專利名稱：：基于酪氨酸激酶受體(包括igf-ir)的工程化蛋白質的靶向治療劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及結合胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)的新蛋白質，以及其它重要蛋白質。本發(fā)明還涉及藥物制劑中的新蛋白質和此類蛋白質的衍生物，及其在診斷、研究和治療應用中的用途。本發(fā)明進一步涉及包含此類蛋白質的細胞、編碼此類蛋白質或其片段的多核苷酸、和包含編碼該新蛋白質的多核苦酸的載體。
背景技術：
：胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)是一種跨膜異四聚體蛋白質，其具有兩條胞外a鏈和兩條跨膜P鏈，采取二硫鍵相連接的p-a-a-P的構造。配體(諸如胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和胰島素樣生長因子-II(IGF-II))通過IGF-IR受體胞外域的結合活化它和(許多情況中的)它的胞內酪氨酸激酶域，導致受體自磷酸化和底物磷酸化。IGF-IR與胰島素受體同源，在(3鏈酪氨酸激酶域中具有84。/。的高序列相似性，而在a鏈胞外富含半胱氨酸域中具有48。/。的低序列相似性(Ulrich,A.等，1986，EMBO，5，2503-2512;Fujita隱Yamaguchi,Y.等,1986,J.Biol.Chem.,261,16727-16731;LeRoith,D.等，1995,EndocrineReviews,16，143-163)。IGF-IR和配體(IGF-I和IGF-II)在許多生理過程中發(fā)揮重要作用，包括胚胎發(fā)生過程中的生長和發(fā)育、代謝、成體中的細胞增殖和細胞分化(LeRoith，D.,2000，Endocrinology,141,1287-1288;LeRoith,D.，1997,NewEnglandJ.Med.，336，633-640)。IGF-I和IGF-II配體都作為內分泌激素在血液中發(fā)揮功能，在那里它們主要存在于與IGF結合蛋白的復合物中，且作為局部生成的旁分泌和自分泌生長因子發(fā)揮功能(Humbel,R.E.，19卯，Eur.J.Biochem.,190，445-462;Cohick，W.S.和Clemmons,D.R,,1993，Annu.Rev.Physiol.55，131-153)。在體內，IGF-I的血清水平依賴于垂體生長激素(GH)的存在。雖然肝是GH依賴性IGF-I合成的主要部位，但是許多肝外組織也生成IGF-I(Daughaday和Rotwein,EndocrineRev.10:68-91(1989))。多種新生物組織也可生成IGF-I(Wemer和LeRoith,Adv.CancerRes.68:183-223(1996))。如此，IGF-I可以經自分泌或旁分泌以及內分泌機制發(fā)揮正常和異常細胞增殖的調節(jié)物的作用。IGF-I和IGF-II在體內結合IGF結合蛋白(IGFBP)。在結合至IGF后，IGFBP或是通過循環(huán)轉運IGF，或是保護IGF免于蛋白水解切割和滅活。游離IGF對于與IGF-IR的相互作用的可用度受IGFBP調控。關于IGFBP和IGF-I的綜述參見Grimberg等，J.Cell.Physiol.183:1-9,2000。在分子水平，已經將IGF-IR與促進腫瘤細胞的生長、轉化和存活聯(lián)系起來(Baserga，R.等，1997,Biochem.Biophys.Acta,1332,F105-F126;Blakesley,V.A.等,1997,JournalofEndocrinology,152,339-344;Kaleko，M.,Rutter，W,J"和Miller,A.D.1990,Mol.Cell.Biol.,10，464-473)。已知數(shù)種類型的腫瘤表達比正常水平高的IGF-IR，包括乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、滑膜肉瘤和胰腺癌。參見Khandwala,H.M.等，2000,EndocrineReviews,21,215-244;Werner,H.和LeRo他,D.,1996,Adv.CancerRes"68,183-223;Happerfield,L.C,等，1997，J.Pathol"183,412-417;Frier,S.等，1999,Gut，44，704-708;vanDam,P.A.等,1994，J.Clin.Pathol"47,914-919;Xie，Y.等,1999，CancerRes"59,3588-3591;Bergmann,U.等，1995,CancerRes"55,2007-2011。在體外，IGF-I和IGF-II已經顯示為數(shù)種人腫瘤細胞系(諸如肺癌、乳腺癌、結腸癌、骨肉瘤和宮頸癌)的有力促分裂原(Ankrapp,D.P.和Bevan,D.R.，1993,CancerRes.,53,3399-M04;Gullen，K.J.,1990,CancerRes"50,48-53;Hermanto,U.等，2000,CellGrowth&Differentiation,11,655-664;Guo,Y.S.等，1995，J.Am.Coll.Surg"181，145-154;Kappel，C.C.等,1994，CancerRes"54,2803-2807;Steller,M.A.等，1996,CancerRes.，56，1761-1765)。數(shù)種這些肺瘤和腫瘤細胞系!還表達高水平的IGF-I或IGF-II,其可以以自分泌或旁分泌方式刺激它們的生長(Quinn，K.A.等，1996，J.Biol.Chem.,271，11477-11483)。流行病學研究已經顯示了IGF-I血漿水平升高(和IGF結合蛋白-3水平降低)與前列腺癌、結腸癌、肺癌和乳腺癌風險升高的相關性(Chan,J.M.等，1998,Science,279，563-566;Wolk,A.等,1998,J,Natl.CancerInst"90，911-915;Ma，J.等，1999，J.Natl.CancerInst"91,620-625;Yu，H.等,1999，J.Natl.CancerInst"91,151-156;Hankinson，S.E.等，1998,Lancet,351,1393-1396)。已經提出將降低血漿中IGF-I水平或抑制IGF-IR功能的策略用于癌癥預防(Wu,Y.等，2002,CancerRes.,62,1030-1035;Grimberg,A.和CohenR,2000,J.Cell.Physiol.,183,1-9)。IGF-IR能保護胂瘤細胞免于由生長因子剝奪(growthfactordeprivation)、錨著非依賴性(anchorageindependence)或細胞毒性藥物處理引起的凋亡(Navarro,M.和Baserga,R,,2001,Endocrinology,142,1073-1081;Baserga,R.等,1997,Biochem.Biophys.Acta,1332,F105-F126)。已經通過突變研究鑒定了IGF-IR中對于其促有絲分裂、轉化和抗凋亡活性至關重要的域。例如，已經鑒定了IGF-IR的酪氨酸1251殘基對于抗凋亡和轉化活性是至關重要的，但是對于其促有絲分裂活性則不然(O'Connor,R.等，1997,Mol.Cell.Biol.,17，427-435;Miura，M.等，1995,J.Biol,Chem.，270，22639-22644)。創(chuàng)建基于IGF-IR拮抗或抑制的治療劑的困難雖然IGF-IR作為治療靶物具有誘人的生物學，但是創(chuàng)建拮抗劑或其它類型抑制劑的嘗試是緩慢的，主要由于一項或多項依賴于治療范例(therapeuticpamdigm)的以下因素難以或不能拮抗靶物但又不產生激動作用；由于不想要的與其它酪氨酸激酶靶物或受體(諸如胰島素受體)的交叉反應性，難以或不能創(chuàng)建選擇性拮抗劑或抑制劑；由于潛在治療劑的半衰期短，難以有效施用；由于潛在治療劑的溶解度低，難以有效施用；及由于潛在治療劑的聚集，難以有效施用。本發(fā)明的治療劑克服了一項或多項這些困難。在生物擴散盒(chambers)中注射入動物中后，表達IGF-IRmRNA之反義的腫瘤細胞發(fā)生大量凋亡?；谀[瘤細胞比正常細胞對IGF-IR抑制引起的凋亡更加易感的假說，此觀察結果使得IGF-IR成為誘人治療靶物(Resnicoff，M.等，1995，CancerRes"55,2463-2469;Baserga，R.，1995,CancerRes"55,249-252)。然而，反義和siRNA這兩種治療策略都受到施用挑戰(zhàn)(administrationchallenge)禾口貨物障石f^昝在成本(potentialcostofgoodsobstacles)的困才尤。抑制肺瘤細胞中的IGF-IR功能的另一種策略是使用結合IGF-IR的胞外6域且可抑制活化的抗IGF-IR抗體。已經報告了數(shù)項嘗試是開發(fā)針對IGF-IR的小鼠單克隆抗體(可獲得兩種抑制性抗體，即IR3和1H7),而且已經在數(shù)項IGF-IR研究中報告了它們的使用。IR3抗體是如下開發(fā)的，使用部分純化的胰島素受體胎盤制備物免疫小鼠，其產生一種選擇性結合胰島素受體的抗體(即IR1)和兩種顯示出IGF-IR(生長調節(jié)素-C受體)的優(yōu)先免疫沉淀但也有胰島素受體的弱免疫沉淀的抗體(即IR2和IR3)(Kull,F.C,等,1983，J,Biol.Chem.,258，6561-6566)。辦^^的我體^/^在有些情況中，抗體活化IGF-IR。這在文獻中顯示了多次。另外，顯示出"抑制，，的抗體可能尚未仔細表征且可能實際上在某些條件下(諸如較低的抗體濃度)活化IGF-IR。在可能存在抗體的擴散梯度的腫瘤中，IGF-IR的活化可隨肺瘤中較低抗體濃度的抗體而發(fā)生。1H7抗體是如下開發(fā)的，用純化的IGF-IR胎盤制備物免疫小鼠，其產生一種抑制性抗體lH7和三種刺激性抗體(Li,S,L.等，1993,Biochem.Biophys,Res.Commun,，196,92-98;Xiong,L.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,5356-5360)。在另一份報告中，通過用表達高水平IGF-IR的轉染3T3細胞免疫小鼠，獲得了一組對人IGF-IR特異性的小鼠單克隆抗體，通過結合竟爭研究和通過它們對IGF-I結合轉染3T3細胞的抑制和刺激將它們分入七個組(Soos,M.A.等，1992,J.Biol.Chem.,267，12955-12963)。雖然IR3抗體是IGF-IR體外研究最常使用的抑制性抗體，但是它受到它在表達人IGF-IR的轉染3T3細胞和CHO細胞中展現(xiàn)出激動活性的缺點的困擾(Kato,H.等，1993,J.Biol.Chem.，268,2655-2661;Steele-Perkins,G.和Roth，R.A.，1990,Biochem.Biophys.Res.Commun"171,1244-1251)。類似的，在由Soos等開發(fā)的那組抗體中，最抑制性的抗體24-57和24-60在轉染3T3細胞中也顯示出激動活性(Soos,M.A.等，1992,J.Biol.Chem.，267,12955-12963)。雖然已經報告了IR3抗體在完整細胞中和在增溶后抑制IGF-I(但是IGF-II則不然)結合所表達受體，但是它顯示出在體外在細胞中抑制IGF-I和IGF-II二者刺激DNA合成的能力(Steele-Perkins,G.和Roth,R.A.,19卯，Biochem.Biophys.Res.Commun.,171，1244-1251)。自嵌合胰島素-IGF-IR構建物推斷出IR3抗體的結合表位是IGF-IR的223-274區(qū)域(Gustafson，T.A.和Rutter,W.J.，1990,J.Biol.Chem.，265,18663-18667;Soos,M.A,等，1992,J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。通常使用MCF-7人乳腺癌細胞系作為模式細胞系來證明IGF-I和IGF-II的體外生長應答(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.,272,31163-31171)。在MCF-7細胞中，IR3抗體將無血清條件中外源添加的IGF-I和IGF-II的刺激效應不完全地阻斷大約80%。還有，IR3抗體不顯著抑制(少于25%)10%血清中MCF-7細胞的生長(Cullen,K.J.等，1990，CancerRes.,50,48-53)。IR3抗體在體外對血清刺激的MCF-7細胞生長的此弱抑制可能與一項其中IR3抗體處理沒有顯著抑制棵鼠中MCF-7異種移植物生長的體內研究有關(Arteaga,C.L.等，1989，J.Clin.Invest"84，1418-1423)。因為IR3和其它所報告的抗體的激動活性弱，而且它們在血清刺激(而不是無血清條件中外源添加的IGF-I或IGF-II的刺激作用)的更加生理性的條件中不能顯著抑制腫瘤細胞(諸如MCF-7細胞)的生長，需要能抑制血清刺激的腫瘤細胞生長但它們自身沒有顯著激動活性的新的抗IGF-IR調控物。雖然，在有些情況中，會想要激動活性(通常用于腫瘤學或失控的或不想要的組織擴增、增殖、或生長以外的應用)。雖然已經報告了抗IGF-IR抗體存在于某些沒有自身免疫病的患者中，但是這些抗體無一已經純化且無一已經顯示出對于抑制IGF-I活性適用于診斷或臨床規(guī)程。參見例如Thompson等，PediatRes.32:455459,1988;Tappy等，Diabetes37:1708-1714，1988;Weightman等，Autoimmunity16:251-257,1993;Drexhage等，Nether.J.ofMed.45:285-293,1994。另外，已經報告了針對IGF-lR的單克隆抗體能刺激細胞增殖(Xiong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5356-5360，1992)。另外，由于特異性、激動作用、聚集作用和溶解性，理論上難以創(chuàng)建抗體和其它治療劑，以及包括IGF-IR作為靶物的雙重特異性治療劑，特別是在使用抗體時。辦^/i的V、為、子,劍,i/凝潛小分子化學程序在創(chuàng)建針對IGF-IR的治療劑方面大多是不成功的。出于許多原因，包括為IGF-IR獲得選擇性化學同時不抑制或結合相關酪氨酸激酶8或受體(諸如胰島素受體)的能力，難以通過蛋白質或小分子創(chuàng)建此靶物的藥物。另外，小分子常常是低溶解度的，使得生物利用度、施用或配制富有挑戰(zhàn)性。本發(fā)明的許多方面之一是在期望組織(諸如腫瘤)的細胞中選擇性結合IGF-IR生物學以觸發(fā)凋亡的本發(fā)明多肽。IGF-IR生物學(包括活化)有助于凋亡調節(jié)。它能減緩或阻止凋亡。多種遺傳損傷對凋亡程序的遏制可能有助于惡性腫瘤的形成和進展。雖然當前的潛在治療策略能夠在體外誘導凋亡或抑制與IGF-I升高、IGF-II、和/或IGF-IR受體水平升高有關的體外細胞增殖，包括遏制IGF-I水平或IGF-II水平或阻止IGF-I結合IGF-IR，但是它們仍然不適于更好的治療劑。和/或分泌。已經使用可溶性IGF-IR在體內在腫瘤細胞中誘導凋亡和在實驗動物系統(tǒng)中抑制腫瘤發(fā)生(D'Ambrosio等，CancerRes.56:4013-20,1996)。另外，已經使用IGF-IR反義寡核苷酸、IGF-I的肽類似物、和針對IGF-IR的抗體來降低IGF-I或IGF-IR表達(見上文)。然而，這些藥劑無一適合于長期施用給人類患者。另外，雖然已經給患者施用IGF-I來治療身材矮小癥、骨質疏松癥、肌肉質減少、神經病或糖尿病，IGF-I對IGFBP的結合常常使得使用IGF-I的治療困難或無效。鑒于IGF-I、IGF-II和IGF-IR在病癥(包括癌癥和增殖性病癥，諸如當IGF-I或IGF-II和/或IGF-IR過表達時)中的作用和其它治療辦法(例如小分子、siRNA、反義和抗體)的缺陷，會希望生成能選擇性調控、抑制或阻斷IGF-IR的針對IGF-IR途經(或者受體或其配體的各種同等型(isoform)或突變體)的治療劑，諸如本發(fā)明多肽。另外，在對IGF-IR或其它靶物的結合特異性之外，會希望這樣的多肽以成本高效方式表達，擁有期望的生物物理特性(例如Tm、基本上是單體、或正確折疊)、小尺寸以穿透組織和適當?shù)难喊胨テ诨蝮w內暴露時間。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面涉及以高親和力結合IGF-IR的新多肽。在有些實施方案中，該多肽以約lpM或更少、約10nM或更少、或約lnM或更少的的解離9常數(shù)結合IGF-IR。在有些實施方案中，該多肽以約l(iM或更多的解離常數(shù)結合胰島素受體。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽抑制IGF-I或IGF-II結合IGF-IR且在基于細胞的測定法中在亞IC50濃度不活化人IGF-IR，其中IC50為少于約lnM或約100pM。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽在基于細胞的測定法中在依賴于IGF-IR活化的細胞系中誘導凋亡。在有些實施方案中，IGF-IR結合物阻斷IGF-IR活性，諸如對凋亡、磷酸化或二聚化的控制。常常希望(特別是在體內應用中)本發(fā)明的靶向IGF-IR的蛋白質(或是作為單特異性治療劑或是作為多特異性(包括雙特異性或三特異性)治療劑)對于IGF-IR與胰島素受體相比是選擇性的。此類選擇性優(yōu)選為至少約IOO倍、至少約1000倍、至少約10,000倍和至少約100,000倍。另外，可能希望(特別是對于具有對IGF-IR的高親和力以致在治療劑或蛋白質的限定濃度或更低濃度檢測不到對胰島素受體的結合的蛋白質)此類濃度為約100nM、約luM、或約1OuM。結合IGF-IR勝過胰島素受體的蛋白質的選擇性相關性也可通過比較Kd、IC50、和Ki(或是測量得到的或是計算得到的，這取決于測定法)或者作為同一生物化學或生物學參數(shù)(例如Kd、IC50、和Ki)的比率來表述。此類比率優(yōu)選包括胰島素受體結合或其它測量對IGF-IR結合或其它測量的比率，其為約IOO、約l,OOO、約10，000或約100,000。本發(fā)明的結合其它耙物(特別是酪氨酸激酶受體)的其它蛋白質優(yōu)選使用本文中所提供的選擇性指導是對期望靶物(例如EGFR或Her2)與胰島素受體相比是選擇性的。在有些實施方案中，該多肽包含基于纖連蛋白的支架(scaffold)蛋白。在有些實施方案中，該多肽包含第十纖連蛋白III型("Fn3)域，其中所述、n3域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG;(ii)至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)具有相對于人"Fn3域的相應環(huán)的序列改變的氨基酸序列；且(iii)以約l^M或更少的解離常數(shù)結合人IGF-IR。在有些實施方案中，至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或1O個氨基酸是用不同于野生型序列的氨基酸替代的。在有些實施方案中，對至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)刪除或添加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個氨基酸。在有些實施方案中，環(huán)BC和環(huán)FG具有相對于人^Fn3域的相應環(huán)的序列改變的氨基酸序列。在有些實施方案中，該多肽包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列?；旧蠁蝺r地經基于纖連蛋白地支架結合IGF-IR在本發(fā)明的這個和其它實施方案中在降低IGF-IR活化方面是有幫助的。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽進一步包含一個或多個藥動學(PK)模塊(moieties)。PK模塊改善多肽的一項或多項藥動學特性，例如生物利用度、血清半衰期、體內穩(wěn)定性、和藥物分布。在有些實施方案中，PK模塊選自聚氧化烯模塊、人血清清蛋白結合蛋白、唾液酸、人血清清蛋白、運鐵蛋白、和Fc或Fc片段。在有些實施方案中，PK模塊是聚乙二醇(PEG)。在有些實施方案中，PEG模塊經Cys或Lys氨基酸與本發(fā)明多肽共價相連接。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽通過至少一個肽鍵與以約300nM或更少的結合親和力結合人血清清蛋白(HAS)的第二蛋白相連接。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽進一步包含結合人蛋白質的第二域(domain)。在有些實施方案中，人蛋白質選自EGFR、葉酸受體、Her2、Her3、c-kit、c畫Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGF3、Tie2、Angl、Ang2、FGF(成纖維細胞生長因子)、EGF(表皮生長因子)、HGF(肝細胞生長因子)、VEGF-A(血管內皮生長因子-A)、VEGF-C、和VEGF-D。在有些實施方案中，人蛋白質是IGF-IR。在有些實施方案中，人蛋白質是酪氨酸受體。在有些實施方案中，第二域以約lpM或更少、約10nM或更少、或約lnM或更少的解離常數(shù)結合人蛋白質。在有些實施方案中，第二域以約lliM或更少、約10nM或更少、或約lnM或更少的解離常數(shù)結合VEGFR2且以約lliM、lOpM、或10)iM、或更多的解離常數(shù)結合VEGFR1。在有些實施方案中，該多肽包含第一和第二蛋白，其中兩者任一或均為單鏈抗體且所述第一和第二蛋白經PEG模塊相連接。在有些實施方案中，第一蛋白結合IGF-IR。在有些實施方案中，第二蛋白選自小于約50kD的抗體模塊、脂籠蛋白的衍生物、四連蛋白的衍生物、avimer、錨蛋白的衍生物、和第二個第十纖連蛋白型III('GFn3)域，其中所述第二^Fn3域包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、和環(huán)FG;且至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)具有相對于人"Fn3域的相應環(huán)的序列隨機化的氨基酸序列，且以約IOnM或更少的解離常數(shù)結合人，n3域不結合的人蛋白質。在有些實施方案中，第二域是"Fn3域且包含SEQIDNO:2-203或226之任一的氨基酸序列。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽和第二域經至少一個二硫4泉、肽鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二醇(PEG)模塊可操作相連接。在有些實施方案中，PEG介于約0.5kDa和約100kDa之間。在本發(fā)明的有些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含經多肽相連接的第一和第二蛋白，其中所述第一或第二蛋白或多肽接頭具有血液或靶組織中的蛋白酶可切割的蛋白酶位點。此類實施方案可用于釋放兩種或更多治療性蛋白質，以實現(xiàn)更好的投遞或治療特性或與分開生成此類蛋白質相比更有效的生成。在有些實施方案中，第一和第二蛋白使用生物相容性聚合物(諸如聚合糖)相連接。此類聚合糖可包括血液或靶組織中的酶可切割的酶促切割位點。此類實施方案可用于釋放兩種或更多治療性蛋白質，以實現(xiàn)更好的投遞或治療特性或與分開生成此類蛋白質相比更有效的生成。本發(fā)明的另一個方面是本發(fā)明的一種或多種蛋白質或本文中所描述的其它蛋白質經聚合物的可操作連接以創(chuàng)建多功能蛋白質，以創(chuàng)建本發(fā)明的蛋白質治療劑。例如，聚合物可以是多肽、聚合糖、基于碳的聚合物(例如脂肪族鏈)或PEG。本發(fā)明的另一個方面包括以PEG連接本文中所描述的本發(fā)明的結合IGF-IR的蛋白質與另一種蛋白質，諸如Fab、單鏈Ab、域抗體、駱駝抗體及其衍生物(特別是小于約50kDa的實體)、抗體模塊(例如小于約50kDa)、Adtein(例如以其它特異性結合靶物同時具有一項或多項本文中所描述的藥學或生物化學特性(特別是那些涉及酪氨酸激酶受體的)的介于5和40kDa之間的蛋白質)、基于纖連蛋白的支架蛋白(例如AdnectinTM)、或抗體替代物(諸如Avimers、微體、Trans-bodiesTM、AffibodiesTM、Affilins、或三連蛋白(trinectin)(例如四連蛋白(tetranectins))和其它蛋白質(像脂籠蛋白或錨蛋白(DARPin))衍生物。在有些實施方案中，第一和第二相連接的蛋白質總共具有1或0個二硫鍵。為了改善基于細胞的系統(tǒng)中的蛋白質生成可能希望這樣。優(yōu)選的是，所述第一蛋白基本上是具有基本上單價的對IGF-IR的結合的單一域。為了改善基于細胞的系統(tǒng)中的蛋白質生成可能希望這樣。優(yōu)選的是，所述第一蛋白以約100pm或更少的結合親和力結合人IGF-IR且具有至少兩個參與所述第一蛋白結合人IGF-IR的結構環(huán)。優(yōu)選的是，所述第二蛋白是通過至少一個肽鍵與所述第一蛋白相連接的基于纖連蛋白的支架蛋白。在有些實施方案中，所述第一蛋白和第二蛋白通過至少一個二辟d建相連接。雖然這可以在細胞中實現(xiàn)，但是可能希望在體外在沒有細胞的情況中實施。本發(fā)明的多肽可包括以約300pM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且具有至少兩個參與所述第一蛋白結合人IGF-IR的結構環(huán)的第一蛋白。優(yōu)選的是，所述第一蛋白以約1nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽進一步包含與所述第一蛋白或所述第二蛋白可操作相連接的PEG模塊。優(yōu)選的是，所述第二蛋白結合人癌癥中上調的人酪氨酸激酶受體，其中所述第二蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人酪氨酸激酶受體且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽可包含總共具有至少6個二^5充鍵，或者在另一個方面，總共具有至少8個二硫鍵的第一蛋白和第二蛋白。優(yōu)選的是，所述第一蛋白和所述第二蛋白是自微生物表達的單一多肽。優(yōu)選的是，所述第一蛋白以約100pM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且具有至少兩個參與所述第一蛋白結合人IGF-IR的結構環(huán)。在有些實施方案中，所述第一蛋白和所述第二蛋白中至少一個是抗體模塊。優(yōu)選的是，此類抗體模塊小于約50kDa，或者在另一個方面中，小于約40kDa。在有些實施方案中，抗體模塊是單鏈抗體模塊。蛋白質治療劑包括其中所述第二蛋白結合以下人蛋白質和配體之一的實施方案，蛋白質EGFR、葉酸受體、Her2、Her3、c-kit、c-Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGF3、和Tie2;配體Angl、Ang2、FGF、EGF、HGF、干細胞因子(SCF)、VEGF-A、VEGF-C、和VEGF-D。在有些實施方案中，第一蛋白和/或第二蛋白是脂籠蛋白的衍生物。在有些實施方案中，所述第一蛋白和所述第二蛋白中至少一個是四連蛋白的衍生物。在有些實施方案中，所述第一蛋白模塊和所述第二蛋白模塊中至少一個是avimer的書亍生物。PEG可用在本發(fā)明的許多方面中，而且可以爿使用不同大小，如本文中所描述的，用于實現(xiàn)期望的治療效果或其它體內效果，諸如成像。為了延遲在身體、血液、非血液胞外流體和組織中的半衰期優(yōu)選較大的PEG。對于體內細胞活性，優(yōu)選約10-60kDa范圍的PEG，以及小于約IOOkDa、更優(yōu)選小于約60kDa的PEG，雖然也可使用大約約100kDa的大小。對于體內成像應用，可使用較小的PEG，一般小于約20kDa，它們不像較大PEG那樣多地延長半衰期，從而容許更快地分布和更短的半衰期。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含經單一Cys或Lys與PEG可操作相連接的第一蛋白和第二蛋白。在有些實施方案中，至少第一或第二蛋白具有不超過一個Cys或Lys。在有些實施方案中，該單一Cys或Lys位于所述第一或第二蛋白中，位于氨基酸序列中的野生型位置。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含第一和第二蛋白，其中所述第一蛋白抑制細胞增殖，具有至少55。C的Tm，且在其氨基酸序列中基本上不干擾對人IGF-IR的結合的區(qū)域中具有非野生型Cys或Lys。在有些實施方案中，第一蛋白和第二蛋白是自微生物表達的單一多肽。在有些實施方案中，第一蛋白以約50pM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且具有至少兩個參與所述第一蛋白結合人IGF-IR的結構環(huán)。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽具有IV施用的情況中至少l天的體內半衰期。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽具有施用后在嚙齒類動物中持續(xù)超過24小時濃度為所述第一蛋白對人IGF-IR的結合親和力的至少約10倍的暴露水平。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽具有皮下施用后在嚙齒類動物中持續(xù)超過24小時濃度為所述第一蛋白對人IGF-IR的結合親和力的至少約100倍的暴露水平。在有些實施方案中，第一或第二蛋白是基于纖連蛋白的支架蛋白。取決于診斷、治療、體外或體內應用，可使用本發(fā)明多肽對IGF-IR、其它人蛋白質、或PK模塊的多種親和力。例如，解離常數(shù)類似于或小于約luM、約100nM、約10nM、約lnM、約100pM、約10pM、約lpM或約100fM的親和力是優(yōu)選的，特別是對于IGF-IR。對期望靶物具有不同親和力的本發(fā)明蛋白質的體內測試有助于選擇用于體內應用的期望親和力。依賴于其它蛋白質的存在和IGF-IR的量的體外測試一般可使用與體內應用相比具有不同親和力的本發(fā)明蛋白質。通常，在體外可使用較低的親和力或較弱的結合。在有些實施方案中，該多肽是通過包括以下步驟的方法選擇的"Fn3域a)生成一群候選RNA分子，每種包含與人^Fn3域編碼序列不同的候選第十纖連蛋白III型(，n3)域序列，所述RNA分子每種都包含與所述候選"Fn3域編碼序列可操作相連接的翻譯起始序列和起始密碼子且每種都在3'端與核酸-。票呤霉素接頭可操作相連接；b)在體外翻譯所述候選"Fn3域編碼序列以生成一群候選RNA，F(xiàn)n3融合物；c)使所述候選RNA-Fn3融合物群與IGF-IR接觸；并d)選擇如下RNA-，n3融合物，其蛋白質部分具有相對于所述人^Fn3對IGF-IR的結合親和力或特異性改變的對IGF-IR的結合親和力或特異性。本發(fā)明的一個方面涉及包含結合人靶物的基于纖連蛋白的支架蛋白的多肽。在有些實施方案中，該多肽進一步包含本文中所描述的PK模塊。PK模塊可以通過合適的接頭(諸如本文中所描述的那些)與基于纖連蛋白的支架蛋白相連接。本發(fā)明的一個方面提供了能夠在存在生長刺激物(諸如例如血清、胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II)時抑制癌細胞生長超過約80%的本發(fā)明多肽。本發(fā)明的又一個方面提供了包含本發(fā)明多肽的藥學可接受組合物，其中該組合物基本上不含內毒素。優(yōu)選的是，該組合物基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。該組合物可以配制用于例如IV、IP或皮下施用。本發(fā)明的又一個方面提供了包含編碼一種或多種本發(fā)明多肽的多核苷酸的細胞。也包括包含此類蛋白質的多核苷酸的載體。序列優(yōu)選是經過優(yōu)化的，以使在所使用的細胞類型中的表達最大化。優(yōu)選的是，表達是在大腸桿菌中。本發(fā)明的蛋白質也可以在例如真核微生物中表達，包括酵母(例如畢赤氏酵母(pichia)或釀酒酵母(cervaisea))或藍綠藻。可以改造酵母細胞以在本文中所描述的任何蛋白質上產生期望的糖基化。一方面，可以改造哺乳動物細胞以在本文中所描述的任何蛋白質上產生期望的糖基化。一方面，細胞表達基于纖連蛋白的支架蛋白。一方面，編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的多核普酸是為了在所選擇的細胞類型中的表達經過密碼子優(yōu)化的。本發(fā)明的一個方面提供了用于治療患有癌癥的受試者的方法，其單獨地或與其它細胞毒劑或治療劑聯(lián)合地通過施用本發(fā)明的新多肽。癌癥可以是例如乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、或其中與非致瘤細胞相比在生理學上IGF-IR水平升高、上調、突變或改變的其它待確定癌癥中的一種或多種。本發(fā)明的另一個方面提供了用于治療患有癌癥的受試者的方法，其通過單獨地或與其它細胞毒劑或治療劑聯(lián)合地施用本發(fā)明的多肽。具體而言，優(yōu)選的細胞毒劑和治療劑包括多西他塞(docetaxel)、帕利他塞(paclitaxel)、多柔t(yī)匕星(doxorubicin)、表柔t(yī)匕星(epirubicin)、主不石粦醜胺(cyclophosphamide)、曲妥單抗(trastuzumab)、卡培他濱(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞片木(goserelin)、奧沙利鈾(oxaliplatin)、卡確白(carboplatin)、J偵4白(cisplatin)、i也塞米^^(dexamethasone)、安肽(antide)、貝伐單抗(bevacizumab)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)、亞葉酸15(leucovorin)、左口米p坐(levamisole)、4尹立替康(irinotecan)、依4乇泊芬(etoposide)、托泊替康(topotecan)、吉西他濱(gemdtabine)、長春瑞濱(vinorelbine)、處,莫司汀(estramustine)、米4毛蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑來膦酸鹽(zoledronate)、鏈佐星(streptozocin)、利妥昔單抗(rituximab)、伊達比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氟達拉濱(fludarabine)、伊馬替尼(imatinib)、阿糖胞芬(cytarabine)、替葉尹莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗(tositumomab)、千4尤素a-2b(interferonalpha-2b)、美法侖(melphalam)、bortezomib、六曱蜜胺(altretamine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、gefitinib、erlonitib、抗EGF受體抗體(例^口西妥昔單凈元(cetuximab)或panitumumab)、ixabepilone、和epothilone或其衍生物。更優(yōu)選的是，治療劑是鉑劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順鈾)、紫杉烷(taxane)(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、或喜樹堿(camptothecin)。另外，可能優(yōu)選聯(lián)合本發(fā)明的多肽與第二治療性蛋白質成為單一分子，或者可能成為單一分子再聯(lián)合第三治療性蛋白質。這樣的治療性實體包括通過PEG或其它聚合物(例如Cys-Cys二硫化物或多肽)相連接的本發(fā)明蛋白質與一種或多種治療性蛋白質。此類治療性蛋白質包括抗體衍生物(例如Fab、駱駝抗體及其衍生物、域抗體(例如大小小于約50kDa)和單鏈(優(yōu)選大小小于約50kDa))、AdnectinsTM和優(yōu)選在約5-約40kDa范圍內的蛋白質。本發(fā)明蛋白質的靶物包括(特別是人型式的，盡管在有些情況中是模式物種型式的，諸如小鼠、大鼠、猴、和犬)IGF-IR、.FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、人pl85受體樣酪氨酸激酶(HER2或Her2)、Her3、c-Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、人血管內皮生長因子(VEGF)A、VEGFC、VEGFD、人CD20、人CD18、人CDlla、人凋亡受體-2(Apo-2)、人a4(37整聯(lián)蛋白、人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、人表皮生長因子受體(EGFR)、和人CD3。另外，本發(fā)明的各方面包括結合第一靶物和至少一種其它靶物的多功能蛋白質。優(yōu)選的是，此類蛋白質通過本文中所描述的PEG相關發(fā)明相連接，盡管在許多實施方案中，此類蛋白質可通過多肽或其它聚合物接頭或非聚合物接頭相連接。穩(wěn)定連接的本發(fā)明蛋白質可用于癌癥的治療性處理。在針對2、3、4或更多種治療性靶物或表位時，本發(fā)明的多特異性蛋白質具有調控、阻斷或抑16制超過一種治療耙物的優(yōu)點?？梢杂弥委焺┑南鄳飳W靶向任何類型的腫瘤和任何類型的腫瘤抗原。癌癥可以是例如乳腺癌(breastcancer)、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經細胞瘤、和橫紋肌肉瘤、或其中與非致瘤細胞相比在生理學上IGF-IR水平升高、上調、突變或改變的其它待確定癌癥中的一種或多種?？梢园邢虻钠渌绢愋偷哪[瘤包括急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、膽癌(biliarycancer)、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、頭頸癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、肺癌、髓性曱狀腺癌(medullarythyroidcancer)、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、膠質瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌、和膀胱癌。另外，可以通過本發(fā)明的多肽靶向腫瘤相關靶物。在有些實施方案中，抗原靶向會有助于在組織分布方面定位治療劑或者提高在組織或期望細胞類型中實現(xiàn)的局部濃度?；蛘?，可以與本文中所描述的耙物之一(針對它創(chuàng)建了治療劑)一起提供別的作用機制來抗擊癌癥。此類抗原或耙物包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、對于A33抗體特異性的抗原、BrE3抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP畫1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧可誘導因子(HIF)、KC4抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、S亂TAG畫72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-I(IGF-I)、胰島素生長因子-II(IGF-II)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、胎盤生長因子(P1GF)、17-1A抗原、血管發(fā)生標志物(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標志物、癌基因產物、和其它腫瘤相關抗原。最近關于腫瘤相關抗原的報告包括Mizukami等，(2005,NatureMed.11:992-97);Hatfield等，(2005，Curr.CancerDrugTargets5:229-48);Vallbohmer等(2005,J.Clin.Oncol.23:3536-44);及Ren等(2005，Ann.Surg.242:55-63)，通過述及將每一篇收入本文。在其它實施方案中，抗血管發(fā)生劑可形成治療劑的一部分且可與本發(fā)明的蛋白質可操作相連接。例示性的可使用的抗血管發(fā)生劑包括血管他丁(angiostatin)、baculostatin、canstatin、maspin、凈元VEGF才元體或肽、4元月臺盤生長因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-IO、Gro-卩、血小板反應蛋白(thrombospondin)、2-曱氧基雌二醇、多育曲菌素相關蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬里馬司他(Marimastat)、多石克酸戊聚糖(pentosanpolysulphate)、血管生成素(angiopoietin2)、干擾素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、利諾胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可堿(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP-470、內皮他丁(endostatin)、巾白利他塞、accutin、血管他丁(angiostatin)、西多福韋(cidofovir)、長春新石威(vincristine)、博來霉素(bleomycin)、AGM畫1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。本發(fā)明的另一個方面提供了包含一種或多種本文中所描述的要素及關于使用那些要素的說明書的試劑盒。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括單獨的或與第二治療劑一起的本發(fā)明蛋白質。此優(yōu)選實施方案的說明書包括關于使用單獨的或與第二治療劑一起的本發(fā)明蛋白質抑制癌細胞生長的說明書，和/或關于使用單獨的或與第二治療劑一起的本發(fā)明蛋白質治療患有癌癥的患者的方法的說明書。本發(fā)明的另一個方面提供了基于蛋白質的組合物，其包含特異性結合人IGF-IR的第一蛋白；其中所述第一蛋白的MW介于約4kD和約40kD之間，與人IGFI或IGF1I具有小于約30。/。的氨基酸同一性，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，該組合物進一步包含PK模塊，諸如PEG或結合人血清清蛋白的蛋白質。在有些實施方案中，第一蛋白具有約lnM或更少的對IGF-IR的解離常數(shù)。在有些實施方案中，該組合物阻斷IGF-I或IGF-II結合IGF-IR。本發(fā)明的另一個方面提供了基于蛋白質的組合物，其包含以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體的第一蛋白；其中所述第一蛋白基本上是對于人IGF-IR具有基本上單價的結合的單一域，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，該組合物進一步包含通過肽一睫與所述第一蛋白相連接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以約1OnM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且18以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。在有些實施方案中，該組合物進一步包含通過至少一個肽鍵與所述第一蛋白相連接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以約300nM或更少的結合親和力結合人血清清蛋白。在有些實施方案中，該組合物進一步包含通過PEG與所述第一蛋白相連接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以約1OnM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。在有些實施方案中，第一或第二蛋白包含基于纖連蛋白的支架蛋白。本發(fā)明的另一個方面提供了基于PEG的組合物，其包含與以約100nM的結合親和力結合人IGF-IR的第一蛋白和結合人蛋白質的第二蛋白相連接的第一PEG;其中所述PEG介于約.5kD和約I00kD之間，且所述組合物基本上不含游離PEG且基本上不含微生物污染，使之適用于體內施用。在有些實施方案中，第二蛋白以約lnM或更少的結合親和力結合至少一種人酪氨酸受體或至少一種人酪氨酸受體配體且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。在有些實施方案中，這兩種蛋白質之一或均為基于纖連蛋白的支架蛋白。本發(fā)明的另一個方面提供了基于蛋白質的組合物，其包含可^t喿作相連4妻的結合人IGF-IR的第一蛋白和結合人蛋白質的第二蛋白；其中所述第一蛋白以約1OnM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約1uM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，該基于蛋白質的組合物進一步包含與所述第一蛋白或所述第二蛋白之任一可操作相連接的PEG模塊。在有些實施方案中，第二蛋白結合在人癌癥中上調的人酪氨酸激酶受體，其中所述第二蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人酪氨酸激酶受體且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體。本發(fā)明的另一個方面提供了蛋白質治療劑，其包含可操作相連接的結合人IGF-IR的第一蛋白模塊和結合人治療性靶物的第二蛋白模塊；其中所述第一蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，其基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用；且進一步的，其中所述第二蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人治療性耙物且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，第一蛋白和第二19蛋白是自微生物表達的單一多肽。本發(fā)明的另一個方面提供了蛋白質治療劑，其包含與PEG可操作相連接的結合人IGF-IR的第一蛋白模塊，該PEG與結合人治療性靶物的第二蛋白才莫塊可操作相連接；其中所述第一蛋白模塊以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用；且進一步的，所述第二蛋白模塊以約力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，第一蛋白模塊和第二蛋白模塊總共具有至少6個二硫鍵。本發(fā)明的另一個方面提供了蛋白質治療劑，其包含與PEG可操作相連接的結合人IGF-IR的第一蛋白模塊，該PEG與結合人治療性靶物的第二蛋白模塊可操作相連接；其中所述第一蛋白模塊以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體且對于人IGF-IR的結合基本上是單價的，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用；且進一步的，其中所述第二蛋白模塊以約10nM或更少的結合親和力結合人治療性靶物且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體且對于人IGF-IR的結合，且基本上不含孩i生物污染，使之適合于體內施用。本發(fā)明的另一個方面提供了蛋白質治療劑，其包含與生物相容性聚合物可操作相連接的結合人IGF-IR的第一蛋白模塊，該生物相容性聚合物與結合人治療性靶物的第二蛋白模塊可操作相連接；其中所述第一蛋白模塊以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約1uM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，4吏之適合于體內施用；進一步的，其中所述第二蛋白模塊以約10nM或更少的結合親和力結合人治療性靶物且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用；且進一步的，其中所述第一蛋白模塊和第二蛋合超過一種治療性靶物的治療收益最大化。在有些實施方案中，該多肽具有血液或靶組織中的蛋白酶可切割的蛋白酶位點。本發(fā)明的另一個方面提供了蛋白質治療劑，其包含與PEG可操作相連接的結合人IGF-IR的第一蛋白，該PEG與結合人蛋白質的第二蛋白可操作相連接；其中所述第一蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人IGF-IR且以約luM或更大的結合親和力結合人胰島素受體且是人IGF-IR的拮抗劑，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用；且進一步的，其中所述第二蛋白以約10nM或更少的結合親和力結合人治療性靶物且以約1uM或更大的結合親和力結合人胰島素受體，且基本上不含微生物污染，使之適合于體內施用。在有些實施方案中，第一蛋白抑制細胞增殖，具有至少55。C的Tm,且在其lys。在有些實施方案中，蛋白質治療劑具有IV施用的情況中至少1天的體內半衰期。在有些實施方案中，蛋白質治療劑具有施用后在嚙齒類動物中持續(xù)超過24小時濃度為所述第一蛋白對人IGF-IR的結合親和力的至少約10倍的暴露水平。在有些實施方案中，第一和/或第二蛋白是基于纖連蛋白的支架。本發(fā)明的另一個方面提供了細胞，其包含編碼一種或多種本文中所描述的蛋白質的多核苷酸。在有些實施方案中，該細胞是經過改造以在本文中所描述的任何蛋白質上產生期望的糖基化的酵母。在有些實施方案中，該細胞是藍綠藻。在有些實施方案中，該細胞是經過改造以在本文中所描述的任何蛋白質上產生期望的糖基化的哺乳動物細胞。在有些實施方案中，該蛋白質是基于纖連蛋白的支架且任選具有為了在細胞中的表達經過密碼子優(yōu)化的多核苦酸。附圖簡述圖l。關于結合人IGF-IR的克隆的分離的選擇概況。顯示的是圖示使用隨機纖連蛋白支架域蛋白文庫進行的PROrusion實驗過程中百分比IGF-IR結合增加的圖。將一萬億個mRNA/cDNA-蛋白質融合物的文庫結合至溶液中的100nM生物素化IGF-IR,并捕捉至鏈霉親合素包被的磁珠上。將cDNA洗脫，通過PCR擴增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白質融合物的新文庫。以這種方式實施5輪PROfusion,并通過定量PCR監(jiān)測文庫中結合IGF-IR的百分比。圖2。人IGF-IR竟爭性克隆的SDSPAGE。顯示的是顯示通過HTPP純化的人IGF-IR竟爭性Adnectins的SDSPAGE凝膠，如實施例35中所述。將樣品加載到10%NuPAGE微型膠上并使用Sypro橙染色。圖3。人IGF-IR竟爭性克隆218C04的純化步驟的SDSPAGE。SDSPAGE凝膠圖示了人IGF-IR竟爭性纖連蛋白支架域蛋白質的最終產物(即此例中的領先(lead)克隆218C04)的質量和典型的中等規(guī)^莫純化，如實施例35中所述。圖5。人IGF-IR竟爭性克隆218C04的優(yōu)化。該示意示了人IGF-IR纖連蛋白支架域蛋白領先者(在此例中是克隆218C04)的典型優(yōu)化步驟。圖5a顯示了通過分別隨機化克隆218C04的一個環(huán)得到的3個文庫的結果。將一萬億個mRNA/cDNA-蛋白質融合物的文庫結合至溶液中的lOOnM生物素化IGF-IR，并捕捉至鏈霉親合素包被的磁珠上。將cDNA洗脫，通過PCR擴增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白質融合物的新文庫。重復文庫構建和親和選擇過程，直至結合至IGF-IR的百分比超過1。/。，正如通過定量PCR所測量的。此時，擴增經過優(yōu)化的環(huán)并重組以生成包含所有三個優(yōu)化環(huán)的單一文庫(圖5b)。將來自此文庫的mRNA/cDNA-蛋白質融合物捕捉到IGF-IR包被的珠上，接著是3輪用lnM生物素化IGF-IR進行的PROfiision。在每種情況中，結合百分比是通過定量PCR測量的(圖5c)。圖6?？寺?18C04優(yōu)化克隆的IGF-I/IGF-IR竟爭性測定法。該圖顯示了具有改善的在實施例35所述竟爭性ELISA中抑制IGF-I和IGF-IR間相互作用的能力的經過優(yōu)化的纖連蛋白支架域蛋白的例子。圖7。所選擇的克隆218C04優(yōu)化的、純化的IGF-IR克隆的SDSPAGE。顯示的是SDSPAGE,其顯示了如實施例35中所述自領先者(leads)的優(yōu)化衍生的并通過純化的改善的人IGF-IR竟爭性Adnectins。將樣品加載到10%NuPAGE微型膠上并使用Sypro橙染色。圖8。經過優(yōu)化的竟爭性IGF-IR克隆338A06的差示掃描量熱法。代表性IGF-IR優(yōu)化克隆(在這種情況中是克隆338A06)的差示掃描量熱法(DSC)。黑色跡線是原始數(shù)據，紅色跡線是擬合。如實施例35中所述實施DSC。圖9。經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆338A06的SEC。自優(yōu)化過程衍生的代表性人IGF-IR竟爭性纖連蛋白支架域蛋白(具體是克隆338A06)的大小排阻層析圖。層析詳情如實施例35中所述。采用熒光檢測。圖IO。經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆338A06的SECMALLS。纖連蛋白支架域蛋白克隆338A06的SEC-MALLS分析。洗脫峰的洗脫時間對摩爾質量的圖。Rayleigh比指所散射的光超過單獨的溶劑所散射的光的過量(只顯示圖ll。IGF-IR竟爭性克隆338A06的質語。人IGF-IR竟爭性克隆338A06的MALDIMS。樣品制備和實驗條件如實施例35中所述。圖12?？寺?38A06的IGF-I增殖測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的人竟爭性IGF-IR結合克隆(在這種情況中是338A06)對IGF-I介導的有絲分裂的抑制。包括了與商品化中和性抗IGF-IR單抗(MAB391)的比較。如實施例35所示1吏用人胰腺腺癌細胞系BxPC-3圖13。IGF-IR竟爭性克隆338A06的IGF-IR抑制測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的人竟爭性IGF-IR結合克隆(在這種情況中是克隆338A06)對IGF-I和IGF-IR間相互作用的破壞。包括了與IGF-I和商品化中和性抗IGF-IR單抗(MAB391)的比較。如實施例35所述使用人乳腺腺癌MCF-7。圖14。克隆338A06FG環(huán)優(yōu)化的克隆的IGF-IR結合測定法。該圖顯示了克隆338A06FG環(huán)優(yōu)化的克隆在實施例35所述直接結合ELISA中的活性。圖15。FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的SEC。18種所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的大小排阻層析圖。層析條件如實施例29中所述。采用熒光檢測。圖16。IGF-IRFG環(huán)優(yōu)化的克隆387B01的SEC。中等規(guī)模水平純化的代表性人FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆(具體是克隆387B01)的大小排阻層析圖。層析詳情如實施例35中所述。釆用熒光檢測。圖17。IGF-IRFG環(huán)優(yōu)化的克隆387B01的RP-HPLC。代表性人FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆(具體是克隆387B01)的RP-HPLC層析圖。層析詳情如實施例35中所述。采用A280nm檢測。圖18。IGF-IRFG環(huán)優(yōu)化的克隆387B01的MALDITOF質譜。中等規(guī)模水平純化的代表性人FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆(具體是克隆387B01)的MALDIMS。樣品制備和實驗條件如實施例35中所述。圖19。PEG化蛋白質的SDSPAGE。顯示的是SDSPAGE凝膠，其顯示了385A08的PEG化型式。PEG化條件如實施例35中所述。將樣品加載到10%NuPAGE微型膠上并使用Sypro橙染色。圖20。PEG化人IGF-IR變體的基于細胞的測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的IGF-IR克隆385A08的PEG化型式對血清介導的增殖的抑制。如實施例35中所述使用人漿細胞瘤細胞系NCI-H929。圖21。IGF-IR多聚體的基于細胞的測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的IGF-IR結合性纖連蛋白支架克隆對IGF介導的增殖的抑制。在存在100ng/mLIGF和不同濃度的每種IGF-IR拮抗劑時將工程化淋巴細胞細胞系32D:IGF-IR在含100/c)胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以10000個細胞每孔的濃度分配入96孔板(*IGF-IR單克隆抗體MAB391;■IGF-IR結合克隆385A08(SEQIDNO:226);〇通過PEG相連接的兩個IGF-IR結合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-385A08;▲通過二硫鍵相連接的兩個IGF-IR結合克隆(SEQIDNO:203):385A08-SS-385A08)。圖22。IGF-IR/VEGFR2多聚體的基于細胞的IGF-IR測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的IGF-IR結合性纖連蛋白支架克隆對血清介導的增殖的抑制。在存在不同濃度的每種IGF-IR拮抗劑時將人漿細胞瘤細胞系NCI-H929(ATCC,Manassas,VA)在含10。/o胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以25000個細胞每孔的濃度分配入96孔板(抗IGF-IR單克隆抗體MAB391,R&DSystems,Minneapolis,畫；〇IGF-IR結合克隆385A08(SEQIDNO:203);▲通過PEG相連接的VEGFR2/IGF-IR結合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-SEQIDNO:128;■VEGFR2結合克隆(SEQIDNO:128))。圖23。IGF-IR/VEGFR2多聚體的基于細胞的VEGFR2測定法。該圖呈現(xiàn)了所選擇的IGF-IR結合性纖連蛋白支架克隆對VEGF介導的增殖的抑制。在存在5ng/mLVEGF和不同濃度的每種VEGFR2拮抗劑時將工程化原B細胞系hKE8-3(Ba/F3:VEGFR2)在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以25000個細胞每孔的濃度分配入96孔板(VEGFR2結合克隆SEQIDNO:128;〇對照SEQIDNO:227;▲通過PEG相連接的VEGFR2/IGF-IR結合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-SEQIDNO:128)。圖24。VH和"Fn3域結構。為具有免疫球蛋白折疊(免疫球蛋白Vh域，左邊)的單域多肽和具有免疫球蛋白樣折疊(^Fn3域，右邊)的單域多肽描繪了結果組織。圖25。連接至HAS的纖連蛋白支架IGF-IR結合物的評估。該圖呈現(xiàn)了所選擇的IGF-IR結合性纖連蛋白支架克隆對血清介導的增殖的抑制。在存在不同濃度的每種IGF-IR拮抗劑時將人漿細胞瘤細胞系NCI-H929(ATCC,Manassas,VA)在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad,CA)中以25000個細胞每孔的濃度分配入96孔板(抗IGF-IR單克隆抗體MAB391,R&DSystems,Minneapolis,MN;〇IGF-IR結合克隆385A08(SEQIDNO:203);▲HSA-385A08(SEQIDNO:203);■人血清清蛋白，HSA，Invitrogen,Carlsbad,CA)。讓細胞于37。C，5%C02增殖72小時。增殖期后，使細胞暴露于細胞滴定96水性增殖試劑(Promega,Madison,WI)并再溫育4小時。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上測量490nm吸光度，并4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得數(shù)據。圖26。IGF-IR構建物的體內胂瘤抑制。將中值腫瘤體積(mg)(y軸)對腫瘤植入后天數(shù)(x軸)繪圖。x軸底部的三角形指示施藥。IGFIR化合物(一種IGF-IR拮抗劑)、385A08(SEQIDNO:226)、385A08-PEG20-385A08(SEQIDNO:203畫PEG20-SEQIDNO:203)、385A08-PEG40(SEQIDNO:203)、和385A08-HSA(SEQIDNO:203)在Rh41異種移植物模型中展現(xiàn)出不同程度的腫瘤抑制。圖27。IGF-IR構建物的體內腫瘤生長抑制。將達到中值組腫瘤大小500mg的天數(shù)(y軸)對圖26所示不同處理組(x軸)繪圖。達到目標大小的組中值時間以水平線標示。對于相對于對照達到500mg的時間，*p^0.05或"氺p^0扁5。圖28。IGF-IR-Fc融合構建物的表征。上圖顯示了SDSPAGE凝膠，最左邊的一欄是分子量標志物，接著是未還原的IGF-IR-Ig(泳道l)、endo-H處理的IGF-IR-Ig(泳道2)、和EndoH(泳道3)。endoH處理后向更小質量的小位移指示了IGF-IR-Ig蛋白具有少量的糖基化。下圖顯示了存在還原劑時的SDSPAGE凝膠，最左邊的一欄是分子量標志物，接著是未處理的IGF-IR-Ig(泳道l)、endo-H處理的IGF-IR-Ig(泳道2)、endo-H和SDS處理的IGF-IR-Ig(泳道3)和EndoH(泳道4)。正如能看到的，觀察到的質量是未還原樣品的大小的大約一半，正如對二硫化物相連接的完整IGF-IR-Ig所預期的。圖29描繪了用于評估385A08-Fc抑制Rh41人橫紋肌肉瘤細胞中IGF-lRAKT和MAPK磷酸化的能力的Western印跡。將細胞用IGF-I、IGF-II、胰島素配體(50ng/ml)刺激或不刺激(NS)，然后用各種濃度的385A08-Fc(SEQIDNO:226)處理。用所示抗體以及磷酸特異性抗體探查膜。25圖30描繪了人纖維蛋白III型域的野生型第十模塊(SEQIDNO:1)、實施例2中所鑒定的IGF-IR竟爭性克隆(SEQIDNO:2-109)、來自實施例8的經過優(yōu)化的218C04克隆(SEQIDNO:110-125)、例示性的VEGFR-2結合"Fn3多肽(SEQIDNO:126-183)、來自實施例18的經過優(yōu)化的338A06克隆(SEQIDNO:184-202)、來自圖21的IGF-IR結合克隆385A08對照(SEQIDNO:226)、來自圖23的纖連蛋白支架蛋白對照(SEQIDNO:227)、例示性的HSA-IGF-IR融合蛋白(SEQIDNO:228-235)、和例示性的運鐵蛋白-IGF-IR融合蛋白(SEQIDNO:236-243)的氨基酸序列。BC、DE、和FG環(huán)在SEQIDNO:l-125中以陰影標示。發(fā)明詳述定義本文中所描述的方法學已經成功地用于開發(fā)本發(fā)明的蛋白質，其包括但不限于自至少兩組相關蛋白質結構(那些具有免疫球蛋白折疊的蛋白質和那些具有免疫球蛋白樣折疊的蛋白質)衍生的單域IGF-IR結合多肽。"多肽"指兩個或更多個氨基酸的任何序列，無論長度、翻譯后修飾、或功能。"多肽"、"肽"、和"蛋白質"在本文中可互換使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，諸如美國專利No.6,559,126(通過述及收入本文)中披露的那些。還可以以多種標準化學方式之任一修飾多肽(例如可以用保護基團修飾氨基酸；可以將羧基末端氨基酸變成末端酰胺基團；可以用基團修飾氨基末端殘基以例如增強親脂性；或者，可以化學糖基化或以其它方式修飾多肽以提高穩(wěn)定性或延長半衰期)。多肽修飾可包括另一結構(諸如環(huán)狀化合物或其它分子)對多肽的附著，而且還可包括包含一個或多個處于改變的構型(例如R或S;或者L或D)的氨基酸的多肽。術語"單域多肽"(singledomainpolypeptide)用于指示受試多肽的耙物結合活性(例如IGF-IR結合活性)位于單一結構域內，不同于例如抗體和單鏈抗體(其一般由重鏈可變域和輕鏈可變域二者貢獻出抗原結合活性)?？梢赃B接本文中所公開的種類的多種單域多肽以創(chuàng)建親合力提高的復合分子。類似的，可以將單域多肽附著(例如作為融合蛋白)至任何數(shù)目的其它多肽(諸如焚光多肽、耙向多肽和具有獨特治療效果的多肽)。術語"PK"與"藥動學"同義且涵蓋化合物的特性，包括例如受試者對26它的吸收、分布、代謝、和消除。"PK調控蛋白"或"PK模塊"指在與生物學活性分子融合或一起施用時影響生物學活性分子的藥動學特性的任何蛋白質、肽、或模塊。PK調控蛋白或PK模塊的例子包括PEG、人血清清蛋白(HSA)結合物(如美國公開文本No.20050287153和20070003549中所公開的)、人血清清蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如唾液酸)。免疫球蛋白或免疫球蛋白樣支架的單域多肽會趨于共享某些結構特征。例如，該多肽可包含約80個-約150個氨基酸，這些氨基酸在結構上組織成一組P或(3樣鏈，形成I3片層，其中P或P樣鏈通過居間環(huán)部分相連接。重鏈可變域和^Fn3域的結構組織的例子顯示于圖24。P片層形成單域多肽的穩(wěn)定核心，同時創(chuàng)建兩個由連接(3或P樣鏈的環(huán)構成的"面"("face")。如本文中所描述的，這些環(huán)可以變化以創(chuàng)建定制的配體結合位點，而且在正確控制下，可以在不破壞蛋白質整體穩(wěn)定性的情況下產生此類變異。在抗體中，三個這樣的環(huán)是眾所周知的互補決定區(qū)(或"CDR")。用于形成單域多肽的支架應當在生理學條件中高度可溶和穩(wěn)定。免疫球蛋白支架的例子是單域VH或VL支架，以及單域camelidVHH結構域(在camelids中找到的一種重鏈可變域形式)或在自然界中找到的或在實驗室中改造的其它免疫球蛋白可變域。在本文中所公開的單域格式中，免疫球蛋白多肽不需要與第二多肽形成二聚體來實現(xiàn)結合活性。因而，可以改變天然包含介導與第二蛋白的二硫化物交聯(lián)的半胱氨酸的任何此類多肽以消除該半胱氨酸?；蛘?，可以保留該半胱氨酸用于將別的模塊(諸如PEG)綴合至單域多肽。其它支架可以是非抗體支架蛋白。"非抗體支架蛋白或域"指具有免疫球蛋白樣折疊的非抗體多肽。"免疫球蛋白樣折疊"指包含兩層反向平行的(3片層且這兩個(3片層的平坦、疏水性面彼此面對面包裝的約80-150個氨基酸殘基的蛋白質域。這樣的支架的例子是"基于纖連蛋白的支架蛋白"，其指基于纖連蛋白III型域(Fn3)的多肽?；诶w連蛋白的支架蛋白的一個例子是AdnectinsTM(AdnexusTherapeutics,Inc.)。纖連蛋白是在胞外基質形成和細胞-細胞相互作用中發(fā)揮至關重要作用的大型蛋白質；它由三種類型(I型、II型、和III型)小型結構域的許多重復組成(Baron等，1991)。Fn3自身是一個大型亞家族的范例，該亞家族包括細胞粘附分子、細胞表面激素和細胞因子受體、伴侶、和碳水化合物結合域的一部分。綜述參見Bork和Doolittle,ProcNatlAcadSciUSA.1992Octl;89(19):8990-4;Bork等，JMolBiol.1994Sep30;242(4):309畫20;Campbell和Spitzfaden,Structure.1994May15;2(5):333-7;Harpez和Chothia,JMolBiol,1994May13;238(4):528-39。優(yōu)選的是，基于纖連蛋白的支架蛋白是"1QFn3"支架，其指基于人纖連蛋白III型蛋白質的第一模塊的多肽變體，其中一個或多個溶劑可及環(huán)被隨機化或突變，特別是鑒定為BC環(huán)(氨基酸23-30)、DE環(huán)(氨基酸52-56)和FG環(huán)(氨基酸77-87)(編號方式基于人纖連蛋白III型結構域的野生型第十模塊的序列)的三個環(huán)中的一個或多個VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPV卿TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQIDNO:l)。優(yōu)選的是，基于纖連蛋白的支架蛋白基于SEQIDNO:l。已經報告了多種突變型"Fn3支架。一方面，Asp7、Glu9、和Asp23中的一個或多個被另一種氨基酸(諸如例如不帶負電荷的氨基酸殘基，例如Asn、Lys、等)替換。已經報告了這些突變具有與野生型相比促進突變型1QFn3在中性pH處的更大穩(wěn)定性的效果(參見例如PCT公開文本No.WO02/04523)。已經公開了1QFn3支架中或是有益的或是中性的多種別的改變。參見例如Batori等，ProteinEng.2002Dec;15(12):1015-20;Koide等，Biochemistry2001Aug28;40(34):10326-33。變型和野生型"Fn3蛋白都特征在于相同的結構，即稱作A-G的七個P鏈域序列和連接前述七個P鏈域序列的六個環(huán)區(qū)(AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)、和FG環(huán))。位置與N-和C-末端最接近的P鏈在溶液中可采取P樣構象。在SEQIDNO:l中，AB環(huán)對應于殘基15-16,BC環(huán)對應于殘基22-30,CD環(huán)對應于殘基39-45，DE環(huán)對應于殘基51-55，EF環(huán)對應于殘基60-66,而FG環(huán)對應于殘基76-87。如圖24中所示，BC環(huán)、DE環(huán)、和FG環(huán)都位于多肽的同一端。類似的，免疫球蛋白支架趨于具有至少七個I3或P樣鏈，而且常常是九個P或P樣鏈?；诶w連蛋白的支架蛋白可包含其它Fn3型纖連蛋白域，只要它們展現(xiàn)出有用的活性和與^Fn3型域相似的特性。本文中所公開的單域多肽可具有分布在至少兩個(3片層間的至少五至七條(3或(3樣鏈，和至少一個連接兩個P或(3樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與對IGF-IR的結合，該結合的特征在于小于lxl(^M和優(yōu)選小于lxlO-SM的解離常數(shù)。如本文中所描述的，體內治療用途特別想要具有小于5xl0一M的解離常數(shù)的多肽來抑制配體信號傳導?；伢w(exvivo)或體內檢測或標記IGF-IR蛋白的用途可能想要具有介于lxl(^M和5xl0"M之間的解離常數(shù)的多肽。任選的是，"IGF-IR結合蛋白"會相對于來自同一物種的其它相關蛋白質特異性結合IGF-IR。"特異性結合"指多肽識別靶物蛋白(例如IGF-IR)并與其相互作用但基本上不識別樣品(例如生物學樣品)中的其它分子且與其相互作用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽會以至少像500nM—樣緊密的KD特異性結合IGF-IR。優(yōu)選的是多肽會以lpM-500nM、更優(yōu)選lpM-100nM、更優(yōu)選lpM-10nM、和最優(yōu)選lpM-1nM或更低的KD特異性結合IGF-IR。"功能性Fc區(qū)"擁有天然序列Fc區(qū)的至少一項"效應器功能"。例示性的"效應器功能"包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬、細胞表面受體(例如B細胞受體(BCR))下調等。此類效應器功能一般要求Fc區(qū)與結合域(例如抗體可變域)組合，而且可以使用本領域已知的用于評估此類抗體效應器功能的各種測定法來評估。"天然序列Fc區(qū)"包含與在自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列同樣的氨基酸序列。圖3提供了天然序列人和鼠IgGFc區(qū)的氨基酸序列。"變異Fc區(qū)"包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)相比具有至少一處氨基酸替代，例如天然序列Fc區(qū)或區(qū)別多肽的Fc區(qū)中約1處至約10處氨基酸替代和優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。本文中的變異Fc區(qū)會優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或區(qū)別多肽的Fc區(qū)具有至少約80%序列同一性和最優(yōu)選至少約90°/。序列同一性、更優(yōu)選至少約95°/。序列同一性。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"和"ADCC"指細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性細胞、和巨噬細胞)識別靶細胞上所結合的抗體并隨后引起靶細胞的溶解。介導ADCC的主要細胞(NK細胞)只表達FcyRIII，而單核細胞表達FcyRI、FcyRn和FcyRin。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估感興趣分子的ADCC活性，天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。"百分比(。/。)氨基酸序列同一性，，在本文中定義為比對序列并在必要時引入缺口已實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分的情況下，候選序列中與所選擇序列中的氨基酸殘基同樣的氨基酸的百分比。出于測定百分比氨基酸序列同一性目的的比對可以以本領域技術范圍內的多種方式來實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實現(xiàn)最大比對所需要的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比較計算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序是由Genentech公司創(chuàng)作的，已經與用戶文檔一起提交給美國版權局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559),登記為美國版權注冊號TXU510087,而且公眾可通過Genentech公司(SouthSanFrancisco,Calif.)獲得。ALIGN-2程序應當編譯成在UNIX操作系統(tǒng)、優(yōu)選數(shù)字UNIXV4.0D上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設定且不再變化。就本文而言，給定氨基酸序列A對(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述為給定氨基酸序列A具有或包含對、與、或針對給定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性)如下計算100乘分數(shù)X/Y，其中X是序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)目，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。應當領會，若氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，則A對B的。/。氨基酸序列同一性會不等于B對A的。/。氨基酸序列同一性。"多肽鏈"指如下的多肽，其中它的每個域通過肽鍵與其它域相連接，與非共價相互作用或二碌J定不同。"分離的"多肽指已經鑒定且與/自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收。其天然環(huán)境的污染物成分指會干擾該多肽的診斷或治療用途的物質，而且可以包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優(yōu)選的實施方案中，多肽會被純化(1)至超過95%(以多肽的重量計，如通過Lowry法所測定的)和最優(yōu)選超過99%(以重量計)；(2)至足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)至均質，通過還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE,使用Coomassie藍或優(yōu)選的銀染色。既然多肽天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的多肽包括重組細胞內原位的多肽。然而，通常會通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽。輩巴物還可以是所述耙物的片段。如此，靶物還是所述靶物的、能夠引發(fā)免疫應答的片段。靶物還是所述靶物的、能夠結合針對全長靶物生成的單域抗體的片段。片段在用于本文時指小于該序列的100%(例如99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%等)，但是包含5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個氨基酸。片段的長度足以以1x10"M或更好的親和力維持感興趣的相互作用。片段在用于本文時還指任選的，基本上不改變靶物結合針對全長靶物生成的單域抗體的能力的、一個或多個氨基酸的插入、刪除和替代。氨基酸插入、刪除或替代的數(shù)目優(yōu)選多至l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個氨基酸。"誘導細胞死亡"的本發(fā)明蛋白質指引起可存活細胞變得不能存活的本發(fā)明蛋白質。所述細胞一般指表達所述蛋白質所結合的抗原的細胞，尤其是過表達所述抗原的細胞。優(yōu)選的是，所述細胞是癌細胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、曱狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是例如SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB453、MDA-MB-361或SK0V3。體外細胞死亡可在不存在補體和免疫效應細胞時測定，以區(qū)分由抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導的細胞死亡。如此，用于細胞死亡的測定法可使用熱滅活血清(即不存在補體)和在不存在免疫效應細胞時實施。為了確定本發(fā)明的蛋白質是否能夠誘導細胞死亡，可相對于未處理細胞評估膜完整性的喪失，它是通過硤化丙啶(PI)、臺盼藍(trypanblue)(Moore等Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD的攝取來評估的。"誘導凋亡"的本發(fā)明蛋白質指根據凋亡相關分子或事件(諸如膜聯(lián)蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、細胞破裂、和/或膜嚢(稱作凋亡小體)形成)的測定，誘導程序性細胞死亡的本發(fā)明蛋白質。所述細胞指表達所述蛋白質所結合的抗原的細胞，尤其是過表達所述抗原的細胞。所述細胞可以是腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、曱狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SKBR3、BT474、Calu3細胞、MDA-MB453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。有多種方法可用于評估與凋亡有關的細胞事件。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結合來測量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過DNA梯化(laddering)來評估DNA斷裂，如本文中實施例中所公開的；及可通過亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨著DNA斷裂的核/染色質濃縮。優(yōu)選的是，誘導凋亡的蛋白質是在使用表達本發(fā)明蛋白質所結合的抗原的細胞的膜聯(lián)蛋白結合測定法中導致對膜聯(lián)蛋白的結合相對于未處理細胞誘導約2至50倍、優(yōu)選約5至50倍、和最優(yōu)選約10至50倍的蛋白質。術語"治療有效量"指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。就藥物可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度而言，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，可通過例如評估疾病進展前時間(timetodiseaseprogression,TTP)和/或測定響應率(responserate,RR)來測量體內功效。綜述本發(fā)明人發(fā)明了以有利特性結合IGF-IR的本發(fā)明的新蛋白質，所述有利特性包括但不限于單價或多價結合模式(例如一個或超過一個結合特定靶物(包括IGF-IR和其它酪氨酸激酶受體)的域)；對期望靶物勝過其它受體的高選擇性，特別是就選擇性結合IGF-IR勝過胰島素受體的蛋白質而言；可調的親和力，包括約100nM至小于約10pM的范圍(包括fM(femtomolar)親和力)；特異性拮抗劑活性，同時具有最小限度的或檢測不到的激動劑活性；阻斷IGF-I或IGF-II結合或活化；對期望靶物的單特異性或多特異性結合；單表位或多表位結合；在大鼠中延長的半衰期；皮下(SC)或靜脈內(IV)劑量給藥；尺寸小(例如約5kDa至約40kDa);Tm超過約55。C或超過約60。C;和基本上單體性質(例如在大小排阻層析(SEC)上的單峰，諸如約90%的面積、32約95%的面積或約98%的面積)。以萬億計地產生和測試新蛋白質作為本發(fā)明的一個方面，產生了估計l-5萬億不同蛋白質變體，以及與此類蛋白質對應的和編碼此類蛋白質的1-5萬億RNA和DNA變體。對所產生的蛋白質測試對人IGF-IR的結合，而且在有些情況中進一步表達和純化并進行多種生物學、生物化學和生物物理學測定法和測量法以幫助鑒定合適的、有用的蛋白質，特別是治療劑。另外，使用本發(fā)明載體和多核苷酸的實例，在大腸桿菌中表達了超過5000種蛋白質變體，并測試表達水平和多種生物學、生物化學和生物物理學測定法。根據這些測量的結果，不同的、選定的蛋白質進入創(chuàng)建具有本文中所描述的特征的優(yōu)化的變異。還對許多此類蛋白質測試關于胰島素受體的選擇性。發(fā)明人第一個應用結合IGF-IR的蛋白質和域的這種類型的廣泛評估。快速產生并測試用于這種類型的評估的本發(fā)明蛋白質的一種方式是AdnexusTherapeutics公司核酸-蛋白質融合物技術。此公開內容描述了此類體外表達和標記技術的使用，該技術稱作PROftisionTM,利用核酸-蛋白質融合物(RNA-蛋白質融合物和DNA-蛋白質融合物)來鑒定對于結合IGF-IR和其它蛋白質(包括酪氨酸激酶受體)重要的新的單域和多域多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白質融合物技術是一種共價偶聯(lián)蛋白質與其編碼遺傳信息的技術。使用PROfusionTM技術來篩選編碼單域多肽的核酸集合，所述單域多肽是使用基于人纖連蛋白III型域("Fn3)構建的或自抗體輕鏈的可變域構建的。對所表達的多肽(稱作支架蛋白"文庫")篩選能以高親和力結合靶物的多肽。我們自此支架蛋白文庫分離到結合IGF-IR和抑制IGF-IR生物學活性的新的單域多肽。另外，發(fā)現(xiàn)許多獨立隨機化的、位于免疫球蛋白或免疫球蛋白樣支架中的環(huán)趨于會聚至一套相關的、參與IGF-IR結合的共有序列。因此，預期具有這些共有序列的多肽作為IGF-IR結合劑會是有用的，即使在與鑒定它們的蛋白質環(huán)境分開時。參見例如本文中的實施例和表格。此類多肽可以作為獨立的小肽IGF-IR結合劑來使用，或者可以位于其它蛋白質中，特別是共享免疫球蛋白或免疫球蛋白樣折疊的蛋白質。(關于RNA-蛋白質融合物技術和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細描述參見Szostak等，美國專利No.6,258,558;6,261,804;6,214,553;6,281,344;6,207,446;6,518,018;PCT公開文本No.WO00/34784;WO01/64942;WO02/032925;及Roberts和Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.94:12297-12302,1997，通過述及收入本文。)如上文所討論的，本公開內容證明了具有某些期望特性(諸如高親和力結合IGF-IR、關于此類受體的一種或多種配體的拮抗劑效應、和改善的藥動學)的單域多肽可用作有效的抗癌劑。雖然預期此類多肽作為抗癌劑的效力與IGF配體和受體在癌癥中的作用有關，但是我們不希望局限于任何特定機制。IGF-IR設計的基于Fn3的多肽的首次成功努力。在實現(xiàn)體內效力中做出的許多改善和發(fā)現(xiàn)可廣泛應用于針對這種和其它靶物的其它基于Fn3的多肽和其它蛋白質模塊和域，一般是小于約50kDa或約40kDa的蛋白質。換言之，雖然基于Fn3的多肽的配體結合特性一般會由相對少數(shù)的、位于溶劑可及(accessible)環(huán)區(qū)中的氨基酸來決定，但是基于Fn3的多肽的其它特征(諸如藥動學特征)會趨于由蛋白質的不直接參與配體結合且在蛋白質間保守的(無論靶物蛋白質)大多數(shù)氨基酸來決定?？贵w就是這種情況，其中少數(shù)環(huán)(稱作CDR區(qū))介導抗原結合，而體內抗體行為的其它特征主要由保守的框架區(qū)和恒定域來規(guī)定。別的蛋白質實施方案本發(fā)明的蛋白質包括本文中所描述的單域多肽，其一般是結合靶物(諸如IGF-IR)的多肽，其中靶物結合活性位于單結構域內，與例如抗體和單鏈抗體不同(其一般由重鏈可變域和輕鏈可變域二者貢獻出抗原結合活性)。本公開內容還提供了可包含結合靶物的單域多肽的較大蛋白質。例如，可以連接多個單域多肽以創(chuàng)建具有升高的親合力和多價性的復合分子。類似的，可以將單域多肽附著(例如作為融合蛋白)至任何數(shù)目的其它多肽。在某些鏈，如免疫球蛋白和免疫球蛋白樣域所例示的。P樣鏈指參與單域多肽的穩(wěn)定化但是并非必須采取P鏈構象的一串氨基酸。P樣鏈是否參與蛋白質的穩(wěn)定化可通過刪除該串或改變該串的序列并分析蛋白質穩(wěn)定性是否被削弱來評估。可以通過例如熱變性和復性研究來評估穩(wěn)定性。優(yōu)選的是，單域多肽34會包含不超過兩條P樣鏈。P樣鏈通常不會采取a螺旋構象，但是可以采取無軌巻曲結構。在免疫球蛋白域或免疫球蛋白樣域的背景中，p樣鏈最常見的會存在于結構中否則會被最N端P鏈或最C端P鏈占據的位置。若位于蛋白質序列的內部則通常會形成(3鏈的氨基酸串在位于N-或C-末端附近的位置時可采取并非清晰P鏈且在本文中稱作13樣鏈的構象。在某些實施方案中，本公開內容提供了結合IGF-IR的單域多肽。優(yōu)選的是，單域多肽結合人IGF-IR和一種模式物種IGF-IR。單域多肽可包含約80個至約150個氨基酸，其具有包含以下各項的結構組織分布在至少兩個P片層間的至少七個(3鏈或(3樣鏈，和連接兩個P鏈或P樣鏈的至少一個環(huán)部分，該環(huán)部分參與對IGF-IR的結合。換言之，環(huán)部分可連接兩個(3鏈、兩個P樣鏈、或一個(3鏈和一個P樣鏈。通常，一個或多個環(huán)部分會參與IGF-IR結合，盡管有可能一個或多個(3或P樣鏈部分也會參與IGF-IR結合，特別是那些最接近環(huán)部分的P或P樣鏈。單域多肽可包含結構單元，其是免疫球蛋白域或免疫球蛋白樣域。單域多肽可結合IGF-IR的任何部分，盡管優(yōu)選結合IGF-IRi包外域的多肽。可以依照平衡常數(shù)(例如解離，Ko)和依照動力學常數(shù)(例如結合速率常數(shù)kon和解離速率常數(shù)k。ff)來評估結合。通常會選擇以小于約10^m、或小于約10-7m、約5xlO—sm、約10-sm或小于約10一m的KD結合IGF-IR的單域多肽。結合IGF-IR的多肽可以與IGF家族的一個、或兩個或更多個成員(特別是IGF-I和IGF-II)竟爭結合，而且可抑制IGF-IR介導的一種或多種生物學事件，諸如癌細胞的增殖和癌癥轉移。結合IGF-IR的多肽可用于治療目的以及任何牽涉IGF-IR^r測或結合的目的。用于治療目的的多肽一般會具有小于5xlO-sm、小于10-Sm或小于10力M的Kd,盡管在k^足夠低或k。n足夠高的情況中可以承受較高的Ko。在某些實施方案中，結合IGF-IR的單域多肽會包含共有序列或選自本文中所描述的IGF-IR結合克隆的IGF-IR結合序列的一種或多種序列。優(yōu)選的是，此類序列會位于環(huán)中，特別是BC、DE、和FG環(huán)，如Chen等的PCT公開文本No.WO2005/056764A2中所記載的。在某些實施方案中，單域多肽包含免疫球蛋白(Ig)可變域。Ig可變域可以例如選自下組人Vl域、人VH域和camelidVhh域。Ig可變域的一個、兩個、三個或更多個環(huán)可參與對IGF-IR的結合，而且通常稱作CDR1、CDR2或CDR3的環(huán)中任一個會參與IGF-IR結合。在某些實施方案中，單域多肽包含免疫球蛋白樣域。免疫球蛋白樣域的一個、兩個、三個或更多個環(huán)可參與對IGF-IR的結合。一種優(yōu)選的免疫球蛋白樣域是纖連蛋白III型(Fn3)域。此類域可包含(自N端至C端)P或P樣鏈A、環(huán)AB、卩或(3樣鏈B、環(huán)BC、卩或P樣鏈C、環(huán)CD、(3或卩樣鏈D、環(huán)DE、卩或卩樣鏈E、環(huán)EF、(3或p樣鏈F、環(huán)FG、和p或(3樣鏈G。結構組織的一個例子參見圖24。任選的是，任何或所有環(huán)AB、BC、CD、DE、EF和FG可參與IGF-IR結合，盡管優(yōu)選的環(huán)是BC、DE和FG，特別是環(huán)BC和FG。一種優(yōu)選的Fn3域是衍生自人纖連蛋白的Fn3域，特別是稱作"Fn3的纖連蛋白的第十Fn3域。應當注意，本文中所公開的IGF-IR結合多肽無一具有與天然1GFn3同樣的氨基酸序列；序列經過修飾以獲得IGF-IR結合蛋白，但是具有'GFn3基本結構特征的蛋白質(特別是那些保留與"Fn3的可識別序列同源性的)在本文中仍然稱作"'GFn3多肽"。此命名法與在抗體領域中發(fā)現(xiàn)的類似，例如，針對特定草巴物蛋白質生成的重組抗體VL域可以與任何天然存在VL域不同^f旦該蛋白質仍然可被識別為VL蛋白。^Fn3多肽可以與SEQIDNO:l中所示人^Fn3域至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%相同。大部分變異性一般會存在于一個或多個環(huán)中。"Fn3多肽的每個卩或(3樣鏈可以基本上由與SEQIDNO:1的對應P或卩樣鏈的序列至少80。/。、85%、卯％、95%或100%相同的氨基酸序列組成，只要此類變異不破壞多肽在生理學條件中的穩(wěn)定性。^Fn3多肽可以在每個環(huán)AB、CD、和EF中具有基本上由與SEQIDNO:l的對應環(huán)的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列組成的序列。在許多情況中，任何或所有環(huán)BC、DE、和FG會是相對于SEQIDNO:l不太保守的。例如，所有環(huán)BC、DE、和FG可以與SEQIDNO:l的對應環(huán)小于20。/。、10%、或0。/。相同。在有些實施方案中，只有BC和FG環(huán)會相對于SEQIDNO:l不太保守。在某些實施方案中，本公開內容提供了包含第十纖連蛋白III型("Fn3)域的多肽，其中所述"Fn3域包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG，且至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)具有相對于人，n3域的對于環(huán)的序列改變的氨基酸序列。'T，指一處或多處相對于模板序列(對應的人纖連蛋白域)的氨基酸序列改變，而且包括氨基酸添加、刪除、和替代。改變氨基酸序列可通過故意的、盲目的、或自發(fā)的序列變異來實現(xiàn)，一般是核酸編碼序列，而且可通過任何技術來發(fā)生，例如PCR、易錯PCR、或化學DNA合成。在有些實施方案中，一個或多個選自BC、DE、和FG的環(huán)在長度方面可以相對于對應的人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在有些實施方案中，環(huán)的長度可以延長2-25個氨基酸。在有些實施方案中，環(huán)的長度可以縮短l-ll個氨基酸。具體而言，'GFn3的fg環(huán)長12個殘基，而抗體重鏈中的對應環(huán)范圍為4-28個殘基。因此，為了優(yōu)化抗原結合，"Fn3的fg環(huán)的長度優(yōu)選在長度以及序列方面隨機化以覆蓋4-28個殘基的CDR3范圍以獲得在抗原結合方面最大的可能靈活性和親和力。在有些實施方案中，可以將整聯(lián)蛋白結合基序用極性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸(N端至C端方向)的氨基酸序列替換。在有些實施方案中，包含"Fn3域的多肽包含SEQIDNO:2-125或184-202之任一的氨基酸序列?？梢栽贜端或C端添加別的序列。例如，可以在N端方文置額外的MG序列。M通常會被切掉，在N端剩下GVS...序列。在有些實施方案中，可以在"Fn3域的C端放置接頭序列，例如SEQIDNO:203和226。在某些實施方案中，本公開內容提供了非抗體多肽，其包含具有結合IGF-IR的免疫球蛋白樣折疊的域。非抗體多肽可具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，而且一般會衍生(例如通過氨基酸序列的改變)自參比蛋白或"支架"蛋白(諸如Fn3支架)。非抗體多肽可以以小于1(^M、或小于10々M、小于5x10—Sm、小于10-SM或小于10一M的kd結合igf-ir。未改變的參比蛋白或是基本上不結合IGF-IR或是以大于1(T6M的KD結合。非抗體多肽可抑制IGF-IR信號傳導，特別是在非抗體多肽具有小于5xlO-SM、小于10-SM或小于10力M的KD時，盡管在k。ff足夠低(例如小于5xlO-、")時可承受更高的KD值。免疫球蛋白樣折疊可以是，n3多肽。在某些實施方案在中，本公開內容提供了包含單域的多肽，所述單域具有結合IGF-IR的免疫球蛋白折疊。多肽可具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，而且一般會衍生(例如通過氨基酸序列的改變)自免疫球蛋白的可變域。多肽可以以小于10^M、或小于10々M、小于5xlO-8M、小于l(ySM或小于10力M的Kd結合IGF-IR。多肽可抑制IGF-IR信號傳導，特別是在多肽具有小于5xlO-SM、小于10-8M或小于10力M的KD時，盡管在koff足夠低或k^足夠高時可承受更高的KD值。在某些優(yōu)選的實施方案中，具有衍生自免疫球蛋白輕鏈可變域的免疫球蛋白折疊且能夠結合IGF-IR的單域多肽可包含選自本文中所描述的IGF-IR結合克隆的氨基酸序列。在某些優(yōu)選的實施方案中，本公開內容提供了包含本文中所描述的具有最期望的生物化學特征的任何IGF-IR結合克隆的氨基酸序列的IGF-IR結合多肽。在包含此類氨基酸序列的多肽的情況中，可以將PEG模塊或其它感興趣模塊共價結合至位于約第85-100位(取決于蛋白質)的半胱氨酸。還可以將PEG模塊共價結合至多肽中的胺模塊。胺模塊可以是例如在多肽N端找到的伯胺或在氨基酸(諸如賴氨酸或精氨酸)中存在的氨基。在某些實施方案中，PEG^f莫塊附著于多肽上選自下組的位置a)N末端；b)N末端和最N端的(3鏈或(3樣鏈之間；c)位于靶物結合位點對面的多肽面上的環(huán)；d)C末端和最C端的P鏈或P樣鏈之間；和e)C末端。在某些方面，本公開內容提供了介導IGF-IR結合的短肽序列。此類序列可以以分離的形式或在插入特定蛋白質結構(諸如免疫球蛋白或免疫球蛋白樣域)中時介導IGF-IR結合。此類序列的例子包括表格中所公開的序列和與SEQIDNO:l或本文中所列舉的任何其它序列至少85。/c)、90%、或95%相同且保留IGF-IR結合活性的其它序列。因而，本公開內容提供了基本上純的或分離的多肽，其包含與任何此類序列至少85%相同的氨基酸序列，其中所述多肽結合IGF-IR并與IGF種類竟爭對IGF-IR的結合。此類多肽的例子包括包含與同表格中的任何序列至少85%相同的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選的是，此類多肽會抑制IGF的生物學活性且可以以小于10"m、或小于10'7m、小于5x1(T8m、小于1(^m或小于10—sm的Kd結合IGF-IR。在某些實施方案中，本文中所描述的任何IGF-IR結合多肽可結合一種或多種額外電話者別的模塊，包括例如也結合IGF-IR的模塊(例如第二個相同的或不同的IGF-IR結合多肽)、結合不同靶物的模塊(例如用以創(chuàng)建雙重特異性結合劑)、標記模塊、便亍蛋白質純化的模塊或提供改善的藥動學的模塊。改善的藥動學可依照所感受到的治療需要來評估。通常希望提高生物利用度和/或延長服藥間的時間，可能是通過延長服藥后蛋白質在血清中保持可獲得的時間。在有些情況中希望改善蛋白質的血清濃度隨時間的連貫性(例如縮小施藥后不久和下次施藥前不久蛋白質血清濃度的差異)。在本文中稱作"PK模塊"的趨于減緩蛋白質自血液清除的模塊包括聚氧化烯模塊(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白質模塊(例如Fc、Fc片段或血清清蛋白)。本發(fā)明的多肽可以與清蛋白或清蛋白的片段(部分)或變體融合，如美國公開文本No.20070048282中所記載的。單域多肽可附著至將多肽在哺乳動物(例如小鼠、大鼠、或人)中的清除速率相對于未修飾多肽降低超過3倍的模塊。改善的藥動學的其它測量可包括血清半衰期，其常常分成OC階段和P階段。可通過添加適宜的模塊來顯著改善兩個階段之一或二者。若采用聚乙二醇，則可以將一個或多個PEG分子附著于蛋白質中的不同位置，而且此類附著可通過與胺、硫醇或其它合適反應性基團的反應來實現(xiàn)。PEG化可通過定點PEG化來實現(xiàn)，其中將合適的反應性基團引入蛋白質中以創(chuàng)建PEG化優(yōu)先發(fā)生的位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，修飾蛋白質，使其在期望的位置具有半胱氨酸殘基，容許半胱氨酸上的定點PEG化。PEG在分子量方面可以廣泛變化，而且可以是分支的或線性的。注意，本公開內容確立了PEG化與^Fn3多肽的靶物結合活性相容，而且進一步的，PEG化改善此類多肽的藥動學。因而，在一個實施方案中，本公開內容提供了PEG化形式的"Fn3多肽，不管此類多肽能結合的靶物。在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含基于纖連蛋白的支架蛋白和PK模塊的綴合物?；诶w連蛋白的支架蛋白可結合任何人蛋白質，而且優(yōu)選衍生自^Fn3域。PK模塊可以是任何改善基于纖連蛋白的支架蛋白的藥動學的模塊。在有些實施方案中，PK模塊至少將支架蛋白的血清半衰期加倍。在有些實施方案中，PK模塊經多肽接頭與支架蛋白相連接。例示性的多肽接頭包括PSTSTST(SEQIDNO:244)、EIDKPSQ(SEQIDNO:245)、和GS接頭諸如GSGSGSGSGS(SEQIDNO:246)，及其多聚體。在有些實施方案中，PK模塊是人血清清蛋白。在有些實施方案中，PK模塊是運鐵蛋白。在某些方面，本公開內容提供了使用IGF-IR結合蛋白來抑制細胞中的于體內或回體，而且可以是例如活生物體的細胞、培養(yǎng)的細胞或組織樣品中接觸，接觸的量和時間足以抑制此類生物學活性。在某些方面，本公開內容提供了用于治療患有對抑制IGF或IGF-IR有響應的疾患的受試者的方法。這樣的方法可包括對所述受試者施用有效量的本文中所描述的任何抑制IGF-IR的多肽。所述疾患可以是以不當IGF-IR生物學為特征的疾患。本文中所描述的任何抑制IGF-IR的多肽可用于制備藥物，該藥物用于治療病癥，特別是選自下組的病癥自身免疫性病癥、再狹窄、和癌癥。在某些方面，本公開內容提供了用于檢測樣品中的IGF-IR的方法。該方39法可包括使樣品接觸本文中所描述的結合IGF-IR的多肽，其中所述接觸是在容許多肽-IGF-IR復合物形成的條件下進行的，并檢測所述復合物，由此檢測所述樣品中的所述IGF-IR。檢測可使用本領域已知的任何技術來進行，諸如例如放射線照相術、免疫學測定法、熒光檢測、質謙、或表面等離振子共4展。樣品常常會是生物學樣品，諸如活檢，特別是疑似肺瘤、腫瘤的活檢。樣品可以來自人或其它哺乳類動物。結合IGF-IR的多肽可以用標記模塊標記，諸如放射性模塊、熒光模塊、顯色模塊、化學發(fā)光模塊、或半抗原模塊。結合IGF-IR的多肽可以在固體支持物上固定化。本公開內容的另一個方面涉及包含編碼本文中所公開的多肽的核酸序列的核酸。在某些實施方案中，核酸可包含編碼選自下組的多肽的核酸序列的核酸本文中所公開的表格中的任何蛋白質序列。本公開內容的又一個方面涉及包含與啟動子可操作相連接的核酸的表達載體，其中所述核酸編碼本文中所公開的多肽。本^^開內容的另一個方面涉及包含本文中所公開的核酸的細胞。還提供了生產結合IGF-IR的多肽的方法，其包括表達編碼本公開內容的多肽的核酸。在某些實施方案中，核酸可包含編碼選自下組的多肽的序列本文中所公開的表格中的任何序列及其對應的蛋白質。在某些實施方案中，核酸在細胞中表達?；蛘撸怂嵩跓o細胞系統(tǒng)中表達。在某些方面，本公開內容提供了可能適用于任何"Fn3多肽的發(fā)現(xiàn)，無論多肽改造成結合什么靶物。如上文所記錄的，本公開內容證明了可以用PEG成功地改善^Fn3多肽的藥動學，同時基本上不干擾靶物結合。因而，本公開內容提供了結合靶物且具有相對于非PEG化多肽改善的藥動學的PEG化"Fn3多肽。在又一個實施方案中，本公開內容證明了刪除"Fn3多肽的頭八個氨基酸能提高靶物結合親和力。因而，本公開內容提供了缺乏最初八個氨基酸的'Vn3多肽(氨基酸參照SEQIDNO:l的序列來編號)。應當理解，可以將一個或兩個氨基酸添加回刪除形式的多肽以便于翻譯和正確加工。本7>開內容證明了皮下施用"Fn3多肽導致延遲的多肽進入血流的釋放和降低的，n3多肽的最大血清濃度。因而，本公開內容提供了通過皮下施用給患者施用IQFn3多肽的方法。此施用路徑對于實現(xiàn)相對于靜脈內施用延遲的釋放和/或將1GFn3多肽的最大血清濃度相對于靜脈內施用相等劑量所實現(xiàn)的最大血清濃度降低至少25%或至少50%可能是有用的。所施用的"Fn3多肽可附著至延長，n3的血清半衰期(或降低清除速率、或類似地影響另一種藥動學參數(shù))的模塊，諸如聚乙二醇模塊。優(yōu)選的是，所施用的"Fn3多肽包含與SEQIDNO:l至少600/。、65%、70%、75%、80%、85%、90%相同的氨基,列。在某些方面，本公開內容提供了結合預先選定的來自第一哺乳動物的靶物蛋白質和來自第二哺乳動物的類似物的單域多肽。此類單域多肽在第一哺乳動物是人而第二哺乳動物是實施臨床前測試的期望哺乳動物(諸如小鼠、大鼠、豚鼠、犬、或非人靈長類動物)的情況中是特別有用的。本公開內容證明了單一多肽能改造成具有此類雙重特異性，且所述雙重特異性通過容許在人細胞、人受試者和動物模型中測試同一多肽而簡化了藥物開發(fā)。優(yōu)選的是，預先選定的來自第一哺乳動物的靶物蛋白質和來.自第二哺乳動物的類似物在氨基酸序列方面足夠相似以容許生成雙重特異性多肽。例如，預先選定的靶物蛋白質和來自第二哺乳動物的類似物可以在至少50個氨基酸的區(qū)域上共享至少80%、90%、或95%同一性，且任選可以在整個蛋白質序列上或在胞外域的序列上(在膜蛋白的情況中)共享至少80%、卯％、或95%同一性。具有這種類型的雙重特異性結合特征的單域多肽可包含免疫球蛋白或免疫球蛋白樣域，而且會優(yōu)選以小于lxlO^M、lxlO々M、5xl(T8M、lxl(^M或1x10—QM的解離常數(shù)結合預先選定的人靶物蛋白質及其類似物。別的測定法力,^f敘敏^:長的,尸劍在又一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質提供了在體內抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化或受體水平或二者的IGF-IR結合物。在一個實施方案中，對動物施用IGF-IR結合物可1起表達IGF-IR的腫瘤中IGF-IR磷酸化信號的降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，IGF-IR結合物引起磷酸化信號降低至少20。/c)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，IGF-IR結合物引起磷酸化信號降低至少50。/。、更優(yōu)選60%。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，結合物引起磷酸化水平降低至少70%、更優(yōu)選80%、甚至更優(yōu)選90%。在另一個實施方案中，給動物施用IGF-IR結合物引起表達IGF-IR的腫瘤中IGF-IR水平的降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，IGF-IR結合物引起受體水平與未處理動物相比降低至少20%。在一個更優(yōu)選的實施方案中，IGF-IR結41合物引起受體水平降低未處理動物中受體水平的至少50%、更優(yōu)選60%。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，結合物引起受體水平降低至少70%、更優(yōu)選80%。#力微在本發(fā)明蛋白質的另一個實施方案中，IGF-IR結合物在體內抑制腫瘤細胞生長。腫瘤細胞可衍生自任何細胞類型，包括但不限于表皮、上皮、內皮、白血病、肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、或中胚層細胞。異種移植物腫瘤研究中使用的常用腫瘤細胞系的例子包括A549(非小細胞肺癌)細胞、DU-145(前列腺)細胞、MCF-7(乳房)細胞、Colo205(結腸)細胞、3T3/]GF國IR(小鼠成纖維細胞)細胞、NCIH441細胞、HEPG2(肝瘤)細胞、MDAMB231(乳房)細胞、HT-29(結腸)纟田月包、MDA-MB-435s(乳房)細胞、U266細胞、SH-SY5Y細胞、Sk-Mel-2細胞、NCI-H929、RPM18226、和A431細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，與未處理動物中的肺瘤的生長相比，結合物抑制腫瘤細胞生長。在一個更優(yōu)選的實施方案中，結合物將腫瘤細胞生長抑制50%。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，結合物將胂瘤細胞生長抑制60%、65%、70%、或75%。在一個實施方案中，對腫瘤細胞生長的抑制是在動物開始結合物處理后至少7天測量的。在一個更優(yōu)選的實施方案中，對腫瘤細胞生長的抑制是在動物開始結合物處理后至少14天測量的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，與IGF-IR結合物一起給動物施用另一種抗腫瘤劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑能夠進一步抑制腫瘤細胞生長。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，抗腫瘤劑是阿霉素(adriamycin)、泰素(taxol)、他莫昔芬(tamoxifen),5-氟脫氧尿苦(5隱fluorodeoxyuridine，5隱FU)或CP-358，774。別的雙特異性和多特異性實施方案在許多實施方案中，會希望生成多特異性組合物，例如結合超過一種靶物或其它感興趣蛋白質的組合物。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連才妄的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約10nM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如IGF-IR)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的，相關靶物(例如人胰島素受體)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約10nM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如EGFR、c-Met、c-kit、Her2、FGFR1、VEGFR2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、葉酸受體)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如人胰島素受體)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含結合IGF-IR的第一1QFn3域和結合VEGFR2的第二1QFn3域。VEGFR-2結合多肽是如PCT公開文本No.WO2005/056764所述生成的，以此通過述及并入作為參考。對于本發(fā)明有用的優(yōu)選的VEGFR-2結合，n3多肽的序列顯示于圖30SEQIDNO:126-183。本發(fā)明的蛋白質包括刪除了頭8個氨基酸的所公開氨基酸序列，而且可以在N或C末端包括別的氨基酸。例如，可以在N末端放置額外的MG序列。M通常會被切掉，在N末端剩下GEV...序列。在N末端重新添加正常的8個氨基酸也產生具有期望特性的VEGFR2結合蛋白。在有些實施方案中，N末端曱硫氨酸被切掉。為了體內使用，可生成適合PEG化的形式。在一個實施方案中，可添加包含半胱氨酸的C末端尾(例如在C末端添加EIDKPCQ(SEQIDNO:225))。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連接的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如EGFR)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(undesiredrelatedtarget)(例如人胰島素受體.)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如Her2、葉酸受體)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如人胰島素受體)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連接的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如EGFR)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如人胰島素受體)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約10nM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如VEGFR1)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連接的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如Her2)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如Her4)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如VEGFR1)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連接的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如FGFR1、c-Met、c-kit)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如人胰島素受體)，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約10nM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如VEGFR1，且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。在一個方面，本發(fā)明的蛋白質包含相連接的或附著的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以約IOnM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第一期望靶物(例如Her2)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如人胰島素受體，且優(yōu)選是單域或基本上單價的，所述第二蛋白以約IOnM(或本44文中所描述的其它適宜親和力)或更低的結合親和力結合第二期望靶物(例如Her3)且以約luM(或本文中所描述的其它適宜親和力)或更高的結合親和力結合不想要的相關靶物(例如Her4),且優(yōu)選是單域或基本上單價的。具有雙特異性親和力的此類分子可進一步附著至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白質。別的PEG實施方案就我們所知，這是第一次能使用PEG(或在功能方面類似的分子)來連接兩種蛋白質，所述蛋白質是結合單一靶物的非抗體模塊，特別是其中每種結合蛋白由單域或多域構成的蛋白質，通常其中每個域是約50個或約60個或約75個氨基酸或更多(與5-20個氨基酸的小肽不同)。優(yōu)選的是，可以在此類實施方案中有利地使用纖連蛋白支架蛋白，而且更優(yōu)選適當改造Cys或Lys氨基酸。'就我們所知，這是第一次能使用PEG(或在功能方面類似的分子)來連接兩種蛋白質，所述蛋白質是結合兩種或更多種不同靶物或感興趣蛋白質(例如PK調控蛋白)的非抗體模塊，特別是其中每種結合蛋白由單域或多域構成的蛋白質，通常其中每個域是約50個或約60個或約75個氨基酸或更多(與5-20個氨基酸的小肽不同)。優(yōu)選的是，可以在此類實施方案中有利地使用纖連蛋白支架蛋白，而且更優(yōu)選適當改造Cys或Lys氨基酸。另外，本發(fā)明的非PEG和PEG方面包括抗體模塊(例如駱駝抗體及其衍生物，以及單鏈抗體和單域抗體；特別是那些自微生物表達的)和抗體樣模塊(例如脂籠蛋白、錨蛋白、多Cys-Cys域、和四連蛋白的衍生物；特別是那些自微生物表達的)，特別是那些通過PEG相連接的、小于約40kDa的，更特別的是那些具有有限數(shù)目Cys氨基酸的。本發(fā)明的PEG相連接的蛋白質有許多先前為認識或發(fā)現(xiàn)的特性和優(yōu)點。當在微生物中表達此類蛋白質時，可能優(yōu)選分離域，然后經PEG或其它聚合物接頭將它們相連接?？梢允褂肞EG或功能可操作聚合物接頭來最佳地改變每個蛋白質模塊之間的距離以創(chuàng)建具有一項或多項以下特征的蛋白質1)在結合至感興趣蛋白質(例如靶物)后對結合一種或多種蛋白質域的空間位阻降低或升高；2)將結合不同靶物的兩種或更多種域相連接；3)在沒有為了提高穩(wěn)定性或溶解度而搜索別的氨基酸替代的情況下提高蛋白質穩(wěn)定性或溶解度(例如溶解度至少約20mg/ml或至少約50mg/ml);4)在沒有為了降低蛋白質穩(wěn)定性而搜索別的氨基酸替代的情況下降低蛋白質聚集(例如通過SEC測量)；4)通過添加別的結合域而提高蛋白質對感興趣蛋白質的整體親合力或親和力。PEG相連接的蛋白質的別的優(yōu)點包括快速生成，單特異性、多價結合模式、以及多特異性、單價或多價結合模式(這取決于PEG相連接的蛋白質中所包括的蛋白質靶向模塊的數(shù)目)。本發(fā)明的'^Fn3多肽可以被PEG化并保留配體結合活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，PEG化的"Fn3多肽是通過定點PEG化生成的，特別是通過將PEG綴合至N或C末端處的半胱氨酸模塊。因而，本公開內容提供了具有改善的藥動學特性的把物結合性'。Fn3多肽;該多肽包含具有約80個至約150個氨基酸的，n3域，其中所述^Fn3域的至少一個環(huán)參與靶物結合；和共價結合的PEG模塊，其中所述"Fn3多肽以小于100nM的KD結合靶物且在哺乳動物中具有小于30mL/hr/kg的清除速率。PEG模塊可通過定點PEG化附著至"Fn3多肽，諸如通過附著至Cys殘基，其中Cys殘基可以位于'GFn3多肽的N末端或位于N末端和最N端的p或(3樣鏈之間或位于^Fn3多肽的C末端或位于C末端和最C端的卩或卩樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其它位置，特別是不參與靶物結合的任何環(huán)。PEG模塊也可以通過其它化學來附著，包括通過綴合至胺。另外，本發(fā)明包括這種類型對抗體模塊(例如駱駝抗體及其衍生物，以及單鏈抗體和單域抗體；特別是那些自微生物表達的)和抗體樣模塊(例如脂籠蛋白、錨蛋白、多Cys-Cys域、和四連蛋白的衍生物；特別是那些自微生物表達的)的N或C末端PEG綴合，特別是那些通過PEG相連接的、小于40kDa的，更特別的是那些具有有限數(shù)目Cys氨基酸的。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，改良形式的受試可溶性多肽包括連接受試可溶性多肽與非蛋白質性質的結合物。在一個具體的實施方案中，聚合物是聚乙二醇("PEG")、聚丙二醇、或聚氧化烯，其方式如美國專利No.4,640,835;4，496，689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中所列舉的。本發(fā)明的改良多肽的例子包括本文中進一步描述的PEG化蛋白質。PEG是眾所周知的水溶性聚合物，其可通過商業(yè)途經獲得或者可依照本領域眾所周知的方法通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,巻3,頁138-161)。術語"PEG"廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子，無論大小或PEG末端的修飾，而且可以由下式來<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>表示X-0(CH2CH20)^CH2CH20H(1),其中n是20-2300且X是H或末端修飾，例如CM鏈烴基。在一個實施方案中，本發(fā)明的PEG以氫或曱氧基終止一端，即X是H或CH3("曱氧基PEG")。PEG可包含進一步的、結合反應所必需的化學基團；其源自分子的化學合成；或者其是為獲得分子各部分最佳距離的間隔物。另外，這樣的PEG可以由一個或多個連接到一起的PEG側鏈組成。具有超過一條PEG鏈的PEG稱作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通過例如添加聚環(huán)氧乙烷至各種多元醇(包括甘油、季戊四醇、和山梨醇)來制備。例如，可以自季戊四醇和環(huán)氧乙烷制備四臂分支PEG。分支PEG記載于例如歐洲已公開申請No.473084A和美國專利No.5,932,462。一種形式的PEG包括兩條經賴氨酸的伯氨基相連接的PEG側鏈(PEG2)(Monfardini,C.等，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。雖然PEG是眾所周知的，但是就我們所知，這是第一次證明兩個分開的'GFn3多肽可以被PEG化并保留配體結合活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，PEG化的，n3多肽是通過定點PEG化生成的，特別是通過將PEG綴合至N或C末端處的半胱氨酸模塊。因而，本公開內容提供了具有改善的藥動學特性的輩巴物結合性，n3多肽，該多肽包含具有約80個至約150個氨基酸的^Fn3域，其中所述^Fn3域的至少一個環(huán)參與靶物結合；和共價結合的PEG模塊，其中所述^Fn3多肽以小于100nM的KD結合靶物且在哺乳動物中具有小于30mL/hr/kg的清除速率。PEG模塊可通過定點PEG化附著至'GFn3多肽，諸如通過附著至Cys殘基，其中Cys殘基可以位于"Fn3多肽的N末端或位于N末端和最N端的卩或卩樣鏈之間或位于^Fn3多肽的C末端或位于C末端和最C端的卩或(3樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其它位置，特別是不參與靶物結合的任何環(huán)。PEG模塊也可以通過其它化學來附著，包括通過綴合至胺。PEG對肽或蛋白質的綴合一^:牽涉活化PEG和將活化后的PEG中間體直接偶聯(lián)至目標蛋白質/肽或接頭，該接頭隨后被活化并偶聯(lián)至目標蛋白質/肽(參見Abuchowski,A.等,J.Biol.Chem.,252,3571(1977)和J.Biol,Chem"252，3582(1977)，Zalipsky等,和Harris等，于Poly(ethyleneglycol)Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications;(J.M.Harris纟扁)PlenumPress:NewYork,1992;章21和22)。注意，包含PEG分子的結合多肽也稱作綴合后的蛋白質，而沒有附著PEG分子的蛋白質可稱作未綴合的。47為了綴合至本發(fā)明的結合多肽，可以選擇多種分子量形式的PEG,例如約l,OOO道爾頓(Da)至lOO，OOODa(n為20-2300)。PEG中重復單元的數(shù)目"n，，是根據以道爾頓描述的分子量而估算的。優(yōu)選的是，活化后的接頭上的PEG的組合分子量適合于藥學用途。如此，在一個實施方案中，PEG分子的分子量不超過100,000Da。例如，如果三個PEG分子附著至接頭，其中每個PEG分子具有12，000Da的分子量(每個的n為約270),那么接頭上的PEG的總分子量為約36，000Da(總n為約820)。附著至接頭的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接頭上的三個分子中，兩個PEG分子可以是每個5，000Da(每個n為約110)另一個PEG分子可以是12,000Da(n為約270)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，IGF-IR或其它受體結合多肽與下式的一個聚乙二醇基團共價相連接-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR，其中聚乙二醇基團的-CO(即羰基)與結合多肽的一個氨基形成酰胺鍵；R是低級鏈烴基；x是2或3;m是約450至約950;而n和m選擇成綴合物減去結合多肽的分子量為約10-40kDa。在一個實施方案中，結合多肽的賴氨酸s-氨基是可利用的(游離的)氨基。上文綴合物可以更具體地以式(II)來表示P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(11)，其中P是本文中所描述的結合多肽的一個基團(即沒有與式(n)所示羰基形成酰胺連接的氨基)；且其中R是低級鏈烴基；x是2或3;m是約450至約950且選擇成綴合物減去結合多肽的分子量為約10至約40kDa。在用于本文時，"m"的給定范圍具有定向意義。"m"的范圍在任何情況中都是確定的，而且完全是由PEG基團的分子量決定的。本領域技術人員能為PEG選擇合適的分子量，例如根據PEG化的結合多肽會如何用于治療、期望的劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考慮。關于PEG及其用于增強蛋白質特性的用途的討論參見N.V.Katre,AdvancedDrugDeliveryReviews10:91-114(1993)。在本發(fā)明的一個實施方案中，PEG分子可以;波活化以與結合多肽上的氨基(諸如與賴氨酸)起反應(BenchamC.O.等，Anal.Biochem.，131，25(1983);Veronese,F.M.等，Appl。Biochem.,11，141(1985);Zalipsky，S.等，PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,adrs9-110ACSSymposiumSeries469(1999);Zalipsky,S.等,Europ.Polym.J"19,1177-1183(1983);Delgado，C.等,BiotechnologyandAppliedBiochemistry,12,119-128(1990))。在一個具體的實施方案中，使用PEG的碳酸酯來形成PEG-結合多肽綴合物?？梢栽谂cPEG的反應中使用N，N，-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC)來形成有活性的混合PEG-琥珀酰亞氨基碳酸酯，其隨后可以與接頭的親核基團或結合多肽的氨基起反應(參見美國專利No.5,281,698和美國專利No.5,932,462)。在一種類似類型的的反應中，可以使l，l，-(二苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡。定基)碳酸酯與PEG起反應以分別形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美國專利No.5,382,657)。"Fn3多肽的PEG化可依照本領域已知方法來實施，例如通過結合多肽與親電子活性PEG的反應(供應商ShearwaterCorp,，USA,www.shearwatercorp.com)。本發(fā)明的優(yōu)選PEG試劑是例如N-羥基琥珀酰亞氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亞氨基丙酸酯或分支的N-羥基琥珀酰亞胺諸如mPEG2-NHS(Monfardini,C.，等，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。此類方法可用于結合多肽賴氨酸s-氨基或結合多肽N末端氨基處的PEG化。在另一個實施方案中，PEG分子可以被偶聯(lián)至結合多肽上的硫氬基(sulfhydryl)(Sartore,L.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.,27,45(1991);Morpurgo等,Biocon.Chem,,7，363-368(1996);Goodson等，Bio/Technology(1990)8,343;美國專利No.5,766,897)。美國專利No,6,610,281和5,766,897記載了例示性的可偶聯(lián)至硫氫基的反應性PEG種類。在有些實施方案中，在PEG分子被綴合至結合多肽上半胱氨酸殘基的情況中，半胱氨酸殘基對于結合多肽是天然的，而在其它實施方案中，將一個或多個半胱氨酸殘基改造入結合多肽中。可以將突變引入結合多肽編碼序列中以產生半胱氨酸殘基。這可以通過例如將一個或多個氨基酸殘基突變成半胱氨酸來實現(xiàn)。用于突變成半胱氨酸殘基的優(yōu)選氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其它親水性殘基。優(yōu)選的是，待突變成半胱氨酸的殘基是表面暴露的殘基。根據一級序列或蛋白質預測殘基的表面可及性的算法是本領域眾所周知?；蛘?，若已經解析出作為設計和發(fā)展結合多肽的基礎的框架的晶體結構且由此已經筌定出表面暴露的殘基，則可以通過比較結合多肽的氨基酸序列來預測表面殘基(參見Himanen等，Nature.(2001)20-27;414(6866):933-8)。在一個實施方案中，在N和/或C末端處或附近或者在環(huán)區(qū)內將半胱氨酸殘基引入結合多肽中。在有些實施方案中，PEG化的結合多肽包含共價附著至N末端氨基酸的a氨基的PEG分子。位點特異性N末端還原性氨化記載于Pepinsky等，(2001)JPET,297,1059和美國專利No.5,824,784。利用其它可獲得的親核氨基將PEG-醛用于蛋白質的還原性氨化的用途記載于美國專利No.4,002,531;Wieder等，(1979)J.Biol.Chem.254,12579;和Chamow等，(1994)BioconjugateChem.5,133。在另一個實施方案中，PEG化的結合多肽包含一個或多個共價附著至接頭的PEG分子，該接頭繼而附著至結合多肽N末端處氨基酸殘基的a氨基。這樣的方法披露于美國公開文本No.2002/0044921和PCT公開文本No.WO94/0145L在一個實施方案中，結合多肽在C末端處^LPEG化。在一個具體的實施方案中，通過引入C末端疊氮-曱硫氨酸，隨后經Staudinger反應綴合曱基-PEG-三芳基膦，將蛋白質在C末端處PEG化。這種C末端綴合方法記載于Cazalis等,C-TerminalSite-SpecificPEGylationofaTruncatedThrombomodulinMutantwithRetentionofFullBioactivity，BioconjugChem.2004;15(5):1005-1009。結合多肽的PEG化也可以依照PCT公開文本No.WO94/01451中記載的一般方法來產生。W094/01451記載了用于制備具有經修飾末端氨基酸oc-碳反應性基團的重組多肽的方法。該方法的步驟牽涉形成重組多肽并用一個或多個在N末端cc-胺和C末端a-羧基處以生物學方法添加的保護基團保護它。然后使肽與化學保護劑起反應以選擇性保護反應性側鏈基團并由此防止側鏈基團被修飾。然后用對生物學保護基團特異性的切割劑切割多肽以形成不受保護的末端氨基酸a-碳反應性基團。用化學修飾劑修飾不受保護的末端氨基酸a-碳反應性基團。然后在側鏈基團處使側鏈受保護的末端修飾的單拷貝多肽去保護以形成末端經修飾的重組單拷貝多肽。該方法中步驟的數(shù)目和順序可以變化以實現(xiàn)多肽N末端和/或C末端氨基酸處的選擇性修飾。1:30、或約1:5至1:15。在本發(fā)明中可以使用各種水性緩沖液來催化PEG對結合多肽的共價添加。在一個實施方案中，所使用的緩沖液的pH為約7.0至9.0。在另一個實施方案中，pH為弱石威性范圍，例如約7.5至8.5?？梢允褂胮Ka接近中性pH范圍的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液。在制備多特異性PEG連接的蛋白質時會使用其它比例，諸如約1:4至1:8或約1:3至1:5?？梢允褂帽绢I域已知的常規(guī)分離和純化技術來純化PEG化結合多肽，諸如大小排阻(例如凝膠過濾)和離子交換層析。也可以使用SDS-PAGE將產物分開?？梢苑珠_的產物包括單PEG化、二PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的結合多肽，以及游離PEG?？梢酝ㄟ^合并洗脫峰周圍的更寬級分以提高組合物中單PEG的百分比來控制單PEG綴合物的百分比。約90%的單PEG綴合物代表了產量和活性的優(yōu)良平衡?？赡芟Ｍ渲欣缰辽?2%或至少96。/。的綴合物是單PEG種類的組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，單PEG綴合物的百分比為約90%至96%。在一個實施方案中，本發(fā)明的PEG化結合多肽包含一個、兩個或更多個PEG模塊。在一個實施方案中，PEG模塊結合至蛋白質表面上的和/或遠離與耙物配體接觸的表面的氨基酸殘基。在一個實施方案中，PEG-結合多肽中PEG的組合分子量或總分子量為約3,000Da至60,000Da，任選為約10,000Da至36，000Da。在一個實施方案中，PEG化結合多肽中的PEG是基本上線性的、直鏈PEG。在本發(fā)明的一個實施方案中，PEG化結合多肽中的PEG在羥胺測定法(例如450mM羥胺pH6.5，室溫，8-16小時)中不會自PEG化氨基酸殘基水解，如此是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，超過80%、更優(yōu)選至少90%、和最優(yōu)選至少95。/。的組合物是穩(wěn)定的單PEG-結合多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明的PEG化結合多肽會優(yōu)選保留與未修飾蛋白質有關的至少約250/。、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的生物學活性。在一個實施方案中，生物學活性指其結合VEGFR-2或IGF-IR的能力，通過K。、k。n或k。ff來評估。在一個具體的實施方案中，PEG化結合多肽蛋白質顯示出相對于未PEG化結合多肽升高的對VEGFR或IGF-IR的結合。PEG修飾多肽的血清清除速率可以相對于未修飾結合多肽的清除速率降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70°/。、80%、或甚至90%。PEG修飾多肽可以具有相對于未修飾蛋白質的半衰期延長的半衰期(t1/2)。PEG-結合多肽的半衰期可以相對于未修飾結合多肽的半衰期延長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400°/。或500%、或甚至1000%。在有些實施方案中，蛋白質半衰期是在體外測定的，諸如在緩沖鹽水溶液中或在血清中。在其它實施方案中，蛋白質半衰期是體內半衰期，諸如蛋白質在動物的血清或其它體液中的半衰期。別的載體和多核苷酸實施方案編碼本文中所公開的各種蛋白質或多肽之任一的核酸可以化學合成?？梢赃x擇密碼子使用率以改善在細胞中的表達。此類密碼子使用率會取決于所選擇的細胞類型。已經為大腸桿菌和其它細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞開發(fā)了專門的密碼子使用率。參見例如Mayfield等，ProcNatlAcadSciUSA.2003Jan21;100(2):438-42;Sinclair等,ProteinExprPurif.2002Oct;26(l):96-105;ConnellND.，CurrOpinBiotechnol.2001Oct;12(5):446-9;Makrides等,MicrobiolRev.1996Sep;60(3):512-38;及Sharp等，Yeast.1991Oct;7(7):657-78。通用核酸操作技術記載于例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,巻1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1989，或F.Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPublishingandWiley-Interscience:NewYork,1987)和定期更新，通過述及收入本文。編碼多肽的DNA與自哺乳動物、病毒、或昆蟲基因的轉錄或翻譯調節(jié)元件可操作相連接。此類調節(jié)元件包括轉錄啟動子、任選的操縱基因序列(用以控制轉錄)、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、和控制轉錄和翻譯終止的序列。還摻入在宿主中復制的能力(通常由復制起點賦予)和選擇基因(用以便于轉化子的識別)。本發(fā)明的蛋白質可以重組生產，不僅是直接的，還有作為與異源多肽的融合蛋白，所述異源多肽優(yōu)選是信號序列或其它位于成熟蛋白或多肽的N末端、具有特異性切割位點的多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞識別和加工(即被信號肽酶切割)的異源信號序列。對于不識別和加工天然信號序列的原核宿主細胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定腸毒素II前導的原核信號序列替換信號序列。對于酵母分泌，可以用例如酵母轉化酶前導、oc因子前導(包括糖酵母(Saccharomyces)屬和克魯維酵母(Kluyveromyces)屬a-因子前導)、或酸性磷酸酶前導、假絲酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前導、或PCTV厶開文本No.WO90/13646中記載的信號替換天然信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(例如單純皰滲gD信號)?？梢詫⒋祟惽绑w區(qū)的DNA與編碼蛋白質的DNA以符合讀碼框的方式相連接。表達和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是使能夠載體不依賴于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒pBR322的復制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2p質粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要復制起點構件(SV40起點的使用通?？赡苤皇且驗樗缙趩幼?。表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物或真核細胞的選擇標志的另一個例子是那些能夠鑒定有能力攝取多價抗體核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(優(yōu)選的是靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶例如，首先通過將所有轉化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一種竟爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系?；蛘?，可以通過細胞在含有針對選擇標志的選擇劑(諸如氨基糖普抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中的生長來選擇經編碼多價抗體、野生型DHFR蛋白質和另一種選擇標志(諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4,965,199。53適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的^/基因(Stinchcomb等，A^w^282:39(1979))。^/基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了選擇標志。Jones,Ge"W"85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在巧。7損傷隨之提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶丄ei/2基因的已知質粒補足ZeW缺陷型酵母菌抹(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6pm環(huán)狀質粒pKDl的載體可用于轉化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘撸瑘髮Я擞糜谠谌樗峥唆斁S氏酵母中大規(guī)模生產重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)。VandenBerg,所o/rec/z"o/ogv8:135(1990)。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業(yè)用菌抹分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達載體。Fleer等，歷o/Tec/"o/ogv9:968-975(1991)。表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼本發(fā)明蛋白質(例如基于纖連蛋白的支架蛋白)的核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括p/70^(啟動子、(3-內酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還將包含與編碼本發(fā)明蛋白質的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基西的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加polyA尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優(yōu)點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP專利公開文本No.73,657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。可通過例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和更優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子獲得的啟動子來控制哺乳動物宿主細胞中自載體的轉錄，倘若此類啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4,4.19,446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No.4，601,978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關于在小鼠細胞中在來自單純皰瘆病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人(3-干擾素cDNA還可參見Reyes等，Atowre297:598-601(1982)?；蛘撸梢允褂脛谑先饬霾《鹃L末端重復序列作為啟動子。常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發(fā)明蛋白質的DNA的轉錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，典型的是，使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚期一側的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側的增強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，WafM297:17-18(1982)。可以將增強子剪接入載體，位于多價抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'位點。用于真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼多價抗體的mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。重組DNA還可包含任何類型的可能對蛋白質純化有用的蛋白質標簽序列。蛋白質標簽的例子包括但不限于組氨酸標簽、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽、或GST標簽。與細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適宜的克隆和表達載體可見于CloningVectors:ALaboratoryManual,(Elsevier,NewYork,1985)，以此通過述及收入其相關公開內容。使用對本領域技術人員顯而易見的、對宿主細胞適宜的方法將表達構建物導入宿主細胞中。本領域已知多種用于將核酸導入宿主細胞中的方法，包括但不限于電穿孔；采用氯化鉤、氯化銣、磷酸4丐、DEAE-右旋糖酐、或其它物質的轉染；微粒轟擊；脂轉染；和感染(其中載體是傳染劑)。合適的宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞、或細菌細胞。合適的細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(￡.co/0或芽孢桿菌屬(Ba"7/";^)。酵母(優(yōu)選來自糖酵母屬物種，諸如啤酒糖酵母或釀酒酵母(S.cewv/w'ae))也可用于多肽生產。也可采用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。關于在昆蟲細胞中生產異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)的綜述見Luckow和Summers,Bio/Technology,6:47，1988。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細胞、HeLa、293、293T、和BHK細胞系。為了制備純化的多肽，培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達重組蛋白。對于許多應用，本文中所公開的許多多肽的小尺寸會使得大腸桿菌表達成為優(yōu)選的表達方法。然后自培養(yǎng)液或細胞提取物純化蛋白質。別的表達和細胞實施方案生產和細胞實施方案所優(yōu)選的蛋白質是基因纖連蛋白的支架和相關蛋白質。適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Esc/zen'c/2/a)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(Eco/z')、腸桿菌屬(五"^ra6a"e。、歐文氏菌屬(￡rvW"/a)、克雷伯氏菌屬(尺/eZwW/a)、變形菌屬(尸ra/ew)、沙門氏菌屬(5"a/mowe〃a)例i口鼠傷寒沙門氏菌(《S"/mo"e〃a/^//z/wwn-Mm)、沙雷氏菌屬(Serraria)例i口粘質沙雷氏菌(5"erra"'awarcescara)、志賀氏菌屬(57n.ge〃a)、以及芽孢桿菌屬(Sa"7//)諸如枯草芽孢桿菌(及MMfc)和地衣芽孢桿菌(及//c/zem/wTmS)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬OP化Mfifomo"os)諸如銅綠假單胞菌(戶aerag/"cwa)、和鏈霉菌屬(&re;tomF^)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446),盡管其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌Xn:76(ATCC31，53"和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼蛋白質的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母OSacc/zaram;;c&scerev^ae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主《效生物之中。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌4朱且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Sc/2izcwacc/wram;;cMpomZ7e);克魯維酵母屬(K/wj;veram^ce力宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(《./acto)、脆壁克魯維酵母(&Aagz7/"(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(尺.^/gan'cw)(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(尺.w/cferaw")(ATCC24,178)、《wa/"/(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.dmyo//w7an^m)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(/CAe，oto/erara)和馬克思克魯維酵母(^:mwx/a"^);亞羅酵母屬(7^roW")(EP專利公開文本No.402,226);巴斯德畢赤酵母CP/c/2/"poton》(EP專利公開文本No.183,070);假絲酵母屬(Ow^fo);瑞氏木霉(7Hc/zoa^wa(EP專利7^開文本No.244,234);粗糙脈孢菌(A^Mmsporacrowa);i午旺酵母屬(5"c/2wa""z'ow^cas),諸^口5"cMva"w'omyc&yoccz'fife"to/^;和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(A^Mmspora)、青霉屬(尸ew'"Www)、彎頸霉屬(7b/;^oc/a^Mm)、和曲霉屬(y^;ergz7/w)宿主i者i口構巢曲霉(j.m^w/ara)禾口黑適于表達糖基化本發(fā)明蛋白質的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾0S;7Ofltoptera/ra^peWa)(毛蟲)、埃及4尹蟲丈"ecfesaegyp")(蟲丈子)、白纟丈4尹蚊"ed&sa/6op/c^s)(蟲丈子)、黑、月復果蟲是(ZVoso//n7ame/a"ogasfer)(果蟲乾)禾口家蠶(5om6少;cmon')等宿主。公眾可獲得多種病毒4朱用于轉染，例如苜蓿尺蟲i^Mtograp/2aca/z/orm'caNPV的L-l變體和家蠶BowZ^xNPV的Bm-5片朱，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉染草地夜蛾細胞。在有些情況中會希望在脊推動物細胞生產蛋白質，諸如糖基化，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊推動物細胞的繁殖已經成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，/Wra/.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細57胞/-DHFR(CHO,Urlaub等，尸rac.Ato/.L^477:4216(1980));小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4，Mather,所o/.23:243-251(1980));猴腎細胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，JmM&MKA^dSc7..383:44-68(1982);MRC5細胞；FS4細胞；人肝瘤系(HepG2);和骨髓瘤或淋巴瘤細胞(例如Y0、J558L、P3和NS0細胞)(參見美國專利No.5,807,715)。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。用本文所述用于生產蛋白質的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產本發(fā)明蛋白質的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基Ham等，Me仇58:44(1979);Barnes等，^"a/.5z.oc/zem.102:255(1980);美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利No.Re.30,985。任何這些培養(yǎng)基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、4丐、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH等)就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技術人員而言是顯而易見的。本文中所公開的蛋白質也可以使用無細胞翻譯系統(tǒng)來生產。為了此類目的，必須修飾編碼多肽的核酸以容許體外轉錄以mRNA和容許mRNA在所利用的特定無細胞系統(tǒng)(真核的，諸如哺乳動物或酵母無細胞翻:^奪系統(tǒng)；或原核的，諸如細菌無細胞翻譯系統(tǒng))中的無細胞翻i奪。本發(fā)明的蛋白質也可以通過化學合成來生產(例如通過SolidPhasePeptideSynthesis,第2版，1984,ThePierceChemicalCo"Rockford,IL中記載的方法)。對蛋白質的修飾也可以通過化學合成來產生。本發(fā)明的蛋白質可以通過蛋白質化學領域普遍知道的蛋白質分離/純化方法來純化。非限制性的例子包括抽提、再結晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、反流分布或這些的任意組合。純化后，可以通過本領域已知的多種技術將多肽更換到不同的緩沖液中和/或濃縮，包括但不限于過濾和透析。純化后的多肽優(yōu)選是至少85%純的、更優(yōu)選至少95°/。純的、和最優(yōu)選至少98%純的。不管純度的精確數(shù)值，多肽對于用作藥品是足夠純的。別的糖基化實施方案在有些實施方案中，將本發(fā)明的蛋白質糖基化可能是優(yōu)選的。優(yōu)選的是，此類蛋白質是基于纖連蛋白的支架?；诶w連蛋白的支架通常不包含糖基化位點，然而，可以將此類糖基化位點改造入蛋白質中。蛋白質的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側鏈的識別序列?？梢詫⑦@些改造入本發(fā)明的蛋白質中，特別是基于纖連蛋白的支架蛋白及其對應的多核苷酸。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向本發(fā)明的蛋白質中添加糖基化位點是通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽序列而便利的完成的(用于N-連接的糖基化位點)?；蛘?，也可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行改變(用于O-連接的糖基化位點)。編碼本發(fā)明蛋白質的氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領域知道的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸59序列變體的情況中)，或者通過對早期制備的變體或非變體型式的蛋白質(例如基于纖連蛋白的支架蛋白)進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備?？赡芟Ｍ谛鞴δ芊矫嫘揎棻景l(fā)明的蛋白質，例如增強抗體的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過引入Fc區(qū)的活性部分以及在蛋白質(例如基于纖連蛋白的支架蛋白)的Fc區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾由此產生變異的Fc區(qū)來實現(xiàn)。Fc區(qū)變體可包含在一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fc區(qū)序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。在一個實施方案中，變異的Fc區(qū)可以比天然序列Fc區(qū)更有效地在存在人效應細胞時介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，或以更好的親和力結合Fc伽馬受體(FcyR)。此類Fc區(qū)變體可以在Fc區(qū)的第256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430位中的一個或多個處包含氨基酸修飾,其中Fc區(qū)中殘基的編號方式是如Kabat中的EU索引的。別的基于抗體的蛋白質，包括模塊和衍生物本發(fā)明的的別的實施方案包括單域抗體，即其互補決定區(qū)作為單域多肽一部分的抗體。優(yōu)選的是，針對IGF-IR,以及包括在本發(fā)明的PEG連接的蛋白質中。例子包括但不限于重鏈抗體、天然不含輕鏈的抗體、自常規(guī)4鏈抗體衍生的單域抗體、工程化抗體和與那些衍生自抗體的不同的單域支架。單域抗體可以是任何現(xiàn)有的或任何未來的單域抗體。單域抗體可以衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱駝、美洲駝(llama)、山羊、家兔、牛。依照本發(fā)明的一個方面，單域抗體在用于本文時是天然存在的單域抗體，即不含輕鏈的重鏈抗體。此類單域抗體4皮露于例如WO94/04678。為了使其更清楚，這種自天然不含輕鏈的重鏈抗體衍生的可變域在本文中稱作VHH或納米抗體，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH區(qū)分開。這樣的VHH分子可以衍生自在駱駝科(Camelidae)物種中生成的抗體，例如駱駝、單峰駝、美洲駝、小羊駝(vicuna)、羊駝(alpaca)和大羊駝(guanaco)。駱駝科以外的其它物種也可生成天然不含輕鏈的重鏈抗體，此類VHH在本發(fā)明的范圍內。依照本發(fā)明及如本領域技術人員所知，VHH是自天然不含輕鏈的免疫球蛋白衍生的重鏈可變域，諸如那些自駱駝科衍生的，如WO94/04678所述(以下稱作VHH域或納米抗體)。VHH分子比IgG分子小約10倍。它們是單一多肽且非常穩(wěn)定，對極端pH和溫度條件有抗性。此外，它們對蛋白酶的作用有抗性，常規(guī)抗體則不然另外，VHH的體外表達產生高產量的、正確折疊的功能性VHH。另外，在駱駝(Camelids)中產生的抗體會識別與經由使用抗體文庫或免疫駱駝以外的哺乳動物生成的抗體所識別的表位不同的表位(WO9749805)。因此，抗EGFRVHH可以比常規(guī)抗體更有效地與EGFR相互作用，由此更有效地阻斷EGFR與EGFR配體的相互作用。由于已知VHH結合"非常，，表位，諸如腔(cavities)或溝(grooves)(W097/49805),因此此類VHH的親和力可能更適合于治療性處理。本發(fā)明的另一個實施方案是抗表皮生長因子受體，其由與針對EGFR或密切相關家族成員的駱駝科VHH的序列對應的序列組成。本發(fā)明還涉及所述多肽的同源序列、功能部分或同源序列的功能性部分。本發(fā)明還涉及能夠編碼所述多肽的核酸。本發(fā)明的單域抗體可以針對EGFR或密切相關的家族成員。依照本發(fā)明及如本文中所討論的，多肽構建物可進一步不含針對其它靶物(諸如例如血清清蛋白)的單域抗體。針對靶物的單域抗體指能夠以好于1(^M的親和力結合所述靶物的單域抗體。本發(fā)明進一步涉及單域抗體，其是屬于具有人樣序列的一類VHH。這樣一類的特征在于VHH攜帶選自下組的氨基酸第45位處的甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、曱疏氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、或谷氨酰胺(諸如例如L45)和第103位處的色氨酸，依照Kabat編號方式。因此，術語這類的多肽顯示出與人VH框架的高度氨基酸序列同源性，而且所述多肽可以直接施用于人，預期不會由此產生不想要的免疫應答，且沒有進一步人源化的負擔。另一種人樣類別的駱駝科單域抗體已經記載于PCT公開文本No.的疏水性FR2殘基，但是通過第103位帶電荷精氨酸殘基替代來自雙鏈抗體的VH中存在的保守色氨酸殘基補償了此親水性損失。因此，屬于這兩類的肽顯示出與人VH框架區(qū)的高度氨基酸序列同源性，而且所述肽可以直接施用于人，預期不會由此產生不想要的免疫應答，且沒有進一步人源化的負擔。本發(fā)明還涉及能夠編碼此類多肽的核酸。抗體可包括全長駱-呢科抗體，即Fc和VHH域。抗清蛋白VHH可以以更有效的方式與稱作載體蛋白的血清清蛋白相互作用。作為載體多肽，血清清蛋白的有些表位可能是所結合的蛋白質、肽和小型化學化合物不可及的。由于已知VHH結合"非常"或非常規(guī)表位，諸如腔(W097/49805),因此此類VHH對循環(huán)中的清蛋白的親和力可能更適合于治療性處理。血清清蛋白可以是在受試者的血清中找到的任何合適蛋白質或其片段。在本發(fā)明的一個方面，血清蛋白質是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、曱狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白、或纖連蛋白。根據預定用途，諸如有效治療所要求的半衰期和/或靶抗原的隔室化，VHH-配偶(partner)可針對上述血清蛋白質之一。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，因此保留了與抗原結合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab'片段，其是在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結構域及CH1結構域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結構域；(vi)dAb片段(Ward等，Atoi^341:544-546(1989)),其由VH結構域組成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv;scFv)(Bird等,&/ewce242:423-426(1988)和Huston等，/WASYtZ&4」85:5879-5883(1988》；(x)"雙抗體，，，其具有兩個抗原結合位點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)(參見例如EP專利公開文本No.404,097;WO93/11161;和Hollinger等，iVoc,胸/.加d腦90:6444-6448(1993));(xi)"線性抗體"，其包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CHl-VH-CHl),與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(qū)(Zapata等，8(10):1057-1062(l"5)和美國專利5，641，870)。已經為抗體片段的生產開發(fā)了多種技術，它們可用于制備本發(fā)明中所使用的抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段經由完整抗體的蛋白水解消化來衍生(參見例如Morimoto等,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);及Brennan等，Science,229:81(1985))。然而現(xiàn)在可以由重組宿主細胞直接生成這些片段。例如，可以自上文所討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可以自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段并化學偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可以自重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離F(ab')2片段。用于抗體片段生產的其它技術對于熟練從業(yè)人員會是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及美國專利No.5,587,458。抗體片段也可以是"線性抗體"，例如如例如美國專利No.5,641，870所述。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。備選的靶向蛋白質治療劑在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可以包含一種或多種avimer序列。avimer是一類對各種靶分子(包括本文中所描述的那些)具有親和力和特異性的結合蛋白。這些蛋白質可以包括在本發(fā)明的PEG連接的實施方案中。它們可以通過體外外顯子改組和噬菌體展示自人胞外受體域開發(fā)(Silverman等，2005，NatBiotechnol.23:1493-94;Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多域蛋白可包含多個獨立的結合域，其可展現(xiàn)出與單表位結合蛋白相比改善的親和力(在有些情況中是亞納摩爾的)和特異性。在各種實施方案中，avimer可附著至例如PEG或多肽接頭。關于avimer的構建和使用方法的別的細節(jié)披露于例如美國專利公開文本No.20040175756,20050048512，20050053973,20050089932和20050221384,通過述及將每一篇的實施例部分以及整個文件收入本文。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種脂籠蛋白相關序列，例如抗anticalins或脂籠蛋白衍生物。anticalins或脂籠蛋白衍生物是一類對各種靶分子(包括本文中所描述的那些)具有親和力和特異性的結合蛋白。此類蛋白質記載于美國專利公開文本No.20060058510(Anticalins)、美國專利公開文本No.20060088908(Muteinsofhumanneutrophilgelatinase-associatedlipocalinandrelatedproteins)、美國專利公開文本No.20050106660(Muteinsofapolipoproteind)和PCT公開文本No.W02006/056464。這些蛋白質可包括在本發(fā)明的PEG連接的實施方案中。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種四連蛋白C型凝集素相關序列或三連蛋白例如四連蛋白C型凝集素或四連蛋白C型凝集素衍生物。四連蛋白C型凝集素或四連蛋白C型凝集素衍生物是一類對各種靶分子(包括本文中所描述的那些)具有親和力和特異性的結合蛋白。不同的四連蛋白C型凝集素和相關蛋白記載于PCT公開文本No.W02006/053568,WO2005/080418,WO2004/094478,WO2004/039841,WO2004/005335,WO2002/048189,WO98/056906,和美國專利公開文本No.20050202043。這些蛋白質可包括在本發(fā)明的PEG連接的實施方案中。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種天然錨蛋白重復蛋白，例如DARPins(MolecularPartners)。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種AffibodiesTM。AffibodiesTM衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG結合域?？赏ㄟ^改變位于蛋白A域結合表面附近的殘基來獲得新的結合特性。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種基于半胱氨酸結的蛋白質支架，即微體(Selecore/NascaCe11)。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含一種或多種Trans-bodies。Trans-bodiesTM基于運4失蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在某些實施方案中，本文所述發(fā)明的蛋白質可包含基于伽馬晶體蛋白或遍在蛋白質的結合蛋白。這些所謂的AffilinTM(ScilProteins)分子特征在于蛋白質(3片層結構中結合區(qū)的從頭設計。AffilinTM分子已經記載于美國公開文本No.20070248536。連接至本發(fā)明蛋白質的毒素和其它分子本文所公開發(fā)明的蛋白質可連接至細胞毒劑。此類實施方案可通過適宜的體外或體內方法來制備。體外方法包括本領域眾所周知的綴合方法，包括與蛋白質相容的化學，諸如對特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將細胞毒劑連接至本發(fā)明的蛋白質，使用連接接頭或反應性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。優(yōu)選的連接基團是二辟b化物基團和碌o醚基團。例如，可以使用二碌"匕物交換反應或通過在抗體和細胞毒劑之間形成硫醚鍵來構建綴合物。優(yōu)選的細胞毒劑是美登木素生物堿、紫杉烷和CC-1065類似物。體內方法包括將毒素、標簽或標記蛋白質連接至本發(fā)明蛋白質，成為融合蛋白。使用編碼期望多肽的多核苷酸生成單一多肽?？梢酝ㄟ^在對毒素有制毒性蛋白質。盡管不是限制性的，在各種實施方案中，可以將本發(fā)明的蛋白質連接至蛋白質，諸如細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌腸毒素-A、商陸(pokeweed)抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、Ranpimase(Rap)、Rap(N69Q)、酶、或熒光蛋白。美登木素生物堿和美登木素生物堿類似物是優(yōu)選的細胞毒劑之一。合適的美登木素生物堿的例子包括美登醇和美登醇類似物。合適的美登木素生物堿披露于美國專利No.4,424，219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;6,333,410;5,475,092;5,585,499;和5,846,545。紫杉烷也是優(yōu)選的細胞毒劑。適合用于本發(fā)明的紫杉烷^坡露于美國專利No.6,372,738和6，340,701。CC-1065及其類似物也是用于本發(fā)明的優(yōu)選細胞毒劑。CC-1065及其類似物披露于美國專利No.6,372，738;6,340,701;5,846,545和5,585,499。用于制備此類細胞毒性綴合物的一種誘人候選物是CC-1065，其是一種自澤耳鏈霉菌(5^eptom;/casze/e"w力培養(yǎng)液分離得到的有力的抗腫瘤抗生素。CC-1065在體外比常用的抗癌藥(諸如多柔比星、曱氨蝶呤和長春新堿)更有力約IOOO倍(B.K.Bhuyan等，CancerRes.,42，3532-3537(1982))。細胞毒性藥物(諸如曱氨蝶呤、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利車霉素)也適合于制備本發(fā)明的綴合物，而且也可以通過居間載體分子(諸如血清清蛋白)將藥物分子連接至抗體分子。為了診斷應用，通常會用可檢測模塊標記本發(fā)明的抗體?？蓹z測模塊可以是能夠直接或間接產生可檢測信號的任何模塊。例如，可檢測模塊可以是放射性同位素，諸如H3、C14或13、P32、S35,或I131;熒光或化學發(fā)光化合物，諸如異硫氰酸熒光素、羅丹明、或螢光素；或酶，諸如堿性磷酸酶、(3-半乳糖香酶或辣根過氧化物酶。綴合可以采用本領域已知的用于將蛋白質綴合至可檢測模塊的任何方法，包括Hunter等，Nature144:945(1962);David等，Biochemistry13:1014(1974);Pain等，J.Immunol.Meth.40:219(1981);及Nygren，J.Histochem.andCytochem.30:407(1982)所記載的方法。體外方法包括本領域眾所周知的綴合化學，包括與蛋白質相容的化學，諸如對特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將模塊(諸如PEG)連接至本發(fā)明的蛋白質，使用連接基團或反應性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，而且包括二疏化物基團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。根據應用，優(yōu)選的連接基團是二硫化物基團和硫醚基團。對于基于纖連蛋白的支架或其它不含Cys半胱氨酸的蛋白質，可以在某個位置改造Cys容許蛋白質存在活性同時創(chuàng)建綴合位置。成像和其它應用本發(fā)明的蛋白質對于體內成像也是有用的，其中給受試者施用(優(yōu)選鍵入血流)經可檢測模塊(諸如不透射線的藥劑或放射性同位素)標記的蛋白質并測定經標記蛋白質在宿主中的存在和位置。這種成像技術在惡性腫瘤的分期和治療中是有用的?？梢杂迷谒拗髦锌蓹z測(通過核7磁共振、放射學、或本領域已知的其它檢測手段)的任何模塊標記蛋白質。本發(fā)明的蛋白質作為親和純化劑也是有用的。在這種方法中，使用本領域眾所周知的方法將抗體固定化在合適的支持物上，諸如Sephadex樹脂或濾紙?；谄鋵GF-IR在細胞中的功能的抑制，本發(fā)明的蛋白質作為生物學研究中的試劑也是有用的。本發(fā)明的蛋白質可用于任何已知的測定法，諸如竟爭性結合測定法、直接和間接三明治測定法、和免疫沉淀測定法(Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,頁147-158(CRCPress,Inc.,1987))?？梢砸员景l(fā)明的適宜實施方案一起^f吏用的別的藥劑在其它治療性處理或組合物中，將本發(fā)明的蛋白質與一種或多種別的治療劑共施用或序貫施用。合適的治療劑包括但不限于靶向治療劑、其它發(fā)現(xiàn)生物制品、和細胞毒性或細胞抑制性藥劑。在有些情況中會優(yōu)選在同一個或66分開的、裝有液體配制劑的治療可接受管形瓶、注射器或其它施用裝置中施用藥劑。癌癥治療劑指那些試圖殺死癌細胞或限制癌細胞生長同時對患者具有最低限度影響的藥劑。如此，此類藥劑可利用與健康宿主細胞相比癌細胞特性(例如代謝、血管化或表面抗原呈遞)的任何差異。腫瘤形態(tài)學差異是干預的潛在位點例如，第二治療劑可以是在遲滯實體瘤內部血管化方面有用，由此減緩其生長速率的抗體，諸如抗VEGF抗體。其它治療劑包括但不限于輔助劑諸如鹽酸格拉司瓊(granisetronHCl)、；維激素抑制劑諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、抗生素諸如多柔比星、抗雌激素諸如他莫昔芬、抗代謝物諸如干擾素a-2a、細胞毒劑諸如紫杉醇、酶抑制劑諸如ras法尼基轉移酶抑制劑、免疫調控劑諸如阿地白介素(aldesleukin)、和氮芥衍生物諸如鹽酸美法侖、諸如此類。可以為了改善的抗癌效果而與本發(fā)明的蛋白質組合的治療劑包括腫瘤學實踐中所使用的多種藥劑(參考文獻Cancer,Principles&PracticeofOncology,DeVita,V.T"Hellman，S.，Rosenberg,S.A.，第6版，Lippincott-Raven,Philadelphia,2001),諸如多西他塞、帕利他塞、多柔比星、表柔比星、環(huán)磷酰胺、曲妥單抗、卡培他濱、他莫昔芬、托瑞米芬、來曲唑、阿那曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、安肽、貝伐單抗、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、伊立替康、依托泊苷、托泊替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來膦酸鹽、鏈佐星、利妥昔單抗、伊達比星、白消安、苯丁酸氮芥、氟達拉濱、伊馬替尼、阿糖胞苷、ibritumomab、托西莫單抗、干擾素a-2b、美法侖、bortezomib、六曱蜜胺、天冬酰胺酶、gefitinib、erlonitib、抗EGF受體抗體(例3口西妥昔單4元或panitumab)、ixabepilone、epothilones或其書f生4勿、和細胞毒性藥物與針對細胞表面受體的抗體的綴合物。優(yōu)選的治療劑是鉑劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順鈾)、紫杉烷(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、和喜樹堿。可以在本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物之前、同時、或之后施用一種或多種別的治療劑。熟練技術人員會理解，對于每種治療劑，特定施用次序可能是有利的。類似的，熟練技術人員會理解，對于每種治療劑，施用藥劑與本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物之間的時間長度會變化。配制和施用本發(fā)明的治療用配制劑通過將具有期望純度的所述蛋白質與任選的生理學可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.編(1980))混合，以水溶液、凍干或其它干燥配制劑的形式制備?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨(octadecyidimethylbenzylammoniumchloride);氯化己烷雙胺(hexamethoniumchloride);苯扎氯銨(benzalkoniumchloride)、苯索氯銨(benzethoniumchloride);酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯甲酸烷基酯(alkylparabens),諸如對羥基苯曱酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚(catechol);間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子(salt-formingcounter-ions),諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應癥所必需的活性化合物，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的化合物。本文中提供了活性化合物組合的例子。此類分子以對預定目的有效的量合適的組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱S旨)微膠嚢)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)，或在粗滴乳狀液中。此類技術披露于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.編(1980)。用于體內施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明蛋白質的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質是定型產品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當膠嚢化抗體或免疫偶聯(lián)物在體內長時間維持時，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導致生物學活性損失和免疫原性可能改變。可以根據相關機制來設計合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是經由硫醇-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。雖然熟練技術人員會理解每種治療劑的劑量會取決于藥劑的身份，但是優(yōu)選的劑量范圍可以是約IOmg/平米至約2000mg/平米、更優(yōu)選約50mg/平米至約1000mg/平米。對于優(yōu)選的藥劑，諸如鉑劑(卡鉑、奧沙利鉑、順鉑)，優(yōu)選的劑量是約10mg/平米至約400mg/平米，對于紫杉烷(帕利他塞、多西他塞)，優(yōu)選的劑量是約20mg/平米至約150mg/平米，對于吉西他濱，優(yōu)選的劑量是約100mg/平米至約2000mg/平米，而對于喜樹4成，優(yōu)選的劑量是約50mg/平米至約350mg/平米。這種和其它治療劑的劑量可取決于本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物是否與治療劑同時或序貫施用。為了治療性應用，以藥學可接受劑量形式將本發(fā)明的蛋白質或綴合物施用于受試者。它們可以靜脈內(作為推注或持續(xù)一段時間的連續(xù)輸注)、肌肉內、皮下、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、口服、表面、或吸入路徑施用。蛋白質也可以通過肺瘤內、腫瘤周圍、病變內、或病變周圍^各徑施用，以發(fā)揮足部以及系統(tǒng)治療效果。合適的藥學可接受載體、稀釋劑、和賦形劑是眾所周知的，而且可以由本領域技術人員4艮據臨床形勢許可來決定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的例子包括(l)Dulbecco氏磷酸鹽緩沖衍生，pH約7.4，含有約lmg/ml至25mg/ml人血清清蛋白；(2)0.9%鹽水(0.9%w/vNaCl);和(3)5。/。(w/v)右旋糖。本發(fā)明的方法可以在體外、在體內、或回體實施。本發(fā)明的蛋白質和一種或多種別的治療劑的施用(無論是共施用或者是序貫施用)可以如上所述為治療應用而發(fā)生。根據共施用的具體治療劑的身6份，熟練技術人員會了解適合于共施用的藥學可接受載體、稀釋劑、和賦形劑。在以水性劑型而非凍干劑型存在時，蛋白質通常會配制成約O.lmg/ml至100mg/ml的濃度，盡管這些范圍以外的廣泛變異也是容許的。為了疾病的治療，抗體或綴合物的適宜劑量會取決于如上文所定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和進程、施用抗體是出于預防目的還是治療目的、先前療法的過程、患者的臨床史和對抗體的響應、及主治醫(yī)師的判斷。一次性地或通過一系列處理地合適地施用蛋白質。根據疾病的類型和嚴重程度，對患者施用的初始候選劑量優(yōu)選是約1mg/平米至約2000mg/平米蛋白質、更優(yōu)選約IOmg/平米至約1000mg/平米抗體，無論是例如通過一次或多次分開的施用，或者是通過連續(xù)輸注。對于持續(xù)數(shù)天或更長時間的重復施用，根據狀況，重復治療直至期望的對疾病癥狀的遏制發(fā)生。然而，其它劑量攝生法可能是有用的，不被排除在外。本發(fā)明還包括試劑盒，其包括一種或多種本文中所描述的成分和關于那些成分的使用說明書。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物，及治療劑。關于此優(yōu)選實施方案的說明書包括使用本發(fā)明的蛋白質及治療劑抑制癌細胞生長的說明書，和/或施用本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物及治療劑治療患有癌癥的患者的方法的說明書。優(yōu)選的是，試劑盒中所使用的治療劑選自下組多西他塞、帕利他塞、多柔比星、表柔比星、環(huán)磷酰胺、曲妥單抗、卡培他濱、他莫昔芬、托瑞米芬、來曲唑、阿那曲峻、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、安肽、貝伐單抗、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依托泊苷、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來膦酸鹽、鏈佐星、利妥昔單抗、伊達比星、白消安、苯丁酸氮芥、氟達拉濱、伊馬替尼、阿糖胞苷、ibritumomab、托西莫單抗、干擾素a-2b、美法侖、bortezomib、六曱蜜胺、天冬酰胺酶、gefitinib、erlonitib、抗EGF受體抗體(侈'J3口西妥昔單4元或panitumumab)、ixabepilone、禾口epothilone或其書亍生4勿。更優(yōu)選的是，治療劑是鉑劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順賴)、紫杉烷(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他濱、或喜樹^4。本發(fā)明試劑盒的成分出于適合于試劑盒的形式，諸如溶液或凍干粉。熟練技術人員會了解，試劑盒的成分的濃度或量因試劑盒的每種成分的身份和試劑盒的說明書中提到的癌癥及其細胞包括乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經細胞瘤、和橫紋肌肉瘤。別的專利參考文獻以下別的專利申請和專利中所記載的方法和組合物也包括在本公開內容中美國專利公開文本No.20050186203;20050084906;20050008642;20040202655;20040132028;20030211078;20060083683;20060099205;20060228355;20040081648;20040081647;20050074865;20040259155;20050038229;20050255548;20060246059;和美國專利No.5,707，632;6,818,418;和7,115,396;及PCT公開文本No.WO2005/085430;WO2004/019878;WO2004/029224;WO2005/056764;WO2001/064942;和WO2002/032925。本申請要求2006年11月22日和2007年1月9日分別提交的美國臨時申請No.60/860,605和60/879，666的優(yōu)先權，通過述及完整收入其內容。通過述及的收錄本文中所記載的所有文件和參考文獻(包括專利文件和網站)通過述及個別地收入本文件，就像完整地或部分地在本文件中書寫的程度。實施例現(xiàn)在通過述及以下實施例來描述本發(fā)明，實施例只是例示性的，并非意圖限制本發(fā)明。雖然已經詳細地、述及具體實施方案地描述了本發(fā)明，對于本領域技術人員顯而易見的是，可以進行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例l:IEG-結合分子的初始鑒定以人纖連蛋白第十3型域的支架為基礎構建了在第23-29、52-55和77-86位處具有三個隨機化區(qū)的大約10。個RNA-蛋白質融合物變體的文庫(氨基酸編號參照SEQIDNO:l)(三環(huán)文庫;Xu等,Chemistry&Biology9:933-942，2002)。轉變成mRNA/cDNA異雙鏈體后，將一萬億個mRNA/cDNA-蛋白質融合物的文庫結合至溶液中的100nM生物素化IGF-IR，并捕捉至鏈霉親合素包被的磁珠上。將cDNA洗脫，通過PCR擴增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白質融合物的新文庫。以這種方式實施5輪選擇，并在每輪后通過定量PCR監(jiān)測文庫中結合IGF-IR的百分比以鑒定靶物結合富集(圖l)。實施例2:竟爭性IGF-IR克隆的鑒定使用竟爭性結合測定法在存在IGF-IR的情況中對由獨立克隆編碼的蛋白質分析對靶物結合的抑制。超過一百個克隆被鑒定為抑制IGF-I結合IGF-IR，提示這些克隆在天然配體(IGF-I)結合位點處或附近結合IGF-IR。這一百個克隆的SEQIDNO(見圖30)及其在竟爭性結合測定法中的百分比抑制呈現(xiàn)于表l。表l:IGF-IR竟爭性克隆的SEQIDNO和。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實施例3:IGF-IR竟爭性克隆的電泳特性的檢驗通過SDS-PAGE檢驗了所選擇克隆的純度和電泳特性(圖2)。考慮到它們的單柱純化，發(fā)現(xiàn)這些克隆是適度純的，而且它們具有與理論質量一致的表觀分子量(考慮了與C末端標簽有關的額外質量)。實施例4:結合IGF-IR的序列家族的鑒定對能夠與IGF-I竟爭的克隆測序并使用VectorNTI(Invitrogen)比對。大多數(shù)克隆落入三個不同的家族。一個家族以保守BC環(huán)第6位的纈氨酸和含有保守精氨酸和酪氨酸的長度可變FG環(huán)來識別(克隆218C04、215D09、2MC(H、214F03、214C03、214E01、和218F09)。第二個家族以DG環(huán)中的保守酪氨酸和脯氨酸來識別，而且常常與恰好10個氨基酸的FG環(huán)有關(克隆225D03、215E09、215B07、215D11、218E09、309B01、310A01、和310A03)。第三個克隆家族具有含保守疏水性氨基酸的14個氨基酸的FG環(huán)(克隆Clones223B01、223B02、和218F08)。剩余克隆沒有顯示出與其它家族的相似性，不能分入不同的家族，而且未顯示。實施例5:適合于優(yōu)化的候選克隆的鑒定源自上述選擇過程的克隆有可能未達到生物治療劑的嚴格親和力、特異性、和生物物理學要求，并因此需要進一步誘變，其中細調或"優(yōu)化，，結合環(huán)。為了鑒定最大限度遵循此軌跡的克隆，選擇一些候選物進行深入表征。在此實施例中，描述了一個IGF-IR竟爭性克隆(即218C04)的表征。制備一升大腸桿菌培養(yǎng)液，并如SDS-PAGE所示純化克隆218C04(圖3)。在生物物理學特性的檢驗中，SEC反映了218C04事實上都是單體的(圖4),提示此克隆不具有在較高蛋白質濃度生成穩(wěn)定聚集體的傾向。純化產物的表面等離振子共振(BIAcore)分析揭示了以溶液相注入的克隆以1.8nM的Ko結合固定化IGF-IR?？傊@些特性指示了此克隆適合于優(yōu)化。實施例6:IGF-IR特異性克隆的優(yōu)化在以下實施例中，描述了一個IGF-IR特異性克隆(即218C04)的優(yōu)化。顯示了克隆218C04的序列，其中BC、DE、和FG環(huán)分別以下劃線標示SSARTATISGLKPGVDYTITVYAVTPSNIIGRHYGPIS雨RT(SEQIDNO:17)構建了三個文庫，其中每次用隨機序列替換一個環(huán)。如下所述在DNA水平構建文庫，只是三個環(huán)中兩個的隨機序列用與克隆218C04對應的固定序列替換。對這三個文庫實施擴增、mRNA-蛋白質融合物的合成、和親和選擇。每輪監(jiān)測結合百分比(圖5a)，并繼續(xù)PROftision直至每個文庫顯示出超過l。/c)的結合。在此點，自每個文庫擴增隨機環(huán)并重新組裝以制備其中所有3個環(huán)都進行了優(yōu)化的主文庫(masterlibrary)(圖5b)。對包含所有3個經過優(yōu)化的環(huán)的主文庫進行多輪擴增、mRNA-蛋白質融合物合成、和親和選擇。使用遞減濃度的IGF-IR以選擇最高親和力的結合物(圖5c)。實施例7:用于評估經過優(yōu)化的衍生物克隆的竟爭性IGF-IR測定法在此實施例中對于所選擇的經過優(yōu)化的基于纖連蛋白的支架蛋白與優(yōu)化前的克隆(即克隆218C04)在竟爭性測定法中比較它們抑制IGF-I和IGF-IR之間相互作用的能力。在HTPP和量化后，許多克隆展現(xiàn)出比起始克隆卓越的抑制，IC50在低nM范圍中(圖6)。具體而言，一個克隆(即338A06)表現(xiàn)出在此測定法中具有l(wèi)nM或低于lnM的IC50(圖6)。實施例8:經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆的序列在優(yōu)化所選擇的克隆并在竟爭性測定法中對衍生物評估對IGF-IGF-IR相互作用的抑制后，對克隆測序。參見圖30和表2中的SEQIDNO:110-125。75與此實施例中的親本克隆218C04相似，所有抑制性衍生物克隆在BC環(huán)中包含保守纈氨酸殘基。另外，在BC環(huán)中的保守位置處頻繁觀察到保守的疏水性殘基(通常是亮氨酸)。經過優(yōu)化的克隆的FG環(huán)也與親本克隆218C04在特定位置共享保守殘基，盡管環(huán)的長度有變化。對于這個特定克隆家族，精氨酸-X-酪氨酸基序表現(xiàn)出是功能性所要求的重要基序。這見于除一個以外的所有書f生物克隆，而在此克隆(354C10,精氨酸-X-纈氨酸)表現(xiàn)出是耐受的、保守替代。因此，對于218C04克隆家族，表現(xiàn)出有四個優(yōu)勢(dominant)位置，兩個在BC環(huán)中，兩個在FG環(huán)中，它們表現(xiàn)出在限定IGF-IR結合和抑制活性方面發(fā)揮最大作用。表2克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:338A05110354A09115354D10120338A06111354A10116354E02121339A01112354B10117354F11122353F10113354C05118354F06123353H09114354C10119354G02124354G09125實施例9:經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆的電泳特性的檢驗制備了所選擇的經過優(yōu)化的克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。SDS-PAGE(圖7)揭示了優(yōu)良的純度(盡管是單柱純化)和與它們的理論分子量(慮及(allowfor)標簽)一致的表觀分子量。實施例10:經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆的熱穩(wěn)定性的檢驗制備了所選擇的IGF-IR優(yōu)化克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。實施了差示掃描量熱法(DSC)來表征各個克隆的解折疊能量學或熔解溫度Tm。克隆338A06展現(xiàn)出解折疊溫度為62。C(圖8),指示了高度穩(wěn)定的結構。別的優(yōu)化克隆的熔解溫度見表3。實施例ll:經過優(yōu)化的IGF-IG竟爭性克隆的溶液特性的檢驗表3:通過差示掃描量熱法測定的IGF-IR克隆的熔化溫度克隆(Tm,0C)338A0568353F1059353H0955354A1046368G0556375G1059制備了所選擇的優(yōu)化克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。大小排阻層析(SEC)揭示了單體行為(在此實施例中是克隆338A06)(圖9)，指示了在較高蛋白質濃度，經過優(yōu)化的克隆不具有聚集的趨向。使用與多角度激光散射(MALLS)聯(lián)合的SEC證實了單體性。"經典"光散射(也稱作"靜態(tài)"或"Rayldgh，，散射或MALLS)提供了分子量的直接測量。因此，它對于確定蛋白質的天然狀態(tài)是單體還是高級寡聚物，及對于測量聚集體或其它非天然種類的質量是非常有用的。在此實施例中，呈現(xiàn)了對克隆338A06的分析。如圖10所示，SECMALLS測定出克隆338A06的質量為12,190Da,完全在帶His標簽的單體的預測質量ll,740的實-瞼誤差內。這提供了這些克隆在溶液中是表現(xiàn)優(yōu)良的單體的額外證據。實施例12:經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆的結合親和力和動力學的測定制備了所選擇的優(yōu)化克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。使用重組的、固定化的IGF-IR和溶液相克隆實施表面等離振子共振(BIAcore)分析以測定結合動力學和結合親和力。如表4所示，此實施例所示克隆的結合親和力的范圍為兩位數(shù)pM至一位數(shù)(singledigit)nMKD。解離速率在1(T4(1/s)范圍中，而結合速率非?？欤ǔＪ羌s1()6(1/M.s)。表4:ka、kd和Kd的BIAcore測定克隆ka(1/M*s)x10+5ko(1/s)x10懇4KD(nM)353F103.72.10.056353H093.82.20.057338A062.24.30細354A101.11.80.158338A051.33.30.261375G101.37.00.538339A011.26.70.565368G050.00369.82.740實施例13:經過優(yōu)化的IGF-IR竟爭性克隆對胰島素受體的結合的測定制備了所選擇的優(yōu)化克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。人IGF-IR對人胰島素受體的同源性為大約56%。為了確保IGF-IR竟爭性克隆確實是對IGF-IR特異性的，使用BIAcore方法學在高濃度針對人胰島素受體進行評估。將人胰島素受體固定化到BIAcore芯片上，正如作為非特異性結合對照的無關蛋白質。使克隆以1(VM流過芯片，該濃度比大多數(shù)克隆的IGF-IR結合Kd高10,000倍以上。記錄相似濃度時胰島素結合信號百分比并呈現(xiàn)于表5。大多數(shù)克隆在此高濃度不展現(xiàn)出或剛剛展現(xiàn)出可檢測的對胰島素受體的結合，說明了它們確實是對IGF-IR特異性的。展現(xiàn)出一些程度的對胰島素受體結合的克隆表現(xiàn)出是選擇性結合物。表5:IGF-IR克隆的胰島素受體(IR)結合克隆10nM處的。/。IR結合338A062354A101353F101353H090375G100368G0521338A0545339A01>訓78胰島素1100_實施例14:IGF-IR克隆338A06的MALDITOF質鐠對純化后的、經過優(yōu)化的IGF-IR克隆實施質鐠以確保身份。在此實施例中，檢驗了克隆338A06。克隆338A06的預測質量為11741原子量單位(amu)。用標準品校準后，克隆338A06的MALDITOF質譜揭示了質量為11741m/z(圖ll)。觀察到更高m/z處別的次要種類，然而這些與基質加合物一致(圖11)。因此，338A06和事實上所有檢驗的IGF-IR克隆給出與它們的預測質量一致的質量。實施例15:IGF-IR竟爭性克隆338A06在基于細胞的測定法中的活性在基于細胞的測定法中評估純化后的、經過優(yōu)化的IGF-IR克隆以驗證活性。在一個例子中展示了所選擇的克隆338A06對IGF-I介導的有絲分裂的抑制，如圖12所示。用連續(xù)稀釋的克隆338A06或常用的抗IGF-IR單克隆抗體(MAB391)處理無IGF-I培養(yǎng)基中的人胰腺癌細胞系BxPC-3。刺激性暴露于IGF-I24小時后，用311-胸苷處理細胞以測量細胞增殖。如圖12所示，克隆338A06與單克隆抗體對照相當?shù)匾种艻GF-I依賴性增殖，IC50為大約10-20nM。在第二個基于細胞的測定法中展示了克隆338A06對同位素標記的IGF-I結合表達IGF-IR的癌細胞系的抑制。將人乳腺癌MCF-7細胞與克隆338A06、單克隆抗體MAB391、或未標記的IGF-1預溫育30分鐘。溫育期后，添加方文射性標記的IGF-I。隨后裂解細胞并量化放射性。如圖13所示，克隆338A06和冷的IGF-I具有基本上相當?shù)腎C50，大約為l-2nM,而單克隆抗體表現(xiàn)出效力較低，IC50為大約5nM。實施例16:克隆338A06的優(yōu)化貯存期間對蛋白質看到的常見降解過程之一是曱疏氨酸殘基的氧化，這可導致化學和物理學穩(wěn)定性及生物學活性的潛在損失。雖然基于纖連蛋白的支架蛋白克隆在它們的骨架中不含曱硫氨酸殘基，所選擇的一些IGF-IR竟爭性克隆在它們的環(huán)中包含甲硫氨酸。為了選擇保留起始克隆的生物學活性的期望特性和生物物理學特性但替代了環(huán)中不想要的曱硫氨酸殘基的克隆而實施了優(yōu)化。在此實施例中，顯示了在FG環(huán)中包含曱硫氨酸殘基的克隆338A06的優(yōu)化。使用在FG環(huán)中具有6個隨機氨基酸的單一文庫優(yōu)化了克隆338A06。使用適宜的寡核苷酸將338A06的序列(SEQIDNO:lll)摻入新文庫的BC和DE環(huán)中。如下所述構建了文庫并將雙鏈DNA轉變成mRNA-蛋白質融合物以給出約1000個拷貝的每種FG環(huán)序列。實施擴增、mRNA-蛋白質融合物形成和親和選擇的PROfusion循環(huán)。在第一輪中，生物素化IGF-IR濃度為100nM，但是這在后續(xù)輪中降低以富集最高親和力結合物。實施例17:338A06的優(yōu)化衍生物的直接結合測定法使用直接結合測定法對克隆338A06的優(yōu)化衍生物篩選增強的對IGF-IR的結合。使用克隆濃度梯度進一步分析在單點測定法中顯示出結合的克隆。如圖14所示，許多衍生物克隆以與親本克隆338A06相當?shù)挠H和力結合IGF-IR。在大約lnM的濃度看到半最大結合(圖14)。實施例18:經過優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的序列優(yōu)化338A06克隆的FG環(huán)并在直接結合測定法中對衍生物評估對IGF-IR的結合后，對克隆測序。參見圖30和表6的SEQIDNO:184-202。在此實施例中所呈現(xiàn)的克隆中，只有一個克隆在FG環(huán)中包含曱硫氨酸(克隆387A09),而且這位于與親本338A06克隆不同的位置。因此，338A06克隆的FG環(huán)中的曱硫氨酸表現(xiàn)出對功能性不重要。本發(fā)明提供了改造除掉此失穩(wěn)性殘基的方法。與這些克隆的218C04衍生化一致，精氨酸-X-酪氨酸基序被保留在338A06FG環(huán)優(yōu)化努力的所有產物中。這提供了此區(qū)域中這兩個殘基在用于此特定家族的基于纖連蛋白的支架蛋白折疊的背景中在IGF-IR結合和抑制中表現(xiàn)為優(yōu)勢決定因素的額外證據。__表6克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:385A08184385F08190386F10196385A09185385H06191386F11197<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實施例19:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的溶液特性的檢驗FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的HTPP物質的大小排阻層析(SEC)揭示了單體行為，指示了在較高蛋白質濃度，經過優(yōu)化的克隆不具有聚集趨向。在此實施例中呈現(xiàn)了9個自優(yōu)化和HTPP衍生的克隆(圖15)。實施例20:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的結合親和力和動力學的測定制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。使用重組的、固定化的IGF-IR和溶液相克隆實施了BIAcore分析以測定結合動力學和結合親和力。如表7所示，對于此實施例中所顯示的克隆，結合親和力的范圍為兩位數(shù)至三位數(shù)pM。解離速率在10"(l/s)范圍中，而結合速率非?？?，通常為約10"1/M.s)。_表7:ka、kd和Ko的BIAcore測定<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實施例21:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆對胰島素受體的結合的測定制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。人IGF-IR對人胰島素受體的同源性為大約56。/。。為了確保IGF-IR竟爭性克隆確實是對IGF-IR特異性的，使用BIAcore方法學在高濃度針對人胰島素受體進行評估。將人胰島素受體固定化到BIAcore芯片上，正如作為非特異性結合對照的無關蛋白質。使克隆以10pM流過芯片，該濃度比大多數(shù)克隆的IGF-IR結合Kd高10,OOO倍以上。記錄相似濃度時胰島素結合信號百分比并呈現(xiàn)于表8。大多數(shù)克隆在此高濃度不展現(xiàn)出可檢測的對胰島素受體的結合，說明這些克隆確實是對IGF-IR特異性的。表8:338A06FG環(huán)優(yōu)化的IGF-IR克隆的胰島素受體結合<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>實施例22:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的熱穩(wěn)定性的檢驗制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。實施了差示掃描量熱法(DSC)來表征各個克隆的解折疊能量學或熔解溫度Tm。所測試的克隆展現(xiàn)出解折疊溫度為58-63。C,指示了高度穩(wěn)定的結構。經過優(yōu)化的克隆的熔解溫度見表9。表9:通過差示掃描量熱法測定的IGF-IR克隆的熔化溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>實施例23:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆在純化后的熔化特性的檢驗制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的HTPP物質的大小排阻層析(SEC)揭示了單體行為，指示了在較高蛋白質濃度，經過優(yōu)化的克隆不具有聚集的趨向。在此實施例中，呈現(xiàn)了一個代表性克隆387B01的SECi普(圖16)。實施例24:FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆在純化后的純度和同質性的RP-HPLC檢驗制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。實施了反相高效液像層析(RP-HPLC)以表征克隆的純度以及確立克隆同質性。所有克隆在利用改造入其C末端的C末端標簽的單柱純化后展現(xiàn)出卓越的純度和同質性，如圖17所示代表性層析圖所例示的。實施例25:FG環(huán)優(yōu)化的338A06克隆在純化后的MALDITOF質譜制備了所選擇的FG環(huán)優(yōu)化的338A06IGF-IR竟爭性克隆的一升大腸桿菌培養(yǎng)液并純化蛋白質。對純化后的、經過優(yōu)化的IGF-IR克隆實施了質譜以確保身份。在此實施例中，檢驗了克隆387B01?？寺?8B01的預測質量為11554原子量單位(amu)。在用標準品校準后，克隆387B01的MALDITOF質譜揭示了大約11553m/z的質量，完全在儀器的實驗誤差內(圖18)。觀察到更高m/z處別的次要種類(圖18)。不確定這是基質加合物還是次要翻譯后修飾種類。因此，387B01和事實上所有檢驗的IGF-IR克隆給出與它們的預測質量一致的質量。實施例26:基于纖連蛋白的支架蛋白的PEG化為了實施體內研究，實施了基于纖連蛋白的支架蛋白的PEG化。在此實施例中，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中生成克隆385A08，其具有C末端延伸以產生如下蛋白質序列(C末端延伸以斜體、粗體標示，Cys97以下劃線標示)(SEQIDNO:203)使用標準馬來酰亞胺化學利用第97位半胱氨酸殘基的單一硫氫基來偶83聯(lián)PEG變體以產生兩種不同PEG化形式的385A08。將線性20kDa雙功能PEG和單功能性分支40kDaPEG(NOFCorporation)都與克隆385A08綴合以分別產生385A08-PEG20-385A08和385A08-PEG40。通過陰離子交換層析和大小排阻層析將PEG化蛋白質形式與未反應的蛋白質和PEG純化分開。通過SDS-PAGE(圖ll)和質譜證實了385A08的這兩種PEG性質的共價連接。實施例27:PEG化基于纖連蛋白的支架克隆變體的結合親和力和動力學的測定使用重組的、固定化的IGF-IR和液相分析物實施了表面等離振子共振(BIAcore)分析以測定385A08-PEG20-385A08和385A08-PEG40變體的結合動力學和結合親和力。雖然發(fā)現(xiàn)385A08-PEG40形式具有相對于未修飾的385A08慢大約10倍的結合速率(ka)，但是385A08-PEG20-385A08形式具有快大約2倍的結合速率(表10)。變體的解離速率(kd，表10)相對于未修飾385A08略有升高(385A08-PEG40形式)或略有降低(385A08-PEG20-385A08變體)(表IO)。表10:ka、kd和Ko的BIAcore測定克隆ka(l/M*s)xlO+6kd(1/s)xl0-4KD(pM)385A086.91.623385A08-PEG20-385A08150.96385A08-PEG400.62.1355實施例28:IGF-IR增殖測定法中對PEG化基于纖連蛋白的支架克隆的評估使用人漿細胞瘤細胞系NCI-H929對PEG化基于纖連蛋白的支架變體評估對血清介導的增殖的抑制。在此細胞系中，抗IGF-IRMAB391和未修飾的385A08展現(xiàn)出程度相當?shù)膶毎L的抑制，表觀IC50為大約100pM。385A08-PEG40變體的抑制作用略低，IC50接近lnM。另一方面，PEG20-385A08-PEG20變體極度有力，在所測試的所有濃度基本上100%抑制。因此，IC50低于100fM。實施例29:IGF-IR增殖測定法中對纖連蛋白支架IGF-IR結合物多聚體的評估使用表達人IGF-IR的鼠淋巴細胞細胞系32D來評估IGF-IR拮抗劑的效果。包含兩個纖連蛋白支架IGF-IR結合域的拮抗劑展現(xiàn)出抑制效果比單個纖連蛋白支架域或抗IGF-IR抗體顯著升高。實施例30:IGF-IR增殖測定法中對雙特異性纖連蛋白支架多聚體的評估使用人漿細胞瘤細胞系NCI-H929對纖連蛋白支架蛋白評估對血清介導的增殖的抑制。在此細胞系中，IGF-IR纖連蛋白支架和IGF-IR/VEGFR2雙特異性纖連蛋白支架多聚體展現(xiàn)出程度相當?shù)膶毎L的抑制。實施例31:VEGFR2增殖測定法中對雙特異性纖連蛋白支架多聚體的評估對纖連蛋白支架蛋白評估對VEGF依賴性細胞系的抑制。在此細胞系中，VEGFR2纖連蛋白支架和IGF-IR/VEGFR2雙特異性纖連蛋白支架多聚體展現(xiàn)出程度相當?shù)膶毎L的抑制。實施例32:對纖連蛋白支架IGF-IR結合物HAS綴合物的評估使用人漿細胞瘤細胞系NCI-H929對纖連蛋白支架蛋白評估對血清介導的增殖的抑制。IGF-IR和IGF-IR/HAS蛋白質展現(xiàn)出程度相當?shù)膶毎L的抑制(見圖25)。在RH41肉瘤異種移植物中對多種IGF-IR拮抗劑測試了它們的體內抗腫瘤活性(見圖26和27)。表ll總結了該研究的結果。表ll:RH41肉瘤研究中的體內抗腫瘤活性<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>*腫瘤生長抑制和概率值是在第39天計算的。a媒介為80。/。PEG400,20%dH20。b媒介為PBS。c每個組的平均體重變化為處理開始時(第20天)和處理結束時(第42天)體重之間的均值差異。TVDT是為500mg的大小計算的。所使用的縮寫如下po，口服路徑；ip，腹膜內路徑；LCK，總體對數(shù)細胞殺傷，以LCK-T-C/(3.32xTVDT)來計算，其中T-C為受處理腫瘤(T)達到預定大小(腫瘤目標大小)的時間(以天計)相對于媒介對照組(C)的差異除以乘上3.32的腫瘤體積倍增時間(TVDT)。TVDT為對照腫瘤達到目標大小的時間(以天計)中值(median卜對照腫瘤達到目標大'J、一半的時間(以天計)中值；結果，若某種處理攝生法產生統(tǒng)計學顯著的LCK>1.0，則認為它是有效的；％TGI，相對％腫瘤生長抑制，以。/。TG》[(Q-Tt)/(CrQ))]xIOO計算，其中C產腫瘤植入后時間t(以天計)時對照小鼠的腫瘤重量中值，T尸時間t時受處理小鼠的腫瘤重量中值，Qr時間O時對照小鼠的腫瘤重量中值。在多個時間點計算。/。TGI值，在1.5倍腫瘤體積倍增時間后開始并持續(xù)3倍腫瘤體積倍增時間的一段時期(如果可能的話)?！?0。/。的。/。TGI值視為有效的，q2dx5(作為進度表的一個例子)，隔天施用5劑化合物。還生成了多肽融合蛋白HSA-IGF-IR。下文列舉了對IGF-IR克隆385A08的多種N-和C-末端HAS融合物。C-末端構建物中省略了HAS前導和前肽序列。Fn接頭l衍生自連接第一和第二纖連蛋白m型域的氨基酸序列。Fn接頭2衍生自連接第十和第十一纖連蛋白m型域的氨基酸序列(見圖30)。人血清清蛋白(未加工的)^11接頭1-385八08;SEQIDNO:2283SSA0S-Fn接頭l-人血清清蛋白(經加工的)；人血清清蛋白(未加工的)〗11接頭2-385八08;人血清清蛋白(未加工的)-(08)5接頭-385八08;人血清清蛋白(未加工的)-卿0接頭-385八08;385A08-Fn接頭2-人血清清蛋白(經加工的)；385A08-(GS)5接頭-人血清清蛋白(經加工的);385A08-(GS)10接頭-人血清清蛋白(經加工的)；SEQIDNO:229SEQIDNO:230SEQIDNO:231SEQIDNO:232SEQIDNO:233SEQIDNO:234SEQIDNO:235實施例33:對連接至運鐵蛋白的纖連蛋白支架IGF-IR結合物的評估使用人漿細胞瘤細胞系NCI-H929對融合至運鐵蛋白的纖連蛋白支架蛋白評估對血清介導的增殖的抑制。生成了多肽融合蛋白運鐵蛋白-IGF-IR。下文列舉了對IGF-IR克隆385A08的多種N-和C-末端運鐵蛋白融合物。C-末端構建物中省略了HAS前導序列(圖30)。人運鐵蛋白(未加工的)^11接頭1-385八08;385A08-Fn接頭l-人運鐵蛋白(經加工的)；人運鐵蛋白(未加工的)-Fn接頭2-385A08;人運鐵蛋白(未加工的)-(GS)5接頭-385A08;人運鐵蛋白(未加工的)-(08)10接頭-385八08;385A08-Fn接頭2-人運鐵蛋白(經加工的)；385A08-(GS)5接頭-人運鐵蛋白(經加工的)；385A08-(GS)10接頭-人運鐵蛋白(經加工的)；SEQIDNO:236SEQIDNO:237SEQIDNO:238SEQIDNO:239SEQIDNO:240SEQIDNO:241SEQIDNO:242SEQIDNO:243實施例34:IGF-IR-Fc融合蛋白對融合至Fc的基于纖連蛋白的支架蛋白評估它們抑制多種細胞系的能力。在Rh41細胞(4.5nM)、DU4475細胞(〉50nM)、H929細胞(0.15nM)、BXPC-3(>500nM)、和HT-29細胞(〉1000nM)中測定了385A08-Fc(SEQIDNO:247的氨基酸90-423)的IC50值。IGF-IR-Fc融合物在RH41細胞系中展現(xiàn)出91%的最大抑制。在RH41人橫紋肌肉瘤細胞中對融合至Fc的基于纖連蛋白的支架蛋白評估了它們抑制IGF-1R、AKT和MAPK磷酸化的能力(圖29)。87在Rh41和H929細胞系中對融合至Fc的基于纖連蛋白的支架蛋白評估了它們抑制增殖的能力(表12)。如所記錄的，用nM濃度的385A08-Fc處理細胞。IC50值如下Rh41試驗l(48.65nM);Rh41試驗2(39.43nM);Rhl試驗平均值(44nM);和H929試驗(0.15nM)。表12:385A08-Fc在Rh41和H929細胞系中對細胞增殖的效果Rh41試驗lRh41試驗2H929測定法nM[3司摻入標準偏差[3H]摻入標準偏差卩H]摻入標準偏差5054.92.6752.13.2720.21.5210.061.91.5659.31.1418.40.892.077.92.8678.61.920.60.620.497.12.2694.61.0832.01.970.08102.91.1498.40.5257.13.870.016101.21.26102.50.9580.13.09實施例35:本文中所使用的方法的例子以下材料和方法被用于前述實施例中所描述的實驗。重組蛋白重組人IGF-I、IGF-IR、胰島素受體(IR)、抗IGF-IRMAB391、和重組人VEGF-R2-Fc得自R&DSystems(Minneapolis,MN)。IGF-IR的生物素化在存在EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-生物素(Pierce,IL)時在lxPBS中于4。C進行2小時。通過針對lxPBS透析除去過量的EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-生物素。通過質譜測定生物素化水平，和使用CoomassieProteinPlus測定法(Pierce，IL)測定蛋白質濃度。引物通過化學合成制備以下寡核苷酸，最終用于文庫構建和選定克隆的誘變T7TMV:5'-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATG-3，(SEQIDNO:204)GCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGG-3，(SEQIDNO:205)FnBC:5'-AGCCTGCTGATCAGCTGGNNS麗SNNSNNSNNS麗SNNSCGATATTACCGCATCACT-3，(SEQIDNO:206)FnCD:5，-AGGCACAGTGAACTCCTGGACAGGGCTATTGCCTCCTGTTTCGCCGTAAGTGATGCGGTAATATCG-3，(SEQIDNO:207)FnDE:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCT麗SNNS麗S麗SACAGCTACCATCAGCGGC畫3，(SEQIDNO:208)TTTAAGGCCGCTGATGGTAGCTGT-3，(SEQIDNO:209)FnFG6:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTNNSNNS麗S麗SNNS麗SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:210)以產生具有6個隨機氨基酸的FG環(huán)FnFG8:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTNNSNNSNNS麗SNNSNNS麗S麗SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:211)以產生具有8個隨機氨基酸的FG環(huán)FnFG10:5'-ACTGTGTATGCTGTCACT麗S麗S麗SNNS麗S麗S麗S麗S麗S麗SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:212)以產生具有10個隨機氨基酸的FG環(huán)FnFG12:5，-ACTGTGTATGCTGTCACT麗S麗S麗S麗S麗S麗SNNS麗SNNS麗SNNSNNSCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:213)以產生具有12個隨機氨基酸的FG環(huán)FnFG14:5，畫ACTGTGTATGCTGTCACTNNS麗S麗S麗S麗S麗S.NNSNNS麗S麗S麗S麗S麗S麗SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:214)以產生具有14個隨機氨基酸的FG環(huán)FnG:5，-TTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGCGGTAATTAATGGAAATTGG-3，(SEQIDNO:215)GTCGTCGTCCTTGTA-3，(SEQIDNO:216)218C04BC:5,-AGCCTGCTGATCAGCTGGTCCCCGTACCTGCGCGTCGCCCGATATTACCGCATCACT-3'(SEQIDNO:217)218C04DE:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCTTCCTCCGCCCGCACAGCTACCATCAGCGGC-3，(SEQIDNO:218)89218C04FG:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTCCGTCCAACATCATCGGCCGTCACTATGGCCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:219)FnB:5，-AGCCTGCTGATCAGCTGG-3，(SEQIDNO:220)FnD:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCT-3，(SEQIDNO:221)FnF:5，-ACTGTGTATGCTGTCACT-3，(SEQIDNO:222)338A06BC:AGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGCGCGTCTGAAAGTTGCGCGATATTACCGCATCACT(SEQIDNO:223)338A06DE:CAGGAGTTCACTGTGCCTAAAAACGTTTACACAGCTACCATCAGCGGC(SEQIDNO:224)一級文庫構建使用KOD聚合酶(EMDBiosciences,SanDiego,CA),通過上文所列交疊的合成寡核普酸的延伸來構建多樣性文庫。在這些寡核苷酸表述中，"N"代表A、C、G和T的混合物；而"S，，代表C和G的混合物。環(huán)的定義與先前所述的那些相同(Xu等，2002)。通過50pmo1FnBC與lOOpmolFnCD在補充有l(wèi)MBine和3。/。DMSO的10(^1KOD反應中的延伸來構建BC環(huán)。該反應進行10個溫度循環(huán)30s94°C，30s52。C和lmin68°C，以確保片段的完全延伸。使用200pmolFnDE與lOOpmolFnEF(用于DE環(huán))或者100pmo1FnFG10與200pmo1FnG(用于FG環(huán))，以相似的方式構建DE和FG環(huán)。在這三個環(huán)的延伸后，將DE和FG環(huán)組合，并一起再延伸10個溫度循環(huán)30s94°C，30s52。C和lmin68。C。以相同的方式用1OOpmolFnAB延伸BC環(huán)。將DE/FG混合物和BC環(huán)均用新鮮的KOD試劑稀釋10倍并分別用FLAG和T7TMV延伸10個溫度循環(huán)30s94。C,30s52。C和lmin68。C。最后，將各片段組合并一起延伸10個溫度循環(huán)30s94。C,30s52。C和lmin68。C。這產生了具有BC環(huán)中的7個隨機氨基酸、DE環(huán)中的4個隨機氨基酸、和FG環(huán)中的10個隨機氨基酸的文庫。通過使用寡核苷酸FnFG6、FnFG8、FnFG12或FnFG14代替FnFG10構建了具有不同F(xiàn)G環(huán)長度的別的文庫。將包含長度介于6個和14個氨基酸之間的FG環(huán)的文庫組合以產生長度可變的FG文庫。自克隆218C04構建單環(huán)隨機化文庫構建了三個文庫，其中用隨機序列替換單環(huán)。這些文庫是如上所述用KOD聚合酶通過交疊延伸在DNA水平構建的，只是三個環(huán)中兩個的隨機序列用與克隆218C04對應的固定序列替換。BC環(huán)中的固定序列由寡核苷酸90218C04BC提供，DE環(huán)中的固定序列由寡核香酸218C04DE提供，而FG環(huán)中的固定序列由寡核苷酸218C04FG提供。在文庫構建過程中用這些寡核苷酸替換對應的隨4幾寡核苷酸FnBC、FnDE、或FnFGlO。其中來自218C04的BC環(huán)用隨機氨基酸替換的文庫是通過裝配如上所述寡核苷酸T7TMV+FnAB+FnBC+FnCD+218C04DE+FnEF+218C04FG+FnG+FLAG構建的。其中來自克隆218C04的DE環(huán)用隨機氨基酸替換的文庫是通過裝配寡核香酸T7TMV+FnAB+218C04BC+FnCD+FnDE+FnEF+218C04FG+FnG+FLAG構建的。其中來自克隆218C04的FG環(huán)用隨機氨基酸替換的文庫是通過裝配寡核苦酸T7TMV+FnAB+218C04BC+FnCD+218C04DE+FnEF+FnFGlO+FnG+FLAG構建的。自克隆218C04構建三環(huán)隨機化文庫如上所述將自克隆218C04衍生的三個單環(huán)文庫進行PROfbsion選擇。每個文庫中幸存克隆包含2個來自親本克隆的環(huán)和1個來自隨機序列(其與每種基于纖連蛋白的支架蛋白的結合相容)的環(huán)。-使用結合周圍支架區(qū)的寡核苷酸引物擴增這三個隨機環(huán)(每個文庫一個)。使用寡核苷酸引物FnB和FnCD自包含可變BC環(huán)的文庫擴增BC環(huán)。使用寡核苷酸引物FnD和FnEF自包含可變DE環(huán)的文庫擴增DE環(huán)。使用寡核苷酸引物FnF和FnG自包含可變FG環(huán)的文庫擴增FG環(huán)。通過瓊脂糖凝膠電泳純化這三個切出的環(huán)，以等比例混合，并先用引物FnAB和FnG后用T7TMV和FLAG通過KOD聚合酶擴增。自克隆338A06構建單環(huán)隨機FG文庫構建了其中克隆338A06的FG環(huán)用6個隨機氨基酸替換的文庫。使用KOD聚合酶來交疊延伸如上所述寡核苷酸T7TMV+FnAB+338A06BC+FnCD+338A06DE+FnEF+FnFG6+FnG+FLAG。通過寡核苷酸338A06BC和338A06DE引入與克隆338A06對應的環(huán)序列，并通過寡核苷酸FnFG6引入隨機6氨基酸FG環(huán)。RNA-蛋白質融合物生成基本上如Xu等，2002，Kurz等，Nuc.AcidRes.28:83,2000所述將雙鏈DNA文庫轉變成RNA-蛋白質融合物(PROflision)。簡言之，使用體外轉錄試劑盒(MEGAscriptTM,Ambion,Austin,Tex)轉錄DNA文庫，并通過NAP-5柱(GEHealthcare)上的大小排阻層析將所得RNA脫鹽。通過在200pl含150mMNaCl,10mMTris-HCl(pH8)和1.5倍過量的含嘌呤霉素接頭(5，-PsouagcggaugcXXXXXXCCPu-3，(Pu=嘌呤霉素，Pso=C6-補骨脂素，u,a，g,c=2'-OMe-RNA,X二9-原子PEG間隔物))的溶液中以314nM輻射20分鐘來交聯(lián)2nmo1認A。然后使mRNA-噤呤霉素分子在3ml家兔網織紅細胞溶胞物(Ambion,Austin,Tex)中在存在35S標記的曱硫氨酸時翻譯。使用寡聚dT纖維素(GEHealthcare)純化所得mRNA-蛋白質融合物，并使用SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)和2nmol引物FLAG依照制造商的說明書逆轉錄。通過M2Flag瓊脂糖(Sigma,StLouis,MO)純化cDNA/mRNA-蛋白質融合物并通過測量所摻入的35S曱硫氨酸來量化。這給出了純化后的大約1012個全長基于纖連蛋白的支架蛋白的文庫，使用引物T7TMV和FLAG通過PCR擴增，供后續(xù)PROfUsion實驗用。對IGF-IR的結合的親和選擇將如上所述制備的mRNA-蛋白質融合物文庫與鏈霉親合素包被的磁珠(M280Streptavidin，Invitrogen)—起溫育以除去結合鏈霉親合素的基于纖連蛋白的支架蛋白。在磁體上分離珠，收集未結合的級分并添加至含0.05%Tween20和lmg/mlBSA(Ambion)的PBS中的100nM生物素化IGF-IR。30分鐘后，在鏈霉親合素包被的磁珠上捕捉所結合的基于纖連蛋白的支架蛋白，并使用Kingfisher磁性粒子處理儀(ThermoElectron,Waltham，MA)清洗6次。將cDNA在100mMKOH中洗脫，用100mMTris-HCl中和，并通過PCR擴增以生成結合IGF-IR的分子得到富集的第二代文庫。將擴增、mRNA-蛋白質融合物的合成、和親和選擇這一連續(xù)過程實施總共5次，并通過定量PCR監(jiān)測所結合的分子的數(shù)目。擴增第4輪和第5輪后得到的基于纖連蛋白的支架蛋白群，并通過重組(InFusionTM,Clontech,MountainView,CA)連接入包含T7RNA聚合物和框內HiS6標簽的大腸桿菌表達載體中。將連接混合物轉化入大腸桿菌菌抹BL21(DE3)pLysS(Invitrogen),該菌抹在用IPTG誘導后表達T7RNA聚合酶，由此給出誘導型蛋白質表達。含3個隨機環(huán)的克隆218C04的優(yōu)化如上所述將三環(huán)隨機化218C04文庫進行多輪擴增、mRNA-蛋白質融合物的合成、和親和選4奪。對于第l輪，將IGF-IR固定化在環(huán)氧活化的珠上以避免選擇結合鏈霉親合素的肽。此后使用遞減濃度的生物素化IGF-IR以選擇最高親和力結合物。自第2輪起，還包括濃度為lpM的非生物素化胰島素受體(IR)，起IR結合的負選擇的作用。四輪后，將所得基于纖連蛋白的支架蛋白群克隆入大腸桿菌，供如上所述分析用。含6氨基酸隨機FG環(huán)的克隆338A06的優(yōu)化如上所述將DNA文庫轉變成mRNA-蛋白質融合物以給出約1OOO個拷貝的每種FG環(huán)序列。如上所述實施擴增、mRNA-蛋白質融合物形成和親和選擇的PROfiision循環(huán)。第l輪中生物素化IGF-IR的濃度為100nM,但是這在第2輪中降至0,8nM,在第3輪中降至0.4nM。所選擇的目標濃度使得結合至IGF-IR的mRNA-蛋白質融合物的百分比在每種情況中小于0.1。/。，如定量PCR所測量的。通過這種方法，具有改善的親和力的基于纖連蛋白的支架蛋白與作為整體的群體相比會具有優(yōu)勢。針對IGF-IR的竟爭性ELISA:將MaxiSorpTM板(NuncInternational,Rochester,NY)用PBS中的30nMIGF-IR于4。C包被過夜，接著在OptEIA緩沖液(BDbiosciences,SanDiego,CA)中于室溫封閉3小時。使純化后的基于纖連蛋白的支架蛋白在OptEIA緩沖液中以范圍為50pM-1pM的濃度于室溫結合每個孔l小時。在PBST中清洗以除去未結合的基于纖連蛋白的支架蛋白后，添加10nM生物素化IGF-I(Upstate,Temecula，CA)于室溫1小時以結合至未被占據的IGF-IR。通過用PBST清洗除去過量的配體，并用鏈霉親合素-HRP(Pierce,Rockford，IL)使用TMB檢測試劑(BDbiosciences)依照制造商的說明書檢測所結合的配體。針對IGF-IR的直接結合ELISA:將MaxiSorpTM板(NuncInternational,Rochester,NY)用PBS中的10nMIGF-IR于4。C包被過夜，接著在PBS-酪蛋白緩沖液(Pierce)中于室溫封閉3小時。使純化后的基于纖連蛋白的支架蛋白在酪蛋白緩沖液中以5nM的濃度于室溫結合每個孔l小時。用PBST清洗板，并向每個孔添加100)ilHis-HRP探針(Pierce)的l:4000稀釋液，于室溫溫育15分鐘。將孔用PBST清洗5次，并用TMB檢測試劑(BDbiosciences)依照制造商的說明書檢測所結合的HRP。進一步使用范圍為30pmo1-330nM的基于纖連蛋白的支架蛋白濃度梯度分析在此單點測定法中顯示出結合的克隆。高通量蛋白質生成(HTPP):將所選擇的結合物克隆入pDEST-14載體中并轉化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞中，以24孔格式接種5ml含50jag/mL羧千青霉素和3493Mg/mLchloromphenicol的LB培養(yǎng)基并于37。C培養(yǎng)過夜。制備新鮮的5mlLB培養(yǎng)基(50昭/mL羧千青霉素和34嗎/mLchloromphenicol)培養(yǎng)物供誘導型表達用，即自過夜培養(yǎng)物吸出200pl并分配入適宜的孔。將培養(yǎng)物于37。C培養(yǎng)直至A6。00.6-1.0。與lmM異丙基-P-硫代半乳糖苷(IPTG)—起溫育后，將培養(yǎng)物于30。C再培養(yǎng)4小時，并通過于4。C以3220g離心30分鐘來收獲。將細胞沉淀物冷凍于-80。C。通過重懸于450pl裂解緩沖液(50mMNaH2P04，0.5MNaCl，lxCompleteTM蛋白酶抑制劑雞尾酒-不含EDTA(Roche),lmMPMSF，10mMCHAPS，40mM咪唑，lmg/ml溶菌酶，30ug/mlDNA酶，2ug/mlaprotonin,pH8.0)并于室溫搖動l小時來裂解細胞沉淀物(以24孔格式)。將溶胞物澄清并再次設置成96孔格式，即轉移入配有96孔650pl捕捉板的96孔WhatmanGF/DUnifilter并以200g離心5分鐘。將澄清后的溶胞物轉移至經平tf緩沖液(50mMNaH2P04,0.5MNaCl,10mMCHAPS,40mM咪唑，pH8.0)平衡的96孔Ni螯合板并溫育5分鐘。通過真空除去未結合的物質。將樹脂用清洗緩沖液l(50mMNaH2P04，0.5MNaCl，5mMCHAPS,40mM咪唑，pH8.0)清洗2x0.3ml/孔，通過真空除去每次清洗。接著，將樹脂用PBS清洗3x0.3ml/孔，通過真空除去每次清洗步驟。在洗脫前，將每個孔用50|11洗脫緩沖液(？88+20mMEDTA)清洗，溫育5分鐘，并通過真空棄去此清洗。通過將另外的100ul洗脫緩沖液應用于每個孔來洗脫蛋白質。于室溫溫育30分鐘后，將板以200g離心5分鐘，并在有5(al0.5MMgCl2附著至Ni板底部的96孔捕捉板中收集所洗脫的蛋白質。使用Bradford測定法量化所洗脫的蛋白質，以BSA作為蛋白質才示準品0可溶性基于纖連蛋白的支架蛋白結合物的中等規(guī)模表達和純化為了表達，將所選擇的克隆(后面有His6標簽)克隆入pDEST-14載體并在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞中表達。用20ml接種物培養(yǎng)物(自單個涂布菌落產生的)接種1升含50pg/mL羧芐青霉素和34嗎/mLchloramphenicol的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物于37。cf培養(yǎng)直至A6。。0.6-1.0。用lmM異丙基-卩-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后，將培養(yǎng)物于30。C再培養(yǎng)4小時并通過于4。C以>10,000g離心30分鐘來收獲。將細胞沉淀物冷凍于-80。C。使用Ultra-turrax勻漿儀(IKAworks)在冰上將細胞沉淀物重懸于25mL裂解緩沖液(20mMNaH2P04,0.5MNaCl,lxCompleteTM蛋白酶抑制劑雞尾酒-不含EDTA(Roche),lmMPMSF,pH7.4)。使用M-110S型微流化儀(Microfluidics)通過高壓(>18,000psi)勻漿來實現(xiàn)細胞裂解。通過于4。C以23，300g離心30分鐘來分離可溶性級分。經0.45pm濾器使上清液澄清。將澄清后的溶胞物(lysate)加載到用20mMNaH2P04,0.5MNaCl,pH7.4預平衡的HisTrap柱(GE)上。然后用25個柱體積的20mMNaH2P04，0.5MNaCl,pH7.4,接著用20個柱體積的20mMNaH2P04，0.5MNaCl,25mM咪唑pH7.4,再接著用35個柱體積的20mMNaH2P04,0.5MNaCl,40mM咪唑pH7.4洗柱。用15個柱體積的20mMNaH2P04,0.5MNaCl,500mM咪唑pH7.4洗脫蛋白質，根據A280吸光度合并級分，并針對lxPBS或50mMNaOAc;150mMNaCl;pH4.5透析。通過0.22pm過濾除去任何沉淀物。抗IGF1R纖連蛋白支架的PEG化經馬來酰亞胺化學用對C型纖連蛋白支架2倍過量的PEG-40-kDa(NOFCorporation)來制備纖連蛋白支架-PEG40分子。讓反應于室溫進行2.5小時。通過陽離子交換層析(SP-H汀rap;GE)將游離PEG-40與纖連蛋白支架-PEG-40分開。將反應混合物用20mMNaH2PO4,pH6.71:10稀釋，并應用于用平衡緩沖液(20mMNaH2P04,10mMNaCl,pH6.7)預平衡的SP-H汀rap柱，用平衡緩沖液清洗，并用20mMNaH2PO4,0.5MNaCl,pH6.7洗脫。根據SDS-PAGE分析合并所洗脫的級分。經G25層析(GE)將SP合并洗脫液交換緩沖液入PBS。經馬來酰亞胺化學用對PEG-20-kDa(NOFCorporation)2倍過量的純化的纖連蛋白支架-C來制備PEG20-纖連蛋白支架-PEG20分子。讓反應于室溫進行1小時。通過20mMNaH2P04,10mMNaCl，pH6.7緩沖液中的SEC層析(Superose6;GE)將未PEG化的纖連蛋白支架與PEG20-纖連蛋白支架-PEG20分開。合并含有PEG20-纖連蛋白支架-PEG20的級分并進一步純化以除去單PEG化的纖連蛋白支架。這是通過陽離子交換層析(SP;GE)來實現(xiàn)的。將SP-HiTrap柱用緩沖液A(20mMNaH2P04,10mMNaCl,pH6.7)預平衡，應用SEC洗脫液，然后將柱用緩沖液A清洗，再然后運行5個柱體積的0-10%緩沖液B(20mMNaH2P04，1.0MNaCl，pH6.7)梯度并再保持5個柱體積。通過50%緩沖液B的洗脫自SP柱洗脫PEG20-纖連蛋白支架-PEG20。根據A280合并級分并通過G25層析(GE)交換緩沖液入PBS。IGF-IR-PEG-VEGFR2結合物的生成在微量天平上稱量PEG20并在20mM磷酸鈉/10mMNaClpH6.7中溶95解至100mg/ml(5mM)。將PEG溶液以5:1的摩爾比例(PEG:蛋白質)添加至克隆385A08(SEQIDNO:203)。將反應于室溫帶混合的溫育至少l小時。為了將385A08-PEG20與未偶聯(lián)的PEG、Bis-385A08、未PEG化的385A08單體和385A08二硫化物連接的二聚體分開，將PEG-蛋白質反應加載到用20mM磷酸鈉/10mMNaClpH6.7(緩沖液A)平衡的HiTrapSP陽離子交換柱上。洗脫緩沖液(緩沖液B)是20mM磷酸鈉/1.0MNaClpH6.7。10%B(100mMNaCl)等度洗脫分離了385A08-PEG20種類，將其用于與VEGFR2特異性結合物(SEQIDNO:128)的反應。將VEGFR2特異性結合物添加至385A08-PEG20-形成了385A08-PEG20-VEGFR2特異性結合物異二聚體。實施大小排阻層析將未偶聯(lián)的單體和二聚體VEGFR2特異性結合物與385A08-PEG20-VEGFR2特異性結合物異二聚體分開。用20mM4f酸鈉/10mMNaClpH6.7平衡Superdex200柱。以1.0ml/min流速應用將385A08-PEG20力口上VEGFR2特異性結合物反應混合物。合并與385A08-PEG20-VEGFR2特異性結合物對應的級分，作為最終的產物?？扇苄曰诶w連蛋白的支架蛋白的BIAcore分析使用BIAcore2000或3000生物傳感器(PharmaciaBiosensor)測量基于纖連蛋白的支架蛋白結合蛋白對靶物的結合動力學。利用IGF-IR-Fc融合物開發(fā)了捕捉測定法。類似的試劑已經記載于Forbes等2002,EuropeanJ.Biochemistry,269,961-968。將人IGF-IR的胞外域(aal-932)克隆入含有人IgGl鉸鏈和恒定域的哺乳動物表達載體。該質粒的瞬時轉染產生了融合蛋白IGF-IR-Fc，隨后通過蛋白A層析純化并通過胺偶聯(lián)捕捉到生物傳感器CM5芯片上固定化的蛋白A上。動力學分析牽涉將IGF-IR-Fc捕捉到蛋白A上，接著在溶液中注入基于纖連蛋白的支架蛋白，并用甘氨酸pH2.0再生蛋白A表面。獲得每個濃度的傳感圖并使用程序Biaevaluation，BIAEvaluation2.0(BIAcore)來評估，以測定速率常數(shù)ka(k加)和kd(koff)。自速率常數(shù)koff/k。n的比值計算解離常數(shù)Ko。典型的是，對純化的基于纖連蛋白的支架蛋白的一系列濃度(2uM至0uM)評估對蛋白A捕捉的人IGF-IR-Fc融合蛋白的結合。對于測定對人胰島素受體的結合的實驗，遵循Biacore(Uppsala,Sweden)推薦的標準規(guī)程通過胺基團連接將重組人胰島素受體(IR)和重組人VEGF-R2-Fc直接偶聯(lián)至CM5生物傳感器芯片。簡言之，在流動槽2和3上，將在乙酸鹽4.5中稀釋的60ug/mLIR偶聯(lián)/固定化至8300RU的水平，并將在乙96酸鹽5.0中稀釋的11.9ug/mLVEGF-R2-Fc固定化至9700RU的水平。在FC1上制備空白參照。通過扣除對空白參照流動槽1觀察到的結合來計算IR或VEGF-R2-Fc的特異性結合。將基于纖連蛋白的支架蛋白在HBS-EP(10mMHepes,150mMNaCl,3mMEDTA，0.05%表面活性劑P20)中稀釋至10uM，并于25。C在流動槽上以20uL/min注入3分鐘，觀察10分鐘里的解離情況。差示掃描量熱法實施中等規(guī)模克隆的差示掃描量熱法(DSC)分析以測定熱穩(wěn)定性。通過在3個大氣壓下以每分鐘1度的速率將溫度自5。C上升至95。C,在N-DSCII量熱計(CalorimetrySciencesCorp)中掃描適宜克隆的1mg/ml溶液。使用Orgin軟件(OrginLabCorp)與適宜緩沖液的對照運行相比地分析數(shù)據。大小排阻層析在Agilent1100HPLC系統(tǒng)上使用TSKgelSuperSW2000柱(TOSOHBiosciences,LLC),4.6mmx30cm實施大小排阻層析(SEC)，伴有A214nm和A280nm的UV檢測和熒光檢測(激發(fā)=280nm,發(fā)射=350nm)。以IOOnL/min流速采用緩沖液100mM硫酸鈉，100mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH6.8。以大約100(ig/mL的濃度分別注入樣品(每種0.1-1嗎)。使用凝膠過濾標準品(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)來進行分子量校準。IGF-1R纖連蛋白支架克隆的SECMALLS分析在配備有Waters2487UV檢測儀、使用Superdex200柱(GEHealthcare)的WatersBreezeHPLC系統(tǒng)上實施大小排阻層析(SEC)，流動相為以0.6ml/min流速應用的100mM碌b酸鈉，lOOmM磷酸鈉，150mM氯化鈉pH6.8。將樣品用流動相稀釋至大約l.Omg/ml并注入50(al。使用在UV;險測儀之后垂直聯(lián)機的(plumbedin-line)miniDAWN光散射檢測儀(WyattTechnologyCorporation)和OptilabDSP差示折光儀(WyattTechnologyCorporation)實施多角度激光散射(MALLS)分析。使用AstraV5.1.9.1版軟件(WyattTechnologiesCorporation)實施對光散射數(shù)據的分析。為了通過280nm吸光度計算基于纖連蛋白的支架蛋白的濃度，使用基于氨基酸序列的理論摩爾消光系數(shù)。對于通過折光率的濃度測定，使用0.185mL/g的估計比折光率增量(dn/dc)。RP-HPLC層析使用在Agilent1100HPLC系統(tǒng)上加熱至60°C的C4聚合物柱#259VHP5415(Vydac),4,6mmx15cm實施反相HPLC(RP-HPLC),伴有A214nm和A280nm的UV檢測和焚光檢測(激發(fā)=280nm,發(fā)射=350nm)。溶劑A由含0.01。/。TFA的MilHQ水組成，溶劑B是含0.01。/。TFA的100。/。HPLC級乙腈。釆用1mL/min的流速。洗脫方案組成如下10分鐘10。/。B的平衡體積，接著是30分鐘里升高至50。/。B的線性梯度。在這些條件下，基于纖連蛋白的支架蛋白在總運行時間的大約25-30分鐘時洗脫。MALDITOF質譜使用VoyagerDEPRO質譜儀(AppliedBiosystems)通過基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析基于纖連蛋白的支架蛋白(圖14)。將樣品用0.1%TFA稀釋至大約l.Omg/ml。將大約12!il樣品加載到C4ZipTip(MilliporeCorporation)上并用0.1%三氟乙酸(TFA)清洗以除去鹽和污染物。使用2pl芥子酸基質(70%乙腈，0.1。/oTFA中10mg/ml)將樣品直接自ZipTip洗脫到目標板上。使用質量已知的兩種蛋白質實施儀器的標定細胞色素C(12361.96Da)和脫鐵卟啉肌紅蛋白(16952.27Da),在芥子酸中制備5jnM的終濃度并點到板上。以如下儀器設置獲取光譜加速電壓25000V,柵極電壓(GridVoltage)91%，導線(GuideWire)0.1%,提取延遲時間400nsec，激光強度3824。通過應用基線校正和高斯平滑算法(濾器寬度值為9),在DataExplorer4.5版(AppliedBiosystems)中力口工原譜。細胞有絲分裂測定法將人胰腺腺癌細胞系BxPC-3(ATCC,Manassas,VA)以2500個細胞每孔的濃度在含10。/o胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)的RPMI1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)中分配到96孔板中。次日，在由含0.1%BSA(Sigma，St.Louis,MO)的RPMI1640組成的饑餓培養(yǎng)基中清洗細胞。將清洗后的細胞在含各種濃度每種IGF-IR拮抗劑的饑餓培養(yǎng)基中預溫育4小時。4小時預溫育后，將細胞暴露于25ng/mL的IGF-I并于37。C,5%C02溫育24小時。對于最后4小時溫育，將細胞暴露于[3司-胸苷(0.25(iCi/孔；PerkinElmer，Wellesley，MA)。溫育期后，將細胞在PBS中清洗，在100jiL由0.P/。SDS+0.5NNaOH組成的緩沖液中裂解，并在TopCountNXT閃爍計數(shù)器(PerkinElmer,Wellesley,MA)上計H。4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分卄斤數(shù)據?；诩毎氖荏w阻斷測定法將人乳腺腺癌細胞系MCF-7(ATCC,Manassas,VA)以50,000個細胞每孔的濃度在含10。/。胎牛血清(Hyclone，Logan,U丁)的RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad,CA)中分配到24孔板中。次日，在由含0.1%BSA(Sigma，St.Louis,MO)的RPMI1640組成的結合緩沖液中清洗細胞，然后在200^L含IGF-IR竟爭物的結合緩沖液中在冰上預溫育30分鐘。預溫育期后，將等同于大約60000計數(shù)每分鐘的40pM[125I]-IGF-I(PerkinElmer,Wellesley,MA)添加至每個孔，并在水上溫和攪動地再溫育3小時。然后用含0.1%BSA的水冷PBS清洗孔。將細胞用500pL由0.1。/。SDS+0.5NNaOH組成的緩沖液裂解。使用Wallac1470伽馬計數(shù)器(PerkinElmer,Wellesley,MA)測量溶胞物的放射性，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析數(shù)據。NCI-H929細胞增殖測定法將人漿細胞瘤細胞系NCI-H929(ATCC，Manassas,VA)以10000或25000個細胞每孔的濃度在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、含各種濃度IGF-IR拮抗劑的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中分配到96孔板中。讓細胞于37。C，5。/。C02增殖72小時。增殖期后，使細胞暴露于20pL細胞滴定96水性增殖試劑(Promega，Madison,WI)并再溫育4小時。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上測量490nm吸光度，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得數(shù)據。32D:IGF-IR細胞增殖測定法在96孔板中在含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中在存在IOOng/mL人IGF-I(R&DSystems,Minneapolis,MN)和IGF-IR拮抗劑時接種細胞(104)。讓細胞于37。C，5%C02增殖72小時。增殖期后，使細胞暴露于細胞滴定96水性增殖試劑(Promega,Madison,WI)并再溫育4小時。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上測量490nm吸光度，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得數(shù)據。Ba/F3:VEGFR2細胞增殖測定法將鼠IL-3依賴性原B(pro-B)細胞系Ba/F3改造成過表達嵌合VEGR2(胞外域)/EpoR(胞內域)，由此成為VEGF依賴性細胞系。在96孔板中在含10%胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中在存在VEGFR2拮抗劑時接種BaF3:VEGFR2細胞(2.5x104)。讓細胞于37。C,5%C02增殖72小時。增殖期后，使細胞暴露于細胞滴定96水性增殖試劑(Promega,Madison，WI)并再溫育4小時。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,99Sunnyvale,CA)上測量490吸光度，并4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得數(shù)據。IGF-IR-HAS綴合物生成將摩爾過量的BM(PEO)2添加至克隆385A08(SEQIDNO:203)。通過陽離子交換層析分離385A08-BM(PEO)2。將具有游離硫氫基的重組人血清清蛋白添加至385A08-BM(PEO)2以形成HSA-385A08。通過陰離子和陽離子交換層析進一步純化綴合物。IGF-IR-Fc融合物生成將385A08(SEQIDNO:226)(以下劃線標示)的羧基末端與Fc片段(Fc鉸鏈-CH2-CH3)(以粗體標示)的氨基末端相連接。將間隔物(以小寫字母標示)置于二者之間以使空間位阻的風險最小化。將表達載體設計成容許該分子在畢赤氏酵母細胞中表達，這比傳統(tǒng)的哺乳動物細胞方法更快。表達載體還包含a因子信號肽(以斜體標示)以能夠在畢赤氏酵母細胞中表達的過程中分泌。此信號肽在分泌時被切除，不是最終純化的IGF-IR-Fc分子的一部分。下文給出了所得表達構建物的序列。MS7WM7丄層n7滯^U^E五GKSZ^腦^GVSDVPRDLEVVAATPTSLLIVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQdpgsEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF薩YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:247)將表達構建物線性化并轉化入3種畢赤氏酵母宿主細胞，即X-33、GS115和KM17H。在zeocin板上選擇轉化子并在2ml培養(yǎng)物中篩選IGF-IR-Fc表達。在搖瓶中以不同pH培養(yǎng)所選擇的克隆并通過蛋白A樹脂純化。在pH6.5-7.0觀察到表達。使用一個克隆的l升搖瓶在pH6.7來表達IGF-IR-DPGG-Ig并經由蛋白A和大小排阻來純化。圖28描繪了純化后的IGF-IR-Ig融合蛋白的SDSPAGE分析。正如能看到的，觀察到的質量是未還原樣品的大小的大約一半，正如對二硫化物相連接的完整IGF-IR-Ig所預期的。IGF-IR-HAS綴合物的體內腫瘤研究在棵鼠中繁殖腫瘤。對于人RH41異種移植物，每四周發(fā)生腫瘤傳代。為了功效測試，將人腫瘤異種移植物植入棵鼠。所有胂瘤傳代都是皮下的(sc)。在下述方面評估抗腫瘤活性a)痊愈和(對于鼠胂瘤模型)由治療組(T)相比于對照組(C)的相對中值存活時間(MST)(即。/。T/C值)反映的壽命增量；和b)通過計算T和C小鼠腫瘤生長到預定"目標"大小(對于所有所描述的sc腫瘤模型而言是lgm)的相對中值時間測定并以T-C值(以天計)表述的主要(primary)腫瘤生長抑制。痊愈小鼠的定義為在處理后超過10倍腫瘤體積倍增時間(TVDT)評估時其腫瘤檢測不到，或<35mg。胂瘤抑制/縮小的判據是符合21總體對數(shù)細胞殺傷(LCK)的主要腫瘤生長的統(tǒng)計學顯著延遲。采用下式來計算LCK:LCK=T-C/(3.32xTVDT),其中TVDT:對照腫瘤達到目標大小的中值時間(天)-對照腫瘤達到目標大小一半的中值時間(天)。某種化合物產生最大治療效果的劑量稱作最佳劑量(OD)。若治療組(通常8只小鼠)中有超過一例死亡可歸于藥物毒性，則認為是該治療過度毒性，在抗肺瘤活性的評估中不使用該數(shù)據。最大耐受劑量(MTD)定義為剛剛低于發(fā)生過量毒性(即超過一例死亡)的水平的劑量水平。若接受處理的小鼠在其腫瘤達到目標大小前死亡，則i人為它死于藥物毒性。4吏用Gehan的通用Wilcoxon檢驗(Gehan，Biometrika52:203-223，1965)來實施數(shù)據的統(tǒng)計學評估。385A08-Fc的Western印跡分析將Rh41人橫紋肌肉瘤細胞在存在0.3。/。BSA時血清奴/喊過夜；然后將它們在用IGF-I、IGF-II、或胰島素配體(50ng/ml)刺激5分鐘后于37。C暴露于385A08-Fc達l小時，之后裂解。將細胞在TTG緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.6，1%tritonX-100,5%甘油，0.15MNaCl，lmMEDTA,完全片劑，和石岸酸酶抑制劑雞尾酒)中裂解。使用BSA作為標準品，測定總細胞裂解物的蛋白質濃度。將來自每份溶胞物的等量蛋白質加載入凝膠的每個孔中。通過SDSPAGE將蛋白質分開，轉移至硝酸纖維素膜并在Odyssey封閉緩沖液(Li-CorBiosciences)中于4。C封閉過夜。用針對IGF-1R、Akt和MAPK的磷酸特異性抗體于室溫探查膜達2小時，然后在含0.1。/。Tween-20的TBS中清洗3次。清洗后，101將膜與熒光標記的二抗一起溫育。利用能夠同時和獨立檢測熒光信號的Odyssey紅外線成像系統(tǒng)(Li-CorBiosciences)實施蛋白質顯影。才艮據使用Li-CorBiosciences成像系統(tǒng)進行的密度測定掃描，通過比專交未處理才羊品相比于受處理樣品中的磷酸信號(針對用作加載對照的肌動蛋白或GAPDH進行標準化)來計算抑制效果。Rh41(人橫紋肌肉瘤)和H929(人多發(fā)性骨髓瘤)中的細胞增殖通過暴露于試劑72小時后摻入DNA的[3H]-胸苷來評估增殖。分別以3500和8000個細胞/孔的密度將Rh41細胞和H929分配入96孔微量滴定板并在24小時后將它們暴露于一定范圍的藥物濃度。于37。C溫育72小時后，將細胞用4pCi/ml[3H]胸苷(AmershamPharmaciaBiotech,UK)脈沖3小時，胰蛋白酶消化，收獲到UniFilter-96,GF/B板(PerkinElmer，Boston,MA)上并在TopCount.NXT(Packard,CT)上測量閃爍。結果表述成IC50,即將細胞增殖抑制達未處理對照細胞的50%所要求的藥物濃度。數(shù)據呈現(xiàn)了一式三^P分孔的平均值，并顯示了標準偏差。權利要求1.一種多肽，其包含第十纖連蛋白III型(10Fn3)域，其中所述10Fn3域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG；(ii)具有至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)，其具有相對于人10Fn3域的相應環(huán)的序列改變的氨基酸序列，且(iii)以約1μM或更小的解離常數(shù)結合人IGF-IR。2.權利要求l的多肽，其中所述"Fn3域以約10nM或更小的解離常數(shù)結合人IGF-IR。3.權利要求l的多肽，其中環(huán)BC和環(huán)FG具有相對于人^Fn3域的相應環(huán)的序列改變的氨基酸序列。4.權利要求l的多肽，其中所述"Fn3域包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列。5.權利要求l的多肽，其進一步包含一個或多個選自下組的藥動學(PK)模塊聚氣化烯模塊、人血清清蛋白結合蛋白、唾液酸、人血清清蛋白、運鐵蛋白、和Fc片段。6.權利要求5的多肽，其中所述PK模塊是聚氧化烯模塊且所述聚氧化烯模塊是聚乙二醇。7.權利要求l的多肽，其進一步包含選自下組的第二域小于約50kD的抗體模塊、脂籠蛋白的衍生物、四連蛋白的衍生物、avimer、錨蛋白的衍生物、和第二個第十纖連蛋白型III("Fn3)域，其中所述第二域結合人蛋白質，且其中所述第二個^Fn3域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、和環(huán)FG;(ii)具有至少一個選自環(huán)BC、DE、和FG的環(huán)，其具有相對于人"Fn3域的相應環(huán)的序列隨機化的氨基g吏序列，且(iii)'以約10nM或更小的解離常數(shù)結合不與人"0Fn3域結合的人蛋白質。8.權利要求7的多肽，其中所述第二域是第二個^Fn3域且包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列。9.權利要求7的多肽，其中所述第二域結合人IGF-IR。10.權利要求7的多肽，其中所述第二域結合人VEGFR2。11.權利要求7的多肽，其中所述第二域是第二個，n3域且包含SEQIDNO:126-183之任一的氨基酸序列。12.權利要求7的多肽，其中所述WFn3域和第二域經至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二醇模塊可操作相連接。13.前述權利要求任一項的多肽，其中所述多肽抑制IGF-I或IGF-II對IGF-IR的結合且在基于細胞的測定法中在亞IC50濃度不活化IGF-IR。14.權利要求l的多肽，其中所述"Fn3域是通過包含以下步驟的方法選擇的a)生成一群候選RNA分子，每種包含與人^Fn3域編碼序列不同的候選第十纖連蛋白III型^Fn3)域序列，所述RNA分子每種都包含與所述候選'Vn3域編碼序列可搡作相連接的翻譯起始序列和起始密碼子且每種都在3'端與核酸-。票呤霉素接頭可操作相連接；b)在體外翻譯所述候選WFn3域編碼序列以生成一群候選RNA-"Fn3融合物；c)使所述候選RNA-Fn3融合物群與IGF-IR接觸；并d)選擇如下RNA-"Fn3融合物，其蛋白質部分具有相對于所述人，n3對IGF-IR的結合親和力或特異性改變的對IGF-IR的結合親和力或特異性。15.—種藥學可接受組合物，其包含前述權利要求任一項的多肽，其中所述組合物基本上不含內毒素。全文摘要本發(fā)明提供了結合胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)的新蛋白質，以及其它重要蛋白質。本發(fā)明還提供了藥物制劑中的新蛋白質和此類蛋白質的衍生物，及其在診斷、研究和治療應用中的用途。本發(fā)明進一步提供了包含此類蛋白質的細胞、編碼此類蛋白質或其片段的多核苷酸、和包含編碼該新蛋白質的多核苷酸的載體。文檔編號C07K14/47GK101636410SQ200780049878公開日2010年1月27日申請日期2007年11月21日優(yōu)先權日2006年11月22日發(fā)明者帕特里克·蓋奇,戴維·法布里齊奧,約翰·門德萊因,雷·坎普豪森,馬丁·C·賴特申請人:雅達思,百時美-施貴寶研究與開發(fā)公司