專利名稱：一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米纖維膜的制備領(lǐng)域，特別涉及一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法。
背景技術(shù)：
自從1991年Iijima發(fā)現(xiàn)碳納米管以來，由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)受到了人們的廣泛關(guān)注。碳納米管是由類似石墨結(jié)構(gòu)的六邊形網(wǎng)格卷繞而成的、同軸中空“微管”，兩端的“碳帽”由五邊形或七邊形網(wǎng)格參與封閉。根據(jù)石墨層片數(shù)的不同，可以分為單壁碳納米管(SWCNT)、雙壁碳納米管(DWCNT)和多壁碳納米管(MWNT)。碳納米管具有良好的導(dǎo)電性，若將其加入到高分子材料中，可使高聚物的電阻降低三個(gè)數(shù)量級以上。碳納米管的尖端具有納米尺度的曲率，是極佳的發(fā)射電極。研究表明碳納米管不僅對多巴胺、NADH以及 抗壞血酸具有良好的電催化活性，而且對蛋白質(zhì)和各種酶也具有良好的電子傳遞作用。靜電紡纖維膜是一種優(yōu)良的酶固定化載體，碳納米管的摻入會(huì)進(jìn)一步提高這種載體的性能，如機(jī)械性能、化學(xué)穩(wěn)定性和導(dǎo)電性等。在電化學(xué)生物傳感器中，碳納米管被用于修飾電極表面以加快酶活性中心與電極之間的電子傳遞速率。因此纖維載體中的碳納米管也有可能會(huì)促進(jìn)固定化氧化還原酶與底物之間的電子轉(zhuǎn)移，從而提高酶的催化活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備。本發(fā)明的Poly(AN-Co-OVAG)/碳納米管復(fù)合纖維膜作為載體將會(huì)有利于氧化還原酶的固定化，載酶量及酶活性、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜，因?yàn)槠浔砻娴牧u基可為酶的化學(xué)固定提供活性位點(diǎn)，碳納米管會(huì)促進(jìn)催化過程中的電子傳遞，而聚合物鏈與碳納米管強(qiáng)的界面粘合力保證了這種載體的穩(wěn)定性。本發(fā)明的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括(I)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3-4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯；(2)將摩爾比為1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質(zhì)量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質(zhì)量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應(yīng)4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應(yīng)4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產(chǎn)物
6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；(3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG = AN摩爾比為1:20，以過硫酸銨作為引發(fā)齊U，H2O作溶劑，然后于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4-5h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共聚物；
(4)用強(qiáng)氧化性的摩爾比為1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下對多壁碳納米管進(jìn)行表面功能化處理，并將其超聲分散進(jìn)DMF溶劑中；(5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的DMF分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜。 所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開劑的化學(xué)組成相同，為石油醚 和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比9:1，用I2顯色。所述步驟(2)中的0VAG，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。所述步驟(3)中的聚合反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物反復(fù)經(jīng)丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒反應(yīng)的 OVAG。所述步驟(3)中OVAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占Poly(AN-co-OVAG)共聚物質(zhì)量的
7.17%-29. 78%ο所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發(fā)劑濃度為1%，單體OVAG濃度為20g/100mLH2O,聚合溫度為60°C。所述步驟(5)中多壁碳納米管的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜的1%_30%。所述步驟(5)中靜電紡絲參數(shù)為注射器規(guī)格為5ml，直徑14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，靜電壓12-17Kv，接收器為接地鋁箔，接收距離15-20cm。通過本發(fā)明的方法制備的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜應(yīng)用于酶的固定化，包括(I)將空白纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3-4h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，收集洗液和原酶液以測定載酶量；膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中待測活性。(2)將O. lmg/mL的酶溶液置于一定溫度的水浴中恒溫，每間隔一段時(shí)間，用移液槍取出O. 03mL測定其活性。將多份相同質(zhì)量的固定化酶膜分別儲(chǔ)存于PBS中，置于一定溫度的水浴中恒溫，每間隔一段時(shí)間，取出一份固定化酶膜測定其活性。以未經(jīng)溫度處理的酶活性為100%，通過考察酶殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的熱穩(wěn)定性。(3)選用不同pH值的緩沖溶液配制底物溶液，測定游離酶和固定化酶的活性。以最高活性為100%，得出相應(yīng)的酶活(enzyme activity) (%)。其中，pH為4. O和5. O的緩沖體系為酯酸/酯酸鈉溶液，pH為6. 5,7. 0,7. 5,8. O的緩沖體系為PBS，pH為9. O的緩沖體系為硼砂/磷酸二氫鉀溶液。(4)將游離酶溶液(O. lmg/mL)和一批處于濕態(tài)的固定化酶膜置于4°C下保存，間隔一段時(shí)間取出一份樣品測定其活性。以未經(jīng)保存處理的酶活性為100%，通過考察酶殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。步驟(I)中固定化所用的過氧化氫酶的濃度為O. lmg/mL,固定化酶膜保存于4°C、pH為7.4的PBS緩沖液中。步驟(2)中在20-70 °C測定固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性，分別在O,20，40，60，80，100，120min 測定酶的活性。步驟(3)中pH范圍在4-9，其中，pH為4. O和5. O的緩沖體系為醋酸/醋酸鈉溶液，pH為6. 5,7. 0,7. 5,8. O的緩沖體系為PBS，pH為9. O的緩沖體系為硼砂/磷酸二氫鉀溶液。步驟 (4)中通過測定固定化酶與游離酶在30d中的殘留活性來測定酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。碳納米管具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，可促進(jìn)催化過程中的電子傳遞，有利于過氧化氫酶的固定；Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜中，Poly (AN-co-OVAG)共聚物表面的羥基可為酶的化學(xué)固定提供活性位點(diǎn)，聚合物鏈與碳納米管強(qiáng)的界面粘合力保證了這種膜載體的穩(wěn)定性。有益.效果本發(fā)明在固定化氧化還原酶方面具有特殊意義，本發(fā)明制備的Po I y (AN-CO-OVAG) /MWCNTs復(fù)合納米纖維固定化酶膜載酶量及酶活性、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜，PH耐受性高于游離酶，這主要是由于多碳納米管良好的導(dǎo)電性能和良好的生物相容性，碳納米管的加入增加了催化反應(yīng)中的電子傳遞率，并且提高了膜生物相容性，使得固定化酶的催化活性大大提高；本發(fā)明的Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復(fù)合納米纖維膜還具有較好的穩(wěn)定性。


圖I為實(shí)施例I中時(shí)間對Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復(fù)合納米纖維膜載酶量及酶活性的影響。圖2為對比例中時(shí)間對Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜載酶量及酶活性的影響。圖3為對比例、實(shí)施例2中，在60°C條件下120min內(nèi)游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性。圖4為對比例、實(shí)施例3中，在pH=4_9條件下對游離酶和固定化酶的影響。圖5為對比例、實(shí)施例4中，在4°C條件下30day中游離酶與固定化酶的殘留活性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I載酶量與固定化酶活性的測定，具體步驟如下(I)稱取0. 36mol己二酸、2. Ig乙酸汞、0. 07g醋酸銅于250mL圓底燒瓶中，加入150mL乙酸乙烯酯，置于60°C油浴鍋中加熱并攪拌，約5min后加入3_4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，硅膠柱層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯，洗脫劑與展開劑的化學(xué)組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯體積比為9:1，用I2顯色。
(2)稱取12g己二酸二乙烯酯、4g葡萄糖，溶于75-100mL吡啶中，1.5g堿性蛋白酶為催化劑，50°C搖床中反應(yīng)4-5天，過濾、旋蒸后硅膠柱層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖(OVAG)，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇與水的混合物，乙酸乙酯、甲醇與水的體積比為17:3:1，用I2顯色。(3)在反應(yīng)瓶中加入丙烯腈AN和0VAG，以過硫酸銨(占葡萄糖乙烯脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1%)作為引發(fā)劑，H2O作溶劑(OVAG濃度為20g/mL H2O),然后于60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly (AN-co-OVAG )共聚物；(4)用強(qiáng)氧化性的混合酸(硫酸/硝酸)在40°C下處理多壁碳納米管，并將其超聲分散進(jìn)DMF溶劑中；(5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜，其中多壁碳納米管的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs 復(fù)合納米纖維膜的 30% ；(6)將5. OOmg的空白纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的O. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，每反應(yīng)I. 5h取出固定化酶膜，用PBS反復(fù)沖洗，收集洗液和原酶液以測定載酶量(Enzyme loading) (mg enzyme/mg mesh);固定化酶膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中以測定其活性，以最高活性為100%，得出相應(yīng)的酶活(enzyme activity) (%)，如圖 I。實(shí)施例2固定化酶熱穩(wěn)定性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的O. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，最后將膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)將O. I mg/mL的過氧化氫酶溶液置于60°C的水浴中恒溫，以未經(jīng)溫度處理酶活性為100%，每間隔20min，用移液槍取出0. 03mL測定其殘留活性。殘留活性(Residualactivity)的計(jì)算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :殘留活性(%)，At t時(shí)間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的熱穩(wěn)定性。(3)將多份相同質(zhì)量的固定化酶膜分別儲(chǔ)存于PBS中，置于60°C的水浴中恒溫，以未處理酶活性為100%，每間隔20min，取出一份固定化酶膜測定其殘留活性。殘留活性(Residual activity)的計(jì)算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中 Ra :殘留活性(%), At :t 時(shí)間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的熱穩(wěn)定性。如圖3。實(shí)施例3固定化酶pH耐受性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，最后將膜保存至IJ 40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)選用pH=4_9的緩沖溶液配制底物溶液，測定游離酶和固定化酶的活性，以最高活性為100%,得出相應(yīng)的酶活(enzyme activity) (%),如圖4。從圖4中可以看出，經(jīng)Poly (AN-co-OVAG)和Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復(fù)合納米纖維膜膜固定的過氧化氫酶對pH的耐受性相差不大,但經(jīng)固定化后pH穩(wěn)定范圍變寬(pH6. 0-8. O)，而游離酶只在PH6. 5-7. 5之間具有較高的穩(wěn)定性。實(shí)施例4固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，最后將固定化酶膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)將游離酶溶液(0. lmg/mL)和一批處于濕態(tài)的固定化酶膜置于4°C下保存，以 未經(jīng)保存處理酶活性為100%，每隔2. 5天取出一份樣品測定其活性。殘留活性(Residualactivity)的計(jì)算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :殘留活性(%)，At t時(shí)間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時(shí)間的變化，研究酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，如圖5。對比例(I)將5. OOmg Poly (AN-CO-0VAG)/OVAG超細(xì)納米纖維膜用環(huán)氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，最后將膜保存到4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)方法同測定固定于Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜上的酶，測定固定到對比例(I)中提到的膜上的酶的載酶量與酶活力、熱穩(wěn)定性、PH耐受性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性，如圖2，3,4,50
權(quán)利要求
1.一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括下列步驟 (1)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質(zhì)量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3_4滴濃硫酸，反應(yīng)至溶液變得藍(lán)色澄清，層析分離產(chǎn)物己二酸二乙烯酯； (2)將摩爾比為1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質(zhì)量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質(zhì)量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應(yīng)4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產(chǎn)物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ； (3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG= AN摩爾比為1:20，以過硫酸銨作為引發(fā)劑，H2O作溶劑，然后于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4-5h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共 聚物； (4)用強(qiáng)氧化性的摩爾比為1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下對多壁碳納米管進(jìn)行表面功能化處理，并將其超聲分散進(jìn)DMF溶劑中； (5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的DMF分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開劑的化學(xué)組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比9:1，用I2顯色。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的0VAG，其粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的聚合反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物反復(fù)經(jīng)丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒反應(yīng)的OVAG0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中OVAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占Poly(AN-co-OVAG)共聚物質(zhì)量的7. 17%-29. 78%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發(fā)劑濃度為1%，單體OVAG濃度為20g/IOOmLH2O,聚合溫度為60°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中多壁碳納米管的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為占Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜的1%_30%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中靜電紡絲參數(shù)為注射器規(guī)格為5ml，直徑14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，靜電壓12-17Kv，接收器為接地鋁箔，接收距離15-20cm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括(1)制備Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物；(2)共價(jià)法對多壁碳納米管MWCNT進(jìn)行表面功能化處理，并將其超聲分散進(jìn)DMF溶劑中；(3)將Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物在常溫下溶解于多壁碳納米管的分散液中，通過靜電紡絲制備得到Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜。本發(fā)明的Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復(fù)合納米纖維膜載酶量、酶活性、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜；pH耐受性高于游離酶。
文檔編號D01F1/10GK102776599SQ20121023806
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者劉中青, 朱利民, 權(quán)靜, 李艷, 王蕾 申請人:東華大學(xué)