專利名稱：從表達(dá)外來(lái)基因的蠶的繭制絲的方法及使用該方法生成的產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從表達(dá)外來(lái)基因的蠶的繭制絲的方法及可以通過(guò)該方法獲得的產(chǎn)品。更具體而言，本發(fā)明涉及在從表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭抽出蠶絲的步驟中在不導(dǎo)致表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭特性喪失的同時(shí)進(jìn)行繭干燥、煮繭和繅絲的技術(shù)。
背景技術(shù)：
活繭中的蠶蛹若任其自由則會(huì)變態(tài)成蠶蛾，擠穿由繭絲構(gòu)成的繭殼的繭絲，并作為蠶蛾從繭殼脫出。由于這樣會(huì)使繭無(wú)法繅絲，所以必須在蛾離開(kāi)繭殼前將蛹?xì)⑺啦⒏稍镄Q繭。通常，通過(guò)設(shè)置初始溫度至115°C或更高(在某些情況下至130°C或更高)，然后在5 至6小時(shí)內(nèi)逐漸向下降低溫度至60°C來(lái)干燥蠶繭。煮苗通常使用進(jìn)行式煮苗機(jī)(progressive-type cocoon cooking machine)來(lái)進(jìn)行。如下實(shí)施煮繭首先于約40°C的溫度浸泡繭絲；然后實(shí)施高溫滲透處理，包括高于 100°C的溫度的蒸汽處理；接著進(jìn)行低溫滲透處理，包括將繭絲放置于約75°C的低溫部中； 然后實(shí)施蒸汽接觸處理，包括另一次蒸汽處理；此后進(jìn)行調(diào)節(jié)處理，包括將溫度從沸騰溫度逐漸降低至約60°C等。如此，在煮繭中，通過(guò)用蒸汽、近沸騰熱水、和低溫水組合處理來(lái)實(shí)施蒸汽和熱水進(jìn)出繭腔(cocoon cavity)的轉(zhuǎn)移。這導(dǎo)致繭層絲膠蛋白(一種包被繭絲的水溶性蛋白質(zhì))的膨脹和軟化，而且改善繭絲自繭的分離。在繅絲(reeling)中，通過(guò)索緒(brushing)抽出細(xì)絲末端，索緒即使用稻穗尖端從大約90°C溫度的熱水中放置的繭抽出細(xì)絲末端。此類常規(guī)制絲方法中，蠶絲蛋白質(zhì)遭受高溫所致的熱變性。結(jié)果導(dǎo)致蠶絲的染料親和力和織物質(zhì)地受到損害。近幾年來(lái)在進(jìn)行含有外來(lái)蛋白質(zhì)的蠶繭的生產(chǎn)，對(duì)在不損害外來(lái)蛋白質(zhì)特性的同時(shí)從繭產(chǎn)生生絲的技術(shù)存在需求。下文列示本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)文件。[現(xiàn)有技術(shù)文件][專利文件][專利 文件 1]Low-Temperature Chemical Cocoon Boiling Apparatus Matsumoto, Τ.，Masago, Y.，Katsuno Μ.日本實(shí)用新型申請(qǐng)公布號(hào) S55-11197[專利文件 2]Vacuum Cocoon Boiler :Nishio，Μ·(授權(quán) / 登記)日本專利號(hào) S49-13926發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明是鑒于上述情況完成的。本發(fā)明的目的是提供一種用于在不損害外來(lái)蛋白質(zhì)特性、且不使絲心蛋白蛋白質(zhì)和絲膠蛋白蛋白質(zhì)遭受熱變性的同時(shí)，從表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭產(chǎn)生生絲的方法。用于解決問(wèn)題的手段為了解決上文所提及的問(wèn)題，本發(fā)明人嘗試了在比那些常規(guī)使用的溫度條件低的溫度條件(大約80°C或更低)下，而不是迄今為止在從繭生成生絲時(shí)使用的高于100°C的條件下進(jìn)行繭的干燥。此外，在煮繭中，嘗試了在低于常規(guī)溫度的溫度且在真空條件(減壓處理)下的滲透處理，而不是常規(guī)采用的于100°c或更高的高溫蒸汽處理或用近沸點(diǎn)熱水的處理。作為一種備選的繭煮沸方法，嘗試了進(jìn)行組合處理，包括利用堿使絲膠蛋白膨脹， 并借助表面活性劑、酶等使熱水滲透入繭層中。此外，本發(fā)明人嘗試了在比常規(guī)溫度低的溫度進(jìn)行繅絲。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以在不損害表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭中所含的外來(lái)蛋白質(zhì)的特性且不使絲心蛋白蛋白質(zhì)和絲膠蛋白蛋白質(zhì)遭受熱變性的同時(shí)，從絲腺中表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭生成生絲。本發(fā)明基于該發(fā)現(xiàn)，提供了下文所描述的[1]至[18][1], 一種從由轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其中該方法包括使用包含堿劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液來(lái)進(jìn)行真空滲透。[2], [1]的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；以及(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[3], [2]的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下干燥所述繭。[4], [2]的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下干燥所述繭。[5], [1]至W]中任一項(xiàng)的方法，其中所述堿劑選自下組碳酸鈉和碳酸氫鈉；所述表面活性劑選自下組非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、和兩性表面活性劑；而所述酶是蛋白酶。[6], 一種從由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[7], [6]的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下干燥所述繭。[8], [6]的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下干燥所述繭。[9], [1]至[8]中任一項(xiàng)的方法，其中所述外來(lái)蛋白質(zhì)選自下組熒光蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞附著活性的蛋白質(zhì)、主要包含酸性和堿性氨基酸的肽、和源自非蠶生物的絲心蛋白蛋白質(zhì)和絲膠蛋白蛋白質(zhì)。[10].可以通過(guò)[1]至[9]中任一項(xiàng)的方法獲得的生絲。[11].可以自[10]的生絲獲得的針織或梭織織物。[12].可以自[10]的生絲獲得的三維結(jié)構(gòu)。[13].自[10]的生絲制成的醫(yī)學(xué)材料。[14]. [13]的醫(yī)學(xué)材料，其選自下組手術(shù)縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、 人工骨、和角膜培養(yǎng)的薄膜。[15]. —種產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[16]. —種產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[17]. [15]或[16]的方法，其中在步驟(a)中在大約80°C或更低的條件下干燥所述苗。[18]. [15]或[16]的方法，其中在步驟(a)中在真空條件下干燥所述繭。附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了顯示繭的干燥百分比的時(shí)間過(guò)程變化的圖。圖2描繪了絲腺中表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭的煮繭的實(shí)例。圖3顯示了標(biāo)示使用熒光轉(zhuǎn)基因繭絲作為內(nèi)部輔助材料的照片。圖4顯示了自具有細(xì)胞附著特性的轉(zhuǎn)基因繭絲制成的人工血管的照片。圖5顯示了顯示將自轉(zhuǎn)基因繭絲制成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型樹(shù)脂)制成的人工血管材料移植入大鼠后的狀態(tài)的照片。圖6顯示了顯示將自轉(zhuǎn)基因繭絲制成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型樹(shù)脂)生成的人工血管材料移植入大鼠后3個(gè)月的狀況的照片。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于自由絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其包括使用包含堿劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液進(jìn)行真空滲透。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于自由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其包括下列步驟。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法， 其包括下列步驟(a)在大約80°C或更低的條件下、在真空條件下、或在常溫且在真空條件下干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。(1)由轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭在本發(fā)明中，獲得絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶。絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶可以例如通過(guò)將編碼外來(lái)蛋白質(zhì)的DNA與編碼后絲腺中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)的 DNA(例如編碼絲心蛋白H鏈或L鏈蛋白的基因)連接，然后生成攜帶此融合基因的轉(zhuǎn)基因蠶來(lái)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依照下列文件中所描述的已知方法，例如遵循下列文件中所披露的內(nèi)容來(lái)生成并獲得絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶。然而，方法不限于此?！と毡緦＠暾?qǐng)?zhí)亻_(kāi)2006-137739(未審查、公布的日本專利申請(qǐng))· WO 2008/081922· Tamura, T. , Thibert, C. , Royer, C. , Kanda, Τ. , Abraham, Ε. , Kamba, Μ. , Komoto, N. , Thomas, J. L. , Mauchamp, B. , Chavancy, G. , Shirk, P. , Fraser, Μ. , Prudhomme, J. C., Couble, P. , Toshiki, Τ. , Chantal, Τ. , Corinne, R. , Toshio, K. , Eappen, Α. , Mari, K., Natuo, K. , Jean—Luc, Τ. , Bernard, Μ. , Gerard, C. , Paul, S. , Malcolm, F. , Jean-Claude, P.禾口Pierre,C. (2000)Germline transfirmation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol,18,81-84*Tomita,M. ,Munetsuna, H. , Sato, Τ. , Adachi, Τ. , Hino, R. , Hayashi,M. , Shimizu, K. , Nakamura, N. , Tamura, T.禾口 Yoshizato, K. (2003)Transgenicsilkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. NatBiotechnol, 21,52-56· Yamao, Μ. , Katayama, N. , Nakazawa, H. , Yamakawa, Μ. , Hayashi, Y. , Hara, S., Kamei,K.禾口Mori,H. (1999)Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13,511-516· Kojima K. , Kuwana Y. , Sezutsu H. , Kobayashi I. , Uchino K. , Tamura Τ.,Tamada Y. (2007)New Method for Modification of Fibroin Heavy Chain Protein in Transgenic Silkworm. Biosci Biotechnol Biochem· 71，2943—2951· Kurihara H.，Sezutsu H.，Tamura Τ.，Yamada K. (2007) Production of an active feline interferon in the cocoon of transgenic silkworms using the fibroin H—chain expression system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 355,976-980· Tamura, T.，Kuwabara, K.，Uchino，K.，Kobayashi，I.禾口 Kanda，Τ. (2007) An Improved DNA Injection Method for Silkworm Eggs Drastically Increases the Efficiency of Producing Transgenic Silkworms. J. Insect Biotechnol. Sericol. 76， 155-159· Yanagisawa S.，Zhu Ζ.，Kobayashi I.，Uchino K.，Tamada Y.，Tamura Τ.， Asakura Τ. (2007)Improving Cell-Adhesive Properties of Recombinant Bombyx mori Silk by Incorporation of Collagen or Fibronectin Derived Peptides Produced by Transgenic Silkworms. Biomacromolecules 8 (11)，3487-3492 等。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蠶在絲腺中具有外來(lái)蛋白質(zhì)。絲腺中含有的外來(lái)蛋白質(zhì)的例子包括熒光蛋白質(zhì)/色蛋白諸如CFP、GFP、YFP、DsRed, K0、KikGr, KaedeJP Dronpa ；具有細(xì)胞附著活性的蛋白質(zhì)諸如膠原和纖連蛋白、和細(xì)胞生長(zhǎng)因子；主要含有酸性和堿性氨基酸諸如天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、和組氨酸的肽；和源自非蠶生物諸如蜘蛛、野生蠶天蠶(Antheraea yamamai)、和珍珠貝(pearl shell)的絲心蛋白蛋白質(zhì)和絲膠蛋白蛋白質(zhì)、 和源自其一級(jí)結(jié)構(gòu)的肽；但是不限于此。若可以獲得絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地由此蠶獲得繭。(2)繭的干燥在本發(fā)明中，將絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭在大約80°C或更低 (例子包括 79 V、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、73°C、72°C、和 71 °C，但不限于此)的溫度條件下干燥。更優(yōu)選地70°C或更低，甚至更優(yōu)選地60°C以上及70°C以下(例子包括61°C、 62 °C、63 °C、64°C、65 °C、66 °C、67 °C、68 °C、和 69 °C，但不限于此)，且特別優(yōu)選地 55 °C 以上及 65°C或以下(例子包括 56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、和 64°C，但不限于此)的溫度條件下干燥繭。在使用熱空氣型干燥器的繭干燥外，也可以使用真空型干燥器或微波(電磁波)。繭干燥的程度隨種類和特征而有所不同，但是干燥直至達(dá)到干燥百分比36%至 44% (例子包括 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、和 44%，但不限于此)是優(yōu)選的?；蛘撸稍?0至24小時(shí)左右(例子包括20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、和24小時(shí)，但不限于此)是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依照繭的特征適當(dāng)?shù)卮_定干燥百分比。例如，對(duì)于普通的蠶繭諸如“ shunrei χ syogetsu，，，42 %至43 %的干燥百分比是合適的，但是當(dāng)蛹的重量相對(duì)于繭層的重量而言較重時(shí)，可以選擇較低的干燥百分比(例如36%至38% 左右的干燥百分比變?yōu)榭赡?。在本發(fā)明中，優(yōu)選在恒定的溫度條件下實(shí)施繭干燥。在本發(fā)明中，還有可能在真空條件下，或在正常溫度且在真空條件下干燥由絲腺中含有外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭，代替在大約80°C或更低的條件下干燥它們。在 80°C或更低、在真空條件下、或在正常溫度且在真空條件下的干燥，如上文所描述地，可以使用熱空氣型干燥器，或者利用真空型干燥器或微波(電磁波)來(lái)實(shí)施。例如，當(dāng)于恒定溫度60°C干燥繭時(shí)，如圖1中所顯示的，可以花費(fèi)約M小時(shí)來(lái)達(dá)到大約45%的干燥百分比。 因此，能夠如此獲得的繭可以不生霉地貯存。在通過(guò)此類方法干燥繭時(shí)，必須從干燥器快速排出來(lái)自蛹的水分。這是因?yàn)槿绻稍锲鲀?nèi)部充滿水分，繭絲分離會(huì)變差。在通過(guò)產(chǎn)生真空同時(shí)提高溫度來(lái)在真空條件下干燥時(shí)，可以比僅通過(guò)熱空氣干燥更高效地實(shí)現(xiàn)干燥。(3) &鋪■劑、胃碰_、_白棚夜Φ胃泡I在本發(fā)明中，在含有堿劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的溶液中浸泡繭。更優(yōu)選地，在含有堿劑和表面活性劑的溶液中，或在含有酶和表面活性劑的溶液中浸泡繭。本發(fā)明的堿劑的例子包括碳酸鈉和碳酸氫鈉，但不限于此。此外，本發(fā)明的表面活性劑的例子包括非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、和兩性表面活性劑，但不限于此。非離子型表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基醚、山梨聚糖脂肪酸酯、烷基多聚葡萄糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、和烷基單甘油酯，但不限于此。陰離子型表面活性劑的例子包括脂肪酸鈉、單烷基硫酸酯、烷基聚氧乙烯硫酸酯、 烷基苯磺酸酯、和單烷基磷酸酯，但不限于此。陽(yáng)離子型表面活性劑的例子包括烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、和烷基芐基二甲基銨鹽，但不限于此。兩性表面活性劑的例子包括烷基二甲基氧化胺和烷基羧基甜菜堿，但不限于此。
此外，本發(fā)明的酶包括蛋白酶，但不限于此。蛋白酶的例子包括絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶、和堿性蛋白酶(alkalase)，但不限于此?？梢岳缛缦聦?shí)施浸泡處理，但其不限于此。將放置在金屬籃中的繭在例如 0. 15%碳酸鈉和0. 3%非離子型表面活性劑的混合溶液(處理水)中浸泡20分鐘。這導(dǎo)致水分可以浸入繭層表面中的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依照繭的特性適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)碳酸鈉和表面活性劑的濃度和處理時(shí)間。在本發(fā)明中，含有酶和表面活性劑的溶液是更優(yōu)選的。酶和表面活性劑的組合的例子包括可以由本文中所描述的酶和表面活性劑規(guī)定的各種組合。(4)在含有堿齊H、表g活+牛齊Ι|、_等的溶液中的真空滲誘在本發(fā)明中，在含有堿劑、表面活性劑、和酶中的至少一項(xiàng)的溶液中對(duì)蠶繭進(jìn)行真空滲透。更優(yōu)選地，在含有堿劑和表面活性劑的溶液，或含有酶和表面活性劑的溶液中浸泡蠶繭。堿劑、表面活性劑、和酶的例子是那些在上文所提及的。可以例如通過(guò)如下方法實(shí)施真空滲透處理(低壓滲透處理)。將接受浸泡處理的繭在仍處于處理水中的狀態(tài)下轉(zhuǎn)移至真空裝置，并產(chǎn)生真空。合適的真空度(vacuumizing degree)是-620mmHg 左右(例如 _640mmHg 至 _600mmHg，或更優(yōu)選地-630mmHg 至-6IOmmHg 等)，但不限于此。例如當(dāng)真空度達(dá)到-620mmHg時(shí)，歷時(shí)5至10分鐘將壓力恢復(fù)至正常壓力。這樣，處理水由于繭腔內(nèi)部和外部間的壓力差而逐漸滲透入繭層中。若在此點(diǎn)突然恢復(fù)壓力，則處理水會(huì)試圖立即進(jìn)入繭腔，繭可能由于壓力差異而崩潰。此外，因?yàn)樘幚硭畷?huì)通過(guò)繭層的薄的部分或繭層的容易透過(guò)的部分，所以有可能無(wú)法獲得均勻煮沸的繭。因此，應(yīng)
9當(dāng)避免突然的壓力恢復(fù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依照繭的特性來(lái)設(shè)置合適的壓力恢復(fù)時(shí)間。在本發(fā)明中，當(dāng)上述浸泡處理在含有堿劑和表面活性劑的溶液中進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選地， 真空滲透處理也使用含有堿劑和表面活性劑的溶液來(lái)實(shí)施。此外，當(dāng)上述浸泡處理在含有酶和表面活性劑的溶液中進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選地，真空滲透處理也使用含有酶和表面活性劑的溶液來(lái)實(shí)施。在本發(fā)明中，真空不限于絕對(duì)真空，而且還包括減壓。(5)真空脫水在本發(fā)明中，使用含有堿劑、表面活性劑、和酶中的至少一項(xiàng)的溶液進(jìn)行滲透后， 在真空中對(duì)蠶繭進(jìn)行脫水。用于真空脫水的方法沒(méi)有特別限制，但是例如可以通過(guò)如下方法在真空中對(duì)繭進(jìn)行脫水。將接受過(guò)真空滲透處理的繭從處理水中取出，并使用真空裝置來(lái)進(jìn)行真空處理。與上文所描述的內(nèi)容相似，真空度優(yōu)選設(shè)置于-620mmHg左右(例子包括但不限于-640mmHg至-600mmHg，或更優(yōu)選地-630mmHg至-610mmHg)，但不限于此。優(yōu)選地， 此真空處理是逐漸實(shí)施的，例如歷時(shí)5至10分鐘。通過(guò)逐漸地實(shí)施真空處理，可以逐漸地將繭腔中的處理水排出至繭層外。若突然實(shí)施真空處理，則溶液會(huì)穿透繭層的薄部分或容易透過(guò)的空間，可能導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行均勻的煮繭處理。(6) &鋪堿劑、胃碰_、_白棚夜雜誘在本發(fā)明中，將真空中脫水后的繭在含有堿劑和表面活性劑的溶液，或含有酶和表面活性劑的溶液中再次進(jìn)行真空滲透處理。真空滲透處理可以通過(guò)例如上文所描述的方法來(lái)實(shí)施，但其不限于此。通過(guò)重復(fù)真空滲透和真空脫水，可以提高繭絲的解離(dissociative)特性。另一方面，重復(fù)真空滲透和真空脫水也具有不利的影響，諸如增加首次索緒的廢料和降低生絲產(chǎn)率。因此，依照繭的特性來(lái)調(diào)節(jié)真空滲透和真空脫水的次數(shù)是至關(guān)重要的。例如，將真空滲透、真空脫水、和真空滲透的循環(huán)實(shí)施一次或者重復(fù)兩次。如在上文中所述的那樣，對(duì)于此處理而言，同樣在通過(guò)真空處理來(lái)使處理水滲透入繭腔中的過(guò)程中優(yōu)選地隨時(shí)間逐漸將壓力從真空狀態(tài)恢復(fù)至正常壓力。相似地，在通過(guò)真空處理將處理水從繭腔內(nèi)部排出至外部時(shí)，優(yōu)選地，花費(fèi)時(shí)間來(lái)完成向真空狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。在煮繭處理中，逐漸膨脹并軟化繭層中繭絲膠著點(diǎn)處的絲膠蛋白是重要的。在本發(fā)明中，堿劑、酶等承擔(dān)膨脹和軟化絲膠蛋白的作用，而表面活性劑擔(dān)當(dāng)滲透入繭層中的繭絲膠著點(diǎn)中的作用。當(dāng)使用含有堿基和表面活性劑的溶液來(lái)實(shí)施上述浸泡處理和真空滲透處理時(shí)，優(yōu)選地，真空滲透處理也通過(guò)使用含有堿基和表面活性劑的溶液來(lái)重復(fù)實(shí)施?；蛘?，當(dāng)使用含有酶和表面活性劑的溶液來(lái)實(shí)施上述浸泡處理和真空滲透處理時(shí)，優(yōu)選地，真空滲透處理也通過(guò)使用含有酶和表面活性劑的溶液來(lái)重復(fù)實(shí)施。(7)在水中浸泡繭在本發(fā)明的方法中，接著，在水中浸泡繭。通過(guò)到(6)為止的煮繭處理所獲得的繭表面覆蓋著堿。若置之不理，則絲膠蛋白由于粘附于繭層表面的堿而趨于膨脹，并且索緒廢料會(huì)增加。因此，在正常溫度的水中浸泡以收斂(converge)繭層表面上的絲膠蛋白是必要的。在水中浸泡繭，直至粘附于繭層表面的堿被除去，且繭層表面上的絲膠蛋白收斂(例如 10至20分鐘左右)。
(8)繅絲在本發(fā)明中，在60°C或更低的溫度下實(shí)施繅絲。更優(yōu)選地于50°C或更低，且甚至更優(yōu)選地在；35 V至45 V的條件下(例如包括；35 V、36°C、37 V、38°C、39°C、40°C、41°C、 42°〇、431、441、和451，但不限于此)實(shí)施繅絲。繅絲可以使用自動(dòng)繅絲機(jī)、多頭繅絲機(jī) (multi-end reeling machine)、$#云力||@豐；1^$11?？壗z包括從通過(guò)上文所提及的方法進(jìn)行繭層絲膠蛋白膨脹和軟化的繭抽出繭絲， 并將數(shù)根這樣的細(xì)絲與絲膠蛋白耦合來(lái)生成單股生絲?？壗z前，在大約80°C或更低的溫水中用索緒帚(一束稻穗)摩擦繭表面，并在抽出數(shù)股繭絲(這稱為索緒(brushing))后，進(jìn)一步將細(xì)絲抽出，直至細(xì)絲的單一末端露出，該末端就成為正確的繭絲末端(這稱為理緒 (picking end))。將從繭(繭絲末端正確的繭)抽出的幾股繭絲集中起來(lái)到期望的粗度， 并將其穿過(guò)集緒器(cocoon filament guide button)(例如由陶瓷等制成，具有鈕扣形狀， 在中央具有小洞)。將如此獲得的生絲通過(guò)集緒器上的兩個(gè)離合輪返回到集緒器附近，將其與剛剛從集緒器產(chǎn)生的細(xì)絲線捻合在一起(這稱作kennel捻絲)后，纏繞在卷軸(reel) 上。手動(dòng)繅絲機(jī)和多端繅絲機(jī)依照想要的細(xì)度(fineness)使用一定數(shù)目的繭(恒定數(shù)目的繭)進(jìn)行繅絲，而自動(dòng)繅絲機(jī)使用細(xì)度檢測(cè)儀來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)度，使得粗度是恒定的(恒定的絲大小)°關(guān)于繅絲，可以參考文獻(xiàn)(Sogo Sanshigaku(General Sericultural Science),Nihon Sanshi Gakkai (Japanese Society of Sericultural Science)編第 358 頁(yè)-第 369 頁(yè)， 1979 ^Nihon Seishi Gijyutsu Shi (History of Japanese Reeling Technology)Kato, S.第 59 頁(yè)-第 144 頁(yè)，1976)。此外，本發(fā)明提供了用于從由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其包括下列(a)至(g)的步驟。本發(fā)明還提供了用于生成經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法，其包括下列(a)至(g)的步驟(a)在大約80°C或更低的條件下、在真空條件下、或在正常溫度且在真空條件下干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。在上述方法中，獲得轉(zhuǎn)基因蠶的繭、繭干燥、在低溫溫水中浸泡繭、繭的真空滲透、 繭的真空脫水、繭的水中浸泡、和自繭繅絲都可以通過(guò)上文所描述的方法來(lái)實(shí)施。在本發(fā)明中，使用80°C或更低(例子包括79°C、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、 73°C、72°C、和71°C，但不限于此)的低溫溫水，更優(yōu)選地70°C或更低(例子包括69°C、 68 °C、67 °C、66 °C、65 °C、64°C、63 °C、62 °C、和61°C，但不限于此)的低溫溫水，甚至更優(yōu)選地 55 0C或更高和60 °C或更高(例子包括56 °C、57 °C、58 °C、和59 V，但不限于此)的低溫溫水。此外，本發(fā)明提供了可以通過(guò)上文所提及的方法獲得的生絲。此外，本發(fā)明提供了可以自生絲獲得的針織織物或梭織織物。另外，本發(fā)明提供了可以自生絲獲得的三維結(jié)構(gòu)。 三維結(jié)構(gòu)的例子包括燈罩、連衣套裝(one-piece suit)、外套、披肩等西式服飾、日本服裝(和服)、日本腰帶(寬腰帶)、西式服裝、面板(panel)、壁紙、椅子座席、名片、和書(shū)的表裝 (binding)，但不限于此。燈罩、連衣套裝、外套、披肩等西式服飾、日本服裝(和服)、日本腰帶(寬腰帶)、西式服裝、面板、壁紙、椅子座席、名片、和書(shū)的表裝等可以通過(guò)公知的方法來(lái)生產(chǎn)。此外，本發(fā)明提供了可以通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的自生絲生成的醫(yī)學(xué)材料。醫(yī)學(xué)材料的例子包括手術(shù)縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、和角膜培養(yǎng)薄膜，但不限于此?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)施醫(yī)學(xué)材料中使用的本發(fā)明生絲的加工。通過(guò)提及而將本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有在先技術(shù)參考文獻(xiàn)收入本文。 實(shí)施例在下文中，本發(fā)明會(huì)具體參照實(shí)施例進(jìn)行描述，但是不應(yīng)解釋為局限于此。[實(shí)施例1]使用絲腺中表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭進(jìn)行制絲1.方法1. 1干燥步驟通常，在經(jīng)過(guò)了約5. 5小時(shí)后，干燥方法將溫度從115°C至120°C的最大溫度逐漸降低至60°C。這會(huì)得到大約42%的干燥百分比。然而，在此實(shí)施例中，不使用溫度梯度，而將繭放置于60°C恒定溫度維持的干燥器中，并在20至M小時(shí)內(nèi)干燥。結(jié)果，獲得了期望的干燥百分比(圖1)。1. 2煮繭步驟在本發(fā)明中，為了在低溫(60°C或更低)條件下膨脹并軟化繭層絲膠蛋白，使用堿劑、表面活性劑、酶等來(lái)實(shí)施煮繭。下面給出使用堿劑和表面活性劑的實(shí)施例。首先，生成0. 1 %至0. 4%碳酸鈉和0. 2%至0. 4%非離子型表面活性劑的溶液，并將表達(dá)外來(lái)基因的蠶的繭在其中浸泡20分鐘。然后，將在真空容器中抽真空至-600mmHg， 使其在此狀態(tài)下放置，然后將壓力逐漸恢復(fù)以引起溶液向繭腔中的逐漸滲透。此后，從真空容器中的溶液取出繭，并以此狀態(tài)創(chuàng)建真空條件以使繭腔中的溶液脫水。這使得溶液滲透繭層繭絲的格子結(jié)構(gòu)，從而使得導(dǎo)致繭絲膠著的絲膠蛋白得以膨脹和軟化。然后，再次將繭放進(jìn)溶液中，再次創(chuàng)造真空條件，并將溶液滲透入繭腔中，并在完成后，使用正常溫度的水來(lái)收斂絲膠蛋白。圖2中顯示了上文所提及的步驟。1. 3繅絲步驟通常，為了從繭引出索緒廢料，將繭放置在85°C至90°C的熱水中，并當(dāng)膨脹并軟化繭層表面上的絲膠蛋白的同時(shí)使用索緒帚來(lái)實(shí)施抽出繭絲的處理。此外，在繅絲中，自 40°C的繅絲槽(reeling basin)中的煮熟繭分離繭絲，并在大約60°C的氣氛下將生絲纏繞在卷軸上。在本發(fā)明中，在進(jìn)行索緒和繅絲時(shí)，索緒溫度和繅絲槽溫度是50°C，而卷軸部分的溫度是40°C。2.結(jié)果表1顯示了使用絲腺中表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭來(lái)實(shí)施繅絲的結(jié)果。常規(guī)地，通過(guò)于60°C或更低的低溫繅絲來(lái)實(shí)施繅絲是不可能的，但是通過(guò)使用本發(fā)明的方法使其變得可能。
表 權(quán)利要求
1.一種從轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其中該方法包括使用包含堿劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液來(lái)進(jìn)行真空滲透。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；以及(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下干燥所述繭。
4.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下干燥所述繭。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述堿劑選自下組碳酸鈉和碳酸氫鈉；所述表面活性劑選自下組非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、 和兩性表面活性劑；而所述酶是蛋白酶。
6.一種從在絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭產(chǎn)生生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下干燥所述繭。
8.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下干燥所述繭。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述外來(lái)蛋白質(zhì)選自下組熒光蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞附著活性的蛋白質(zhì)、主要包含酸性和堿性氨基酸的肽、和源自非蠶生物的絲心蛋白蛋白質(zhì)和絲膠蛋白蛋白質(zhì)。
10.可以通過(guò)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法獲得的生絲。
11.可以自權(quán)利要求10的生絲獲得的針織或梭織織物。
12.可以自權(quán)利要求10的生絲獲得的三維結(jié)構(gòu)。
13.自權(quán)利要求10的生絲制成的醫(yī)學(xué)材料。
14.權(quán)利要求13的醫(yī)學(xué)材料，其選自下組手術(shù)縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、 人工骨、和角膜培養(yǎng)的薄膜。
15.一種產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟 (a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在包含堿劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
16.一種產(chǎn)生經(jīng)遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)干燥由絲腺中包含外來(lái)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因蠶所結(jié)的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；并(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中在步驟(a)中在大約80°C或更低的條件下干燥所述苗。
18.權(quán)利要求15或16的方法，其中在步驟(a)中在真空條件下干燥所述繭。
全文摘要
在低溫(60℃或更低)條件下，而不是在從繭生成生絲時(shí)常規(guī)采用的高于100℃的溫度的條件下干燥繭。此外，通過(guò)于低溫進(jìn)行真空滲透處理(減壓處理)，而不是常規(guī)采用的100℃以上的高溫處理或者用接近沸點(diǎn)的熱水處理來(lái)實(shí)施煮繭。作為一種替代的煮繭方法，實(shí)施組合處理，其包括用堿使絲膠蛋白膨脹，并利用表面活性劑、酶等使熱水滲透入繭層中。此外，在比常規(guī)采用的溫度更低的溫度進(jìn)行繅絲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以從表達(dá)外來(lái)基因的蠶繭生成生絲而不損害該蠶繭中所含的外來(lái)蛋白質(zhì)的特性。
文檔編號(hào)D01F9/18GK102257192SQ20098015079
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者中村敬, 吉井圭, 唐澤智司, 宮崎榮子, 宮脅敦史, 山口純次, 山田勝成, 朝倉(cāng)哲郎, 木下晴夫, 栗原宏征, 桑原伸夫, 瀬筒秀樹(shù), 田村俊樹(shù), 町井博明, 立松謙一郎, 青木里步, 飯塚哲也, 高林千幸 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所