉淀，將沉淀先后用0.1mol/L的NaOH溶液及去離子水清洗， 再于-8(TC下預(yù)冷凍，冷凍干燥24h后即得殼聚糖/三聚磷酸鈉的納米 纖維，其直徑約為50nm，如圖1所示。
實(shí)施例2殼聚糖/海藻酸鈉納米纖維的制備 殼聚糖/海藻酸鈉納米纖維的制備方法，其步驟如下
(1)稱取0.03克殼聚糖(脫乙酰度91 % )溶于30毫升2% (g/mL)的己二酸溶液中，配制濃度為0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液；
(2) 稱取O.Ol克海藻酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成濃度 為0.1% (g/mL)的海藻酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液 以lmL/min的速度加入至0.1X (g/mL)的海藻酸鈉溶液中，保持并 控制混合液總體系的pH為3 5之間直至滴加結(jié)束，再攪拌1小時(shí)；
(4) 將上述步驟(3)所得溶液經(jīng)20000rpm離心30min，沉淀先 后用0.05mol/L的NaOH溶液及去離子水清洗，再于-8(TC下預(yù)冷凍， 冷凍干燥24h后即得殼聚糖/海藻酸鈉的納米纖維，其直徑約為 350nm，如圖2所示。
實(shí)施例3膠原/殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的制備 (1 )稱取0.03克殼聚糖(脫乙酰度100% )溶于30毫升2% (g/mL) 的己二酸溶液中，配制濃度為0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液；
(2) 稱取0.003克膠原溶解于殼聚糖溶液中，得到殼聚糖/膠原的 復(fù)合溶液；稱取0.01克三聚磷酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成 濃度為0.1% (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液 以lmL/min的速度加入至0.1X (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液中，保持 并控制混合液總體系pH為3 5之間直至滴加結(jié)束，再攪拌1小時(shí)；
(4) 將上述步驟(3)所得的溶液經(jīng)20000rpm離心30min，沉淀 先后用O.lmol/L的NaOH溶液及去離子水清洗，再于-8(TC下預(yù)冷凍，冷凍干燥24h后得到膠原/殼聚糖/三聚磷酸鈉的納米纖維，其直徑約 為300nm，如圖3所示。
實(shí)施例4明膠/殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的制備
(1) 稱取O.(B克殼聚糖(脫乙酰度100% )溶于30毫升2X(g/mL) 的己二酸溶液中，配制濃度為0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液；
(2) 稱取0.005克明膠溶解于殼聚糖溶液中，得到殼聚糖/明膠的 復(fù)合溶液；稱取0.01克三聚磷酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成 濃度為0.1% (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將0.1% (g/mL)的殼聚糖/明膠的己二 酸溶液以lmL/min的速度加入至0.1 % (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液中， 保持并控制混合液總體系pH為3 5之間直至滴加結(jié)束，再攪拌1 小時(shí)；
(4) 將上述步驟(3)所得的溶液經(jīng)20000rpm離心30min，沉淀 先后用O.lmol/L的NaOH溶液及去離子水清洗，再于-8(TC下預(yù)冷凍， 冷凍干燥24h后得到明膠/殼聚糖/三聚磷酸鈉的納米纖維，其直徑約 為200nm，如圖4所示。
實(shí)施例5負(fù)載地塞米松的殼聚糖/三聚磷酸鈉納米纖維的制備及 其藥物體外釋放
(1)稱取0.03克殼聚糖(脫乙酰度85% )溶于30毫升2% (g/mL) 的己二酸溶液中，配制濃度為0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液； 稱取0.004克地塞米松磷酸鹽溶解至上述溶解有0.1% (g/mL)的殼聚糖的己二酸溶液中，得到殼聚糖和地塞米松磷酸鹽的復(fù)合溶液；
(2) 稱取0.01克三聚磷酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成濃 度為0.1% (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將步驟(1)得到的殼聚糖地塞米松磷酸 鹽復(fù)合溶液以lmL/min的速度加入0.1X (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液 中，保持并控制pH為3 5之間直至反應(yīng)結(jié)束；
(4) 經(jīng)20000rpm離心30min，沉淀先后用0.05mol/L的NaOH溶 液及去離子水清洗，于-80。C下預(yù)冷凍，冷凍干燥24h后得到負(fù)載地 塞米松磷酸鹽的殼聚糖/三聚磷酸鈉的納米纖維(包封率為89%)， 其直徑約為200nm。
(5) 采用紫外分光光度儀在278nm波長下測量37"C下納米纖維在 PBS緩沖溶液中地塞米松的釋放行為，如圖5所示，藥物釋放的時(shí)間 較長，藥物的累積釋放百分?jǐn)?shù)也隨時(shí)間延長而增大，具有緩慢釋放的 特征。
實(shí)施例6負(fù)載牛血清白蛋白(BSA)的殼聚糖/三聚磷酸鈉納米 纖維的制備及其體外釋放
(1) 稱取0.03克殼聚糖(脫乙酰度85% )溶于30毫升2% (g/mL) 的己二酸溶液中，配制濃度為0.1% (g/mL)的殼聚糖己二酸溶液； 稱取0.003克BSA溶解至上述溶解有0.1% (g/mL)的殼聚糖的己二 酸溶液中，得到殼聚糖和BSA的復(fù)合溶液；
(2) 稱取0.01克三聚磷酸鈉溶解于10毫升去離子水中，配成濃度為0.1% (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液；
(3) 常溫下磁力攪拌下，將步驟(1)得到的殼聚糖/BSA復(fù)合溶 液以lmL/min的速度加入0.1X (g/mL)的三聚磷酸鈉溶液中，保持 并控制pH為3 5之間直至反應(yīng)結(jié)束；
(4) 經(jīng)20000rpm離心30min，沉淀先后用0.05moi;L的NaOH溶 液及去離子水清洗，于-8(TC下預(yù)冷凍，冷凍干燥24h后得到負(fù)載BS A的殼聚糖/三聚磷酸鈉的納米纖維(包封率為56%)，其直徑約為 300腿。
(5) 采用紫外分光光度儀在280nm波長下測量37。C下納米纖維在 PBS緩沖溶液中BSA的釋放行為，如圖6所示，表現(xiàn)出緩慢釋放的 特征。
權(quán)利要求
1. 一種殼聚糖基納米纖維的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)將生物活性物質(zhì)溶解或分散在殼聚糖的稀酸溶液中，再加入明膠或膠原溶解；(2)將生物降解性聚陰離子溶解于去離子水中；(3)將步驟(1)所得溶液緩慢加入步驟(2)所得溶液中，室溫?cái)嚢杈鶆颍?4)將步驟(3)所得溶液經(jīng)離心、洗滌、冷凍干燥，即得殼聚糖基納米纖維。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中， 所述生物活性物質(zhì)為消炎藥物、激素、骨形成發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因 子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、 神經(jīng)膠質(zhì)生長因子、表皮生長因子；生物活性物質(zhì)與殼聚糖的質(zhì)量比 為0 1:4。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中， 所述殼聚糖為脫乙酰度為70 100%、分子量為2000 150萬的殼聚 糖；殼聚糖在稀酸溶液中的濃度為0.01 3^g/mL。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中， 所述稀酸為己二酸；稀酸濃度為0.5 5%8/111￡。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中， 所述膠原或明膠含量控制在殼聚糖質(zhì)量的0 20%以內(nèi)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中， 所述生物降解性聚陰離子是三聚磷酸鹽、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽、酸 性殼聚糖衍生物；生物降解性聚陰離子在去離子水中的濃度與殼聚糖在己二酸溶液中的濃度相同。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述酸性殼聚 糖衍生物為羧甲基殼聚糖、丁二酸化殼聚糖、殼聚糖硫酸酯、殼聚糖 磷酸酯。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中， 步驟(1)所得溶液與步驟(2)所得溶液的體積比為1:1 4:1;步驟(1)所得溶液加入步驟(2)所得溶液中時(shí)，加入速度為0.1 lmL/min; 室溫?cái)嚢杈鶆蚝蠡旌弦后w系的pH值為3 6。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中， 所述離心速度為10000 50000rpm;所述洗滌采用0.01 lmol/L的 NaOH溶液及去離子水；所述冷凍干燥的預(yù)冷凍溫度為-2(TC -200 °C，冷凍干燥時(shí)間為8h 48h。
10、 權(quán)利要求1 9所述任一項(xiàng)方法制備的殼聚糖基納米纖維在 可組織工程、創(chuàng)傷修復(fù)、藥物及生物活性物質(zhì)釋放中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖基納米纖維的制備方法與應(yīng)用，該制備方法包括如下步驟將藥物或生長因子等生物活性物質(zhì)溶解或分散于濃度為0.01％～3％(g/ml)的殼聚糖己二酸溶液中，然后加入膠原或明膠溶解；將生物降解性的聚陰離子溶于去離子水中，配成與殼聚糖具有相同濃度的溶液；將殼聚糖混合溶液緩慢加入聚陰離子溶液中，室溫?cái)嚢杈鶆蚝?，?jīng)離心、洗滌、冷凍干燥即得負(fù)載生物活性物質(zhì)的納米纖維。本發(fā)明制備的殼聚糖基納米纖維可生物降解，具有仿細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并可實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的控制釋放，膠原或明膠的加入可改善納米纖維的細(xì)胞相容性及調(diào)控生物活性物質(zhì)的釋放速度，在組織工程、臨床創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)D01F8/00GK101280467SQ200810028159
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者劉宏偉, 美 屠, 戎 曾, 查振剛 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)