專利名稱：：包含法呢烷和法呢烷衍生物的燃料組合物及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：除了別的以外，本發(fā)明包括柴油燃料和噴氣燃料等燃料組合物。具體地，本發(fā)明包括包含法呢烷的燃料組合物，以及制備和使用該種燃料組合物的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括穩(wěn)定的燃料組合物，其包含簡單有效地生成的、至少部分來自微生物的法呢烷。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含高濃度生物工程化法呢烷的燃料組合物。
背景技術(shù)：
：在過去幾十年來，由于對石油價(jià)格不斷上漲、迫切的供應(yīng)限制以及全球二氧化碳排放量上升的擔(dān)憂，生物生產(chǎn)的燃料("生物燃料")受到了諸多關(guān)注。與諸如石油和煤等不可再生的天然能源不同，生物燃料來自于可再生的天然來源，通常為活的有機(jī)體及其代謝副產(chǎn)物、迄今為止，適用于柴油發(fā)動機(jī)等內(nèi)燃機(jī)的生物燃料通常來自于植物油。所謂的第一代"生物柴油"通常為由植物油轉(zhuǎn)酯形成的C16-Cw脂肪酸甲酯。最近，通過如NExBTL工藝(披露于W(:)2()06/()75057)等新型工藝生產(chǎn)了第二代"生物柴油"，其通過氯化植物油或動物脂肪以獲取相應(yīng)的烷烴或石蠟':.由于該起始原料的性質(zhì)，兩種方法均生成了可能隨批次變化的復(fù)雜的不均勻的產(chǎn)品混合物。這種產(chǎn)品的變化性使得生產(chǎn)具有特定規(guī)范或要求的燃料變得比較復(fù)雜。因此，需要燃料添加劑和燃料組分來制備燃料組合物，并需要能用于例如柴油發(fā)動機(jī)和噴氣發(fā)動機(jī)的可簡單制備并具有可再生性的燃豐f組分。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含類異戊二烯或其衍生物的燃料組合物、燃料組分或燃料添加劑，及其制備和使用方法。這些組合物的實(shí)施方案被認(rèn)為能夠滿足上述需求。更特別地，類異戊二晞及其衍生物可用作該燃料組合物中的燃料組分。在某些實(shí)施方案中，該類異戊二烯或其衍生物可被用作該燃料異戊二烯及其衍生物可從微生物(包括生物工程化微生物)制備得到。本發(fā)明所公開的燃料組合物可用作內(nèi)燃機(jī)，如汽油發(fā)動機(jī)、柴油發(fā)動機(jī)和噴氣發(fā)動才'L的燃-料。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有一種或多種生物工程化燃料組分的柴油燃料。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有--種或多種生物工程化燃料組分的噴氣燃料。在這些實(shí)施方案中，該生物工程化燃料組分可由任意能夠生成該生物工程化燃料組分的微生物，例如遺傳工程化微生物、野生型微生物或選擇的其菌抹生成。在某些實(shí)施方案中，該生物工程化燃料組分為本發(fā)明所公開的類異戊二烯或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，所述生物工程化燃料組分可來自容易獲得的、可再生的材料。令人注目的是，本發(fā)明從而提供了容易獲得的、可再生的能源，以及使用它們進(jìn)行能量生產(chǎn)的方法。在某些實(shí)施方案中，該生物工程j匕燃料組分可來自糖，例如單糖或二糖。在某些其它實(shí)施方案中，所述生物工程化燃料組分可來自容易獲得的非發(fā)酵性碳源，例如醋酸鹽或甘油。圖1是生成異戊烯基焦磷酸("〖PP")的甲羥戊酸("MEV")途徑的示意圖。圖2是生成IPP和二甲基丙'陣焦磷酸脂("DMAPP")的DXP途徑的示意圖,,:Dxs為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶;Dxr為卜脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(也稱為IspC);Isp:D為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspE為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；1spF為2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-環(huán)二磷酸合成酶；IspG為1-羥基-2-甲基-2-(E)-T烯基—4-二磷酸合成酶(I:spG);ispH為異戊烯基/二甲基蹄丙基二磷酸合成酶。圖3顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM97的圖譜。圖4顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM4()8的圖譜。圖5顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM424的圖譜。圖6A-E顯示了載體pAM489的ERG20-PGAL-tHMGR插入物、載體pAM49:l的ERG13-PGA,tHM:GR插入物、栽體pAM:493的IDII-PGAL4HMGR插入物、載體pAM495的E.RG10-PGAL-ERG12插入物、以及載體pAM.497的ERG8-PGAL-ERG19插入物的圖譜。圖7顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM373和pAM342的圖譜。圖8顯示了表達(dá)質(zhì)粒pAM4()4的圖譜。圖9顯示了來自BPWhiting煉油廠的2號柴油以及5%、2《)％和50%法呢烷(AMD-2()())與該燃料的混合物的ASTM[)975測試數(shù)據(jù),圖10顯示了來自BPCarson煉油廠的滿足美國加外'!空氣資源理事:會(Ca:lioraiaAirResourcesBoard)要求的柴油燃料(CAR:B燃料)以及5%、2()%、50%和65%法呢烷混合物(AMD-200與該燃料)的ASTMD975測試數(shù)據(jù)。CARB燃料的該具體樣本不包含通常存在于CARB燃料中的潤滑增強(qiáng)劑。圖11A-B顯示了與不同量法呢烷(AMD-200)混合的2號柴油和CARB柴油的蒸餾曲線。定義由ASTM國際公布的ASTMD975規(guī)范對在美國使用的不同等級柴油燃料提出了一些最低驗(yàn)收要求。例如，2-D級超低疏柴油燃料應(yīng)具有以重量計(jì)最大().()5%的疏含量(根據(jù)ASTMD2622測試)，以重量計(jì)最大.(:),()〗％的灰分含量(根據(jù)ASTMD482測試)，最小為40的十六烷值(根據(jù)ASTMD6079測試)，在4(rC下從1.9eSt至2.4cSt的粘度(根據(jù)ASTMI:)445測試)，以及最小為52i:的閃點(diǎn)。日本和歐洲對于等級相當(dāng)?shù)牟裼腿剂暇哂信c美國類似的柴油燃料規(guī)范。例如，日本的JISK2204中，2級柴油燃料應(yīng)在4(rC:下'具有2.0cSt的最低粘度，具有以重量計(jì)最大0.()5%的硫含量，以及最小為45的十六烷值。與之相應(yīng)地，在歐洲的CEN590中，A-F級柴油燃料應(yīng)在40"C下具有2.0cSt至4.5cSt的粘度，具有以重量計(jì)最大0.05%的疏含量，以及最小為49的十六烷值。在一些實(shí)施方案中，本發(fā).明所公開的燃料組合物滿足上述屬性的至少一個(gè)或全部。由ASTM國際公布的ASTMD1655規(guī)范對.letA提出了一些最低驗(yàn)收要求o"灰分含量"指柴油燃料在ASTMD482所述的條件下燃燒后剩余的殘留物的數(shù)量。"生物柴油"指各種來自生物來源(例如植物油或動物脂肪)的柴油燃料。生物柴油主要指烷基酯的混合物，包括由油和甲醇轉(zhuǎn)酯后得到的脂肪酸甲酯。盡管大豆油是生物柴油的最大來源，但來自其它植物或動物脂肪的油"生物工程化燃料組分"指至少部分由宿主細(xì)胞，包括任意的古細(xì)菌、細(xì)菌或真核細(xì)胞生成的燃料組分。"生物燃料"指來自于生物量(biomass)(即存活的有機(jī)體或其代謝副產(chǎn)物，例如牛的肥料)的任意燃料。與其它天然來源如石油、煤和核燃料不同，它是一種可再生能源。"C15類異戊二烯起始原料"指法呢基焦磷酸("FPP")或能夠由:F:PP衍生的化合物。"十六烷值"指在ASTM:D613所述的條泮下燃料開始燃燒(自燃)的容易度。具有高十六烷值的燃料會在注入圓筒后短時(shí)間內(nèi)燃燒，它具有短著火延遲期。相反地，具有低十六烷值的燃料不易自燃，其具有較長的著火延遲期。"濁點(diǎn)"指在ASTMD2500所述的條件下冷卻時(shí)燃料樣衣中首次出現(xiàn)蠟晶濁斑的溫度。"冷濾堵塞點(diǎn)"(CFPP)指燃料在設(shè)定時(shí)間段內(nèi)首次無法通過鐵絲網(wǎng)時(shí)的溫度的大約指示。ASTMD6371測試模擬了燃料系統(tǒng)中冷卻的燃料通過過濾器的流動。因此，CF:PP是燃料的動力學(xué)冷流屬性的量度。"柴油燃料"指適用于柴油發(fā)動機(jī)的燃料，在柴油發(fā)動機(jī)中該燃料髙壓下經(jīng)空氣加熱引燃。柴油燃料的類別包括具有較大分予量范圍的烴類。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的柴油燃料包括包含至少15個(gè)碳的烴一在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的柴油燃料包括包含至少15個(gè)碳的烴、包含至少3個(gè)碳的醇、包含至少10個(gè)碳的脂肪酸酯，及其混合物。柴油燃料的類型包括但不限于石油柴油、生物柴油、生物工程化柴油或其混合物。柴油燃料還可從合成燃料，例如頁巖油或Fischer-Tropsch燃料，如由合成氣和煤液化物衍生的燃料中獲得?；蚱淞Ⅲw異構(gòu)體。在--些實(shí)施方案中，法呢烷包括基本純的法呢烷立體異構(gòu)體。在其它實(shí)施方案中，法呢烷包括法呢烷的立體異構(gòu)體(例如對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體)的混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方衆(zhòng)中，法呢烷混合物中的每種立體異構(gòu)體的量獨(dú)立地占該法呢烷混合物總重的約0,1wt.M至約99.9wt,%、約0.5wt.(^至約99.5wt.%、約1wt，o至約99wt.%、纟勺5wt，o至約95wt.%、約10wt.。/o至約卯wt.(K,、約20、1.%至約80wt,%。"a-法呢晞"指具有下式的化合物法呢烷"指具有式(III)的化合物:或其立體異構(gòu)體。在一些實(shí)施方案中，a-法呢烯包括基本純的a-法呢烯立體異構(gòu)體。在其它實(shí)施方案中，a-法呢烯包括立體異構(gòu)體(例如，順式-反式異構(gòu)體)的混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，a-法呢蹄混合物中的每種立體異構(gòu)體的量獨(dú)立地占該a-法呢烯混合物總重的約0.1wt,o/o至約99.9wt.%、約0.5wt，o至約99.5wt.%、約1wH至約99wt.%、約5wH至約95wt%、約10wU至約90wt.%、約20wt.%—￡約80wt.%。"(3-法呢烯"指具有下式的化合物"或其立體異構(gòu)體。在一些實(shí)施方案中，P-法呢烯包括基本純的j3-法呢烯立體異構(gòu)體。在其它實(shí)施方案中，(3-法呢蹄包括立體異構(gòu)體(例如，順式-反式異構(gòu)體)的混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，P-法呢烯混合物中的每種立體異構(gòu)體的量獨(dú)立地占該(3-法呢烯混合物總重的約0.1wt.W至約99.9wt.%、約0.5vvt.o/o至約99.5wt.%、約1\\化.％至約99wt.%、約5wt/i至約95wt,%、約10wt，。至約90wt.%、約20wt，。至約80wt,%。"閃點(diǎn)"指在ASTMD93所述的條件下應(yīng)用火源使得柴油燃料上的蒸汽燃燒的最低溫度。"燃料"指--種或多種烴、一種或多種醇、一種或多種脂肪酸酯或其混合物。優(yōu)選地，可使用液體烴。燃料可用于向往復(fù)發(fā)動機(jī)(例如，汽油發(fā)動機(jī)和柴油發(fā)動機(jī))、Wankel發(fā)動機(jī)、噴氣發(fā)動機(jī)、一些火箭發(fā)動機(jī)、導(dǎo)彈發(fā)動機(jī)、以及燃?xì)鉁u輪發(fā)動機(jī)等內(nèi)燃機(jī)提供動力。在一些實(shí)施方衆(zhòng)中，燃料通常包含烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴等烴類的混合物。在一些實(shí)施方案中，燃料包括本發(fā)明所公開的一種或多種Qs類異戊二烯化合物。''燃料添加劑"指向燃料中添加以改變該燃料的性質(zhì)(例如，提高發(fā)動機(jī)性能、燃料處理、燃料穩(wěn)定性、或污染控制)的微量燃料組分，如化學(xué)組分。添加劑的類型包括但不限于抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、十六垸值增進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、潤滑性能改進(jìn)劑、防冰劑、噴射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、清潔劑、反乳化劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合。術(shù)語"常規(guī)添加劑"指除了本發(fā)明的類異戊二烯化合物外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的燃4+添加劑，例如上述燃料添加劑。"燃料組合物"指包含至少兩種燃料組分的燃料。"燃料組分"指用于配制燃料組合物的任意化合物或化合物的混合物。存在"主要燃料組分"和"次要燃料組分"。主要的燃料組分在燃料組合物中至少占50%的體積；而次要燃料組分在燃料組合物中的比例小于50%。燃料添加劑為次要燃料組分。本發(fā)明所公開的類異戊二烯其自身或與其它燃料組分的混合物可作為主要組分或次要組分。"類異戊二烯"和"類異戊二歸化合物"在此可互換，并指由異戊蹄基焦磷酸("IPP")衍生的化合物。"初滯點(diǎn)"和"終沛點(diǎn)"指蒸餾曲線中的點(diǎn)，其與樣本中被加熱樣本而逐漸升高的溫度除去的部分相關(guān)。初始沸點(diǎn)是第--滴液體離開冷凝器時(shí)的沐點(diǎn)溫度，而終沛點(diǎn)是最后一滴液體離開冷凝器時(shí)的沸點(diǎn)溫度。當(dāng)樣本由單個(gè)組分組成時(shí)，該初和終沸點(diǎn)相同，并被稱為"沐點(diǎn)"。ASTM標(biāo)準(zhǔn)D86是測定燃料蒸餾曲線的常用步驟。"噴氣燃料"指適合在噴氣發(fā)動機(jī)中使用的燃料。"煤油"指通常在大氣壓下150"(:〕和275"C之間的石油(也稱為"原油")的特定蒸餾組分。原油主要由石蠟族、環(huán)烷和芳香族的烴組成:，"潤滑性"指柴油燃料在ASTMD6079所述的條件下進(jìn)行高壓滾動點(diǎn)接觸的金屬間接觸過程中對發(fā)動機(jī)元件提供更有效磨損保護(hù)的能力的量度。"石油柴油"指通常在大氣壓下120。C和380°C之間的石油的特定蒸餾組分。在另一實(shí)施方案中，石油柴油為1個(gè)大氣壓下15()"C和37(rc之間的石油的蒸餾組分。"傾點(diǎn)"指燃料可注入容器或從容器移出或者可通過管道流動的最低溫度的大概指示，傾點(diǎn)可在ASTMD97所迷的條件下測定。傾點(diǎn)是確定燃料在較冷氣候下的有用性和適用性的特征之一c"基本純的"化合物的組合物指基本不含一種或多種其它化合物的組合物，即基于該組合物的總體積或總重，該組合物包含大于80%、大f90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%、大于99.5%、大于99.6%、大于99,7%、大于99.8%、大于99.9%的該化合物，或者包含小f().()1%的--種或多種其它化合物。"基本不含"一種化合物的組合物指基于該組合物的總體積或總重，包含少于20%、少于1()%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、少亍1%、少于0.5%、少于0.1%、或少于0.01%的該化合物的組合物。除了上述定義外，本發(fā)明所述的某些化合物具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，其可以作為一種或多種立體異構(gòu)體(例如順式異構(gòu)體、反式異構(gòu)體、E異構(gòu)體和Z異構(gòu)體)存在。在某些實(shí)施方案中，這些作為單獨(dú)立體異構(gòu)體的化合物基本不含其它立體異構(gòu)體。在某些其它實(shí)施方案中，這些化合物為各種立體異構(gòu)體的混合物。"Tx"指根據(jù)A.STM::[)-86(在此通過引用并入本文)，燃料組合物的原始體積的xM被蒸餾時(shí)的蒸餾溫度。例如，"Ti()"、"T5()"和"T90"指根據(jù)ASTMD86，該燃料組合物的原始體積的10%、50%和90%分別被蒸餾時(shí)的蒸餾溫度。"T-iO"、"T50"和'T90"還分別被稱為10vol,M溫度、50vo!.^溫度和90voH溫度。在下文的描述中，本發(fā)明所公開的所有數(shù)值均為大約值，不論其是否連接了"大約"或"約"等詞。數(shù)值可能有1%、2%、5%或有時(shí)為10-2()%的變化。當(dāng)公開的數(shù)值范圍具有下限R1'和上限Ru時(shí)，則該范圍內(nèi)的任意數(shù)值都被特別地公開。具體地，在該范圍內(nèi)的下列數(shù)值被特別地公開R=RL+k*(Ru-RL)，其中k為1%至100%范圍內(nèi)以1%遞增的變量，即k為1%、2%、3%、4%、5%、5%、…、50%、51%、52、…、95%、96%、97%、98%、99或100%。此外，還特別地公開上文所述的由兩個(gè)R值定義的任意數(shù)值范圍。具體實(shí)施方案本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含作為主要或次要燃料組分的一種或多種(:15類異戊二烯化合物的燃料組合物。本發(fā)明可使用任意cl5類異戊二烯化合物。在一些實(shí)施方案中，該cl5類異戊二烯中的每一個(gè)具有式(i)和(n)之其中Z為H、(:)-r、或(:)-c(-())R;R為:H、烷基、環(huán)烷基、芳基、*或芳烷基。在一些實(shí)施方案中，Z為O-R或O-C(=())R;R為(；(::6烷基。在其它實(shí)施方案中，z為(:)-R或(:)-C(K))R，其中R為甲基。在其它實(shí)施方案中，Z為()-:R或0-C(=())R，其中R為乙基。在其它實(shí)施方案中，該c15類異戊二歸化合物為法呢烷，即式(:i:)或(n)的z為h。在一組實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物為:(i)其中Z如上文定義。在另一組實(shí)施方案所述類異戊二烯化合物為(ii)其中Z如上文定義,在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物為具有下式的種化合物-種或多<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中Z如上文定義。式(1-a)、(I-b)、(I-c)和(i-d)是式(I)的四種可能的立體異構(gòu)體，而式(n)是式(n-a)、(II-b)、(U-c)和(n-d)的四種可能的立體異構(gòu)體。在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二?；衔餅?川)或其立體異構(gòu)體在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物為(IV)或其立體異構(gòu)體，其中R采用前述定義,在另一組實(shí)施方案中烷基。在另一組實(shí)施方案中，R為甲基。在另一組實(shí)施方案中，在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物為R為C,.C;R為乙基。或其立體異構(gòu)體，其中R采用前述定義,:烷基。在另一組實(shí)施方案中，R為甲基。在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊—(V)在另一組實(shí)施方案中在另一組實(shí)施方案中:R為(V(—:3R為乙基。-烯化合物具有式(川)，(IV)或(V):或其中R為烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、以及線性或帶支鏈的戊基、己基、庚基、四癸基、六t基、八癸基、二十烷基、二辛基、壬基、癸基、十二烷基、.十二烷基等。在其它實(shí)施方案中該類異戊二烯化合物包含式(ni)、(:[v)或(v)的混合物,在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二蹄化合物包含具有式(m)、(iv)或(V)的至少兩種不同的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>或其立體異構(gòu)體，其中R為Ci乂〕5烷基，該兩種化合物存在的量分別至少占該燃料組合物總重或總體積的約5%。在另一組實(shí)施方案中，所述類異戊二蜂化合物為如下其中之一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中R.如上文定義。式(ni-a)、(in-b)、(in-c)和(ni-d)是式(m)的四種可能的立體異構(gòu)體。式(rv-a)、(:[v-b)、(iv-c)和(:rv-d)是式(i:v)的四種可能的立體異構(gòu)體。式(V-a)、(V-b)、(V-c)和(V-d)是式(V)的四種可能的立體異構(gòu)體。所述燃料組合物中的每一種類異戊二蜂化合物均能作為燃料組分，在與氧氣等氧化劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)釋放能量；或可作為燃料添加劑，改變該燃料組分的性能或?qū)傩?。在一些?shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重或總體積至少約2%、至少約3%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約9()%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重或總體積最多約5%、最多約U)%、最多約15%、最多約20%、最多約25%、最多約30%、最多約35%、最多約4(》％、最多約45%、最多約50%、最多約60%、最多約70%、最多約80%、或最多約90%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重或總體積約2%至約99%、約2.5%至約95%、約5%至約9()%、約7.5%至約85%、約；0%至約8()%、約15%至約8()%、約20%至約75%、或約25%至約75%。在一些實(shí)施方案中，所述Ci5類異戊二蹄化合物衍生自生物工程化Cl5類異戊二烯起始原料。在某些實(shí)施方案中，該生物工程化C!5類異戈二烯起始原料可通過宿主細(xì)胞將碳源轉(zhuǎn)化為C15類異戊二歸起始原料制備得到。在其它實(shí)施方案中，所述碳源為糖，例如單糖、二糖或其一種或多種組合。在某些實(shí)施方案中，該糖為能夠支持本發(fā)明所提供的一種或多種細(xì)胞生長的單糖。該單糖為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意單糖。部分適用的單糖的非限制性范例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其組合。適用的二糖的一些非限制性范例包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖及其組合。在其它實(shí)施方案中，所述碳源為多糖。適用的多糖的一些非限制性范例包括淀粉、糖原、纖維素、幾丁質(zhì)及其組合。在其它實(shí)施方案中，所述碳源為不可發(fā)酵的碳源。合適的不可發(fā)酵碳源的一些非限制性范例包括乙酸酯或鹽和甘油。在其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物可進(jìn)一步包含來自于石油、煤、木材或任意其它烴類來源的常規(guī)燃料組分。常規(guī)燃料組分的示范性范例包括柴油燃料、噴氣燃料、煤油、汽油、以及Fischer-Tropsch衍生燃料。在一些實(shí)施方案中，該常規(guī)燃料組分來自石油或煤油。在特定實(shí)施方案中，該燃料組分為柴油燃料、噴氣燃料、煤油、汽油、或其組合，或者包含柴油燃料、噴氣燃料、煤油、汽油、或其組合。在其它實(shí)施方案中，該燃料組分為蒸餾柴油燃料或者包含蒸餾柴油燃料。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該燃料組分的量占該燃料組合物的總重量或總體積的至少1()%、至少2()%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少卯％。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該燃料組分的量占該燃料組合物的總重量或總體積最多10%、最多20%、最多30%、最多40%、最多50%、最.多60%、最多70%、最多80%、或最多90%。在一些實(shí)施方案中，所述燃料組合物可進(jìn)一步包舍常規(guī)燃料添加劑。該一種或多種添加劑的性質(zhì)和量取決于最終燃料組合物的目標(biāo)用途。在某些實(shí)施方案中，所述燃料組合物預(yù)期用于柴油發(fā)動機(jī).美國檢測與材料學(xué)會(ASTM)將柴油燃料分為三個(gè)大組。對這些燃料進(jìn)行分類的需求源于柴油發(fā)動機(jī)的不同用途，該柴油發(fā)動機(jī)被設(shè)計(jì)成可用其中一種標(biāo)準(zhǔn)柴1-I)號為輕餾分，與煤油類似，可用于需要頻繁變化負(fù)荷和速度的發(fā)動機(jī)(例如，卡車、拖拉機(jī)發(fā)動機(jī))。該燃料具有大于38T的閃點(diǎn)，最大十六烷值為40。該燃料特別適用于寒冷天氣下的運(yùn)轉(zhuǎn)。2-D號是中餾分燃料，具有比1-D號更低的揮發(fā)性和更高的密度。該燃料可用于更重型的發(fā)動機(jī)，例如，鐵路發(fā)動機(jī)，其可比1-D號在使用中得到勻速但更高負(fù)荷的運(yùn)轉(zhuǎn)。其閃點(diǎn)大于52。C,最小十六烷值為40。4-1〕號是重餾分燃料，其具有三種柴油燃料中最高的密度和最低的揮發(fā)性。它可用于能在持續(xù)負(fù)荷下運(yùn)轉(zhuǎn)的低和中速發(fā)動機(jī)，例如船用發(fā)動機(jī)和發(fā)電機(jī)。其閃點(diǎn)大于55T,最低十六烷值為3().,高級柴油燃料為滿足或超過了國家度量衡公會(NCWM)或發(fā)動機(jī)制造商協(xié)會(EMA)之一的高級柴油定義的柴油燃料。一般而言，柴油燃料為數(shù)千種個(gè)體化合物的復(fù)雜混合物。這些化合物中多數(shù)為C,(rC22烴類，且通常為石蠟族、環(huán)烷(環(huán)石蠟族)和芳香族烴類。普通的石蠟指具有直碳鏈的烷烴(由氫和碳組成)。柴油燃料在1個(gè)大氣壓下通常具有390至715。1'，(200至380"C)的蒸餾區(qū)間和0.760至0.935范圍內(nèi)的比重,除了這些性質(zhì)，柴油燃料應(yīng)含有<1wt.M的疏、<0.1wt.%的灰分、<0.5vol.M的水和沉積物，并具有大于55t:的閃點(diǎn)。柴油燃料品質(zhì)可根據(jù)十六烷值(通常在30至60范圍內(nèi))進(jìn)行表征。高十六烷值表示該發(fā)動機(jī)易于發(fā)動并平穩(wěn)運(yùn)轉(zhuǎn)的潛力。該十六烷值與汽車發(fā)動機(jī)十六烷值類似，其中十六烷(正十六烷，(:16:〖134)具有指定值io()。在該等級的另一端，十六烷的異構(gòu)體七甲基壬烷具有指定值()。柴油燃料的十六烷值可通過與十六烷和七甲基壬烷的混合物進(jìn)行比較來測定。它對應(yīng)于具有該燃料相同的燃燒性質(zhì)的十六烷-七甲基壬烷混合物中十六烷的體積份數(shù)的值。一般而言，普通柴油燃料具有高于20wH的芳族含量，數(shù)百ppm.或更高的疏含量。它們可進(jìn)一步包含額外的氧和/或氮雜質(zhì)。為獲得所需的柴油燃料，普通柴油燃料通常需要進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中該普通柴油燃料中的芳香烴被轉(zhuǎn)化為非芳香烴，例如，環(huán)石蠟。這通?？赏ㄟ^將普通柴油燃料在氫化催化劑存在下進(jìn)行氫化得以實(shí)現(xiàn)。也可采用其它的轉(zhuǎn)化方法。通常而言，原油經(jīng)簡單蒸餾生成的"直餾"柴油燃料具有較低的芳香烴含量。然而，通過催化裂化殘油提高汽油和柴油生成可導(dǎo)致芳香族含量的上升。典型的蒸餾柴油可包含20至25%體積的芳香烴，而混合了催化裂化的原料的柴油可具有40至50%的芳香烴。本發(fā)明所公開的燃料組合物的芳香烴含量占該燃料組合物的總體積小于約50vol.%、約45voL。/"約40vol.%、約35vo1.%、約30vo1.%、約25vo1.%、或約20vol.%。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物的芳香烴含量占該燃料組合物的總體積小于約15vol.%、小于約10vol.%、小亍約5vol.%、小于約2.5vol.0/"或小于約1vol.%。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物基本不含芳香族烴。芳香烴具有較差的自燃品質(zhì)，因此含有高比例芳香烴的柴油燃料通常具有較低的十六烷值。直餾柴油的典型十六烷值在50至55范圍內(nèi)，高芳香烴柴油燃料的十六烷值通常在40至45范圍內(nèi)，甚至可能更低。這可能由亍著火延遲而引發(fā)冷啟動的困難，并提高燃燒噪音。為了減少本發(fā)明所述的燃料組合物的疏含量，可采用脫疏工藝減少該燃料組合物中的柴油燃料組分和/或可采用更高的類異戊二烯化合物量。任意脫疏方法可用于本發(fā)明的實(shí)施方案。還可使用其它脫氧和/或氮的步驟，以獲得所需的柴油燃料。美國專利號5,611,912、5,068,025、4,746,420和4,675,102披露了可用于本發(fā)明的實(shí)施方案中的氫化和/或脫硫工藝。所有前述專利的披露內(nèi)容在此全文通過引用并入本文。本發(fā)明所公開的燃料組合物可具有或可制備成具有占該燃料組合物總重少于約500ppni、約100ppra、約50ppm、約30ppm、纟令20ppm、或約15ppm的疏含量。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物的疏含量少于約H:)ppm。在其它實(shí)施方案中，該燃剩組合物基本不含疏。規(guī)范。僅在美國還采用了稱為JetA的一種JetA-1類型。在民航中常用的另一種噴氣燃料被稱為Jet:B。JetB是石油腦-煤油(naptha-kerosene)領(lǐng)域的一種因其寒冷天氣性能而被使用的點(diǎn)火器燃油。JetB的蒸餾范圍通,在140至460。F(:50至250°C)。JetA、JetA-1和JetB在ASTM規(guī)范D.1655-68中有具體說明。替代性地，噴氣燃料可采用JP編號系統(tǒng)在全世界進(jìn)行軍用分類。部分幾乎與其民用對象一致，僅在少量添加劑的量上有所區(qū)別。例如，JetA-1與JP-8類似，而JetB與JP-4類似?；蛘?，噴氣燃料也可被分類為煤油型或石油腦型。煤油型噴氣燃料的一些非限制性范例包括JetA、JetA1、JP-5和JP-8。石油腦型噴氣燃料的一些非限制性范例包括JetB和JP-4。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)燃料組合物包含式(m)或式(i)或式(ii)(其中Z為H)時(shí)不包含根據(jù)ASTM規(guī)范D1655-68的JetB。JetA是美國自1950年以來使用的標(biāo)準(zhǔn)噴氣燃料類型。除了-4(rC的更高凍點(diǎn)外，JetA與Jet-A1類似。與JetA-〗類似，JetA具有最低38"C的較高閃點(diǎn)，自燃溫度為21(TC。在某些實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含至少一種常規(guī)燃料添加劑。常規(guī)燃料添加劑的一些非限制性范例包括抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、十六烷值增進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、潤滑性能改進(jìn)劑、防冰劑、噴射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分-敬劑、清潔劑、反乳化劑、染料、標(biāo)記物、在某些實(shí)施方案中，所述燃料纟于噴氣發(fā)動機(jī)。最常見的其被分類為JetA-l，其生產(chǎn)滿足囯際標(biāo)準(zhǔn)防靜電劑、殺蟲劑及其組合.。該燃料組合物中的燃料添加劑的總量可占該燃剩-組合物總重的O.O()l至H)wt%，在--個(gè)實(shí)施方案中為O.()l至5wt%。一些常規(guī)燃料添加劑的描述可見ChunshamSong等人，"C/kw"http://:)'o/'t/人"'/./認(rèn)/,"Taylor&Francis,London,第一章，第32-36頁(2000),其在此通過引用并入本文。此外，如下美國專利披露了各種可用-f本發(fā)明實(shí)施方案的添加劑6,054,420、6,05!,039、5,997,593、5,997,592、5,993,498、5,968,211、5,958,089、5,931,977、5,891,203、5,882,364、5,880,075、5,8,72、5,855,629、5,853,436、5,743,922、5,630,852、5,529,706、5,505,867、5,492,544、5,490,864、5,484,462、5,321,172、以及5,284,492。所有前述專利的披露內(nèi)容在此全文通過引用并入本文。在某些其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含作為潤滑性能改進(jìn)劑或增強(qiáng)劑的燃料添加劑，在一些實(shí)施方案中，一種或多種潤滑性能改進(jìn)劑與該柴油燃料相混合。該潤滑性能改進(jìn)劑在該燃料中的濃度通常占該燃料組4、物的總重'的纟々1p:pm至約5(:).()(:)()ppm、約10.ppm至約2(),()()0p.pm、25pp.ra至約〗()，()O()ppm、或50ppm至約1000ppm。合適的潤滑性能改進(jìn)劑的——些非限制性范例包括脂肪酸的酯，例如甘油單油酸酯和二異癸基己二酸酯；基于酰胺的添加劑，例如可從LubrizoJChemicalCompany獲得的添加劑(如LZ539C);二聚亞油酸；氨烷基嗎啉；二硫磷酸二酯-二醇；以及具有至少一個(gè)羰基基團(tuán)的烷基芳香族化合物。一些適用的潤滑性能改進(jìn)劑或增強(qiáng)劑描述于專利文獻(xiàn)中，例如WO95/33805;W()94/17160;W(:)98/01516及美國專利號5,484,462和5,490,864,以及Da.叩ingWeiamiH.A.Spikes,"TheLubricityofDieselFuels"，Wear，III(1986)217235，所有這些文.獻(xiàn)均在此通過引用并入本文。商用潤滑性能改進(jìn)劑的一些非限制性范例包括OLI9000(來自O(shè)cte!Corporation"Manchester,UK)，PARADYNE655和VEKTRON601.0(來自lnilneum，Linden，R",以及HITECE58(:)(來自EthylCorporation,Richmond,VA)。在某些其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含怍為清潔劑的燃料添加劑。一般而言，該清潔劑添加劑的量占該燃料組合物的總重的少于io,()()oppm、少于1000pp.m、少于10《)pp.m、或少于10ppm。合適的清潔劑的-一些非限制性范例包括聚烯烴取代的丁二醜亞胺或聚胺的丁二酸酰胺，例如聚異丁烯丁二酰亞胺或聚異丁烯胺丁二酸酰胺、脂肪族胺、Mannich堿或胺，以及聚烯烴(例如，聚異丁烯)馬來酸酐。一些適用的丁二酰亞胺清潔劑描述于GB960493、EI)0147240、EP0482253、EP0613938、EP0557561以及WO98/42808(全部在此通過引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，該清潔劑為聚.烯烴取代的丁二酰亞胺，例如聚異丁烯丁二酰亞胺。商用清潔劑添加劑的一些非限制性范例包括F7661和F7685(來自Infiiieum，Linden，NJ)以及OMA413():[X,來自(:)ctelCorporation,Manchester,UK)。在某些其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含作為十六烷值增進(jìn)劑的燃料添加劑。十六烷值增進(jìn)劑的一些非限制性范例包括過氧化物、硝酸鹽、亞硝酸鹽、偶氮化合物等?？墒?用硝酸烷基酯例如硝酸戊酯、硝酸己酯和混合的硝酸辛酯、2-甲基-2-硝基丙基硝酸酯，和2-乙基硝酸己酯。在一些實(shí)施方案中，該十六烷基增進(jìn)劑為2-乙基硝酸己酯，其可從Associated()ctelCompanyLimited購得,商標(biāo)為CI-()8()1。該十六烷基增進(jìn)劑的濃度可為該燃料組合物的總重的約o,ocn至5wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中從0.01至2.5wt%。在某些其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含作為穩(wěn)定劑的燃料添加劑。穩(wěn)定劑的一些非限制性范例包括叔烷基伯胺。許多:穩(wěn)定劑也可作為緩蝕劑。穩(wěn)定劑在該燃料組合物中的濃度可為該燃料組合物總重的約().()()l至2Wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中0.01至1Wt%。在某些其它實(shí)施方案中，所述燃料組合物包含作為助燃劑的燃料添加劑。助燃劑的一些非限制性范例包括二茂鐵(二(環(huán)戊二烯)鐵)、鐵基助燃劑(例如、TU:RBOTE〔TTM:ER-18、來自于Turbotecl(USA)i:nc.、Tomball、Texas)、鋇基助燃劑、鈰助燃劑、以及鐵和鎂基助燃劑(例如，TURBOTECT703，來自Turbotect(USA)Inc,，Tombal〗，Texas),,助燃劑在該燃料組合物中的濃度可為該燃料組合物總重的約0.001至1wt%,在一個(gè)實(shí)施方案中0.01至〗wt%。另一方面，提供了包含如下的組合物(a)具有式(I)或(II)的類異戊二烯化合物(b)常規(guī)燃料組分；以及(c)燃料添加劑其中Z為:H、O-R、或()-C(二O)R;R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基；基于該燃料組合物的總體積，該類異戊二烯的量至少為約1vol.%，而該常規(guī)燃料組分的f至少為約5vol.%;且其中該燃料組合物具有等于或大于38'C的閃點(diǎn)，并具有介于約100"(〕和約200°C之間的初沛點(diǎn)0在一些實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物在本發(fā)明所公開的燃料組合物中的量為該燃料組合物的總體積的至少2vol.%、3vol.%或4vol.%.:.在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物的量為該燃料組合物的總體積的約1vol.o/。至約卯vol.%、約2v()H至約90vol.%、約3vol.Q/。至約90vol.%、或約4vol.o/。至約90vol.%。另一方面，提供了包含如下的組合物(a)具有式(I:)或(II)的類異戊二烯化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>(b)常規(guī)燃料組分；以及(c)燃豐f添加劑其中Z為H、O-R、或OC(-:O):R;R為H:、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基；基于該燃料組合物的總體積，該類異戊二烯的量至少為約5vol.%，而該常規(guī)燃料組分的量至少為約5vol.%;且其中該燃料組合物具有等于或大于38°C的閃點(diǎn)，并具有介于約100。C和約200"C之間的初沸點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述類異戊二烯化合物在本發(fā)明所公開的燃料組合物中的量為該燃料組合物的總體積的約5voLM至約90vol,%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物的量占該燃料組合物的總體積小于約75vol.%、小于約65vo1,%、小于約5()vo1,%、或小于約45vo1.%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物的量為約5vo:I.M至約10vo:!.%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物的量為約15voH至約25vol.%。在其它實(shí)施方案中，該類異戊二烯化合物的量為約45vol.M至約55vol.%。在其它實(shí)施方案中，基于所述燃料組合物的總體積，本發(fā)明所公開的燃料組合物中所述常規(guī)燃料組分的量為至少約20%,而所述類異戊二烯化合物的量為約5%至約75%。在某些實(shí)施方案中，基于該燃料組合物的總體積，該常規(guī)燃料組分的量為至少約30%,而該類異戊二烯化合物的量為約5%至約65%。在某些實(shí)施方案中，基于該燃料組合物的總體積，該常規(guī)燃料的量為至少約40%，而該類異戊二烯化合物的量為約5%至約50%。在某些實(shí)施方案中，基于該燃料組合物的總體積，該常規(guī)燃料的量為至少約50%,而該類異戊二烯化合物的量為約5%至約45%。在一些實(shí)施方案中，所述常規(guī)燃料組分為基于煤的燃料。在其它實(shí)施方案中，該常規(guī)燃料組分為石油柴油。在其它實(shí)施方案中，該常規(guī)燃料組分為煤油。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有大于約io()r、大于約i.i(rc、大于約i2o°c、大于約〗3(rc、或大于約14(rc的初::弗點(diǎn),:，在其它實(shí)施方案中，該初沛點(diǎn)為約io(rc至約i5()°c。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有大于約2()(rc的終沐點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，該終沸點(diǎn)大于約225t:、大于約25(TC、大于約275°C、大于約300"C、或大于約325'C。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該終沐點(diǎn)為大于約35(TC。在某些實(shí)施方案中，該終沸點(diǎn)為大于約375"C。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有約IO(TC至約200"C的初沐點(diǎn)和大于約300'C的終沸點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約110。C至約140'C的初沸點(diǎn)和大于約35(T'C的終沸點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約li(r'C至約14()"C的初沸點(diǎn)和大于約375"C的終沸點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有約27(rc至約35(TC的T90蒸餾溫度。在其它實(shí)施方案中，該T9()蒸餾溫度為約282"C至約338°C。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有從約175"C至約375"C、從約200"C至約350"C、從約225'C至約325"C、或從約25(TC至約300"C的T50蒸餾溫度。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有從約150t'至約350。C、從約175"C至約325。C、從約200。C至約300。C、或從約225T〕至約275。C的T10蒸餾溫度c在--些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有至少約40、至少約45、至少約50、至少約55、至少約60、或至少約65的十六烷值。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有至少約70的十六烷值。在某些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有約40至90、約45至80、或約50至70的十六烷值。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有等于或小于(rc的濁點(diǎn)。在另一組實(shí)施方囊中，該燃料組合物具有等于或小于-5°〔〕的濁點(diǎn)。在另一組實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或小于-i(rc的濁點(diǎn)。在另一組實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或小于-15"C的濁點(diǎn)。在另一組實(shí)施方案中，該燃料組合物具有等于或小于-2(TC的濁點(diǎn)。在另一組實(shí)施方衆(zhòng)中，該燃料組合物具有等于或小于-25"C的濁點(diǎn)。在--些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物具有低含硫量。在其它的實(shí)施方案中，該燃料組合物的含疏量相比該燃料組合物的總重低于500ppm。在其它實(shí)施方案中，該含疏量相比該燃料組合物的總重低于25()ppm,<氐于15()p'pm、'《氐于100.p.pm、J氐于50ppm、j氐于25ppm、'f氐于20ppm、低于1ppm、或低于5()ppm。在某些實(shí)施方案中，該燃料組合物不具有可測的含疏量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開的燃料組合物滿足ASTMD975對于2號柴油的規(guī)定。另一方面，4t供了包含如下的組合物(a.)量為至少約1vol.%的C20烴;和(b)具有式(I)或(II)的類異戊二烯化合物其量為至少約1vol.%,其中各種量均基于該燃料組合物的總體積，Z為H、O-R、或0-C(=())R;R為H或d-Q，烷基。在一些實(shí)施方案中，該類異戊二蹄化合物的量為至少約2voL%，3vo:L%，或4voi.%。在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物進(jìn)一步包含(c)占該燃料組合物總體積至少約1vol.M的Qo烴類。另一方面，提供了包含如下的組合物(a)量為至少約lvoH的《320烴；和(b)具有式(I)或(II)的類異戊二蟑化合物z(I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>其量至少為約5vol.%,其中各種量均基于該燃料組合物的總體積，Z為H、O-R、或0-C(=0)R;R為H或C!.Q，烷基.,在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物進(jìn)一步包含(c)占該燃料組合物總體積至少約ivol.M的Ci()烴類。在一些實(shí)施方案中，所述C,o烴類的量為至少約2vol.%、3vol.%、4vol.%、或5vol.%o在其它的實(shí)施方案中，該C加烴類的量為至少約2vol,%、3vol.%、4vol.%、或5vol,%。在一些實(shí)施方案中，所述燃料組合物進(jìn)一步包含(::n-Ci9烴類，其中每--組Cu、Cl2、Cl3、C|4、C15、C16、(〕n、C1S、和(::w烴類的量為該燃料組合物的總體積的至少約1vo:i%。本發(fā)明所公開的燃料組合物可用于為需要燃料(例如，柴油燃料或噴氣燃料)的任意設(shè)備(例如應(yīng)急發(fā)電機(jī)或內(nèi)燃機(jī))提供動力。在某些實(shí)施方案中，提供了包括一種或多種上述燃料組合物的應(yīng)急燃料。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述燃料組合物作為應(yīng)急燃料的用途。術(shù)語"應(yīng)急燃料"指通常儲存在車輛氣罐以外的容器中的燃料。該燃料應(yīng)當(dāng)在較長的時(shí)間段(例如，六至十二個(gè)月)中保持穩(wěn)定。當(dāng)該牟輛燃料用盡時(shí)，該應(yīng)急燃料被添加至該車輛的氣罐，并向車輛提供燃料。由于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案制備的柴油燃料的閃點(diǎn)通常超過140下，因此可將其安全的儲存在柴油車輛的行李箱中。該燃料組合物還可被用作替代燃料，如美囯專利號6,096,103所述，其全文在此通過《j用并入本文。另一方面，提供了包括含有本發(fā)明所提供的燃料組合物的燃料箱的燃料系統(tǒng)。該燃料系統(tǒng)可選地進(jìn)一步包括具有再循環(huán)發(fā)動機(jī)冷卻液的發(fā)動機(jī)冷卻系統(tǒng)，連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管和/或設(shè)置在燃料管.濾器。內(nèi)燃機(jī)的一些非限制性范例包括往復(fù)發(fā)動機(jī)(例如，汽油發(fā)動機(jī)和柴油發(fā)動機(jī))、Wan.ke:l發(fā)動機(jī)、噴氣發(fā)動機(jī)、一些火箭發(fā)動機(jī)、以及燃?xì)鉁u輪發(fā)動機(jī)。在一些實(shí)施方案中，所述燃料箱與所述冷卻系統(tǒng)設(shè)置在一起,從而允許所述再循環(huán)發(fā)動機(jī)冷卻液到該燃料箱中的燃料組合物的熱傳遞。在其它實(shí)施方案中，該燃料系統(tǒng)進(jìn)一步包括含有用于柴油發(fā)動機(jī)的第二燃料的第二燃料箱和連接該第二燃料箱和該內(nèi)燃機(jī)的第二燃料管?？蛇x地，該第一和第二燃料管可配備電磁操作閥，該閥可彼此獨(dú)立地或同步地開啟或關(guān)閉。在其它實(shí)施方案中，該第二燃料為石油柴油。另一方面，提供了發(fā)動機(jī)裝i，其包括內(nèi)燃機(jī)，包括本發(fā)明所公開的^J燃料箱，連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管。可選地，該發(fā)動機(jī)裝置進(jìn)一步包括燃料過濾器和/或包括再循環(huán)發(fā)動機(jī)冷卻液的發(fā)動系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)燃機(jī)為柴油發(fā)動機(jī)。在其它實(shí)施方案中，該內(nèi)燃機(jī)為噴氣發(fā)動機(jī)。當(dāng)使用本發(fā)明所公開的燃料組合物時(shí),需要在將其注入該發(fā)動機(jī)前除去該燃料組合物中的徵粒狀物質(zhì)。因此，需要在本發(fā)明所公開的燃料系統(tǒng)中選用適當(dāng)?shù)娜剂线^濾器。內(nèi)燃機(jī)燃料中的水.，即使量極少，可對該發(fā)動機(jī)引起極大的危害。因此，需要在燃料組合物注入發(fā)動機(jī)前除去其中的水分。在--些實(shí)施方案中，可通過采用渦輪式離心機(jī)的燃料過濾器去除水和微粒狀物質(zhì)，其中水和徵粒狀物質(zhì)從該燃料組合物中分離的程度使得過濾后的燃料組合物可以注入該發(fā)動機(jī)而不帶來損傷該發(fā)動機(jī)的危險(xiǎn)。也可采用其它類型的燃料過濾器來去除水和/或微粒狀物質(zhì)。另一方面，提供了交通工具，其包括內(nèi)燃機(jī)，包括本發(fā)明所公開的燃料組合物的燃料箱，連接該燃料箱和內(nèi)燃機(jī)的燃料管?？蛇x地，該交通工具進(jìn)一步包括燃料過濾器和z或包括再循環(huán)發(fā)動機(jī)冷卻液的發(fā)動機(jī)冷卻系統(tǒng)。交通工具的一些非限制性范例包括汽車、摩托車、火牟、輪船和航空器。另一方面，提.4^了制備式(i)或(n)的類異戊二烯化合物的方法(ii)，其中z為h、0-r、或o-c(:-())r;r為h、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。該方法包括a)從生物來源獲得C！5類異戊二烯起始原料，和b)將該C15類異戊二埽起始原料通過化學(xué)合^趙另一方面，提供了類異戊二蹄化合物(l)或(II)(:)(n),其中Z為H、O-R、或O-C(O)R;R為h、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基，其中該化合物通過如下方法制備a)從生物來源獲得C,5類異戊二蹄起始原料，和b)將該Cl5類異戊二烯起始原料通過化學(xué)合成轉(zhuǎn)化為所述化合物。另一方面，提供了通過如下方法生成的生物燃料a)從生物來源獲得C,5類異戊二烯起始原料，和b)將該Ci5類異戊二埽起始原料通過化學(xué)合成轉(zhuǎn)化為式(I)或(I:l)的類異戊二蜂化合物^A^x/L/^^仰，其中z為h、o-r、或(:)-(:(=(:))r;r為h、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基。在一組實(shí)施方案中，所述(:〕15類異戊二蹄化合物起始原料為或其立體異構(gòu)'沐。在另一組實(shí)施方案中，所述c15類異戊二錄化合物起始原料為或其立體異構(gòu)體，其中r為烷基。在另一組實(shí)施方案中，所述cl5類異戊二烯化合物起始原料為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>或其立體異構(gòu)體，其中R為烷基。另一方面，提供了制備燃料組合物的方法，其包4左a)在適于生成所述Cl5類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成該C,5類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與單糖相接觸；b)氫化該C15類異戊二烯起始原料，以形成氫化的Cl5類異戊二烯化合物；和c)將該氫化的C15類異戊二烯化合物與一種或多種燃料組分或燃料添加劑相混合以制備該燃料組合物。另一方面，提供了制備燃料組合物的方法，其包括a)在適于生成所述C15類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成該C!5類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與非發(fā)酵碳源相接觸；b)氫化該Cb類異戊二烯起始原料，以形成氫化的C,5類異戊二烯化合物；和c)將該氫化的Cl5類異戊二烯化合物與一種或多種燃料組分或燃料添加劑相混合以制備該燃料組合物。另一方面，提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的燃剩-、生物工程化燃料組分或生物工程化燃料添加劑的裝置。在某些實(shí)施方案中，該裝置能夠以生物學(xué)方法生產(chǎn)所述(:、5起始原料。在某些實(shí)施方案中，該裝置進(jìn)一步能夠從該起始原料制備類異戊二烯燃料添加劑或燃料組分,所述裝置可包括能夠采用微生物制備所述Ci5起始原料的任意結(jié)構(gòu)'在一些實(shí)施方案中，該生物裝置包括本發(fā)明所公開的一種或多種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該生物裝置包括細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞培養(yǎng)物至少包含占其總重至少約1wt.%、至少約5wt.%、至少約10wt.%、至少約20wt.%、或至少約30wt.M的C,5起始原料。在其它實(shí)施方案中，該生物裝置包括含有本發(fā)明所述的一種或多種細(xì)胞的發(fā)酵罐。本發(fā)明可使用能夠提供適于細(xì)胞或微生物生長或繁殖的穩(wěn)定和適宜環(huán)境的任意發(fā)酵罐。在--些實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包括具有本發(fā)明所公開的一種或多種細(xì)胞的培養(yǎng)物。在其它實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包括能夠以生物學(xué)方式生成法呢基焦磷酸(FPP)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在其它實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包括能夠以生物學(xué)方式生成異戊烯基焦磷酸(IPP)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實(shí)施方案中，該發(fā)酵罐包含細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞培養(yǎng)物至少包含占其總重至少約1wt.%、至少約5wt.%、至少約1()wt,%、至少約20wt.%、或至少約30wt.W的C,5起始原料。所述裝置可進(jìn)一步包括能夠由所述C15起始原料生產(chǎn)所述燃料組分或燃料添加劑的任意結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可包括用于氮化該C15起始原料的氬化器。本發(fā)明可使用能在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下將C二C雙鍵還原為C-C單鍵的任意氫化器。該氬化器可包括本發(fā)明所公開的的氫化催化劑。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括混合器、容器、以及在該容器中的來自氫化步驟的氮化產(chǎn)物和常規(guī)燃料添加劑的混合物。宿主細(xì)胞Cl5類異戊二烯起始原料可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法制備，包括生物學(xué)方法、化學(xué)合成(不使用生物學(xué)來源的原料)以及同時(shí)采用生物學(xué)和化學(xué)手段的混合方法。當(dāng)該C,5類異戊二烯起始原料通過生物學(xué)方法制備時(shí)，一種方法包括使用經(jīng)改造可生成目標(biāo)產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。與所有的類異戊二烯類似，Cl5類異戊二蜂起始原料可通過常見的中間體異戊烯基焦磷酸("IPP")經(jīng)生物化學(xué)方法制備。所述宿主細(xì)胞可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意技術(shù)進(jìn)行生長。具體地，該宿主細(xì)胞可生長在適合該宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在有利的實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基包含容易獲得的可再生的組分「因此，本發(fā)明提供了容易獲得的可再生的能源，將其用于生成燃料組合物的方法。在某些實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞在適亍其生長和生成C，5類異戊二烯的條件下通過與單糖接觸進(jìn)行生長或培養(yǎng).:.在某些實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞可通過與葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其組合接觸進(jìn)行生長或培養(yǎng)。因此，本發(fā)明提供了來自單糖，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其組合的燃料組合物，以及通過該單糖生成該燃料組合物的方法。任意合適的宿主細(xì)胞均可用于實(shí)施本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為遺傳工程改造的宿主徵生物，其核酸分子已經(jīng)過插入、刪除或更改(即突變；例如通過核普酸的插入、刪除、取代和/或倒位)以生成所需的類異戌二烯或類異戊二烯衍生物，或者提高所需的該類異戊二烯或類并戊二烯衍生物的產(chǎn)量。在另--實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠在液體生長培養(yǎng)基中生長。適用的宿主細(xì)胞的范例包括古細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和真核細(xì)胞。古細(xì)菌細(xì)胞的一些非限制性范例包括屬于氣火菌屬(/〗er鄰yraw)、/J/Y/"eg/W船、嗜鹽桿菌屬(//a/o6flC/^r/,卵)、甲坑球菌屬(M〃awococt'船)、甲烷If菌屬(Mf/70TO9/)a"eT/"附)、熱球菌屬(7^vraco'cw50、疏化葉菌屬(S"^9fo/w's')、和嗜熱枝原體屬(77erwo//^/")的古細(xì)菌細(xì)胞。古細(xì)菌菌抹的--些非限制性范例包括嗜熱菌敏捷氣熱菌、閃爍古生球菌、詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、/).w'o","'"'tf/少'A',s/、/))'raoxns'/z6w/rtw/w'/'、嗜酉ll熱原體.和77w/'附(9//as'附"w/"ww附等o細(xì)菌細(xì)胞的一些非限制性范例包括屬于農(nóng)桿菌屬、脂環(huán)脧桿菌屬、魚腥藻屬、組囊藍(lán)細(xì)菌屬、節(jié)桿菌屬、定氮菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、產(chǎn)色菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、大腸桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、慢生根瘤菌屬、甲基桿菌屬、微桿菌屬、席藍(lán)細(xì)菌屬、假單胞菌屬、紅細(xì)菌屬、紅假單胞菌屬、深紅紅螺菌、紅球菌屬、沙門氏菌屬、&e"ft;feMwn、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、鏈霉菌屬、^v'"wecocc附和發(fā)酵單月包菌屬的纟B菌細(xì)月包。細(xì)菌菌林的--些非限制性范例包括枯草芽孢桿菌、醫(yī)學(xué)環(huán)狀桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、5re.W6aCw/ww/附附"〃'o/M"附、拜季林斯基(氏)梭菌、Ewten^/虛',s'ate"紐、大腸桿菌、乳酸乳球菌、中慢生根瘤菌、銅綠假單孢菌、/)W狄:foOTWMW附eV"/(.)/7//、./)WM6fcwWWM'/議/k'(7、莢月莫.紅纟田菌、J求形纟工細(xì)菌、深紅紅螺菌、腸炎沙門(氏)菌、沙門氏菌傷寒桿菌、鼠傷寒沙門(氏)菌、志賀氏痢疾桿菌、弗氏志賀(氏)菌、宋內(nèi)志賀菌、金黃色葡萄球菌等。一般而言，如果使用細(xì)菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選采用非病原性菌林。非病原性菌抹的一些非限制性范例包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、丄ac"&K'/:/Z織c"c//"/"x、瑞士乳(酸)軒菌、銅綠孑艮單月包菌、ftratfo/船"os附ev"/o;//、惡臭假單月包菌、球形紅細(xì)菌、光合菌、深紅紅螺菌等。真核細(xì)胞的一些非限制性范例包括真菌細(xì)胞。真菌細(xì)胞的一些非限制性范例包括屬于曲霉屬、念珠菌屬、金孢子菌屬、0>'otoax'CM、鐮孢菌屬、克魯維酵母屬、內(nèi)生真菌屬、鏈孢霉屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、酵母菌屬和木霉菌屬的真菌細(xì)胞。真核細(xì)胞菌抹的一些非限制性范例包括構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、白色念珠菌、C72/^w^wr/w附/mc々wo、禾.谷鐮孢菌、鐮孢霉、乳酸克省-維酵母、粗糙脈孢菌、安格斯畢赤酵母、吉利蒙德(氏)畢赤酵母、庫德畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、奧默酵母、巴斯德畢赤酵母、尸/c//"7"、樹千畢赤酵母、抗菌素鏈霉菌、金色鏈霉菌、鏈金黃色葡萄球菌、5V/ccm'cwy;ces6a[rara/s、布氏西孝'母、商良酒酵母、殺真菌素鏈霉菌、灰產(chǎn)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌、鉛青鏈霉菌、產(chǎn)橄欖色鏈霉菌、枝鏈霉菌、田無鏈霉菌、酒紅鏈霉菌、和里氏木霉。一般而言，當(dāng)使用真核細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選非病原性菌抹。非病原性菌株的一些非限制性范例包括禾谷鐮孢菌、鐮孢霉、巴斯德畢赤氏酵母、布拉氏酵母和釀酒酵母。此外，某些菌株已經(jīng)經(jīng)食品藥品管理局指定為GRAS或通常認(rèn)為安全,這些菌棘的一些非限制性范例包括枯草芽孢桿菌，Lrtrt//"c/〃"、"c'/J，/i,7船'，瑞士乳(酸)桿菌和釀酒酵母。IPP途徑存在兩種已知的合成I:PP及其異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸脂("DMAPP")的生物合成途徑。不同于植物，真核生物專有地使用甲羥戊酸.-依賴性("MEV")類異戊二烯途徑將乙酰輔酶A("acetyl-(:()A")轉(zhuǎn)化為IPP，〗PP隨后被異構(gòu)化為:DMAP:P。原核生物(存在少數(shù)例外)使用甲羥戊酸-非依賴性或脫氧木酮糖5-磷酸("DXP")途徑通過一個(gè)分支點(diǎn)分別生成:PP和DMAPP。一般而言，植物同時(shí)使用MEV和DXP途徑進(jìn)行〗:PP合成。MEV途徑圖1顯示了M:EV途徑的示意圖。一般而言，該途徑包括六個(gè)步驟。在第一步，兩個(gè)乙酰輔酶A分子經(jīng)酶催化合并形成乙酰乙酰輔酶A。已知催化該步驟的酶是，例如，乙酰輔酶A疏解酶。編碼該種酶的核苷酸序列的--些非限制性范例包括如下GeriBank登錄號和可獲得該序列的有機(jī)物(NC—000913REGION:2324131,,2325315;大腸軒菌)、(D49362;脫氮微球菌)、和(L2()428;釀酒酵母)。在MEV途徑的第二步，乙酰乙酰輔酶A與另一乙酰輔酶A分子縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG輔酶A合成酶。編碼該種酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(NC—001145.補(bǔ)體19061..20536;釀酒酵母)、(X96617;釀酒酵母)，(X83882;擬南芥)、(AB037907;K故"'a仍/orag〃》朋/a)，(BT007302;智人)、和(NCJ)02758，LocustagSAV2546，GeneID112257；金黃色葡萄球菌)。在第三步，HMG輔酶A酶催化轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸。已知催化該步驟的酶是，例如，HMG輔酶A還原酶。編碼該種酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(NM—206548;果蠅)、(NC—002758，LocustagSAV2545，Genel—D1122570;會夷-色葡萄球離)、(剛—204485;Gallusgailus)、(AB()i5627;鏈霉菌屬K()3988)、(AF542543;漸俠葉煙草)、(AB()37907;A'/她7/罕)rat油)、(AX128213，提供編碼截短HMGR的序列；釀酒酵母)以及(NC—001M5:補(bǔ)體(115734.,118898;釀酒fl孝母),.在第四步，甲鞋戊酸被踏催化磷酸化形成甲鞋戊酸5-磷酸。已知催化該步驟的裕是，例如，甲鞋戊酸激賂。編碼該種i給的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(L77688;擬南齊)和(X55875;釀酒酵母)。在第五步，向所述甲鞋戊酸5-磷酸酶催化添加另--個(gè)磷酸基間，從而形成甲幾戊酸5-焦磷酸脂。已知催化該步驟的豫是，例如，磷酸甲鞋戊酸激雜、，編碼該種酵的核普酸序列的一些非限制性范例包括(AF429385;巴西橡膠樹)、(畫—一006556;智人)和(NC001145.樸體712315J13670;釀酒酵母)。在第六步，甲羥戊酸5-焦磷酸脂被酷.催化轉(zhuǎn)化為1PP,已知催化該'少-呢的酶是，例如，甲鞋戊酸焦磷酸脂脫羧酵、編碼該祌t給的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(X97557;喊酒酵母)、(AF2卯()Q5;屎腸球菌)和(U4926();智人)。如要將IPP轉(zhuǎn)化為〖)MAPP,則需要進(jìn)行第七少-。已知催化該少驟的ft,是，例如，1PP異構(gòu)條。編碼該種酶的核脊酸序列的一些非限制性范洌包括(NC—000913，3031087..3031635;大腸桿菌)和(AH()82326;雨生紅球藻),-DXP途徑圖2顯示了DXP途徑的示意圖，一4i而言，DXP途徑包括七個(gè)步驟。在第一步，將丙酮酸鹽與D-甘油醛3-疇酸縮合形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的的是，例如，1-脫氣-D-木酮糖-5-磷酸合成的..編碼該種酶的核普酸序列的一些非限制性范例包括(AF035440;大腸軒簡)、(NC—002947，k)custagPP()527;惡臾假單胞菌KT244(.))、(CP()()()()26，locustagSPA2301;腸炎副傷寒沙門氏菌，見ATCC9150)、(NC—007493，ioeustagRSP—0254;球形紅細(xì)菌2.4.1)、(NC—005296，locuslagRPA0952;沼澤紅假單胞菌CGA009)、(NC—004556，k)custagPD1293;A>'/t'〃《/^、////"A'"'"/"/)和(NC—003076，locustagAT5(;1380;擬南務(wù))。在第二步，i-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤藻糖酌-4-磷酸。已知催化該步驟的酵是,例如，i-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原年構(gòu)萌、編碼該種酶的核苷酸序列的—些非限制性范例包括(AB()13300;大腸軒菌)、(AF148852;擬南芥)、(NC002947，locustagPP1597;惡是假單胞菌KT2440)、(AL939i24,iocustagSC05694;天藍(lán)色鏈霉渴A3(2))、(NC—007493，locustagRSP2709;球形紅細(xì)菌2.4.1)和(NC007492,locustagPf1.一H07;炎光假單胞菌PfO-1),在第三步，2C-甲基-D-赤藻糖醉-4-磷酸被轉(zhuǎn)化為4-二礙酸胞啶基-2(:-甲基-D-赤藻糖醇。已知催化該歩驟的酶是，例如，4-二疇酸胞啶基-2('甲基-D-赤藻糖醇合成酶。編碼該種酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(AF230736;大腸桿菌)、(NC—007493，bcus—tagRSP—2835;球形紅細(xì)菌2.4.1)、(NC一()03071,locus—tagAT2G025()();擬南芥)和(N(:—002947,locusjagPP1614;惡臭假單胞菌KT2440),在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇被轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醉-2-磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇激酶。編碼該種酶的核普酸序列的一些非限制性范例包括(AF2J63()0;大腸桿菌)和(NC.007493，bciis.tagRSP—779;球形紅細(xì)菌2.4.1)。在第五步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-環(huán)二疇酸合成酶。編碼該種酶的核苷酸序列的--些非限制性范例包括(AF230738;大腸桿菌)、(NC—007493，1ocus」agRS.P—6071;球形紅細(xì)菌2.4.1)和(NC—002947，locusjagPP1618;惡臭假單胞菌K.T244())。在第六步中，2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環(huán)二磷酸被轉(zhuǎn)化為1-羥基-2-甲基-2-(E>-丁烯基-4-二磷酸。已知催化該步驟的酶是，例如，卜羥基》2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。編碼該種酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(AY0335!5;大腸軒菌)、(NC002947，locus—tagPP085);惡臭假單胞菌KT2440)和(NC007493，locustagRS:P_2982;球形紅細(xì)菌2,4.〗)。在第七步中，1幾基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被轉(zhuǎn)化為IPP或其異構(gòu)體，即I:)MAPP。已知催化該步驟.的酶是，例如，異戊基/二甲基歸丙基二磷酸合成酶。編碼該種酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(AY()62212;大腸桿菌)和(NC—002947，locus—tagPP()6()6;惡臭假單胞菌KT244())0在--些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞自身的代謝過程和本發(fā)明提供的涉及IPP生成的過程之間的"串音"(或千擾)被最小化或完全消除。例如，當(dāng)該宿主微生物專門依賴DXP途徑合成:PP，而將MEV途徑導(dǎo)入以提供額外的1P:P時(shí)，串音被最小化或完全消除。該種宿主微生物不會被賦予改變該MEV途徑酶的表達(dá)的能力或被賦予處理與該MEV途徑相關(guān)的中間體的能力。專門或主要依賴DXP途徑的有機(jī)體包括，例如，大腸桿菌。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞專門通過MEV途徑或與I)XP途徑聯(lián)合生成i:pp。在其它實(shí)施方案中，宿主[)xp途徑失去功能，從而使宿主細(xì)胞專門通過外部引入的MEV途徑生成PP。可通過使一種或多種DXP途徑酶停止基因表達(dá)或功能失活使該DXP途徑失去功能。G,5類異戊二烯起始原料類似i:pp,法呢基焦磷酸("FPP")也可通過生物學(xué)方法制備,、一般而言，可將兩分子的.IPP與一分子的DMAPP縮合形成.FPP。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)可被已知催化該步驟的酶(例如，法呢基焦磷酸合成酶)所催化。編碼法呢基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的一些非限制性范例包括(ATU80605;擬南芥)、(ATHFPS2R;擬南芥)、(AAU36376;青蒿素)、(AF461050;牛)、(D00694;大腸桿菌K-12)、(AE009951,LocusAAL95523;具核梭桿菌亞種皿cleatumATCC25586)、(GFFPPSGEN;騰倉赤霧菌)、(CP()0()0()9，LocusAAW6(X)34;氧化葡糖桿菌62〗H)、(A:F()1卿2;向日葵)、0-ll.層'APS;智人)、(KLPFPSQCR;乳酸克魯維酵母)、(LAUI5777;白羽扇豆)、(LAU2(:)771;白羽扇豆)、(A:F3()95()8;小家鼠)、(NCFPPSGEN;粗糙鏈孢霉)、(PAFPS1;銀膠菊)、(PAFPS2;銀膠菊)、(RATFAPS;褐鼠)、(YSCFPP;釀酒酵母)、(:D89104;粟酒裂殖酵母)、(CP()000(B,LocusAAT87386;化膿性鏈球菌)、(C:PO()()017,LocusAAZ51849;化膿性鏈球菌)、(NC—008022，LocusYP—598856;化膿性鏈球菌MGASi0270)、(NC—008023,LocusYP—600845;化膿性鏈球菌MGAS2096)、(NC—008024，LocusYP—602832;化膿性鏈球菌MGAS10750)和(MZEFPS;玉朱)。同時(shí)生物生成ipp和fp:p的方法已有描述，可參考包括w(:)2006/0〗4837和美國專利公開號2003/0J48479、2()()4/0()()5678和2006/0079476。實(shí)施例1和2還提供了制備這些化合物的實(shí)施方囊。F:PP隨后可被轉(zhuǎn)化為多種cl5類異戊二烯。一般而言，可以非環(huán)式(帶支鏈或線性)和環(huán)式(帶有或不帶有側(cè)鏈)的c15類異戊二烯作為起始原料。然而，在本發(fā)明的實(shí)施中，通過非環(huán)式c,5類異戊二烯生成日標(biāo)化合物需要更少的化學(xué)步驟。適用的c!5類異戊二晞起始原料的一些非限制性范例包括但不限于a-法呢蜂a-法呢烯，其結(jié)構(gòu)為發(fā)現(xiàn)存在于多種生物來源，包括但不限于，螞蟻的杜氏腺以及蘋果和梨皮的覆層。從生物化學(xué)角度看，a-法呢烯可由FPP通過a-法呢烯合成酶生成。編碼該種酶的適用核苷酸序列的一些非限制性范例包括(DQ3()9()34;P，附cowww/,s'cw//'/vflrJ'』^/'oM);ft(AY182241;iW"/Mscfo/&"/c")。^#-見Pechouus等人，Planta219(1):84-94(2004)。卩-法呢烯卩-法呢烯，其結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>發(fā)現(xiàn)存在于多種生物來源，包括但不限于，蚜蟲和精油(如薄荷油)。在一些植物(如野生馬鈴薯)中，P-法呢埽作為天然驅(qū)昆蟲劑被合成。從生物化學(xué)角度看，p-法呢晞可由F:PP通過p-法呢烯合成酶生成。編碼該種酶的適用核苷酸序列的一些非限制性范例包括(A.F024615;x/々;e;'/to)和(AY835398;^Tfe冊"'/'o"/w認(rèn))。參見Picaud等人，Phytochemistry66(9):961-967(2005)。法呢商f法呢醇，其結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>發(fā)現(xiàn)存在于多種生物來源，包括昆蟲和來自巖蘭草(cintronella)、橙花油、仙客來、檸檬草、晚香玉以及玫瑰的精油。從生物化學(xué)角度看，法呢醇可由FPP通過法呢醇合成酶等羥化酶生成。編碼該種酶的適用核普酸序列的--些非限制性范例包括(AF529266;玉米)和(YDR48〗C;釀酒酵母)。參見Song，L.,AppliedBiochemistryandBiotechnology128:149-158(2006)。橙花叔醇橙花叔醇，其結(jié)構(gòu)為也稱為peruviol,其發(fā)現(xiàn)存在于多種生物來源，包括來自橙花油、姜、茉莉、薰衣草、茶樹和檸懞草的精油。從生物化學(xué)角度看，橙花叔醇可由FPP通過橙花叔醇合成酶等鞋化酶生成。編碼該種酶的適用核苷酸序列6纟一些一〉限制性范例包括來自玉米的AF529266(玉蜀恭；基因tpsl):,在一些實(shí)施方案中，所述類異戊二烯起始原料可從天然存在的萜烯獲得或制備得到，該裕烯可由多種植物(例如，Co^"^ra/w吸wfor//、針葉樹，和大戟樹)，昆蟲(例如，燕尾蝶、葉甲、白蟻以及松葉蜂)和海洋生物(例如，海藻、海綿、珊瑚、軟體動物和魚)生成。Co/，a〖;/en3/""g,"/o/:/h'或Copaifera樹也稱為柴油樹和煤油樹。它在；也方i吾言中具有多個(gè)名稱，包"l舌/("pa:v、c"/"、'附o和o/r〃)'ra。Copaifera樹可在其木材和葉子中生成大量的綜蜂烴。一般而言,一顆Copaifera樹每年可生成約30至約40升的裕蜂油。萜烯油還可從針葉樹和大戟樹獲得。針葉樹屬于植物中的松柏r](Pinophyta或Coniferae),且通常為具有維管組織的以松果攜帶種子的植物。針葉樹中大部分是樹，但有些針葉樹可能是灌木。合適的針葉樹的一些非限制性范例包括雪松、柏樹、道格拉斯椒樹、機(jī)樹、杜松、貝殼松、落葉松、松樹、紅杉、云杉、以及紫杉.大戟樹，也稱為E叩horbia，是在全世界廣泛分布的植物，屬f-大戟家族(E叩horbiaceae)。大戟樹由約2")()個(gè)種類，是植物王國最大的物種之一。所述C,5類異戊二烯起始原料為倍半稱，它是稱為薛烯的更大類別化合物的一部分。作為烴類中較大的類別，薛烯包括半薛烯、單薛烯、倍半萜、二萜烯、二倍半碎、三碎烯、四萜烯和多裕烯。因此，適用的Ci5類異戊二烯起始原料可從本發(fā)明中采用的路烯油分離?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化本發(fā)明所公開的燃料組合物可包含(1)，或其中Z如上文定義。式(I)或(1I)可通過本領(lǐng)域已知的任意方法制備得到，包括生物學(xué)方法和化學(xué)合成(不使用生物來源的原料)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Ci5類異戊二烯起始原料可從天然存在的來源分離得到。例如，法呢醇可從巖蘭草、enroli、仙客來、檸懞草、晚香玉和玫瑰分離得到。在另一實(shí)施方案中，該C!5類異戊二烯起始原料可通過經(jīng)改造生成該化合物或提高了該天然存在的化合物的產(chǎn)量的宿主細(xì)胞制備得到。不管其來源為何，每一種Ci5類異戊二烯起始原料均可通過任何已知的還原反應(yīng)(例如氫化，或者還原反應(yīng)和酯化的組合)被化學(xué)轉(zhuǎn)化為燃料組分或燃料添加劑。在--些實(shí)施方案中，該C15類異戊二烯起始原料采用催化劑(洌如Pd、Pd/C、Pt、Pt(:)2、Ru(PPh3)2C:l2、蘭尼鎳、或其組合)被氯化還原。在一個(gè)實(shí)施方案中，該催化劑為Pd催化劑。在另一實(shí)施方案中，該催化劑為5%Pd/c。在進(jìn)一步的實(shí)施方囊中，該催化劑為高壓反應(yīng)容器中的.!()%Pd/(::'，該反應(yīng)允許進(jìn)行至完成。一般而言，在完成后，可洗滌該反應(yīng)混合物，濃縮，并千燥以獲得相應(yīng)的氫化產(chǎn)物。替代性地，也可使用任何能將C::C鍵還原為c-c鍵的還原劑。例如，該Cj5類異戊二烯起始原料可通過在(:)2下，在催化劑(例如，5-乙基-3-甲基光黃素高氯酸g旨)存在下以肼處理氫化得到相應(yīng)的氫化產(chǎn)物。該種用肼進(jìn)行的還原反應(yīng)披露于.Imada等人，J,Am.Chem,Soc,127，14544-14545(2005)(在此通過引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，所述C,5類異戊二烯起始原料中的C二C鍵在室溫下于催化劑和氫的存在下被氮化還原為相應(yīng)的C-C鍵,:.在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該催化劑為下文流程1所示的10%Pd/C。流程1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>根據(jù)上述流程1獲得的全飽和Cu醇可通過任何已知的酯化劑(例如羧酸、羧酸鹵化物(例如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)和羧酸酐)被進(jìn)一步修飾以生成相應(yīng)的飽和C!5酯。該酯化反應(yīng)可在任意被技術(shù)人員認(rèn)可的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該C,5醇起始原料通過在酸或堿催化劑的存在下，或在Fischer或Steglich酯化條件下與目標(biāo)羧酸反應(yīng)被酯化。在其它實(shí)施方案中，該Ci5醇起始原料可在堿催化劑(例如，胺或吡啶化合物)的存在或缺失下與目標(biāo)羧酸卣化物反應(yīng)被酯化。在其它實(shí)施方案中，如下文流程2所示，該C,5醇起始原料可在堿催化劑(例如，胺化合物(如，三乙胺))的存在或缺失下與日標(biāo)羧酸酐反應(yīng)被酯化。完成的反應(yīng)混合物可被濃縮、洗滌并千燥生成相應(yīng)的酯。流程2替代性地，所述飽和Ci5酯可從所述飽和的Ci5醇獲得.，可通過下文流程3所示的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)得到所需的酯。該轉(zhuǎn)酯反應(yīng)可在任意被技術(shù)人員認(rèn)可的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)酯反應(yīng)被堿催化劑(例如堿金屬(如:Li、Na、K.、Rb和Cs)和堿性(例如Mg、Ca、Sr和Ba)氬氧化物、碳酸鹽或醋酸鹽或其組合)所催化。流程3"R『QR+'R"-OH在一些實(shí)施方案中,所述全飽和C，5醇可通過任何已知的烷化劑如R-X被進(jìn)一步修飾生成相應(yīng)的酯，其中R為烷基，而X為良好的離去基團(tuán)，例如卣素、磺?；?、疏酸根基團(tuán)等。烷化劑的一些非限制性范例包括烷基鹵化物、烷基磺酸酯和烷基疏酸酯等。一般而言，該C!5醇可首先通過堿轉(zhuǎn)化為(:15烷氧化物，然后該C,5烷氧化物可如下文流程4所示與R-X反應(yīng)形成相應(yīng)的酯，其中X為CI、Br或i。在一些實(shí)施方案中，該堿可以是活性金屬，例如金屬鈉或金屬氮氧化物，如氬氧化鈉、氮化鋁鋰以及硼氫化鈉。'、々程4飛0HX=C1、Br或I替代性地，c^烯醇可首先如上文所述被烷基化或酯化，然后如下文流程5所述被氫化，其中R'為R或CeO)R,而R為H或烷基。流程5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>參照下文流程6，所述酯化可通過與如上所述相同的方式進(jìn)行。后續(xù)的氫化可以以如上所述的相同方式進(jìn)行。替代性地，可采用任意不影響所迷-0-C(=0)R基團(tuán)的氫化催化劑進(jìn)行雙鍵的后續(xù)選擇性氫化。在一些實(shí)施方案中，該氫化催化劑為Pd/C，以二苯疏醚為催化劑毒物，從而選擇性還原烯烴光能團(tuán)，而不會氬化該0-C(=0)R基團(tuán)，參見Mori等人，Org,Lett,8,3279-328〗.(2006)，在此通過引用并入本文。在其它實(shí)施方案中，可使用聚.(乙二西f)和Adams催化劑(即，Pt02)作為溶劑，從而在1個(gè)大氣壓下通過氫氣選擇性氫化雙鍵。Adams催化劑的使用披露于Chandrasekhai'等人，J,Org,Chem.71，2196-2199(2006)，其在此通過引用并入本文。流程6所述Ci5類異戊二烯起始原料的氫化可在不對稱氫化催化劑(例如銠-手性雙膦復(fù)合物)存在的情況下進(jìn)行，從而形成基本不含其它立體異構(gòu)體的立體特異性氫化產(chǎn)物。該非對稱氫化催化劑的非限制性范例包括銠-D1PAMP催化劑。該銠-DIPAMP催化劑和其它非對稱氫化催化劑披露于Vineyard等人，J.Am,Chem,Soc.1977,99，(18)，5946;RyojiNoyori，"AsymmetricCatalysisInOrganicSynthesis,"JohnWii.ey&■SonsInc.,NewYork,第2章,pp.16-94(1994);和Blaser等人,"AsymmetricCatalysisonIndustrialScale:Challenges,ApproachesandSolutions,"Wiley-VCH，Weinheim，pp.23-52(2004)，其全文均在此通過引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，a-法呢煤和p-法呢烯可在不對稱氫化催化劑存在的情況下氫化形成下文所示的法呢烷的四種可能的立體異構(gòu)體之一，即，化合物(ni-a)、(iH:-b)、(in-c)、和(m-d)之一。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>類似地，法呢醇可在不對稱氫化催化劑存在的情況下氬化形成如下所示的3,7Ji-三甲基十二烷-1-醇的四種可能的立體異構(gòu)體之一。類似地，橙花叔醇可在不對稱氫化催化劑存在的情況下氫化形成如下所示的3，7,11-三甲基十二烷-3-醇的四種可能的立體異構(gòu)體之一。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>13(\萬H3、，類似地，C!5烯醇或其烷基化的、酯化的、疏酸化的、磷酸化、^t酸化的或是膦酸化的產(chǎn)物可在不對稱氫化催化劑的存在下被氫化形成相應(yīng)的立體特異性氫化產(chǎn)物。在另--替代性的方法中，所述C!5烯醇的烷基化、S旨化、疏酸化、磺酸化、磷酸化或膦酸化可同時(shí)進(jìn)行。燃剩-組合物本發(fā)明所公開的燃料組合物可通過具有成本效益的和環(huán)境友好的方式制備。有利的是，本發(fā)明所提供的類異戊二烯化合物可通過一種或多種微生物生成。因而，這些類異戊二烯化合物可以提供可用于柴油或噴氣燃料，特別是本發(fā)明所提供的燃料組合物的可再生能源。此外，這些類異戊二烯化合物可降低對不可再生的燃料、燃料組分和/或燃料添加劑來源的依賴性。如上文所述，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了特別地可用作柴油燃料或噴氣燃料的各種燃料組合物。與目前的柴油和脂肪酸甲s旨化衍生的生物柴油燃料相比，本發(fā)明所公開的燃料組合物能夠更好地耐受氧化降解，因而具有更高的保存期。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，該燃料組合物具有至少約一年、至少約兩年、至少約三年、至少約四年、至少約五年、至少約十年、至少約十五年、至少約二十年或至少約二十五年的保存期。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有至少約五十年的保存期。在其它實(shí)施方案中，該燃料組合物具有超過五十年的保存期。盡管本發(fā)明已通過有限量的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但一個(gè)實(shí)施方案的特定特征不應(yīng)歸因于本發(fā)明的其它實(shí)施方案。沒有一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案可代表本發(fā)明的所有方面。在一些實(shí)施方案中，所述組合物或方法可包括多種此本發(fā)明未提及的化合物或步驟。在其它實(shí)施方案中，該組合物或方法不包括，或基本不包括，本發(fā)明未列舉的任何化合物或步驟.。本發(fā)明所述的實(shí)施方案存在變體和變動。例如，所述柴油燃料不需要是普通石蠟和支鏈?zhǔn)灥幕旌衔?。它可包含任意類型的烴，只要該柴油燃料中的芳香烴含量以重量計(jì)小于10%,硫含量小于100ppm。盡管優(yōu)選該柴油燃料具有以重量計(jì)小于10%的芳香烴含量和小于l()Oppm的硫含量，但針對某些目的，可接受含有以重量計(jì)大亍10%的芳香烴含量和高于100ppm的疏含量的柴油燃料。應(yīng)注意，該柴油燃料的應(yīng)用不限于柴油發(fā)動機(jī)；它可用于任何需要柴油燃料的裝備，例如應(yīng)急發(fā)電機(jī)。盡管法規(guī)要求所有的柴油燃料具有至少40的十六烷值，但并非所有本發(fā)明的實(shí)施方案的柴油燃料需要滿足該法規(guī)要求。換言之，可接受十六烷值低于40的柴油燃料。應(yīng)注意，所述的制備和使用該柴油燃料的方法涉及多個(gè)步驟。在一些實(shí)施方案中，這些步驟可以任意順序?qū)嵤?。在一些?shí)施方案中，可省略或合并--個(gè)或多個(gè)步驟，但依然實(shí)現(xiàn)基本相同的結(jié)果。附加的權(quán)利要求書意在覆蓋所有落入本發(fā)明范圍的該種變體和變動。本說明書中所涉及的所有出版物和專浮'j申請均通過引用并入衣文，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物和專利申請?zhí)囟ǖ貑为?dú)通過引用并入本文一樣。盡管前述發(fā)明已通過闡釋目的的圖示和范例進(jìn)行詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)能夠輕易理解可在不脫離附加權(quán)利要求的精神和范圍的情況下對其進(jìn)行一定的更改和調(diào)整。實(shí)施例除非另行指明，本發(fā)明的實(shí)施可采用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的生物合成等行業(yè)中的常規(guī)技術(shù)。對于本發(fā)明未完全描述的該種技術(shù)，人們可在科技文獻(xiàn)中找到有關(guān)于此的充分參考。在如下的實(shí)施例中，我們努力確保所用數(shù)字(例如量、溫度等)的精確性，但應(yīng)容許變化和偏差，且當(dāng)此處存在該種數(shù)值的書寫錯誤時(shí)，本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)能根據(jù)本發(fā)明的其余公開推導(dǎo)出正確的值。除非另行指明，溫度用攝氏度表示，壓力等于或接近海平面的大氣壓。除非另行指明、所有的試劑可通過化學(xué)方法獲得。以下實(shí)施例意在闡述目的，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例描述了的編碼酶(包括來自操縱子調(diào)節(jié)的釀酒酵母MEV途徑的酶)的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法。表達(dá)質(zhì)粒pMevT可通過將MevT操縱子插入pBAD33載體后生成。該MevT操縱子編碼MEV途徑的一組可共同將普遍存在的前體乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(R)-甲羥戊酸的酶，即乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMG輔酶A合成酶和HM'G輔酶A還原酶。從大腸桿菌基因組DNA得到基因的編碼序列(GenBank登錄號N(〕—000913REGION23241312325315)(編碼乙跳乙酰輔酶A硫解酶)，從釀酒酵基因組DNA獲得服;"基因的編碼序列(Gen:Bank登錄號X96617,REGION2201695)(編碼HMG輔酶A合成酶),并從釀酒酵母基因組DNA獲得.//M(7/基因的編碼區(qū)域的一個(gè)片段(GenBank登錄號M22002,REGION16603165)(編碼截短HMG輔酶A還原酶(tHMGR)),通過PCR擴(kuò)增生成該MevT操縱子。用于//MG7基因片段擴(kuò)增的上游:PCR引物包括人工起始密碼子。通過重疊延伸(SOEirig)將擴(kuò)增的片段拼接在--起，在該過程中，將核糖體接合位點(diǎn)導(dǎo)入到"toA和￡/(7/J編碼序列的后面。添加3'A懸掛后，將該MevT操縱子連接至TA克隆載體pCR4(Invi加gen，Carlsbad,CA)。隨后，該MevT操縱子被連接至栽體pBAD33的A^船/ft//限制性位點(diǎn)(Guzman等人(199S)JBacterid177(14)4121-4130)。為使該操縱子受到Pn啟動子的控制，以pBBRIMCS的M',7-U片段替換pBAD33的《raC-/^,l0A^//-^mZ片段，從而得到表達(dá)載體pM:evT(參見美國專利7,192,751)。表達(dá)質(zhì)粒pAM36-MevT66可通過將M:evT66操縱子插入pA.M36栽體生成。pAM36載體可通過將含有^/~A/S/-Xto/-P"c/-Ks//-JP,we/限制性位點(diǎn)的寡聚核苷酸盒插入pACYCi84載體(GenBank登錄號XO6403),并除去pACYC〗84中四霉素耐受性獲得基因(conferringgene)后獲得。該MevT66操縱子可通過以SEQIDNOI為模板合成得到，該SEQIDNO1包含了來自大腸軒菌的atoS基因(GenBank登錄號NC—000913REGION2324131..2325315)，來自釀酒酵母的￡膨3基因(GenBank登錄號X96617,REGION220..1695),以及來自釀酒酵母的截短型//MG7基因(GenBank登錄號:M22(:)02，REGION1777J285),所有這三種序列被密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。該合成生成的MevT66操縱子被5'限制性位點(diǎn)和3!州"J/〃限制性位點(diǎn)所包夾，因此可被克隆進(jìn)入克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源的載體)的相容限制性位點(diǎn)。該MevT66操縱予被PCR擴(kuò)增，并帶有側(cè)翼的胡/和限制性位點(diǎn)，使用斬/和A/5/限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的DNA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，通過凝膠純化試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)凝膠提取約4.2kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pAM36載體的鄰/Av/S/限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM36-MevT66。表達(dá)質(zhì)粒pAM25可通過將MevT66操縱子插入pAM29載體生成。該pAM29載體可通過將來自pZS24-MCS1的pl5A復(fù)制起始區(qū)和卡那霉素耐受性獲得基因(LutzandBqjard<1997)NuclAcidsRes,25:〗203-1210)與寡聚核苷酸生成的啟動子裝配產(chǎn)生。使用i"說/和/〃/限制性內(nèi)切酶將包含MevT66操縱子(參見上述pAM36-MevT66的描述)的I)NA合成抅建體消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.2kbI)NA片段，并將分離的DNA片段連接至pA:M296的￡co./////^//限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM:25。表達(dá)質(zhì)粒pMev:B-Cm可通過將Mev:B操縱子插入pB:BRlMCS-1載體,后生成。該MevB操縱子編碼一組能共同將(:r.)-甲羥戊酸化為:i:pp的酶，即甲羥戊酸激酶、褲酸甲羥戊酸激酶以及甲幾戊酸焦磷酸脂羧化酶。該MevB操縱子可通過從釀酒酵母基因組DNA中PC.R擴(kuò)增基因(Gen.Bank登錄號X55875,REGION:580..1911)(編碼甲鞋戊酸激酶)、基因(GenBank登錄號Z49939,REGION:3363..4718)(編碼磷酸甲鞋戊酸激酶)、以及MFD/基因(Gen:Bank登錄號X97557,REGION:544,,1734)(編碼甲羥戊酸焦磷酸脂羧化酶)的編碼序列，并通過重疊延伸(S(:)Eing)將PCR片段拼接在一起后獲得。通過選擇適當(dāng)?shù)囊镄蛄?，在擴(kuò)增過程中將￡/"G/2和的終止密碼子由TAA變?yōu)門AG,以引入核糖體結(jié)合位點(diǎn)。添加3'A懸掛后，將M:evB操縱子連接至TA克隆載體pCR4(:Invitrogen，Carlsbad,CA)一通過以限制性內(nèi)切酶完全消化該克隆構(gòu)建體以切除該MevB操縱子，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.2kbDNA片段，并將分離的DNA片段連接至pBBRlMCS-1載體的限制性位點(diǎn)(Kova.ch等人，Gene66(1):175-176(1995)),從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pMevB-Cim。表達(dá)質(zhì)粒pMBI可通過將MBI操縱子插入pBBRlMCS-3載體生成。除了該MevB操縱子的酶外，該MBI操縱子還編碼異戊烯基焦磷酸酶異構(gòu)酶，其將IPP催化轉(zhuǎn)化為DM:APP,:,該MBI操縱子可通過如下方式獲得以在5'端包含A^m/限制性位點(diǎn)的引物從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增基因(GenBank登錄號AF119715)的編碼序列，使用限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的I)NA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約0.5kb片段，并將分離的DNA片段連接至pMevB-Cm表達(dá)質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)，從而將置于MevB操縱子的3'端。將該MBI操縱子亞克隆進(jìn)入栽體pBBRlMCS-3的&//5^.〃艮制性位點(diǎn)(:1^0乂3(:11等人，Gene")6(i):175-176(1995))，從而獲得表達(dá)栽休p:MB:〖(參見美國專利7,192,751)。通過將^p/i基因插入p:MBI生成表達(dá)質(zhì)粒pMBIS。該/平j(luò)基因編碼法呢基焦磷酸合成酶，該酶將兩分子IPP與一分予DMAPP催化縮合生成FPP。采用具有&c〃限制性位點(diǎn)的正向引物和具有限制性位點(diǎn)的反向引物從大腸桿菌基因組DNA中PCR擴(kuò)增該/取4基因(GenBank登錄號D00694，REGION:484..D83)的編碼序列。使用S"c〃和&k/限制性內(nèi)切Sl將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約().9kb片段，并將分離的DNA片段連接至p:M:BI.表達(dá)質(zhì)粒的&^〃&'/限制性位點(diǎn)，從而將該/'v^基因置于和MevB操縱子的3'端，并獲得表達(dá)質(zhì)粒pMB！S(參見美國專利號7,192,751)?？赏ㄟ^將所述MBIS操縱子插入pAM36-MevT66,并在MB1S和M:evT66操縱子之前添加《:/K5啟動子以形成表達(dá)質(zhì)粒pAM45。通過包含5'屈o/限制性位點(diǎn)和3'尸"c/限制性位點(diǎn)的引物從pMBIS中PCR擴(kuò)增該MBIS操縱子，使用和尸"('/限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物,凝膠提取約5.4kbDNA片段,并將分離的DNA片段連接至pAM36-MevT66的屈o/Pflc/限制性位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM:43。包含編碼/ac/K5啟動子的核苷酸序列的DNA片段可由寡聚核普酸合成得到，并亞克隆進(jìn)入pAM43的，4,w/和Av/S/A7o/限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM45。實(shí)施例2本實(shí)施例描述了的編碼酶(包括來自操縱子調(diào)節(jié)的金黃色葡萄球菌MEV途徑的酶)的表達(dá)載體的制備方法。可通過將表達(dá)質(zhì)粒pAM25的//似G./基因(編碼戴短釀酒酵母HM(]輔酶A還原酶)的編碼序列替換為"";W基因(編碼金黃色葡萄球菌HMG輔酶A還原酶(GenBank登錄號BA00007，REGION:2688925,2687648))的編碼序列獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM41。使用引物4-49mvaAS/—(SEQIDNO:13)和4-49mvaAR(SEQIDNO:14)從金黃色葡萄球菌(ATCC70069)基因組DNA.中PCR擴(kuò)增附'ra/i基因的編碼序列，使用5^e/限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增的:DNA片段消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約！.3kbDNA片段。通過使用////k////限制性內(nèi)切酶將pAM25消化完全，從該質(zhì)粒去除/7AG/編碼序列。泉用T4I)NA聚合酶截短所得線性DNA片段的末端懸掛。然后采用限制性內(nèi)切酶部分消化該DNA片段，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約4.8kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至5i^/-消化的wra」PCR產(chǎn)物，以獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM41。可通過將表達(dá)質(zhì)粒pAM41的￡WG73基因(編碼釀酒酵母HMG輔酶A合成酶)的編碼序列替換為ww"5基因(金黃色葡萄球菌HMG輔酶A合成酶(GenBank登錄號BA000017，REGION:2689180,.2690346))的編碼序列獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM52。使用引物HMGS5'Sa""處S"-S(SEQIDNO:15)和HMGS3'Sa續(xù)S-AS(SE.QIDNO:16)從金黃色葡萄球菌(ATCC7()069)基因組DNA中PCR擴(kuò)增基因的編碼序列，該擴(kuò)增的DNA片段可用作PCR引物，以根據(jù)Geiser等人(BioTechniques3i:88-92(2001))的方法替換pAM41中的Z/MG/基因的編碼序列，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM52。pAM52中包含的"toy5(opt):/m'，aS:附ra/操縱子的核普酸序列為SEQIDNO:2?？赏ㄟ^將表達(dá)質(zhì)粒pAM45的MevT66操縱子替換為pAM52的("to^(opt):wmS:wva4)操縱子獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM97。使用A/S/和鄰/限制性內(nèi)切酶將表達(dá)質(zhì)粒pAM45消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取缺失該MevT66搡縱子的約8.3kbDNA片段。使用引物！9-25e加S鄰/"S(SEQIDNO:17)和19-25wra,4-J,s/S/-AS(SEQ11)NO:18)PCR擴(kuò)增pAM52的(flto5(opt):附v必:"n說4)操縱子，使用柳和/lx說限制性內(nèi)切酶PCR產(chǎn)物消化完全，通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取約3.8kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至表達(dá)質(zhì)粒pAM45的A必Y胡/限制性位點(diǎn)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM97(參見圖3的質(zhì)粒圖譜)。實(shí)施例3本實(shí)施例描述了編碼酶(包括來自操縱子調(diào)節(jié)的大腸桿菌DXP途徑的酶)的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法。表達(dá)質(zhì)粒pA:M408可通過將編碼"頂端"DX:P途徑的酶的基因插入pAM29載體后生成。"頂端"DXP途徑的酶包括l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大腸桿菌的基因編碼)、1-脫氧-D-木酮糖》5-砩酸還原異構(gòu)酶(由大腸桿菌的血r基因編碼)、4-二磷酸胞啶基-2C-甲基4)-赤藻糖醇合成酶(由大腸桿菌的/,spD基因編碼)以及4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大腸桿菌的基因編碼)，這些酶共同將丙酮酸鹽和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。包含編碼"頂端"DXP途徑的酶的核普酸序列的DNA片段可通過使用SEQIDNO:19-26所示的PCR引物PCR.擴(kuò)增來自大腸桿菌菌抹DH1(AT(:C弁33849)的(GenBaiik登錄號1腦()％REGION:437539..439401),At(GenBank登錄號U()()()%REGION:1.93521,.194717)、一D(GenB肌k登錄號U()()0%REGK:)N:2869803..28705.12)以及,'s尸五(Gen:B肌k登錄號U()00%REGION1261249.」2621.OO)基因編碼序列并添加最佳ShineDalgarno序列以及5'和3'限制性位點(diǎn)來生成。凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠提取，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(.狄0/和用于包含基因的PCR產(chǎn)物；和Jpfl/用于包含血r基因的PCR產(chǎn)物；卻tf/和用亍包含一D基因的PCR產(chǎn)物；AWe/和Mw/用于包含/印￡基因的PCR產(chǎn)物)消化至完全，并使用PCR純化試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)進(jìn)行純化。然后將大約等摩爾的各PCR產(chǎn)物添加至連接反應(yīng)，以將單個(gè)基因組裝配入操縱子,:，1ul的該連接反應(yīng)的反應(yīng)混合物被用于PCR.擴(kuò)增兩個(gè)單獨(dú)的基因盒，即血"、t和—純/，￡基因盒。使用引物67-IA-C(SEQIDNO:19)和67-1D-C(SEQDNO:22)PCR擴(kuò)增該ofe-血r基因盒，并使用引物67-lE-C(SEQII)NO:23)和67陽1H-C(SEQIDNO:26)PCR擴(kuò)增該基因盒。通過凝膠電泳分離兩種PCR產(chǎn)物，并凝膠提取。使用和々;a/限制性內(nèi)切酶將包含該血r基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全，使用j戸/和M/m/限制性內(nèi)切酶將包含該一Z)-—￡基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全。純化該兩種PCR產(chǎn)物，并將純化的DNA片段連接至pAM29載體的5^//.緒///限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM408(參見圖4的質(zhì)粒圖譜)。表達(dá)質(zhì)粒pAM409可通過將編碼"底部"DXP途徑的酶的基因插入pAM369載體后生成,"底部"DXP途徑的酶包括2C-甲基-D-赤錄糖醇2，4-環(huán)二磷酸合成酶(由大腸桿菌的,'一，基因編碼)、1-羥基-2-甲基-2-(E)--〗-雄.基—4-二磷酸合成酶(由大.腸軒菌的/5/)G基因編碼)以及異戊烯基—/二甲基蹄丙基二磷酸合成酶(由大腸桿菌的m//Z基因編碼)，這些酶共同將4-二磷酸胞咬基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸轉(zhuǎn)化為IPP和I:〕MAPP。:1PP還可通過并戊基二磷酸異構(gòu)酶(由大腸桿菌的基因編碼)的活性轉(zhuǎn)化為DMAPP。DMAPP還可通過法呢基二磷酸合成酶(例如由大腸桿菌的基因編碼)的活性進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為FPP。編碼"底部"DXP途徑的酶以及異戊基二磷酸異構(gòu)酶和法呢基二磷酸合成酶的操縱子可通過使用SEQIDNO:27-36所示的PCR引物PCR擴(kuò)增來自大腸桿菌菌抹DH1(ATCC#33849)的/平F(GenBaiik登錄號U00096REGION:2869323..2869802)、/:spG(GenBank登錄號U00096REGION:2638708,2639826)、(GenBank登錄號U00096REGION:26277..27227)、滅(Gen:Ban.k登錄號AF119715)以及/,sp/f(GenBank登錄號D00694REGION:484,.!383)基因并添加最佳ShineDalga腦序列以及5'和3'限制性位點(diǎn)來生成。凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠提取，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(i證///和/用于包舍/一，基因的PCR產(chǎn)物;一/和卻"/用于包含/^G基因的PCR產(chǎn)物；&〃和用于包含/.^//基因的PCR產(chǎn)物;S"〃和用于包含W基因的PCR產(chǎn)物;〃,W〃/和A/ra/用于包含基因的PCR產(chǎn)物)消化至完全，并純化。然后將大約等摩爾的各PCR產(chǎn)物添加至連接反應(yīng)，以將單個(gè)基因組裝進(jìn)入操縱子。1ul的該連接反應(yīng)的反應(yīng)混合物被用于PCR擴(kuò)增兩個(gè)單獨(dú)的基因盒，即/,甲/^罕G和基因盒。使用引物67-2A-C(SEQIDNO:27)和(SEQIDNO:30)PCR擴(kuò)增該is/^/5/G基因盒，并使用引物67-2E-C(SEQIDNO:31)和67-2J-C(SEQIDNO:36)PCR擴(kuò)增該基因盒。通過凝膠電泳分離兩種PCR產(chǎn)物，并凝膠提取。使用和/(p"./限制性內(nèi)切酶將包含該/平f/5pG基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全，使用和臉o/限制性內(nèi)切酶將包含該基因盒的PCR產(chǎn)物消化完全。純化兩種PCR產(chǎn)物o載體可通過將來自pAM29的pl5A復(fù)制起始區(qū)，來自pZE12-luc的用于氨比西林耐受的卩內(nèi)酰胺酶基因(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-12!())與寡聚核普酸生成的/"d/F5啟動子裝配后生成。將包含"底部"DXP途徑操縱子的兩種分離PCR產(chǎn)物連接至pAM369載體的5""http:///Ato/限制性位點(diǎn)，以獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM409。表達(dá)質(zhì)粒PAM424，即包含廣鐠宿主性的RK.2復(fù)制起始區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒pAM409的衍生物，可通過將/ac'"K5啟動子和pAM409的/'印FGH-操縱子轉(zhuǎn)移至pAM257載體生成。載體pAM257可通過如下方式生成采用引物9-156A(SEQIDNO:)7)和9-156B(SEQIDNO:38)從RK2質(zhì)粒DNA擴(kuò)增RK2pork)cus(Meyer等人(1975)Science190:1226-1228)，使用顛//和Z/w/限制性內(nèi)切酶將該2.6kbPCR產(chǎn)物完全消化，并將該〖)NA片段連接至含有p15復(fù)制起始區(qū)和來自載體pZA31-luc的氯霉素耐受性獲得基因的質(zhì)粒(Lutz和Bujard(1997)NuclAcidsRes.25:1203-1210),以獲得質(zhì)粒pAM37-戸,'；使用限制性內(nèi)切酶和///w////將pAM37-/;"r消化完全，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，并凝膠提取包含/"rlocus和氯霉素耐受性獲得基因的DNA片段，將分離的DNA片段連接至徵-RK.2復(fù)制子pRR10的5^'////>^///位點(diǎn)(110&6115等人(1990)JBacteriol.172:6204-6216)，獲得載體pAM133;使用Sg///和///wi///限制性內(nèi)切酶將pAM133消化完全，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，并凝膠提取缺失該氨比西林耐受性基因和or/r結(jié)合起始區(qū)的約6.4kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至合成生成的包含包括尸c//和A7w/限制性位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)的DNA片段，獲得載體pAM257。使用為/和/)('//限制性內(nèi)切酶將pAM:4()9消化完全,通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，并凝膠提取約4.4kbDNA片段，將分離的[)NA片段連接至pAM257載體的A7w/尸d/限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM424(參見圖5的質(zhì)粒圖譜)。實(shí)施例4本實(shí)施例描述了將編碼酶(包括MEV途徑的晦)的核酸定向整合至S良酒酵母的特定染色體位置以制備載體的方法?；蚪MDNA分離自釀酒酵母菌沐Y002(CEN.PK2背景；MATA;ura3-52;trp1-289;ieu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)、Y()()7(S228C背景MATAtrplA63)、Y051(S228C背景；MATahis3A1leu2A0lys2A()ura3A0PGALI-HMG11586.3323pGAU.i!pc2-1erg9::PMm-ERG9::HIS3Pgau-ERG20Pg八u-HMG1，"3")以及EG123(MATALira3;trpl;leu2;his4can1)。該菌抹在含有1%酵母提取物、2%細(xì)菌蛋白胨和2%右旋糖的液體培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)中生長過夜。將10mL液體培養(yǎng)物3,100rpm離心，以10mL超純水洗滌細(xì)胞團(tuán)，再次離心以分離細(xì)胞。使用Y-DER酵母DNA抽提試劑盒(PierceBiotechnologies,Rockford，IL)根據(jù)生產(chǎn)商的.建議方案抽提基因組DNA。將抽提的基因組DNA重懸浮于中100uL10inMTris-Cl(pH8.5)，在ND-1000分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies,Wi!mington,DE)上讀取OD2柳湖讀數(shù)，以確定基因組:DNA濃度和純度。在AppliedBiosystems2720ThermocycSer(AppliedBiosystemsInc，F(xiàn)osterCity,CA)中，采用Phusion高保真DNA聚合酶系統(tǒng)(Finnzymes(:)Y，Espoo,Finland),并參照生產(chǎn)商的建議方案，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA。在完成待插入TOP(:)TAp(〕R2.1克隆載體(Invitr()gen，Cadsbad,CA)的DNA片段的PCR擴(kuò)增后，通過向該反應(yīng)混合物添加1uL的QiagenTaq聚合酶(Qiagen，Valencia,CA)，額外運(yùn)行10分鐘72°CPCR伸展步驟，然后冷卻至4i:,以生成核苷酸懸掛。在PCR擴(kuò)增完成后，將8uL的50M甘油溶液添加至反應(yīng)混合物，并將完整的混合物加載至含有0.5ug/mL溴化乙啡啶的1%TBE(0.89MTris，0.89M碉酸，0.02MEDTA鈉鹽)瓊脂糖凝股。在120V,400mA下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，并采用紫外線顯示:DNA條帶。使用無菌刀片從凝膠中切除DNA條帶，并采用Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒(ZymoResearch，Orange，CA)參照生產(chǎn)商的建議方案對切除的DNA進(jìn)行凝膠純化。將純化的DNA洗脫進(jìn)入10uL超純水，在ND-1000分光光度計(jì)上讀取OD祝,/，讀數(shù)，以確定I)NA濃度和純度。使用100-500ug的純化:PCR產(chǎn)物和高濃度的14DNA連接酶(NewEnglandBioiabs,lpswich，MA)，參照生產(chǎn)商的建議方案進(jìn)行連接。為進(jìn)行質(zhì)粒增殖，將連接的構(gòu)建體參照生產(chǎn)商的建議方案轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(.invitrogen,Cadsbad，CA)。在含有1.5%Bacto瓊脂、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl、以及50ug/mL適當(dāng)抗生素的固體培養(yǎng)基上選擇陽性轉(zhuǎn)化體。使分離的轉(zhuǎn)化體在含有50ug/mL羧芐青霉素或卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37。C下生長16小時(shí)，使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)參照生產(chǎn)商的建議方案分離和純化質(zhì)粒,通過診斷性限制性內(nèi)切酶消化驗(yàn)證構(gòu)建體，并在瓊脂糖凝膠上分離和顯示DNA片段。還可通過DNA測序驗(yàn)證選擇的構(gòu)建體，該工作由ElimBiopharrnaceut.icaisInc.(H:ay沐ard,CA)完成。通過將載體pAM471的ERG20-PGAL-tHM:GR插入物插入載體pAM466生成質(zhì)粒pAM489。通過將DNA片段ERG20-:PGAi4HMGR插入TOP(:)ZeroBluntII.克隆載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)生成載體pAM471，該DNA片段ERG20-PGAl,tHMG:R包含ERG20的開放閱讀框架(ORF)(ERG20核香酸位置1至1208;ATG起始密碼子的A為核苦酸1)(ERG20)，包含趨異進(jìn)化GAL1和GAL10啟動子的基因組基因座(GAL1核苷酸位置-1至-668)(P(iAL)，以及//M7/的截短ORF(/7MG/核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通過將DNA片段TRP1-856至+鄰插入TOPOTApCR'2.1克隆載體(〗nvitrogen，Carlsbad，CA)生成載體pAM466，該DNA片段TRP1-856至+548包含從核苷酸位置-856延伸至位置548的釀酒酵母野生型TRP1基因座，并在堿基-226和-225之間帶有非天然內(nèi)部X服"限制性位點(diǎn)。參照表1的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG20-PGAL-tHMGR和TRP1-856至+548。為構(gòu)建pAM489，使用義附rt/限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs,ipswkh，MA)將400ng的pAM471和100ng的pAM466消化完全，將對應(yīng)于E:RG2()-PGAL-tHMGR插入物和線性化的pAM466載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入物和1.摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM489《參見圖6A的圖鐠，以及ERG20-PGAL-tHMGR插入物的核苷酸序列SEQIDNO:3)。表1-生成pAM489APCR擴(kuò)增<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>通過將載體pAM472的ERG13-PGAL-t.HMGR插入物插入載體pAM467生成質(zhì)粒pAM491。通過將DNA片段E.RG13-PGA1,tHMGR插入TOPOZeroBluntII克隆載體的限制性位點(diǎn)生成載體pAM472,該[)NA片段ERGi3-PGAI-tHMGR包含ERG13的()RF(ERG13核普酸位置1至1626)(ERGL3)，包含趨異進(jìn)化GAL1和GA.Ll()啟動子的基因組基因座(GAL1核苷酸位置-1至-668)(P(;a,)，以及/做;/的載短(:)RF(///V/G/核苷酸位置1586至3323)(tHMGR)。通過將DNA片段URA3-723*701插入T(:)POTApCR2,!克隆載體生成載體pAM:467，該DNA片段URA3-723s701包含從核苷酸位置-723延伸至位置-224的釀酒酵母野生型URA3基因座、并在堿基-224和-223之間帶有非天然內(nèi)部A7w"/限制性位點(diǎn)。參照表2的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段ERG13-PGA-tHMGR和URA,723至7ul。為構(gòu)建pAM49(,使用X腿/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM472和100ng的pAM467消化完全，將對應(yīng)于ERG13-PGAl-tHMGR插入物和線性化的pAM467栽體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入物和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接、獲得pAM491(參見圖6B的圖譜，以及ERG13-PGAI,t:HMGR插入物的核普酸序列SEQIDNO:4)。表2-i威pAM491的PCR擴(kuò)增<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>通過將載體pAM473的IDU-PGAI.4HMGR.插入物插入載體pAM468生成質(zhì)粒pAM493。通過將DNA片段1DI1-PGAL-tHMGR.插入TOPOZeroBluntn克隆載體生成載體pAM473，該DNA片段IDI1-PGAL-t腦:GR包舍IDI1的ORF(II)n核苷酸位置〗至1017)(IDI1),包含趨異進(jìn)化GAL1和GA.Ll()啟動子的基因組基因座(GA:Li核苷酸位置-1至-668)(PGAI,),以及ffiWG/的截短ORF(服G7核普酸位置1586至3323)(t:HMGR)。通過將DNA片段ADEr825至653插入TOPOTApCR2.1克隆載體生成載體pAM468，該DNA片段A:D:E1—825至653包含從核苷酸位置-225延伸至位置653的釀酒酵母野生型A:D.El基因座，并在堿基-226和-225之間帶有非天然內(nèi)部A>wa/限制性位點(diǎn)。參照表3的概述通過PCR擴(kuò)增生成DNA片段1DI1-:PGAl-tHM:GR和ADE1—825至653。為構(gòu)建pAM493,使用為"/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM473和100ng的pAM468消化完全，將對應(yīng)于IDIl-PGA1,tHMGR插入物和線性化的pAM468栽體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)f的該純化插入物和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載休相連接，獲得pAM493(參見圖6C的圖譜，以及:i:[)n-p(,A1,tHM:G:R插入物的核苷酸序列seqidno:5)。表3-生成。AM493的PCR擴(kuò)增PCR循環(huán)模板引物1引物2引物3，IOOng的Y007基因組DNA6N67-CPK009-G(S即關(guān)O:47)6I-67-CPK0I0-G<SEQIDNO:鄰61-67-CPKOli-G(SEQro脆49)G(SEQIDNO:50)100ng的Y002基因組DNAG(SEQ.iD冊69)6卜67'CPK064.G(SEQIDNO:M)ion(3f卿10NO;72)6J-67-CPK065-G(SEQ!DNO:85)G(SEQNO:63)61-67-C陽53.G(S??！DNO:73)t,GR100ng的每種ADE'r825"26和ADE1-225至653純化PCR產(chǎn)物G(SK，DNO:47》G(SEQIDNO:50)100ng的每種IDI1和PGAL純化PCR產(chǎn)物G(SEQIDNO:斷6M7-CPK052*G(SEONO:72)IDU-P緣3100ng的每種IDI1-PGAL和tHMGR純化PCR產(chǎn)物G(鄉(xiāng)！DNO:63)G(SEQ!DNO:69)IDU-IWt剛GR通過將載體pAM474的ERG10-PGA1-ERG12插入物插入載體pAM469生成質(zhì)粒pAM495。通過將DNA片段ERG10-PGAI,ERG12插入topoZeroBluntII克隆載體生成載體pAM474，該DNA片段ERG10-PGAI,ERG12包含ERG10的ORF(ERGJO核香酸位置1至1347)(ERGIO)，包含趨異進(jìn)化GAU和GALIO啟動子的基因組基因座(GALI核苷酸位置-1至-668)(p(;a!)，以及ERG12的ORJF(ERG2核苷酸位置1至1482)(ERG12).通過將DN.A片段h1s3—32至-1000-hismx-his3訓(xùn)至—!朋插入topotapCR2.1克隆栽體生成載體pAM469，該DNA片段HI:S3-32至-翻-HISMX-:〖HS3504至—1103包含從核苷酸位置-32延伸至位置-1000的釀酒酵母野生型his基因座、h:1SMX標(biāo)記、和在his3鄉(xiāng)至-"的序列和該hismx標(biāo)記之間的非天然力w"/限制性位點(diǎn)。79參照表4的概述通過P(::'R擴(kuò)增生成DNA片段ERG1()-P(;AL-ERG12和HIS3"':'￡—iO0G-HISMX-HlS35O4i—'103。為構(gòu)建pAM495，使用X顧/限制性內(nèi)切酶將400ng的pAM474和l()Ong的pAM469消化完全，將對應(yīng)于ERGI0-PGAL-ERG12插入物和線性化的pAM:469載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入物和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM495(參見圖6D的圖傳，以及ERG1()-PGAL-ERG12插入物的核苦酸序列SEQIDNO:6)。表4-生成pAM495的PCR擴(kuò)增<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>**'該pAM330中的HISMX標(biāo)記束自手pFA6a-HISMX6-PGALl,如vanDijken等人((2000)EnzymeMicrob.Technol.26(9-10):706-714)所述，通過將載體pAM470的ERG8-P(iAl-ERG19插入物插入栽體pAM470生成質(zhì)粒pAM497。通過將I)NA片段ERG8-P(,讓-ERG19插入T(:)P(::)ZeroBlunt!:I克隆載體生成載體pAM475，該DNA片段ERG8-PGAI,ERG19包含ERG8的ORF(ERG8核苷酸位置1至1512)(ERG8)，包含趨異進(jìn)化GALl和GAL10啟動子的基因組基因座(GAI」核苷酸.位置-i至-668)(Pgal)，以及erg19的C)RF(ERG19核苷酸位置1至1341)(ERG19)。通過將DNA片段LEUT100至450-h:〖smx-:LEU21096至1770插入t(:):p(:)tapcr2.i克隆載體生成栽體pAM470，該DNA片段LEIJ2-!00至450-H1SM:X-LEU21096至1770包含從核香酸位置-100延伸至位置450和核苷酸位置10%延伸至位置〗770的兩釀酒酵母野生型L:EU2基因座片斷、fflSMX標(biāo)記、和LEU2")96至'77()序列與該HI:SMX標(biāo)記之間的非天然限制性位點(diǎn)。參照表5的概述通過:pcr擴(kuò)增生成DNA片段ERG8-PGAL-erg19和LEU2"00至45u-HISMX-LEU2隨至1770。為構(gòu)建pAM497，使用力做/限制性內(nèi)切晦將400ng的pAM475和100ng的pAM4709消化完全，將對應(yīng)于ERG8-PGA1,ERG19插入物和線性化的pAM470載體的DNA片段凝膠純化，并將4摩爾當(dāng)量的該純化插入物和1摩爾當(dāng)量的該種純化線性化載體相連接，獲得pAM497(參見圖6E的圖譜，以及ERG8-PGAL-ERG19插入物的核苷酸序列SEQIDno:7)。PCR循環(huán)模板引物1引物2引物3100ng的Y007基因組DNAG(SEQIDNO:56)G,IDNO:LEU2'嫩至婦6〗-67-CP,3-G(SEQIE>船，10ng的質(zhì)粒pAM330DNA**袋么乂DG(SEQIDNO:59)H隨XG(SEQDNO:印G《SEQ10船卿E'陽100ng的Y002基因組DNA<3(SEQIDNO:g!)82)G(SEQiDNO:68)61-67-'CPK啦-G(SEQIDNO:■ERG19200ng的每種LEU2畫"77o和H1SMX純化PCR產(chǎn)物6〗-67-CP隨卜G(SEQID船竭—G(SEQIDNO:s"至"70100ng的每種ERG8和PGAL純化PCR產(chǎn)物W7-CP,卜G(SEQDMO:67》G(SEQ!.DNO:曙100ng的每種LEU2—'00*450和HISMX-LEU2l096i'77o純化PCR產(chǎn)物G(SEQ!DMO:56)G(SBQ固O:崎LEU5穆氣一H麵X-LEU2'衡3100ng的每種ERG8-PGAL和ERG19純化PCR產(chǎn)物G<s:Kro賜67)Ci(SEQIDNO:ERG8-PGAI,**該pAM330中的HISMX標(biāo)記來自于pFA6a-HISMX6-PGAL1，如wMicrob.Technol.26(9-10):706-714)所述。inDijken等人((2000>Enzyme實(shí)施例5本實(shí)施例描述了編碼轉(zhuǎn)化FPP的酶的表達(dá)質(zhì)粒的制備方法。表達(dá)質(zhì)粒pAM373可通過將針對在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼青蒿素p-法呢烯合成酶(GenBank.登錄號AY835398)的核苷酸序列插入載體pTrc99A后生成。編碼(3-法呢歸合成酶的核苷酸序列可通過以SEQIDNO:8為模板合成得到，并采用引物A(SEQIDNO:86)和S|物B(SEQIDNO:87)為引物從DNA合成構(gòu)建體通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。為了在包含該p-法呢烯合成酶的PCR產(chǎn)物中創(chuàng)建前導(dǎo)M:'o/限制性位點(diǎn)，以在5'PCR引物中編碼天冬氨酸(GAC)的密碼子替換原始肽序列中編碼第二氨基酸的密碼子(TCG編碼絲氨酸)。使用M:'a/限制性內(nèi)切晦部分消化所得的PCR產(chǎn)物，并使用&c./限制性內(nèi)切酶消化完全，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，凝膠提取包含該|3-法呢烯合成酶編碼序列的約1.7kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至pTrc99A載體的Wm/限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM373(參見圖7的質(zhì)粒圖譜)。表達(dá)質(zhì)粒pAM342可通過將針對在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼挪威云杉a-法呢蜂合成酶(GeiiBank登錄號'AY473627,REGION:24..1766)的核苷酸序列插入載體pTrc99A后生成。編碼a-法呢烯合成酶的核苷酸序列可通過以SEQIDNO:9為模板合成得到，并采用引物C(SEQII.)NO:88)和引物D(SEQIDNO:89)為引物從DNA合成構(gòu)建體通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。使用iVco/和&c/限制性內(nèi)切酶完全消化所得的PCR產(chǎn)物，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，凝膠提取包含該a-法呢烯合成酶編碼序列的約1.7kbI)NA片段，將分離的DNA片段連接至pTrc99A載體的./Vco/&c/限制性位點(diǎn)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM342(參見圖7的質(zhì)粒圖譜)。表達(dá)質(zhì)粒pAM341和pAM:353可通過分別將編碼a-法呢烯合成酶或卩-法呢蹄合成酶的核苷酸序列插入載體p:RS425-Gail后生成(Mu.mbERG等人，(1994)Nud.Acids.Res.22(25):5767-5768)。該核苷酸序列插入物可采用經(jīng)過均針對在釀酒酵母中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的挪威云杉ct-法呢烯合成酶基因(GenBank登錄號AY473627,REGION:24..1766)編碼序列或青蒿素卩-法呢雄合成酶基因(Gen.Bank登錄號AY835398)編碼序列(分別為SEQIDNO:11和IO)作為模板合成得到。該合成得到的核苷酸序列被5'5朋/附和3'屈o./83限制性位點(diǎn)包夾，因此可被克隆進(jìn)入克隆載體(例如標(biāo)準(zhǔn)pUC或pACYC來源栽體)的相容限制性位點(diǎn),」每種合成生成的核苷酸序列可采用和A7w./限制性內(nèi)切酶將該DNA合成構(gòu)建休消化完全后分離得到。通過凝膠電泳分離反應(yīng)混合物，凝膠提取包含該a-法呢晞合成酶或P-法呢蹄合成酶編碼序列的約1.7kbDNA片段，將分離的:DNA片段連接至pRS425-Gall栽體的限制性位點(diǎn)，從而分別獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM341或pAM353。表達(dá)質(zhì)粒pAM404可通過將針對在釀酒酵母中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼青蒿素f3-法呢烯合成酶(GenBank登錄號AY835398)的核苷酸序列插入載體pAM178后生成。采用'〗i物GW-52-84pAM326(SEQIDNO:90)和GW-52-84pAM326Me/(SEQIDNO:91)從pAM353PCR擴(kuò)增編碼卩-法呢烯合成酶的核苷酸序列。使用S〃w州和A%e/限制性內(nèi)切晦完全消化所得的PCR產(chǎn)物，通過凝膠電泳分離該反應(yīng)混合物，凝膠提取包含該P(yáng)-法呢蟑合成酶編碼序列的約1.7kbDNA片段，將分離的DNA片段連接至pAM178載體的限制性位點(diǎn),從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pAM404(參見圖8的質(zhì)粒圖譜)。實(shí)施例6本實(shí)施例描述了可用于本發(fā)明的大腸桿菌宿主菌抹的生成。如表6所述，可通過實(shí)施例1至3和實(shí)施例5的一種或多種表達(dá)質(zhì)粒將化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌親代細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成宿主菌抹。84表6大腸桿菌宿主菌才朱<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>在含有抗生素的LuriaBertoni(LB)瓊脂上選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單克隆從LB瓊脂轉(zhuǎn)移至含有5mL的LB液體培養(yǎng)基和抗生素的培養(yǎng)管中。在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于37°C下孵育B526、B552和B592宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，直至生長至靜止期。在250卬m的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于3(TC下孵育B650、B651、B652和B653宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體30小時(shí)。通過將細(xì)胞在含有0.8%葡萄糖和抗生素的M9-M(:)PS培養(yǎng)基(M9-MOPS培養(yǎng)基的組分可參見表7)中連續(xù)傳代4至5輪，使細(xì)胞適應(yīng)最少培養(yǎng)基.。將含于由4()()uL無菌5()M甘油和600uL液體培養(yǎng)基組成的1m:L儲存液中的細(xì)胞儲存在-8()°C下的冷凍小瓶中。表7M9-MOPS培養(yǎng)基的組成組分量(每升)12.8gKH2P04■3緊，"NaC豕0.3g1g輸，........20,1'mmirf碌胺素MOPS緩沖液I5M7.,43、7ugM，BO4"u緊€:載,lug2,.4贈l".g2,，F(xiàn)eSO40,28rag實(shí)施例7本實(shí)施例描述了可用于本發(fā)明的釀酒酵母菌林的生成。為了制備釀酒酵母菌抹Y141和Y140，通過在卓富培養(yǎng)基中培養(yǎng)來從釀酒酵母菌抹EPY224去除表達(dá)質(zhì)粒(Ro等人(2006)Nature440:940-943;:PCT專利公布WO2007/005604)，獲得菌抹EPY3()()。然后以表達(dá)質(zhì)粒pAM341或pAM353轉(zhuǎn)化菌抹EPY3()(:)，分別獲得宿主菌棘Y141或Y亂在含有2%葡萄糖和除亮氨酸外所有氨基酸的合成的確定組分培養(yǎng)基(SM-glu)上選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至含有5mL缺乏亮氨酸的液體SM-g:!u的培養(yǎng)瓶中，并在3(TC下振蕩孵育該培養(yǎng)物直至達(dá)到靜止期。將含于由400uL無菌50M甘油和600uL液體培養(yǎng)基組成的1mL儲存液中的細(xì)胞儲存在-80°C下的冷凍d、瓶中o為制備釀酒酵母菌抹Y258，通過以釀酒酵母ME73啟動子替換E.RG9啟動子，并以光滑念珠菌LEO基因(Cg丄M72)替換爿D五/ORF制備釀酒酵86母菌株CEN.PK2-1C(Y()()2)(MATA;ura3-52;trpl-289;leu2-3,H2;:his3A1;MA:L2-8C;SUC2)和CEN.PK2-1D(Y()03)(MATot;ura3-52;trpi-289;ieu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SU(:2),以用于導(dǎo)入可誘導(dǎo)的MEV途徑基因(vanDijken等人(2000)EnzymeMici'ob.Technol.26(9-1()):7()6-714)。這可通過如下步驟實(shí)現(xiàn)使用引物50-56-pw100-G(SEQIDNO:93)和50-56-pwl01-G(SEQ:[DNO:94)PCR擴(kuò)增栽體pAM328的KanMX-PMET3區(qū)(其包含與天然啟動子同源的45個(gè)堿基對)，使用40%w/w聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)、100mM醋酸鋰(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以及10ug鮭魚精子DNA(InvitrogenCorp.，Cadsbad，CA)將10ug所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入指數(shù)生長的Y002和Y003細(xì)胞，將該細(xì)胞在30"C下孵育30分鐘后在42"C下熱沖擊30分鐘(Schiestl和Gietz.(1989)Cm'r.Genet.16,339-346)。陽性重組體可通過其在含有0.5ug/m—L遺傳霉素(Geneticin)(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)的牟富培養(yǎng)基上生長的能力進(jìn)行鑒定，并可通過診斷性PCR對所選的克隆進(jìn)行確認(rèn)~所得克隆命名為Y93(MATA)和Y94(MATa)。然后使用引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO:95)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO:96)從光滑念珠菌基因組DNA(ATC(:，Manassas,VA)擴(kuò)增該3.5kbCgLM:/2基因組基因座(其包含與，4Z)￡/ORF同源的50個(gè)堿基對)，將10ug所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入指數(shù)生長的Y93和Y94細(xì)胞，選擇在沒有亮氨酸添加下生長的陽性重組體，并通過診斷PCR確認(rèn)所選的克隆。所得克隆命名為Y176(MATA)和Y177(MAT(x)。然后通過使用尸附e/限制性內(nèi)切酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化2ug的pAM491和pAM495質(zhì)粒DNA，并將該純化的DNA插入物導(dǎo)入指數(shù)生長的YJ76細(xì)胞得到菌抹Y88。選擇可在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養(yǎng)基上生長的陽性重組體，并通過診斷性PCR確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。然后通過使用尸附e/限制性內(nèi)切酶消化2ug的pAM489和pAM497質(zhì)粒DNA，并將該純化的DNA插入物導(dǎo)入指數(shù)生長的Y177細(xì)胞得到菌抹Y189。選擇可在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養(yǎng)基上生長的陽性重組體，并通過診斷性:PC:R確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。為了生成菌抹Y238,接著將來自菌抹Y188和Y189的約1Xl(f細(xì)胞在YPD培養(yǎng)板上室溫下混合6小時(shí)進(jìn)行接合，然后將混合的細(xì)胞培養(yǎng)物涂覆在缺乏組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基上生長來選擇二倍體細(xì)胞。然后以被尸we/限制性內(nèi)切酶完全消化的2ug的pAM493質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化該二倍體細(xì)胞，并將純化的DNA插入物導(dǎo)入指數(shù)生長的二倍體細(xì)胞。選擇可在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長的陽性重組體，并通過診斷性PCR確認(rèn)整合進(jìn)入正確的基因組基因座。單倍體菌抹Y—21l(MATot)可通過如下方式生成在2%醋酸鉀和0.02%棉子糖液體培養(yǎng)基中使菌株Y238形成孢子，采用SingerInstrumentsMSM300系列顯微操作儀(SingerInstrumentLTD，Somerset,UK)分離約200個(gè)遺傳四分體，通過在缺乏腺噤呤、組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基中生長的能力鑒定包含誘導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的適當(dāng)補(bǔ)體的獨(dú)立遺傳分離物，并通過診斷性PCR確認(rèn)所有誘導(dǎo)的DNA的整合。最后，通過以pAM404質(zhì)粒:D:NA轉(zhuǎn)化菌抹Y211.得到宿主菌抹Y258。在含有2%葡萄糖和除亮氨酸外的所有氨基酸的合成的確定組分培養(yǎng)基(SM-glu)上選擇宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至含有5mL缺乏亮氨酸的液體SM-glu的培養(yǎng)瓶中，并在3CTC下振蕩孵育該培養(yǎng)物直至達(dá)到靜止期。將含于由400u:L無菌50%甘油和600uL液體培養(yǎng)基組成的1mL儲存液中的細(xì)胞儲存在-8(rc下的冷凍小瓶中。實(shí)施例8本實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌株中通過MEV途徑生成a-法呢烯和(3-法呢烯。將宿主菌抹B552和B592的等分儲液各自添加至單獨(dú)的含有25m:LM9-MOPS、0.8%葡萄糖、0.5%酵母提取物以及表6中所述的抗生素的125mL燒瓶中，并生長過夜，以形成各宿主菌林的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始OD柳)接種單獨(dú)的含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物、以及抗生素的250mL燒瓶。在250卬m的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于30。C下孵育培養(yǎng)物直至其達(dá)到約0.2的OD,、此時(shí)通過向培養(yǎng)基添加40uL的1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的法呢烯的生成、在誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物(organicoverlay)以捕獲法呢烯。每24小時(shí)通過將2-10uL的該有機(jī)覆蓋物轉(zhuǎn)移至含有1mL乙酸乙酯，并添加了反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)的清潔玻璃瓶中以完成采樣。在配有Agilent5975質(zhì)譜的Agilent6890N氣象色譜儀(GC/MS)(AgilentTechnologiesInc.,PaloA.lto，CA)上以全離予掃描模式(50-5(X)m/z)分析該乙酸乙酯樣本.。在采用HP-5:MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)、氦載氣以及如下溫度程序分離luL的各種樣本中的化合物150"C維持3分鐘，以25"C/分鐘升溫至的20(TC溫度，以60"C/分鐘升溫至30CTC,并300"C下維持1分鐘。使用該方案，已顯示P-法呢烯具有4.33分鐘的保留時(shí)間。法呢烯滴度可通過將生成的峰面積與含于添加反式丁香蹄的乙酸乙酯中的純j3—法呢蜂(Sigma-AlckichChemicalCompany,St.Louis,M(:))的定量校正曲線進(jìn)行比較后計(jì)算得到。宿主菌株:B592在120小時(shí)生成了約4()()mg/L的a-法呢烯(3個(gè)獨(dú)立克隆的平均值；在時(shí)間點(diǎn)0誘導(dǎo))，并具有約46mg/L/OD柳)的最大單位生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。宿主菌抹B552在120小時(shí)生成了約LIg/L的P-法呢烯(3個(gè)獨(dú)立克隆的平均值)，并具有約％mg/L/()D柳)的最大單位生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。實(shí)施例9本實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中通過DXP途徑生成(3-法呢烯。將宿主菌抹B650、B65J、B652和B653的等分儲液各自添加至單獨(dú)的含有25mLM9-MOPS、0,8%葡萄糖、0.5%酵母提取.物、以及表6中所述的抗生素的125mL燒瓶中，并生長過夜，以形成各菌抹的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始()D柳接種舉獨(dú)的含有40mLM9-M(:)PS、45ug/mL硫胺素、微量營養(yǎng)素、U)():E-5molFeS(:)4、O.IMM:()PS、2%葡萄糖、().5%酵母提取物、以及抗生素的250m:L燒瓶。在250rprn的潮溫孵育振蕩器上于3()"C下孵育培養(yǎng)物直至其達(dá)到約0.2至0.3的(:)D6()0,此時(shí)通過向培養(yǎng)基添加40uL的1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的法呢烯的生成。在誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物(organicoverlay)以捕獲p-法呢烯。通過將上層有機(jī)覆蓋物的100uL樣本轉(zhuǎn)移至清潔的管中以獲取不同時(shí)間點(diǎn)的樣本。離心該管以分離任意殘留的細(xì)胞或培養(yǎng)基，將10uL該有機(jī)覆蓋物樣本轉(zhuǎn)移至清潔玻璃瓶中500uL乙酸乙酯中，以卩或反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)。將混合物渦旋30秒，然后參照實(shí)施例8所述進(jìn)行分析。90宿主菌抹B653生成了約7mg/gD(::'W的(3-法呢婦(I:)CW指"細(xì)胞干重")。實(shí)施例10本.實(shí)施例描述了在釀酒酵母宿主菌抹中生成a-法呢蹄和p-法呢烯。將宿主菌抹Y14i、Y140和Y258的等分儲液各自添加至單獨(dú)的含有缺乏亮氨酸的25mLSM-glu的125niL燒瓶中，并生長過夜，以形成各菌林的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約0.05的初始OD癒,接種單獨(dú)的250mL帶擋板燒瓶，該燒瓶包含含有0.2%葡萄糖和1.8%半乳糖，缺乏亮氨酸的40mL合成的組分明確培養(yǎng)基。在200rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于30°C下孵育培養(yǎng)物。以8mL的十二烷覆蓋Y141和Y140培養(yǎng)物；以8mL的異丙基十四酸酯覆蓋Y258培養(yǎng)物。每24小時(shí)采集Y〖41和Y140培養(yǎng)物的樣本，直至120小時(shí)，而Y258培養(yǎng)物的樣本可通過在誘導(dǎo)后72小時(shí)將2uL至10uL的有機(jī)覆蓋物轉(zhuǎn)移至5(0(0uL乙酸乙酯的清潔玻璃瓶中來采集，以p或反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)。YI41和Y140樣本可參照實(shí)施例8所述進(jìn)行分析，而該Y258樣本可參照實(shí)施例11所述進(jìn)行分析。宿主菌抹Y1.41在120小時(shí)生成了約9.8mg/L的a-法呢烯(3個(gè)獨(dú)立克隆的平均值)，并具有約3mg/L/0:D6()(,的最大單位生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。宿主菌林Y140在120小時(shí)生成了約56mg/L的p-法呢晞(3個(gè)獨(dú)立克隆的平均值.)，并具有約20mg/L/OD綱的最大單位生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。宿主菌抹Y258在72小時(shí)生成了約762mg/L的卩-法呢蜂(3個(gè)獨(dú)立克隆的平均值>,并具有約145mg/L/OD柳)的最大單位生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。91實(shí)施例11本實(shí)施例描述了在有氧、氮限制、補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下在大腸軒菌宿主菌抹中生成P-法呢蹄。將宿主菌抹B526的等分儲液添加至含有50mLM9-M(:)PS培養(yǎng)基和抗生素的250m:L燒瓶中,并在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于3'7。C下孵育該培養(yǎng)物過夜，以形成用于發(fā)酵的宿主菌抹B526的接種培養(yǎng)物。該接種培養(yǎng)物可用于以約的初始OD柳)接種含有40mLM9-:MOPS培養(yǎng)基和抗生素的250mL燒瓶。在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于37"C下再次孵育該培養(yǎng)物，直至其達(dá)到約3至5的OD600。表8顯示了發(fā)酵批次070522-l(氮過量)和070522-5(氮限制)的最終培養(yǎng)基組成。將兩個(gè)生物反應(yīng)器(2LApplikonBk)consoleADI1025,帶有ADI1010控制器，AppiikonBiotechnology,FosterCity,CA)中的整批培養(yǎng)基分別在12rC下加熱30分鐘滅菌。將滅菌后的添加物(PSA)和抗生素(終濃度100ug/L的羧千青霉素和終濃度34ug/L的氯霉素)無菌過濾怍為儲備液，并通過頂板注入各生物反應(yīng)器。所有的痕量金屬被合并并預(yù)制備為濃縮溶液(表9)，添加至該P(yáng)SA或投料培養(yǎng)基。各發(fā)酵批次的起始體積為1L。所有的批次均通過經(jīng)頂板注入50mL接種培養(yǎng)物(5%(v/v))進(jìn)行接種。92表8發(fā)酵培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表9痕量金屬溶液的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>當(dāng)初始葡萄糖團(tuán)(15g)被消耗時(shí)啟動具有6小時(shí)倍增時(shí)間的指數(shù)期葡萄糖投料，并注入溶解氧。在最大為31g/hr的前提下，將發(fā)酵罐軟件(BioXpert、ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)編程成參照如下方程計(jì)算紹率/i=0,12'其中nv是底物質(zhì)量流速(g/hi-)，p是比生長速率，1()是初始的葡耗盡的時(shí)間，So是初始底物濃度。達(dá)到最大速率時(shí)，葡萄糖給料被減少至l丄7g/hr的it率，并在該發(fā)S牟-余匕次的剩余時(shí)間內(nèi)保持該速率恒定。在30"C的降低溫度下進(jìn)行發(fā)酵；生物反應(yīng)器內(nèi)的氣流設(shè)定為1vvm;初始攪拌為700rpm;通過Biosp腿ex消泡劑200K控制泡沫;使用高落攪拌(700-1,200卬rn)和氧富集將溶解氧張力控制在40M;使用9.9NNH4OH(2份濃縮的NH4()H,i份〖.12(:))將pH維持在7,在NOVA:Bk)pro:〖11e300分析儀(NovaBiomedicalCorp.,Waltham，MA)上參照生產(chǎn)商的說明檢測氨.在約30的(:)D柳)下通過向所述培養(yǎng)基添加1mL的1M.I:PTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞生成[3-法呢烯。通過使排出的氣體經(jīng)過含有200m.L庚醇的氣洗儀捕獲揮發(fā)的P-法呢烯。然后將該庚醇溶液稀釋至乙酸乙酯(稀釋因子K)()X)?？扇苄訮-法呢晞可通過如下方式從發(fā)酵液中萃取將50uL發(fā)酵液與950uLHPLC級甲醇混合，在FisherVortex.Genie2'頂混合器(ScientificIndustries，Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振蕩該樣本約30分鐘，14,000Xg離心IO分鐘從該樣本獲取細(xì)胞碎片團(tuán)，并將該乙腈溶液在玻璃HPLC瓶中用9卯uLHPLC級乙酸乙酯稀釋。在配備了火焰離子化檢測器(GCFID)的Agilent6890NNetwork氣象色譜系統(tǒng)(AgilentTechnologies，Inc.,PaloAlto，CA)上分析該乙酸乙酯樣本。注射1.uL等分的各樣本，采用DBi-MS柱(30mX250umX0.25um;AgjlentTechnologies,I.nc,，PaloAlto,CA)，氦載氣以及如下的溫度程序分離該樣本中含有的化合物2()or維持i分鐘，以1(rc/分鐘升溫至23(rc,以4(rc/分鐘升溫至3()(rc，并3()()。C下維持1分鐘使用該方案，已顯示卩-法呢'蹄具有4.33分鐘的保留時(shí)間。法呢婦滴度可通過將生成的峰面積與含于添加了反式丁香烯的乙酸乙酯(作為內(nèi)標(biāo))中的純p-法呢烯(Sigma-A!drichChemical.Company,St.Louis,M:O)的定量校正曲線進(jìn)行比較后計(jì)算得到。發(fā)酵批次070522-5(氮限制)比批次070522-l(氮過量)顯示了更低的細(xì)胞培養(yǎng)密度和更高的P-法呢烯滴度。發(fā)酵批次070522-5(氮限制)在50小時(shí)內(nèi)消耗了發(fā)酵培養(yǎng)基中所有的銨，而批次070522-1(氮過量)在所有采樣的時(shí)間點(diǎn)均含有過f的銨。如表l()所示，兩個(gè)發(fā)酵批次中均在培養(yǎng)液中包含了生成的大部分(3-法呢歸。表10在生物反應(yīng)器和氣體洗滌器之間的法呢烯分布發(fā)酵批次位￡體積滴度(g&)P-法呢烯fe》占重量的％0仍22！(N過量)發(fā)酵液i:2，4328.797.2%(N過量)庚醇0.24,1仏8070S22-5(N過景)《酵液223.647.2亂1%OTOSM-S(N限制')發(fā)酵液|0.2《S0.91.9%實(shí)施例12本實(shí)施例描述了大腸桿菌宿主菌抹培養(yǎng)物中的p-法呢婦分布的測定。將由發(fā)酵批次070522-1經(jīng)65.5小時(shí)培養(yǎng)(參見實(shí)施例1)后獲得的冷凍全細(xì)胞培養(yǎng)液(WCB)在環(huán)境溫度下融解。將1.4mL的WCB置-f2mL帶刻度的按蓋管(snap-captube)中，并在懸杯式離心機(jī)(swingingcuprotor)上以10,600RCF離心10分鐘。離心后，可在管中見到三個(gè)不同的層細(xì)胞團(tuán)、上清液、以及有機(jī)固體(輕固體)層。在將管子傾斜時(shí)，可在該有機(jī)固體上方見到另--液體(輕液體)層(可能是穿過該輕固體的上清液)。將輕液體吸取至單獨(dú)的管子；使用吸管尖端將輕固體轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管子并稱重'；將上清液傾倒入單獨(dú)的管子并重新離心以去除所有的細(xì)胞碎片；并將細(xì)胞團(tuán)重懸浮于去離子水中，所得體積為1.4m:L。對每一層采用H::PLC級甲醇進(jìn)行萃取，以參照實(shí)施例11.所述進(jìn)行GCF〗:D分析。約50%在培養(yǎng)中生成的j3-法呢烯存在于該輕固體中。約32%所生成的卩-法呢烯位于各層中，無法確定，這可能是由于微量體積操作困難所導(dǎo)致。95表ll萃取比例和產(chǎn)物分布位置曱醇稀釋乙酸乙酯稀釋p-法呢烯(mg/mL.)體積p-法呢烯(mg)WCB20咖24.10，，4wjL33.74輕液體20柳12,i40.01mL0.12細(xì)胞團(tuán)20253.641,4mL5.09輕固體(以^L量計(jì))l加O326,75謹(jǐn),4g上;f液2000鄰1.07mL實(shí)》包例13本實(shí)施例描述了由a-法呢烯氳化得到法呢烷。將a-法呢烯(204g，1mole，255mL)添加至含有10%Pd/C(5g，a-法呢烯重量的5%)的500mLPa]T高壓容器中。將反應(yīng)容器密封，通過吸塵器抽真空5分鐘，然后在25'C下以H2將該反應(yīng)混合物增壓至35psi。振蕩該反應(yīng)混合物，直至未觀察到H2壓力的進(jìn)一步下降(約16小時(shí))。通過吸塵器將多余的H2氣體移除，排放至N2大氣中。薄層層析("TLC"，R，0.95，己烷，對茴香醛染色或碘)顯示了所述反應(yīng)物完全消失.:.經(jīng)硅膠(60A，來自Aldrich)墊真空過濾該反應(yīng)物組分，然后以己烷(2L)從硅膠上洗滌。以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮該濾出液。進(jìn)一步真空干燥分離的產(chǎn)物，以去除殘留己烷，得到無色液體狀的法呢烷(195g，244mL，95%)。'H-NMR(CDC13，5()()MHz):51,56-U1加，HH)，0,88-0.79(重疊t&d,15H).實(shí)施例14本實(shí)施例描述了將3,7，11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯-1-醇或法呢醇?xì)浠癁?,7,11-三甲基十二烷-l-醇。將法呢醇(572g，2.58摩爾，650mL)添加至含有10%Pd/C(23g，法呢醇重量的4%)的1000mLParr高壓容器。將反應(yīng)容器密封，通過吸塵器96抽真空5分鐘，然后以H2將該反應(yīng)混合物增壓至〗()()()psi。在25"C下攪拌該反應(yīng)混合物，并在約12小時(shí)后通過薄層層析("T:L(::"'，Rf=().32，()():H:)己烷乙酸乙酯)判斷反應(yīng)完全。將反應(yīng)容器在真空下減壓，然后通過N2氣。經(jīng)硅膠(60人，來自Aldrich)墊真空過濾該反應(yīng)物組分，然后以乙酸乙酯("EtOAc"，3L)從硅膠上洗滌。以旋辨蒸發(fā)儀濃縮該濾出液。將分離的產(chǎn)物在高真空下進(jìn)一步千燥以去除任意殘留的EtOAc，提供淺黃色粘稠液體狀的3,7，1〗-三甲基十二烷-l陽醇。':H-NMR(CDC1:"500MHz):53.71(nm，2H)，1.65-1.05(ra，17H)，0.89-0.83(重疊t&d，12H).實(shí)施例15本實(shí)施例描述了從3,7,11-三甲基十二烷-1-醇合成3,7,1.-三甲基十二烷乙酯。在25。C下向攪拌中的3,7,11-三甲基十二烷-l-醇(542g,2.38摩爾)的(::1-{2(〕12溶液(1500mL)添加乙酸酐(267g，2.63mol,247m:L)，然后添加三乙胺(36()g，3.57mol，497m:L)，以生成無色溶液。在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌約12小時(shí)，然后生成深銹色的溶液。TLC(Rf=0.32，96:4己烷乙酸乙酯)分忻判斷反應(yīng)完全。按如下方式終止反應(yīng)，并處理。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮反應(yīng)組分以去除CH:2Cb,并以Et(〕Ac(2L)稀釋。以H:2()(3X,1L)洗滌有機(jī)層，然后倒入錐形瓶。添加脫色木炭(20g)，攪拌15分鐘，經(jīng)Celite床過濾，以EtOAc(2:L)洗滌生成淺黃色濾出液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾出液，并在真空下進(jìn)一步干燥得到淺黃色粘稠液體狀的3,7,11-三甲基十二烷乙酯。'H-NMR(CDCl3，500MHz):S4.ll(t,2H)，2.04(s,3H)，1.62:1.09(m，17H)0.91-0.83(重疊t&d，12H).實(shí)施例16本實(shí)施洌描述了將徵生物來源的P-法呢烯氫化為法呢烷。將P-法呢烯(5.014g的KJF-41-1.20-05和KJF-41-120-06)裝入玻璃耐壓瓶,向瓶中添加101mg10%碳載鈀(Sigma-Aldric:h#205699-50G)。將燒瓶抽真空10分鐘，然后在振蕩下以氳氣(AirgasUHP)增壓至55psi。8分鐘后，排除氫氣，以氫氣將容器增壓至53psi，然后在16分鐘內(nèi)排除。停止振蕩，然后將燒瓶在53psi下開放至4L氳氣鋼瓶48小時(shí)以上。使用Fene-Fane-Split100方法以GC/MS進(jìn)行分析顯示反應(yīng)完全，然后將燒瓶增壓至52psi，并振蕩過夜。在隨后數(shù)天內(nèi)，當(dāng)壓力下降至48psi以下時(shí)，將反應(yīng)重新增壓至48psi。當(dāng)GC/MS分析顯示反應(yīng)依然未完全時(shí)，添加另外101mg的相同碳載鈀，再次將反應(yīng)增壓至48psi。17分鐘后,氫氣消耗完全，再將其增壓至48psL在隨后數(shù)天內(nèi)，當(dāng)壓力下降至48psi以下時(shí)，將反應(yīng)重新增壓至48psi，直至GC/MS分析顯示反應(yīng)完全。在多空漏斗上使用硅膠濾走該催化劑，獲得L47g無色油。使用GC/FI:D分析產(chǎn)物顯示產(chǎn)物純度為99.42%。實(shí)施例17本實(shí)施例描述了P-法呢烯大規(guī)模氫化生成法呢烷。向2加侖的反應(yīng)器添加4kg(4.65L=〗,23加侖)法呢烯液體和24g的10wt.%Pd/C(千)催化劑.,由此得到5.J6g/L的初始催化劑裝載量。將容器密封，以氮?dú)馇逑矗缓蟪檎婵?。開始攪拌，并以100psig連續(xù)添加壓縮氫氣。將反應(yīng)器加熱至8(TC。23小時(shí)后，采集樣本進(jìn)行分忻。經(jīng)GC-FID檢測該法呢烷濃度為45.87%。另外4小時(shí)后，采集第二個(gè)樣本并進(jìn)行分析。經(jīng)GC-FID檢測該法呢烷濃度98為47%。冷卻該反應(yīng)器，開啟，添加10g10wt.%Pd/(:(千)催化劑(總計(jì)34g)。使反應(yīng)器返回上述反應(yīng)條件。24小時(shí)后，采集第三個(gè)樣本并進(jìn)行分忻c經(jīng)GC-FII:)檢測該法呢烷濃度為67.86%。冷卻該反應(yīng)器，開啟，添加24g10wt.%Pd/C(千)催化劑(總計(jì)58g)。使反應(yīng)器返回上述反應(yīng)條件。24小時(shí)后，采集第四個(gè)樣本并進(jìn)行分析。經(jīng)GC-FI:D檢測該法呢烷濃度為97.27%。冷卻該反應(yīng)器，開啟，添加l()g10wt，oPd/C(千)催化劑(總計(jì)68g)。使反應(yīng)器返回上述反應(yīng)條件。24小時(shí)后，采集第五個(gè)樣本和最終樣本并進(jìn)行分析。經(jīng)GC-FID檢測最終法呢烷濃度為99.71%(:冷卻該反應(yīng)器，通風(fēng)，開啟。然后使用0.5微米過濾筒過濾該反應(yīng)混合物，以l加侖玻璃瓶收集?？?￡應(yīng)時(shí)間約為96小時(shí)?；谇笆雠蔚慕?jīng)驗(yàn)，對該流程進(jìn)行修改，以進(jìn)行后續(xù)的批次。向2加侖的反應(yīng)器添加4kg(4.65L=L23加侖)法呢烯液體和75g的i()wt.%Pd/C(干)催化劑。由此得到16.13g/L的初始催化劑裝栽量。將容器密封，以氮?dú)馇逑?，然后抽真?開始攪拌，并以100psig連續(xù)添加壓縮氫氣。將反應(yīng)器加熱至8(rC?？偡磻?yīng)時(shí)間約為48小時(shí)。經(jīng)GC-FID檢測最終法呢烷濃度為99.76%。冷卻該反應(yīng)器，通風(fēng)，開啟。然后使用0.5微米過濾筒過濾該反應(yīng)混合物，以1加侖玻璃瓶收集。如果需要，該產(chǎn)物可通過蒸餾進(jìn)一步純化。如下提供了示范性的1L蒸餾方案。將約1L的法呢烷裝入2L圓底燒瓶，該燒瓶上具有水冷蒸餾頭和與該接頭連接的Vigreaux柱。攪拌液體，并抽真空至14Toir。此時(shí)，將該液體加熱至155"C，將燒瓶包在具有4S箔的玻璃棉中。在加熱時(shí)，液體由澄清變?yōu)闇\黃色。在120'C下開始出現(xiàn)蒸汽。在蒸餾終止前收集了約950n止的澄清法呢烷。本實(shí)施例描述了9()%的超低疏柴油(2號柴油，達(dá)到ASTM1)975標(biāo)準(zhǔn))與10%的包含3,7,H-三甲基十二烷基乙S旨和法呢烷的混合物的混合產(chǎn)品的屬性。該種混合物主要包含3,7丄1-三甲基十二烷基乙酯，存在少量法呢烷。表12ASTM測試方法卯。/。ULSD和10%法呢烷以及3，7，11-三甲基十二烷基乙酸酯十六烷值細(xì)3冷濾堵塞點(diǎn)(t;)D6371:<-22濁點(diǎn)('c)D2500<-22傾點(diǎn)('c)訴7<-2440'C下的粘度D44S3,594實(shí)施例19本實(shí)施例描述了從Whitting(ln.dia.na)的BP煉油廠或Carson(California)的BP煉油廣獲得的超低疏柴油中不同量的法呢烷的檢測。來自BPCarson煉油廣的柴油是CARB燃料，其滿足美國加州空氣資源理事會(Cali腦iaAirResourcesBoard)要求。盡管在煉油過程中常向CARB燃料添加潤滑劑，但該CARB燃料樣本在添加任何潤滑劑之前獲得。圖9和10顯示了與來自該煉油廠的柴油燃料混合的不同量法呢烷的測試數(shù)據(jù)。圖11A-B顯示了測試的各種燃料和混合物的蒸餾曲線。實(shí)施例20100本實(shí)施例描述了在石油柴油(具有數(shù)千種單獨(dú)化合物的復(fù)雜混合物)中天然發(fā)現(xiàn)的法呢烷的量的測定。這些化合物中多數(shù)為Cur"(:22烴類，且通常為石蟲t族、環(huán)烷和芳香族烴類。將柴油樣本在己烷中稀釋，然后參照Zielinsk.a等人，J.Air&WasteManage.Assoc.54:1138-1150(2004)所述以GC-MS測定。表13顯示的結(jié)果一,{立為ug/m:L、wt.%#口vol,%。表..13<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>除了表13最后兩種樣本外，所有的柴油樣本為從加油站購買的柴油燃料。該2號柴油來自于BPWhiting煉油廣。該CARB柴油來自于BPCarson煉油廠，且不含潤滑性能改進(jìn)劑。'實(shí)施例21本實(shí)施例描述了向法呢烷與自于BPWhiting煉油廠的柴油或來自于BPCarson煉油廠的CARB柴油的混合物中添加潤滑性能改進(jìn)劑。該來自BPWhiting煉油廣的柴油燃料包含200ppm的InfmimiiR6%潤滑性能改進(jìn)劑(:曾被稱為ECD-1》。向該基礎(chǔ)燃料再添加100ppm，并參照ASTMD6079測試5vol.%、20voli和50volM的法呢烷與該基礎(chǔ)燃料的混合物的潤滑性能。5vol.%、20voi.%和50vol。/o的法呢烷與該基礎(chǔ)燃料的混來自于BPCarson煉油廠的CARB柴油不含潤滑性添加劑,:，向該基礎(chǔ)燃料添加300ppm的lnfmi薩R6%，并參照ASTMD6079測試5vol.0/"20vol.0/"50volo/o和65volM的法呢烷與該基礎(chǔ)燃料的混合物的潤滑性能。5vol.%、20vol.%、50vo!。/。和65volM的混合物的潤滑性能(HFRR鍵6()t:)分別為200(im、240「im、280sim以及240pni。》別為300fim、240,以及450降.序列表SEQIDNO1MevT66操縱子(5，to3')GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAA(MACTGTCTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACCiGCTCTTTAGCCMGCACCTCTGCAATCGATCTroCiGTGCGACClGTCATTAAGGCTGTGTGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCAGCA.GC03CGATC<3AGTCTC<JTCC<3rJTAC<3<}CG<MAATCGTGCCAC5TTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAC5GCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTCACAAAGCGGGCACCJGTCACCGCCGGTAATCCGAGCGGCATCCATTM5CGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGOCGGCC3TCCCACCAC5CCCTGATGGGCATGGGTCCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTGGCGC3TGGGTAAGAATCTGG(XTTCGACACiCGAGAAAGTCAATCTGAACGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAOCC3GCGCACGCATCTTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACOCGACAAGACCTTAGOCCTGGCGACCTTATGGCAAAAGACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGCiCATCCAGATTTATATCCCGACGCAGTCJTGAGACGCTGATTGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTCTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGACMACA、CTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTOGACGGCCACTTCTCTCTGACCTGCTATC'rGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAOCAAAAAGGCGATTTCTAAGGGCCTGGTCAGC■GACCCGGCAGGCAGOMCGCCCTGAACGTCCTGAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCOACCTGCAAATTAGTGACCAAATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACOTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGAGCGTOTCGCCCAAAGCCTC5ATCGTCCCC5ACCAACACCK3G"ACATGTATACCGCGTCTGTCTACGOGGCATTCC5CGACiCCTGCTTAGCGGCCAGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGCTCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAGCCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTCMCGAACArrcACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAA^gGC^GCAACACCAAGCAGCTGAAGAACAAGGAAGTTCCAGCGpJGGTCATCCACGCTAAGCOACTACGACCGCOTG'TTTGGCGCGTCCTGCGAGAATGTCATTGGCTACATGCCCJTTACCGC5TTGGGTTAACCAAGGATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCOTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGGCGCGTCTAAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGCJCCAAAACGCGATCAAGAAAGCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTOSCGCGTTTACAGCATATCCAGACCrcCCTCGCCGGlCGACCTGCTGTrCATGOaCTTGCACCGACAA0AAGCC(3(3CAGCCATTAACTCK3ATTCMK3GTCGCC3GCAAAAGCGTCGTGC1CAAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAGCGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTCGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTOGTTACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAC3AGCAGCAACTCCATTACCTTAATCAAAGAGG丁TGACGGTCACCTGCGCATCAGCGTTTCTATGCCGTCTATCGAGGTCOGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATCCTCOTAAGCTTSEOIDNO:2,pAM52的ato￡fop":mva5V/va^操縱子(5'至3')ATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTCCGCACGGCGATCOCiCACiCTTTAACGGCTCTrrAGCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTCGTCTGGCCGAGACCGTGTGTCGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCT<3AA<3AGCGTGGCCCTGGCAGCACAAGCGATTCAAGCCCiGTCAG3CACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCATGOAGAACATCTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGTTATCGCCTGGGCGATGGTCAGCFTGTACGACGTCATCTTACGCGATCGCTTAATGTGGTGCGTTTACGGCOGAAATCGTGCCAGTTAACGTOCn'CACGCGCAAGAAGACCiTrcGTTTTCAGCCAGGACGAGTTCCCGAAGGCAAACAGCACCOCGGAGGCCTTAGGTCCCTTACGCCCAGCCTTTTCATCATGGAA<3AGAGCGCCGCATTAGCAGCGG<}TCTGACCCCATTAGCGCGCATTAAATCTrATGCCAGCGOCGGCGTCCCACCAGCCCTGATOGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGC(KKJCCTGCAACTGGCCGACA1了GATCTCATCC3AGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGTTCCTC(3CGGTGG(5TAAGAATCTGGGCTTCCiACAGCGAGAAAGTCAATGTOAACGGTGGC;GCGATTGCGTTAOGCCATCCGATTGGTCCAAGCGOCGCACOCATCTTAGTCACGTTACTCCACGCCATGCAGGCACOCGACAAGACCn'AGGCCTGGCGACCTTATGTATTCGTGGCGCTCAAGGTATCCAAAATAAACTTTTACGTTCCAAAGTACTATGTAGACATGGCTAAATTAGCAGAAOCACGCCAAGTAGACCCAAACAAATTTTTAATTGGAATTGGTCAAACTGAAATGGCTGTTAGTCCTCTAAACCAAGACATCGTTTCAATGGGCGCTAACGCTGCTAAGGACATTATAACAGACGAAGATAAAAAGAAAATTGGTATGOTAATTGTCK3CAACTGAATCAGCAGTTGATGCTCCTAAAGCAGCCGCTGTTCAAATTCACAACTTATTAGGTATTCAACCTTTroCACGTTCCTTTGAAATGAAAGAAGCTTGTTATGCTGCAACACCAGCAATTCAATTAGCTAAAGATTATTTAGCAACTAGACCGAATGAAAAAGTATTAGTTATTGCTACAGATACAGCACGTTATGGATTCAATTCAC3GCGC3CGAGCCAACACAAGC5TGCTGGCGCA(3TTCCGATOGTTATTGCACATAATCCAAGCATm'CraCATTAAATCAAGATGCT<3TT<3CTrACAC'roAAGACGTTTATGATTTCTCGCGTCCAACTGGACATAAATATCCATTAGTTGATGGTGCATTATCTAAAGATGCTTATATCCGCTCATTCCAACAAAGCroGAA'roAATACGCAAAACGTCAAGGTAACTCGCTAGCTGACTTCGCATCTCTATGCTTCCATGTTCCATTTACAAAAATCGGTAAAAAGGCATTAGAGTCAATCATTGATAACGCTGATGAAACAACTCAAGAGCGTTTACCTTCAGGATATGAAGATGCTGTAGATTATAACCGTTATGTCGCTAATATTTATACTGGATCATTATATTTAAGCCTAATATCATTACTTGAAAATCGTOATTrACAAGCTOTGAAACAATCGGTTTATTCAGTMTGGCTCAGGTTCAGTTGGTC3AATTTTATAGTGCGACATTAGTTCAAGGCTACAAM5ATCATTTAGATCAAGCTGCGTTTTCATGACGTTCAATTTGACGAAGAACAAGATOCTGTrcATGAAGATCGTCATATTTTCTACATCATCCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCGACATTTATCTCGTCAACAAAAGTTACAACAATTGGTAGATAAGCAATGGTTATCAGAAGATCAATTCGACATTTTATTGAATCATCCATTAATTGATGAGGAAGTAGCAAATAGTTTAATTGAAAATGTCATCGCGCAAGGTGCATrACCCGTTGGATTATTACCGAATATCATTGTGGACGATAAOGCATATGTroTACCTATGATGGTGGAAGAOCCTTCAGTTGTCGCT(3CA<3CTAGTTATC<5TGCAAAGCTAGTGAATCAGACTCGCG<MTTTAAAACGGTATCTTCT(3AACGTATTATGATAGGTCAAATCCTCTTTGATGGCGTTGACGATACTGAAAAATTATCAGCAG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TTSEO,DNO:82引物61-67-CPK062-G(5'至3')GGTAACOGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTnTTTCTCCTTGACC3TTASEQID船O引物61-67-CPK063-G(5，至3，)119SEQIDNO:84引物61-67-CPK064-G(5，至3，)AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCSEQ1DNO:85引物61-67-CPK065-G(5'至3')GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTSEOiDNO:86引物A(5'至3')CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGCSECIDNO:87引物B(5'至3')(JAGCTCTCATACGACCATAGGGTGTACGSEQ1DNO:88引物C(5'至3')CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGCSEQIDNO:89引物D(5'至3')GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAGSEQiDNO:卯引物GW-52-84pAM326BamHI(5'至3')TAATAAGGATCCATGTCAACTTTGCCTATTTCSEQiDNO:91引物GW-52-84pAM326Nhel(5'至3')TTATAGCTAGCTCAAACGACCATAGGATGAACSEQIDNO:92引物61-67-CPK016-G(5'至3"SEQIDNO:93引物50-56-pwlOO-G(5'至3，)CSEQIDNO:94引物50-56-pwl01-G(5'至3')S￡QIDNO:95引物61-67-CPK066-G(5'至3')TGACCSEQ1DN0:96引物61-67-CPK067-G(5，至3，)CCAGT120權(quán)利要求1.燃料組合物，其包含或荻自一種混合物，該混合物包含(a)具有式(I)或(II)的類異戊二烯化合物或其立體異構(gòu)體，其中Z為H、O-R或O-C(＝O)R；R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基，其中該類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重的約1wt.％至約99wt.％；和(b)燃料組分。2.如權(quán)利要求l所述的燃料組^物，其中所迷T9()蒸餾溫度為約282X:至約338。C。3.如權(quán)利要求i所述的燃料組合物，其中所述類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重的約5wt.。/。至約90wt.%。4.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重的至少10wt.%。5.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總f的至少20wt.%.6.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述類)-^二'膝化合物占該7.如權(quán)利要求l所述的燃料組合物，其中該燃料組合物-!t冇基于其總重、￡少于20ppm的硫含量，8.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中該燃料組合物具有占其總休積少于20%的芳族含量(.9.如權(quán)利要求i所述的燃料組合物，其中該燃料組'&物凡冇大于joor的初沸點(diǎn)，10.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中該燃料組合物凡冇大于2()0"C的終游,點(diǎn)。11.如權(quán)利要求i所述的燃料組合物，其中所述初';弗點(diǎn)介于ioo"c和15(TC，且該燃料組合物具有大于30()。C的終沐點(diǎn)。12.如權(quán)利要求l所述的燃料組合物，其中所述燃料組分來自于石油或13.如權(quán)利要求12所述的燃料組合物，其中所述燃料組分包含柴油燃料、^氣燃料、煤油、汽油、或其組合。14.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述燃枓組分包含蒸餾柴油燃料，其中該蒸餾柴油燃料的量至少為該燃扦組合物總f的10%。15.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，進(jìn)一步包含燃科添加劑。16.如權(quán)利要求15所述的燃料組合物，其中所述燃料添加劑選自潤滑性能改進(jìn)劑、抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、十六烷值增進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、防冰劑、嘖射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、清潔劑、反乳化劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合。17.如權(quán)利要求15所述的燃料組合物，其中所述燃料添加劑為潤滑性改進(jìn)劑。18.如權(quán)利要求1所述的燃扦組合物,其中所迷類異戊二烯化合物為孔有式(IV)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>或其立體異構(gòu)體、其中R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳統(tǒng)基19.如權(quán)利要求.18，其中所述r為(:'i—(:'3烷基,20.如權(quán)利要求19所述的燃料組合物，其中所述R為甲基r21.如權(quán)利要求l所述的燃料組合物，其中所述類異戊二J有式(iV)的基本純的化合物(IV),<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>或其立體異構(gòu)體，其中r為h、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基22.燃料組合物，其包含或獲自一種混合物，該混合物包含(a)按體積計(jì)至少50%的燃料組分；和(b)按體積計(jì)大于().()1%但小亍5()%的式(i)或(U)的類異戊二烯化合物(〗:i)，或其立體異構(gòu)體，其中Z為H、(:)-R、或O-C(O)R;:R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基。23.如權(quán)利要求22所述的燃料組合物，進(jìn)一步包含燃料添加劑24.如權(quán)利要求23所述的燃料組合物，其中所述燃抖添加劑選自潤滑性能改進(jìn)劑、抗氧化劑、熱穩(wěn)定性改進(jìn)劑、十六烷值增進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、低溫流動性改進(jìn)劑、助燃劑、消泡劑、消光霧添加劑、緩蝕劑、防冰劑、噴—射器清潔添加劑、防煙劑、減阻添加劑、金屬減活劑、分散劑、清潔劑、良乳化劑、染料、標(biāo)記物、防靜電劑、殺蟲劑及其組合。25.如權(quán)利要求22所述的燃料組合物，其中所述燃料組分為噴氣燃料。26.如權(quán)利要求22所述的燃料組合物，其中所述燃料組分為柴油燃料。27.如權(quán)利要求22所述的燃料組合物，其中所述柴油燃料為蒸餾柴油燃料。28.如權(quán)利要求22所述的燃料組合物，其中所述類異戊二烯化合物為或其立體異構(gòu)體，其中R為H:、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。29,如權(quán)利要求28所述的燃料組合物，其中所述類異戊二歸化合物為式(I:V)，其中R為C,-C,烷基o或其立體異構(gòu)體，其中Z為OH，或30.如權(quán)利要求29所述的燃料組合物，其中所述R為甲基。31.制備燃料組合物的方法，其包括將具有式(I)或(I1)的類異戊二^化合物或其立體異構(gòu)體，與燃料組分、燃料添加劑或其組合相混合，其中Z為H、O-R或0-C^O)R;R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基，其中該類異戊二烯化合物占該燃料組合物的總重的約1wt,W至約99wt,%。32.如權(quán)利要求31所述的燃料組合物，其中所述T9()蒸餾溫度為約282'C至約338°C。33.如權(quán)利要求31所述的燃料組合物，其中所述類異戊二烯化合物的量為該燃料組合物總重的約5wt。/o至約90wt.%。34.如權(quán)利要求31所迷的方法，其中所述類異戊二烯化合物由Ci5類異戊二烯起始原料經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化獲得。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述Ci5類異戊二烯起始原料為或或其立體異構(gòu)體。36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述燃料組合物具有基于其總重量少于20ppm的疏含量。37.制備燃料的方法，其包括將燃料添加劑與具有式(i)或(n)的類異戊二烯化合物()或其立體異構(gòu)體相混合，其中z為h、(:)-r或(::)-c(K:))R;r為i...:i:、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述式(:〖)或(:I1)的類異戊二烯化合物由cl5類異戊二烯起始原料經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化獲得。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述C15類異戊二烯起始原料可從生物來源獲得。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述(:|5類異戊二烯起始原料為或其立體異構(gòu)體，其被氫化或酯化生成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>或其立體異構(gòu)體，其中R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷JL41.如權(quán)利要求4()所述的方法，其中R為C"C;烷基c42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中R是甲基,43.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述(:|5類異戊二烯起始原料為或其立體弄構(gòu)體，其被氬化或酯化生成(V)或其立體井構(gòu)體，其中R為H、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基,:44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中R為Ci-C:;烷基.:45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中R是甲基。46.如權(quán)利要求37所述的方法，進(jìn)一步包括將所述燃料添加劑和所述類異戊二烯化合物與燃料組分相混合。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述燃料組分為蒸餾柴油燃料。48.由權(quán)利要求3749,燃料組合物，其包含或獲自一種混合物，該混合物包含至少兩種不同的化合物或其立體異構(gòu)體，所述化合物分別獨(dú)立地具有式(n)、(iv)或(v):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R為C,.Cs烷基，總重的5wt.%。量分別至少占該燃料組合物50,包括內(nèi)燃機(jī)、與該內(nèi)燃機(jī)連接的燃料箱、以及燃料箱中的如權(quán)利要求〗所述的燃料組合物的車輛，其中該燃料組合物用于向該內(nèi)燃機(jī)提供動力。51.如權(quán)利要求50所述的車輛，其中所述內(nèi)燃機(jī)為柴油機(jī)。52.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物的沸點(diǎn)為282"C至338。C。53.如權(quán)利要求1所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物的沸點(diǎn)為14(TC至320"C。54.如權(quán)利要求l所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物的沸點(diǎn)低于約200"C。55.向發(fā)動機(jī)提供動力的方法，其包括燃燒如權(quán)利要求l所述的燃料組合物的步驟。56.包含燃料組分和生物工程化C!5類異戊二烯化合物的燃料組合物。57.通過以微生物制備法呢烯，由該法呢烯制備法呢烷，并由該法呢烷58.包含來自于單糖的燃料組分的燃料組合物。59.如權(quán)利要求58所述的燃料組合物，其中所述單糖為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其組合。60.由單糖制備燃料組合物的方法，其包括如下步驟(a)在適于生成(::i5類異戊二烯起始原料的條件下，將能夠生成該cl5類異戊二烯起始原料的細(xì)胞與所述單糖相接觸；(b)氫化該C15類異戊二烯起始原料，以形成氫化的C!5類異戊二烯化合物;和(C)將該氫化的C!5類異戊二蹄化合物與一種或多種燃料組分或燃料添加劑相混合以制備該燃料組合物。61.如權(quán)利要求60所述的方法、其中所述單糖為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其組合。全文摘要包含法呢烷(farnesane)和/或法呢烷衍生物以及選自柴油燃料、噴氣燃料、煤油或汽油的常規(guī)燃料組分的燃料組合物。該法呢烷或法呢烷衍生物可在該燃料組合物中用作燃料組分或燃料添加劑。該燃料組合物可進(jìn)一步包含常規(guī)燃料添加劑。還披露了該燃料組合物的制備和使用方法。文檔編號C10L10/16GK101553558SQ200780045575公開日2009年10月7日申請日期2007年10月10日優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日發(fā)明者尼爾·斯蒂芬·倫寧格,德里克·J·麥克菲申請人:阿邁瑞斯生物技術(shù)公司