專利名稱：具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程人工皮膚材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有良好生物相容 性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備方法。
背景技術(shù)：
目前常用的皮膚修復途徑有自體移植、同種移植、異種移植。但是由于供皮區(qū)不 足、免疫排斥反應、細菌感染及傳播疾病等缺點，尋找一種理想的皮膚替代物或者修復途徑 一直是臨床亟需解決的難題。然而，這一現(xiàn)象不僅僅存在于皮膚損傷修復領(lǐng)域，在其他器官 和組織的損傷修復方面也亟需解決。組織工程的宗旨就在于尋求一種科學的方法，解決器官移植供求不平衡之間的矛 盾以及損傷修復困難。構(gòu)建或預制皮膚組織是解決大面積燒傷患者皮源缺乏的有效方法和 根本途徑。理想的組織工程化皮膚應能夠阻止細菌入侵、能夠及時提供、能存放較長時間、 能防止體液丟失、在創(chuàng)面長期存活、無抗原性、容易獲得且價格適中、應用方便。鑒于這樣的 背景下，本課題的研究方向與皮膚損傷修復這一發(fā)展趨勢高度一致，不僅對皮膚替代材料 的開發(fā)具有重要的參考價值，而且對臨床醫(yī)學界攻克皮膚替代物或者修復途徑，甚至于其 他器官和組織的損傷修復疑難的解決提供了借鑒和可行的思路。近年來，納米技術(shù)在許多科學領(lǐng)域中都引起了廣泛的重視，納米材料在電子學、光 學、微機械、藥物釋放、生物材料和催化等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應用前景。由于納米材料的獨 特性質(zhì)，在骨、皮膚、血管、神經(jīng)導管等人工材料的制備方面都具有廣闊的應用。靜電紡納米 纖維直徑在IOOnm-IOOOnm范圍內(nèi)，這和細胞外基質(zhì)的主要成分I型膠原蛋白直徑大小極為 相近，因此，細胞的黏附和增殖能力都有顯著提高。上世紀末至本世紀初，靜電紡絲技術(shù)得 到長足的發(fā)展，在組織工程領(lǐng)域也得以廣泛的應用。許多科學工作者以天然高分子或者人 工合成高分子為原料，利用靜電紡絲技術(shù)制備出極細的納米纖維，并且在制備好的纖維膜 或者纖維氈上通過層層自組裝的方法修飾或改性材料，以提高材料的生物相容性。其中層 層自組裝技術(shù)簡單，無需特定的設備，易操作以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點而得到了廣泛的研究。例 如，丁彬等人以醋酸纖維素為基底，在經(jīng)靜電紡絲得到的納米纖維上組裝上聚電解質(zhì)殼聚 糖和海藻酸鈉(ALG)，并探究了在細胞的粘附和增殖方面的影響。然而要獲得尺寸均勻、機 械性能完好、能夠誘導細胞生長的靜電紡納米纖維膜材料，仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。碳納米管(Carbon Nanotubes,CNTs)由于其獨特的機械、物理和化學性質(zhì)，因而在 組織工程領(lǐng)域得到了許多潛在的應用。例如，Mattson和Hu等人報道了利用CNTs作為基底 促進神經(jīng)生長，而且神經(jīng)生長可以通過改變CNTs的表面電荷進行控制。Lovat等人證實了 CNTs可以作為基底促進神經(jīng)信號傳導，并支持神經(jīng)元伸長和細胞黏附。這些研究證實CNTs 可以作為一種最有潛力的納米纖維仿生模擬細胞外基質(zhì)。進一步的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，CNTs展 示了可以模擬膠原蛋白并作為支架促進羥基磷灰石的生長，并促進骨組織的生長。在最近 的一項研究中，Meng等人研究了含多壁碳納米管(MWCNTs)的聚氨酯納米纖維膜對成纖維
3細胞的生長影響。發(fā)現(xiàn)，MWCNTs的介入可以促進細胞的黏附、生長、分化和遷移。我們最近 的研究工作也顯示了我們能夠?qū)WCNTs和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)共聚物電紡形成納米纖 維，用于提高纖維的機械強力。我們預計將CNTs通過組裝或者直接和生物相容性聚合物電 紡引入納米纖維膜材料中，得到的含CNTs的膜材料不僅能夠提高纖維機械性能，更為重要 的是可以提高細胞的響應，促進細胞的黏附、增殖和分化，為組織工程人工皮膚材料的研制 提供新思路。殼聚糖(Chitosan)是甲殼素的脫乙酰衍生物，是天然多糖中惟一的堿性多糖，可 以從蝦殼、蟹殼還有一些細菌的細胞壁中大量提取。殼聚糖表面存在大量游離的氨基和羥 基，因此可以參加很多化學反應，殼聚糖還有一個特性是它能打開上皮細胞的緊密結(jié)合處， 因此能很好地將大分子穿過緊密的上皮層。殼聚糖還能黏附于黏膜表面，這又提供了它作 為一個黏膜給藥體系的可能。作為無毒、來源豐富、具有良好生物相容性及生物可降解性且 具有抗菌止血的天然物質(zhì)，殼聚糖成為應用廣泛的生物材料之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納 米纖維的制備方法，該方法制備的納米纖維具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳納米 管后促進細胞的增殖及對蛋白的吸附，且材料的制備過程簡單易操作，在組織工程方面應 用廣闊。本發(fā)明的一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備方法，包括(1)將醋酸纖維素加入到體積比為2 1的丙酮和二甲基甲酰胺為溶劑，配制成濃 度為12. 5wt%醋酸纖維素溶液，通過靜電紡絲工藝制備納米纖維膜；(2)將上述制備的納米纖維膜真空干燥；(3)將殼聚糖溶解到醋酸溶液中，加入NaCl，制成濃度為lmg/mL的殼聚糖組裝液； 將碳納米管超聲溶解到超純水中，制成濃度為lmg/mL的碳納米管組裝液；(4)將干燥后的膜浸泡在配制好的殼聚糖與碳納米管組裝液中，組裝工藝為I.將膜浸泡在帶正電荷的殼聚糖溶液中5分鐘，超純水洗膜3次，每次2分鐘；II.再將水洗后的膜浸泡在帶負電荷的碳納米管溶液中5分鐘，然后水洗膜3次， 每次2分鐘；經(jīng)上述I和II步驟后，組裝好一個雙層，重復上述I和II步驟；(5)將組裝好的復合膜材料真空干燥。所述步驟(1)醋酸纖維素的濃度配置在12. 5%，濃度過高，紡絲困難，制備不出形 貌和直徑分布均勻的納米纖維膜。所述步驟(1)丙酮和二甲基甲酰胺的體積比為2 1，并且電壓保持在20KV。所述步驟(1)中靜電紡絲工藝參數(shù)為紡絲電壓20KV，接收距離20cm，溫度25°C， 濕度4050%。所述步驟⑵或(5)干燥的溫度為80°C，時間為12h以上。所述步驟(2)制備好的納米纖維薄膜放置在真空干燥箱中，80°C干燥12小時以 上，使殘留的有機溶劑徹底去除。所述步驟(4)在浸泡自組裝過程時，輕輕地攪拌，使納米纖維膜在組裝溶液中充 分伸展，接觸面積均勻。
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將經(jīng)組裝好的復合膜材料經(jīng)消毒殺菌處理后(消毒殺菌一定要嚴格按照無菌操 作，防止染菌導致實驗失敗)，用于小鼠成纖維細胞L929的培養(yǎng)以測試其生物相容性，細胞 黏附實驗時，種植密度為1.0X104，細胞增殖實驗時接種密度為1.5X104，用于拍掃描電鏡 觀察細胞在材料上的形態(tài)時的種植密度為2. OX 104。在細胞培養(yǎng)3天后拍電鏡，培養(yǎng)3天 的細胞在纖維上充分伸展，形態(tài)良好。使用SEM (掃描電鏡)、紅外光譜法(ATR-FTIR)、TGA、MTT Assay等方法表征本發(fā) 明獲得的含有多壁碳納米管的復合納米纖維膜結(jié)果如下(I)SEM的測試結(jié)果SEM的測試結(jié)果表明利用靜電紡絲制備得到醋酸纖維素納米纖維膜形貌優(yōu)良， 具有較大的空隙率，纖維平均直徑為305nm，主要集中在200-300nm范圍內(nèi)。參見說明書附 圖一。經(jīng)層層自組裝上殼聚糖和碳納米管后的纖維材料仍然保持著原有的三維結(jié)構(gòu)，原本 光滑的纖維表面變得粗糙，明顯在納米纖維表面沉積了殼聚糖和碳納米管，見說明書附圖二。(2) ATR-FTIR、TGA 測試結(jié)果為了進一步表征纖維膜表面碳納米管的成功組裝，本實驗綜合紅外光譜、TGA測試 方法，其結(jié)果表明，我們成功地將殼聚糖和碳納米管組裝到醋酸纖維素納米纖維上，從TGA 圖譜中看出，隨著組裝層數(shù)增加，組裝到納米纖維膜上的碳納米管的量逐漸增加，見說明書 附圖三、圖四。(3) MTT Assay 測試結(jié)果MTT Assay測試結(jié)果表明，不管是黏附試驗還是增殖試驗，組裝上碳納米管的復合 材料上，細胞的黏附和增殖能力都明顯優(yōu)于不含碳納米管的材料，隨著培養(yǎng)時間的增加，兩 種材料上細胞的增殖能力差異越來越顯著，從第三天開始，組裝有碳納米管的復合材料細 胞的增殖分化能力顯著優(yōu)于不含碳納米管的復合材料，由此說明，加入的碳納米管能加強 細胞在納米纖維材料上的吸附，細胞在含碳納米管復合材料上保持良好的形態(tài)，并促進細 胞增殖、分化，參見附圖五。本發(fā)明涉及了兩個基本原理(1)利用靜電紡絲的原理使聚電解質(zhì)溶液在高壓的作用下帶電并形成錐形射流， 帶電的射流在電場力的作用下受到牽伸細化形成納米纖維，最終以纖維氈的形式沉積在接 收板上；(2)利用帶電基板在帶相反電荷中的交替沉積制備聚電解質(zhì)自組裝多層膜。有益效果本發(fā)明制備的納米纖維具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳納米管后促進 細胞的增殖及對蛋白的吸附，改善了醋酸纖維素的生物相容性，且材料的制備過程簡單易 操作，在組織工程方面應用廣闊。


圖1為本發(fā)明利用靜電紡絲技術(shù)制備好的納米纖維SEM圖；圖2為本發(fā)明制備的經(jīng)靜電層層自組裝后得到的纖維膜SEM圖；圖3為本發(fā)明制備的含碳納米管具有良好生物相容性的復合納米纖維的FTIR圖；圖4為本發(fā)明制備的含碳納米管具有良好生物相容性的復合納米纖維TGA圖；圖5為本發(fā)明制備的含碳納米管具有良好生物相容性的復合納米纖維小鼠成纖 維細胞L929黏附實驗時測定細胞活力的MTT圖；圖6為本發(fā)明制備的含碳納米管具有良好生物相容性的復合納米纖維小鼠成纖 維細胞L929增殖時測定細胞活力的MTT圖；圖7為本發(fā)明制備的含碳納米管具有良好生物相容性的復合納米纖維上生長的 小鼠成纖維細胞L929的SEM圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實施例1(1)配制濃度為12. 5wt%的醋酸纖維素，用電子天平稱取1. 8克醋酸纖維素溶解 在15毫升的丙酮/ 二甲基甲酰胺體積比2 1的混合溶劑中，配制成濃度為12. 5wt%的醋 酸纖維素紡絲溶液，用玻璃棒攪拌3分鐘左右，再超聲30分鐘后，磁力攪拌12小時后，得到 均勻的醋酸纖維素溶液，備用；(2)將配制好的12. 5襯％的醋酸纖維素溶液超聲15分鐘，然后將連接有硅膠管的 10毫升的注射器，吸取大約7毫升的溶液，固定在注射泵上，并調(diào)節(jié)流速為lml/h。紡絲條 件設置接收距離為20cm，電壓為20kV，流速為lmL/h，外界環(huán)境的溫度在25°C，濕度保持在 40-50%。制備的納米纖維收集到鋁箔上。先將納米纖維于空氣中自然干燥1天后，再放入 真空干燥器中干燥24小時；將干燥好的納米纖維膜在掃描電鏡下觀察，SEM的測試結(jié)果表明有連續(xù)的納米 纖維形成，并且纖維上幾乎不存在串珠結(jié)構(gòu)，纖維的空隙均勻，纖維形貌較好；(3)配制靜電層層自組裝溶液配制lmg/ml的殼聚糖溶液，稱取殼聚糖lOOmg，溶 解在IOOmL的濃度為的醋酸溶液里，加入0. 5M的NaCl增強離子強度(加入NaCl的量 為2. 92克)。配制lmg/mL的海藻酸鈉(ALG)溶液，稱取ALGlOOmg，溶解在100毫升的超純 水里，加入0. 5M的NaCl增強離子強度(加入NaCl的量為2. 92克)。配制lmg/mL的碳納 米管分散液，將研磨均勻的多壁碳納米管，準確稱取lOOmg，加入IOOmL超純水中，超聲1小 時使碳納米管在超純水中分散均勻，配制溶液時所用水均為電阻率18. 2ΜΩ. cm的超純水。(4)將靜電紡絲得到的醋酸纖維素納米纖維膜(帶負電荷)，在殼聚糖(帶正電 荷)和碳納米管(帶負電荷)/ALG組裝溶液中交替浸泡，自組裝工藝為1、將膜浸泡在帶正 電荷的殼聚糖中5min，水洗膜3次，每次2min，II、再將水洗后的膜浸泡在帶負電荷的碳納 米管/ALG溶液中5分鐘，然后水洗膜3次，每次2分鐘。經(jīng)上述I和II步驟后，組裝好一 個雙層，重復上述I和II步驟以達到設計的雙層數(shù)目。將組裝好的多層膜用濾紙先將水吸 干，然后置于密封袋中，80°C干燥12小時。得到的CA/CS/CNTs材料為我們的實驗材料，得 到的CA/CS/ALG為對照材料。
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實施例2在接種小鼠成纖維細胞L929前先將膜放入到24孔板中用鋼環(huán)壓好，75%的酒精 處理消毒12小時以上，然后用PBS緩沖液洗三次，第一次加入后隨即吸出，第二、第三次加 入后20分鐘后吸出，使殘留的酒精完全洗脫。在消毒后的每孔加入300 μ 1的培養(yǎng)基，完全浸潤材料。用于細胞增殖實驗的接種 細胞數(shù)目為IXio4/孔。培養(yǎng)時間梯度為1，3，5，7天。達到培養(yǎng)時間后取出24孔板，移去 培養(yǎng)基后加入360 μ L的純DMEM培養(yǎng)基和40 μ L的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育4小時后， 取出培養(yǎng)板并吸去上清液，然后加入400 μ L的DMSO溶解晶體，20分鐘后用移液槍吸取其中 的100 μ L紫色溶液于96孔板中(吸取時每一孔換一次槍頭)，隨即用酶標儀測定吸光值。
權(quán)利要求
1. 一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備方法，包括(1)將醋酸纖維素加入到體積比為2 1的丙酮和二甲基甲酰胺溶劑中，配制成濃度為 12. 5wt%醋酸纖維素溶液，通過靜電紡絲工藝制備納米纖維膜；(2)將上述制備的納米纖維膜真空干燥；(3)將殼聚糖溶解到醋酸溶液中，加入NaCl，制成濃度為lmg/mL的殼聚糖組裝液；將碳 納米管超聲溶解到超純水中，制成濃度為lmg/mL的碳納米管組裝液(4)將干燥后的膜浸泡在配制好的殼聚糖與碳納米管組裝液中，組裝工藝為1.將膜浸泡在帶正電荷的殼聚糖溶液中5分鐘，超純水洗膜；II.再將水洗后的膜浸泡在帶負電荷的碳納米管溶液中5分鐘，然后水洗膜； 經(jīng)上述I和II步驟后，組裝好一個雙層，重復上述I和II步驟；(5)將組裝好的復合膜材料真空干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備 方法，其特征在于所述步驟(1)中靜電紡絲工藝參數(shù)為紡絲電壓20KV，接收距離20cm， 溫度25°C，濕度40-50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備 方法，其特征在于所述步驟(2)或(5)干燥的溫度為80°C，時間為12h-24h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有良好生物相容性CA/CS/CNTs復合納米纖維的制備方法，包括配制醋酸纖維素溶液，通過靜電紡絲工藝制備納米纖維膜；(2)將上述制備的納米纖維膜真空干燥；(3)配制殼聚糖與碳納米管組裝液；(4)進行組裝；(5)將組裝好的復合膜材料于80℃真空干燥12小時備用。本發(fā)明制備的納米纖維具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳納米管后促進細胞的增殖及對蛋白的吸附，且材料的制備過程簡單易操作，在組織工程方面應用廣闊。
文檔編號D01D1/02GK102000363SQ201010538059
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者史向陽, 沈明武, 羅宇 申請人:東華大學