專利名稱：用于紙漿生物漂白的漆酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學領(lǐng)域。本文提供的是分離的漆酶和編碼它們的核酸。也提供用于漆酶反應(yīng)的介質(zhì)。本文也提供使用漆酶以氧化木素和其它酚類和芳香族化合物的方法，例如用于在高溫和pH條件下對木漿進行生物漂白和脫色以促進漂白化學物質(zhì)使用的實質(zhì)性減少，以及用于纖維處理。相關(guān)技術(shù)的描述木質(zhì)纖維是多層結(jié)構(gòu)，主要由纖維素、半纖維素和木素組成。木素是酚類化合物的不溶性復合聚合物?？蛇_90%的木素在打漿過程中被溶解和去除。殘留的木素是導致紙漿中顏色殘留的主因，并且必須通過氧化降解或漂白去除。所述漂白過程需要應(yīng)用能量密集型的苛刻化學物質(zhì)和條件。使用在漂白過程中起輔助作用的酶能減少使用漂白化學物質(zhì)，增加紙漿廠的能效，并且由于減少化學廢物流而具有環(huán)境益處。絲狀真菌能通過幾種分泌酶類的作用而有效降解木素。這些之中，對于紙漿生物漂白的應(yīng)用，漆酶很具吸引力。漆酶是多銅氧化酶，其結(jié)合了芳香族化合物的直接氧化和分子氧還原為水。在木素降解期間，漆酶被認為作用于小酚醛木素片段，其然后與木素聚合物反應(yīng)使其降解?？蛇x地，可以提供人工介質(zhì)化合物以加速脫木質(zhì)化過程。木材制漿過程可以包括堿性條件。然而，最有名的漆酶是酸性酶。僅有少數(shù)中性或堿性漆酶被報道；對于酹類底物，來自Rhus vernificera的漆酶具有pH_(最適pH)9,而來自Melanocarpus albomyces的酶具有中性的pH。#。不過,這兩種漆酶都僅能氧化相對低的氧化還原電位介質(zhì)，其不可能氧化木素。在紙漿生物漂白應(yīng)用中，漆酶也有可能被暴露于相對高溫度。需要在一般打漿過程的高溫和PH條件下具有良好功能的漆酶。發(fā)明概述一些實施方式涉及漆酶多肽。特別是，一些實施方式涉及分離的多肽，其包含SEQID NOs :2和4的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NOs :2和4的氨基酸序列組成或由SEQ IDNOs :2和4的氨基酸序列組成。一些實施方式提供漆酶多肽的變體。例如，一些實施方式涉及分離的多肽，包含這樣的氨基酸序列、基本由其組成或由其組成所述氨基酸序列與SEQ ID NOs :2和4的多肽氨基酸序列具有至少80 %、85%、90 %、95%、96 %、97%、98 %或99%的序列同一性。在一些實施方式中，所述分離的多肽具有漆酶活性，能在PH大于或等于8的條件下氧化木素，并且在大于或等于60°C下，保持漆酶活性至少約5分鐘。一些實施方式涉及SEQ ID NO :4的變體，其具有至少一個氨基酸取代，其中SEQ IDNO :4中的至少一個取代的位置是選自氨基酸殘基162、163、164、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、208、210、212、213、214、215、216、218、313、314、315、316、317、318、319、320、321、351、352、353、354、452、454、470、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、540、541、542、545、546、547、572、573、574、575、576、577、578、579、597、598、599、603、604、605、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、616、618、619和620，或其任意組合。在一些實施方式中，所述漆酶多肽變體缺少其連接的信號肽，而在其它實施方式中，所述漆酶多肽或漆酶多肽變體包括信號序列。本文還提供多核苷酸，其編碼本文公開的漆酶多肽和漆酶多肽變體。一些實施方式提供分離的多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO :2或4的多肽或其變體的序列、基本由編碼SEQ ID NO :2或4的多肽或其變體的序列組成或由編碼SEQ ID NO :2或4的多肽或其變體的序列組成。例如，一些實施方式涉及多核苷酸，其包含SEQ ID NO :1或3的核酸序列、基本由SEQ ID NO :1或3的核酸序列組成或由SEQ ID NO :1或3的核酸序列組成。—些實施方式涉及漆酶多核苷酸變體。本文提供的一些實施方式提供多核苷酸序列，其與SEQ ID NO :1或3的多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，其中所述多核苷酸編碼具有漆酶活性的多肽，能在pH大于或等于pH 8的條件下氧化木素，并且在大于或等于60°C下，保持漆酶活性至少約5分鐘。其它實施方式涉及能介導漆酶反應(yīng)的化合物。這些化合物被稱作“介質(zhì)”。一些實施方式涉及由式I表示的化合物
權(quán)利要求
1.分離的多肽， 其如SEQ ID NO :2的氨基酸序列所闡明，其中所述分離的多肽具有漆酶活性，在大于或等于PH 8. O的pH條件下氧化木素，并且在大于或等于60°C下，保持漆酶活性至少約5分鐘以上。
2.權(quán)利要求I所述的分離的多肽，其中所述多肽為SEQID NO 2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1-2中任一項所述的分離的多肽，其缺乏其結(jié)合信號肽。
4.分離的多核苷酸， 其如SEQ ID NO :1的序列所闡明，其中所述多核苷酸編碼具有漆酶活性的多肽，在大于或等于pH 8. O的pH條件下氧化木素，并且在大于或等于60°C下，保持漆酶活性至少約5分鐘。
5.權(quán)利要求4所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸為編碼SEQID N02的多肽的序列。
6.權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸,其中所述分離的多核苷酸為SEQID N0:1的多核苷酸序列。
7.介導酚類或芳香類底物的氧化的方法，包括 (a)使所述酚類底物與介質(zhì)接觸，其中所述介質(zhì)是由式I或式II表示的化合物，其中式I由下式表示
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述介質(zhì)是& H
9.使包含木素的組合物脫木素的方法，其包括 使所述組合物與權(quán)利要求I所述的多肽接觸。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述組合物進ー步包括酚類或芳香類底物。
11.權(quán)利要求9或10所述的方法，進ー步包括使所述組合物與介質(zhì)接觸。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述介質(zhì)是由式I或式II表示的化合物。 '人,
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述介質(zhì)是彡k H F3C^。
14.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述介質(zhì)選自紫尿酸；2，6，6_四甲基哌啶-I-基氧(TEMPO) ;I-羥基苯并三唑(HBT) ；2,2/ -連氮-雙(3-こ基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；丁香醛連氮；N-苯甲酰-N-苯基羥胺(BPHA) ;N-羥基鄰苯ニ甲酰亞胺、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；10-(3-ニ甲氨基丙基)吩噻嗪；1，8-ニ羥基-4，5-ニ硝基蒽醌；吩噁嗪；蒽醌；2_羥基-1，4-萘醌；吩噻嗪；蒽酮；蒽；1，5_ニ羥蒽醌；脫氧茜素；ニ甲氧基苯酚(DMP)；阿魏酸；兒茶素；表兒茶素；高香草酸(HMV);和2，3_ ニ羥基苯甲酸(2，3-DHB);或其任何組ムロ ο
15.氧化包含纖維的組合物的方法，其包括 通過使所述組合物與權(quán)利要求I所述的多肽接觸。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物進ー步包括酚類或芳香類底物。
17.權(quán)利要求15或16所述的方法，進ー步包括使所述組合物與介質(zhì)接觸。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述介質(zhì)是由式I或式II表示的化合物。
O Η0、人 N-
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述介質(zhì)是メL H F3C^ り
20.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述介質(zhì)選自紫尿酸；2，6，6_四甲基哌啶-I-基氧(TEMPO) ;I-羥基苯并三唑(HBT) '2,2'-連氮-雙(3-こ基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；丁香醛連氮；N-苯甲酰-N-苯基羥胺(BPHA) ;N-羥基鄰苯ニ甲酰亞胺、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；10-(3-ニ甲氨基丙基)吩噻嗪；1，8-ニ羥基-4，5-ニ硝基蒽醌；吩嗯嗪；蒽酮；2_羥基-1，4-萘醌；吩噻嗪；蒽酮；蒽；1，5_ニ羥蒽醌；脫氧茜素；ニ甲氧基苯酚(DMP)；阿魏酸；兒茶素；表兒茶素；高香草酸(HMV);和2，3_ ニ羥基苯甲酸(2，3-DHB);或其任何組
21.漂白包含紙漿或紙的組合物的方法，其包括 使所述組合物與權(quán)利要求I所述的多肽接觸。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物進ー步包括酚類或芳香類底物。
23.權(quán)利要求21或22所述的方法，進ー步包括使所述組合物與介質(zhì)接觸。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述介質(zhì)是由式I或式II表示的化合物。
25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述介質(zhì)是
26.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述介質(zhì)選自紫尿酸；2，6，6_四甲基哌啶-I-基氧(TEMPO) ;I-羥基苯并三唑(HBT) ；2,2/ -連氮-雙(3-こ基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；丁香醛連氮；N-苯甲酰-N-苯基羥胺(BPHA) ;N-羥基鄰苯ニ甲酰亞胺、3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4-酮；10-(3-ニ甲氨基丙基)吩噻嗪；1，8-ニ羥基-4，5-ニ硝基蒽醌；吩噁嗪；蒽醌；2_羥基-1，4-萘醌；吩噻嗪；蒽酮；蒽；1，5_ニ羥蒽醌；脫氧茜素；ニ甲氧基苯酚(DMP)；阿魏酸；兒茶素；表兒茶素；高香草酸(HMV);和2，3_ ニ羥基苯甲酸(2，3-DHB);或其任何組ムロ ο
全文摘要
本發(fā)明涉及用于紙漿生物漂白的漆酶。本文提供了分離的漆酶和編碼它們的氨基酸。也提供了用于漆酶反應(yīng)的介質(zhì)。本文也提供了使用漆酶以氧化木素和其它酚類和芳香族化合物的方法，如用于在高溫和pH條件下木漿的生物漂白和脫色，以促進實質(zhì)性減少漂白化學物質(zhì)的使用，以及用于纖維的處理。
文檔編號D21C9/10GK102634491SQ20111037864
公開日2012年8月15日 申請日期2007年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日
發(fā)明者D·羅伯特松, G·德桑提斯, J·S·克羅沃, O·科克斯, P·盧詹布爾, R·麥克坎, S·哈雷姆扎, T·哈比徹 申請人:巴斯夫歐洲公司, 維萊尼姆公司