專利名稱：礦化玉米蛋白纖維膜及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明是一種礦化玉米蛋白纖維膜及其制備方法，涉及一種用于骨組織修復再生的礦化玉米蛋白纖維膜及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料領域。
背景技術：
骨是人體內(nèi)以羥基磷灰石晶體為主要無機成分的高度礦化組織。骨質(zhì)的礦化是通過形成骨膠原網(wǎng)絡開始的，膠原蛋白通過自組裝形成三維框架，微小的羥基磷灰石晶體在膠原纖維上規(guī)則間隔的溝槽里形核。在骨組織中，由于羥基磷灰石和蛋白的相互作用，形成具有特殊的高級自組裝結構，從而顯示出優(yōu)良的抗壓或抗張等力學性質(zhì)及生物功能。從組成、結構和功能等方面進行仿生礦化，一直是制備骨修復材料的有效途徑。基于生物礦化原理的仿生主要是依據(jù)天然生物礦物材料的分級結構及其與功能的關系。天然生物礦化材料幾乎都采取了以基質(zhì)蛋白為主的有機分子調(diào)控無機相生長的策略。其中，有機基質(zhì)通常應具備分割細胞外空間和提供機械支撐的構架以及能與周圍過飽和溶液中離子發(fā)生相互作用的礦化形核表面，并有效控制無機礦物的成核、生長和礦物結構的堆積方式。國內(nèi)外許多研究組都通過有機質(zhì)的體外模擬礦化，構建與體內(nèi)天然骨近似的礦化纖維，用于各類骨缺損修復。清華大學崔福齋教授研究組根據(jù)天然骨的結構特征，通過羥基磷灰石粉末與I型膠原蛋白作用，仿生合成了納米羥基磷灰石/膠原復合骨替代材料，并檢測了其對骨的修復性能。他們還以絲蛋白為有機質(zhì)誘導礦化，制得礦化絲蛋白材料和礦化絲蛋白/高分子復合多孔材料(ZL 200410003453. 6，ZL200410003454. 0)，其生物相容性好，成本低，可用于臨床骨修復。靜電紡絲是近年來興起的制備生物大分子納米纖維的有效方法，采用電紡方法可以獲得直徑為數(shù)十納米至數(shù)微米的納米纖維。研究骨的分級結構發(fā)現(xiàn)，骨是膠原微纖維連接成的網(wǎng)狀骨架上沉積了片狀或針狀骨礦晶體的復合體，而電紡納米纖維的直徑正好與膠原纖維的尺寸相當。此外，電紡納米纖維均一性高、交錯編織的結構特點使其不僅有很好的結構仿生性，還具備良好的力學性能。研究者不僅采用天然高分子膠原蛋白(CN 101601871A)、絲蛋白、殼聚糖電紡纖維，還以合成高分子聚-L-乳酸、聚(丙交酯-co-乙交酯)電紡纖維為有機模板，經(jīng)生物礦化得到納米羥基磷灰石復合材料，這些結果為研究開發(fā)新型仿生礦化骨修復材料提供了重要的信息。然而，天然高分子膠原蛋白提純工藝復雜，成本高，來源于動物的膠原蛋白存在一定安全性問題，基因工程法生產(chǎn)的重組人膠原蛋白的安全性和效果尚待檢驗，絲蛋白的制備工藝則需要經(jīng)過脫絲膠、冷凍干燥等眾多步驟。因此，有必要尋找一類生物相容性良好，來源廣泛，成本低廉的天然高分子材料作為生物礦化的有機模板，制備礦化骨組織修復再生材料。玉米蛋白是一種含大量疏水氨基酸的蛋白質(zhì)，富含谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，以及較多的含硫氨基酸。玉米蛋白來源廣泛，價格低廉，近年來被用作藥物釋放載體以及化妝品組分(US2010172853-A1，US2010189845-A1, US2010062988-A1 )，其良好的生物學性質(zhì)也已得到肯定。以玉米蛋白纖維為有機模板，經(jīng)仿生礦化制得玉米蛋白/羥基磷灰石纖維膜，將是一類有價值的骨組織修復再生材料。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的是提供一種礦化玉米蛋白纖維膜及其制備方法。該纖維膜羥基磷灰石沉積在玉米蛋白纖維表面，可有效促進骨細胞的生長與分化。技術方案本發(fā)明的礦化玉米蛋白纖維膜是由含有機成分和礦物質(zhì)的納米纖維無規(guī)堆積而成，所述有機成分是玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白，所述礦物質(zhì)是鈣磷鹽晶體。玉米蛋白纖維或含有添加劑的玉米蛋白纖維的直徑為20納米-10微米，纖維膜的孔尺寸為100納米-100微米。鈣磷鹽晶體為羥基磷灰石。添加劑是細胞生長因子、骨生長因子、維生素、多肽、酶中的一種或多種物質(zhì)的混合物，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的0.01%-10%。添加劑是明膠、膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、絲蛋白、藻酸鹽、甲殼素、甲殼素衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、葡聚糖、肝素、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種物質(zhì)的混合物，或者是至少以下任意兩種單體的共聚物的一種L-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、己內(nèi)酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、氨基酸，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的0. 1%_30%。本發(fā)明的礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法依次包括下列步驟
1)將玉米蛋白溶于溶劑中，得到電紡溶液；或?qū)⑻砑觿┤苡谟衩椎鞍兹芤褐?，得到電紡混合溶液，加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到一個或多個噴射頭，噴射頭接直流高壓電場， 電壓為正或負1千伏-50千伏，接受裝置接地，進行電紡，制得玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白纖維，纖維無規(guī)堆積得到纖維膜，
2)將步驟1)制備的纖維膜浸泡在摩爾濃度為0.00Γ1 mol/L的乙酸溶液中1_60分
鐘，
3)將步驟2)處理過的纖維膜依次浸泡在含鈣離子的溶液1-60分鐘、含磷酸根的溶液中1-60分鐘，鈣離子的摩爾濃度為0.005、mol/L，磷酸根離子的濃度為0.003 3 mol/L, 鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1:2 3:1，
4)以步驟3)為一個循環(huán)，循環(huán)1-5次，纖維膜經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，即可得礦化玉米蛋白纖維膜，
其中步驟1)制備的纖維膜為交聯(lián)或不交聯(lián)。交聯(lián)所用的交聯(lián)劑是醛、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷、二異氰酸酯、碳化二亞胺中的一種或多種的混合物。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點
(1)本發(fā)明從組成、結構和功能等方面進行仿生礦化，制備礦化玉米蛋白纖維膜。通過調(diào)節(jié)電紡工藝參數(shù)可有效調(diào)節(jié)玉米蛋白纖維的直徑分布范圍，使其與骨中膠原微纖維的尺寸相當，電紡纖維膜無規(guī)交錯的分布特點具有結構仿生性。羥基磷灰石沉積在玉米蛋白纖維表面，可有效促進骨細胞的生長與分化。(2)本發(fā)明對交聯(lián)玉米蛋白纖維膜進行礦化，能長期維持礦化玉米蛋白纖維在液
4體的結構穩(wěn)定性和通透性，具有良好的力學性能。(3)本發(fā)明提供的礦化玉米蛋白纖維膜具有良好的生物相容性和生物降解性，可以用于細胞、組織培養(yǎng)，也可用于臨床骨修復再生。(4)本發(fā)明礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法具有原料來源廣泛、工藝簡單、成本低等優(yōu)點，使用無毒無害的醇、水為溶劑，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。


圖1.礦化玉米蛋白纖維膜掃描電鏡照片。圖2.礦化玉米蛋白纖維膜的X射線衍射圖。
具體實施例方式本發(fā)明的一種礦化玉米蛋白纖維膜是由玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白纖維無規(guī)堆積而成，其中纖維表面沉積鈣磷鹽晶體。玉米蛋白纖維或含有添加劑的玉米蛋白纖維的直徑為20納米-10微米，纖維膜的孔尺寸為100納米-100微米。對于含有添加劑的玉米蛋白纖維，其中添加劑是細胞生長因子、骨生長因子、維生素、多肽、酶中的一種或多種物質(zhì)的混合物，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的0.01%-10%?；蛘咛砑觿┦敲髂z、膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、絲蛋白、藻酸鹽、甲殼素、甲殼素衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、葡聚糖、肝素、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種物質(zhì)的混合物， 或者是至少以下兩種單體的共聚物的一種L-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、己內(nèi)酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、氨基酸，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的0. 1%-30%。
礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法，其步驟為1)將玉米蛋白溶于溶劑中，得到電紡溶液，或?qū)⑻砑觿┤苡谏鲜鋈芤褐?，得到電紡混合物，加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到一個或多個噴射頭，噴射頭接直流高壓電場，電壓為正或負1千伏-50千伏，接受裝置接地，進行電紡，制得玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白纖維，纖維無規(guī)堆積得到纖維膜。制備的纖維膜可以交聯(lián)也可以不交聯(lián)。2)將制備的纖維膜浸泡在摩爾濃度為0.00廣1 mol/L的乙酸溶液中1-60分鐘。3)將制備的纖維膜依次浸泡在含鈣離子的溶液1-60分鐘、含磷酸根的溶液中1-60分鐘。鈣離子的摩爾濃度為0.005、mol/L，磷酸根離子的濃度為0.003 3 mol/L，鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1:2 3:1。4)以步驟3)為一個循環(huán)，循環(huán)1_5次， 纖維膜經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，即可得礦化玉米蛋白纖維膜。實施例1將3克玉米蛋白溶于IOmL乙醇和水的混合溶劑中，乙醇和水的體積比為 70 :30，配成30% (w/v)的高分子溶液，加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到噴射頭，
進行電紡。噴射頭接直流高壓電場，電壓為正15千伏，噴射頭與接收物間距離控制在 10cm，溶液流速6mL/h，接受裝置接地。玉米蛋白纖維無規(guī)堆積得到纖維膜。一4一
將玉米蛋白纖維膜依次浸泡在0.01 mol/L乙酸溶液中30分鐘，0.5 mol/L氯化鈣溶液中30分鐘，0.3 mol/L磷酸二氫銨溶液中30分鐘。浸泡完成后取出纖維膜，經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，得到礦化玉米蛋白纖維膜。用掃描電鏡觀察纖維膜的形態(tài)結構(附圖1)，礦化玉米蛋白纖維直徑在500-800納米之間，表面均勻沉積礦物晶體，經(jīng)X射線衍射(附圖2)確認礦物晶體為羥基磷灰石晶體。實施例2將5克玉米蛋白溶于IOmL甲醇和水的混合溶劑中，甲醇和水的體積比為60 :40，配成50% (w/v)的高分子溶液，加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到噴射頭，進行電紡。 噴射頭接直流高壓電場，電壓為正10千伏，噴射頭與接收物間距離控制在10cm，溶液流速 20mL/h，接受裝置接地。玉米蛋白纖維無規(guī)堆積得到纖維膜。玉米蛋白纖維膜在2. 5 wt% 戊二醛溶液中交聯(lián)M小時后，浸泡在0.02 mol/L乙酸溶液中30分鐘。交聯(lián)玉米蛋白纖維膜依次浸泡在0. 5 mol/L氯化鈣溶液中30分鐘，0. 3 mol/L磷酸二氫鈉溶液中30分鐘，并以此為一個循環(huán)，浸泡3個循環(huán)。浸泡完成后取出纖維膜，經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，得到礦化玉米蛋白纖維膜。實施例3將4克玉米蛋白溶于10 mL乙醇和水的混合溶劑中，乙醇和水的體積比為70 :30，配成40% (w/v)的高分子溶液，加入1. 5 mL 0. 05mg/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2) 的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。將混合溶液加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到噴射頭，進行電紡。噴射頭接直流高壓電場，電壓為負12千伏，噴射頭與接收物間距離控制在10 cm, 溶液流速6 mL/h，接受裝置接地。玉米蛋白纖維浸泡在0.01 mol/L乙酸溶液中20分鐘后， 依次浸泡在0. 15 mol/L氯化鈣溶液中15分鐘，0. 09 mol/L磷酸二氫銨溶液中15分鐘，并以此為一個循環(huán)，浸泡3個循環(huán)。浸泡完成后取出纖維膜，經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，得到礦化玉米蛋白纖維膜。實施例4將4克玉米蛋白溶于IOmL異丙醇和水的混合溶劑中，異丙醇和水的體積比為90 :10，配成40% (w/v)的高分子溶液，加入1.5 mL 1.0 wt%的透明質(zhì)酸(平均分子量為10萬)水溶液，攪拌均勻，將混合溶液加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B
接到噴射頭，進行電紡。噴射頭接直流高壓電場，電壓為負20千伏，噴射頭與接收物間距離控制在10cm，溶液流速4mL/h，接受裝置接地。玉米蛋白纖維無規(guī)堆積得到纖維膜。玉米蛋白纖維膜浸泡在0.1 mol/L乙酸溶液中60分鐘，隨后依次浸泡在1.5 mol/L氯化鈣溶液中10分鐘，0.9 mol/L磷酸氫二鉀溶液中10分鐘。浸泡完成后取出纖維膜，經(jīng)反復水洗、 冷凍干燥后，得到礦化玉米蛋白/透明質(zhì)酸復合纖維膜。實施例5將3. 5克玉米蛋白溶于IOmL乙醇和水的混合溶劑中，乙醇和水的體積比為80 20,配成35% (w/v)的高分子溶液，加入5mL絲蛋白水溶液，攪拌均勻，將混合溶液加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到噴射頭，進行電紡。噴射頭接直流高壓電場，電壓為負15千伏，噴射頭與接收物間距離控制在10cm，溶液流速2mL/h，接受裝置接地。玉米蛋白/絲蛋白纖維無規(guī)堆積得到纖維膜。玉米蛋白/絲蛋白纖維膜在濃度為5%的二苯基甲烷二異氰酸酯的四氫呋喃溶液中交聯(lián)M小時，取出后洗凈后真空干燥。交聯(lián)玉米蛋白/絲蛋白纖維膜依次浸泡在0. 05 mol/L氯化鈣溶液中20分鐘，0. 03 mol/L磷酸二氫鈉溶液中20分鐘， 并以此為一個循環(huán)，浸泡5個循環(huán)。浸泡完成后取出纖維膜，經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，得到礦化玉米蛋白/絲蛋白復合纖維膜。實施例6由實施例2得到的礦化玉米蛋白纖維膜進行細胞粘附性和增殖率實驗。納米纖維多孔膜平鋪于M孔培養(yǎng)板中，分別將細胞或大鼠成骨細胞以 5 X 104/mL細胞密度接種于M孔培養(yǎng)板中，在37 ° C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6小時和72小時后，加入MTT液并在酶標儀上測定細胞OD57tlnm值。表1細胞粘附性實驗測定結果廠士 S，n = 3)
試驗材料OD值細胞粘附率(％)材料0. 288 ±0. 00991. 0空白對照組(培養(yǎng)板)0. 315±0. 005100
權利要求
1.一種礦化玉米蛋白纖維膜，其特征在于該纖維膜是由含有機成分和礦物質(zhì)的納米纖維無規(guī)堆積而成，所述有機成分是玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白，所述礦物質(zhì)是鈣磷鹽晶體。
2.根據(jù)權利要求1所述的礦化玉米蛋白纖維膜，其特征在于玉米蛋白纖維或含有添加劑的玉米蛋白纖維的直徑為20納米-10微米，纖維膜的孔尺寸為100納米-100微米。
3.根據(jù)權利要求1所述的礦化玉米蛋白纖維膜，其特征在于鈣磷鹽晶體為羥基磷灰石。
4.根據(jù)權利要求1所述的礦化玉米蛋白纖維膜，其特征在于添加劑是細胞生長因子、 骨生長因子、維生素、多肽、酶中的一種或多種物質(zhì)的混合物，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的 0. 01%-10%。
5.根據(jù)權利要求1所述的玉米蛋白納米纖維多孔膜，其特征在于添加劑是明膠、膠原、纖維蛋白、彈性蛋白、絲蛋白、藻酸鹽、甲殼素、甲殼素衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、葡聚糖、肝素、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種物質(zhì)的混合物，或者是至少以下任意兩種單體的共聚物的一種L-丙交酯、D, L-丙交酯、乙交酯、 己內(nèi)酯、丁內(nèi)酯、戊內(nèi)酯、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、氨基酸，添加劑的含量為玉米蛋白質(zhì)量的 0. 1%-30%。
6.一種如權利要求1所述的礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法，其特征在于所述方法依次包括下列步驟1)將玉米蛋白溶于溶劑中，得到電紡溶液；或?qū)⑻砑觿┤苡谟衩椎鞍兹芤褐校玫诫娂徎旌先芤?，加入儲罐中，通過泵或?qū)Ч苓B接到一個或多個噴射頭，噴射頭接直流高壓電場， 電壓為正或負1千伏-50千伏，接受裝置接地，進行電紡，制得玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白纖維，纖維無規(guī)堆積得到纖維膜，2)將步驟1)制備的纖維膜浸泡在摩爾濃度為0.001~1 mol/L的乙酸溶液中1_60分鐘，3)將步驟2)處理過的纖維膜依次浸泡在含鈣離子的溶液1-60分鐘、含磷酸根的溶液中1-60分鐘，鈣離子的摩爾濃度為0.005~5mol/L，磷酸根離子的濃度為0.003 3 mol/L, 鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1:2 3:1，4)以步驟3)為一個循環(huán)，循環(huán)1-5次，纖維膜經(jīng)反復水洗、冷凍干燥后，即可得礦化玉米蛋白纖維膜。
7.根據(jù)權利要求6所述的礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法，其特征在于步驟1)制備的纖維膜為交聯(lián)或不交聯(lián)。
8.根據(jù)權利要求7所述的礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法，其特征在于交聯(lián)所用的交聯(lián)劑是醛、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷、二異氰酸酯、碳化二亞胺中的一種或多種的混合物。
全文摘要
礦化玉米蛋白纖維膜由含有機成分和礦物質(zhì)的納米纖維無規(guī)堆積而成，其中有機成分是玉米蛋白或含有添加劑的玉米蛋白，礦物質(zhì)是鈣磷鹽晶體。玉米蛋白纖維或含有添加劑的玉米蛋白纖維的直徑為20納米-10微米，纖維膜的孔尺寸為100納米-100微米。礦化玉米蛋白纖維膜的制備方法為將玉米蛋白溶于溶劑中，進行電紡，制得無規(guī)堆積的纖維膜。將制備的纖維膜依次浸泡在乙酸溶液、含鈣離子溶液、含磷酸根溶液中一定時間，鈣離子與磷酸根離子的摩爾比為1:2~3:1。纖維膜經(jīng)反復浸泡、水洗、冷凍干燥后，即可得礦化玉米蛋白纖維膜。
文檔編號D01F11/02GK102154786SQ20111010261
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權日2011年4月25日
發(fā)明者吳菲菲, 姚琛, 李新松, 李月玲 申請人:東南大學