專利名稱：：一株高光學(xué)純度d-乳酸生產(chǎn)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)d-乳酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌芽孢乳桿菌S/ora/acto6acz7/w";.Y2-8菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，屬于有機(jī)酸發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：乳酸(Lacticacid)又名a-羥基丙酸(a-Hydroxypropionicacid),是世界公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，根據(jù)其旋光性性質(zhì)可分為L-乳酸、D-乳酸和D，L-乳酸。隨著D-乳酸的系列新用途的開發(fā)，對D-乳酸的應(yīng)用和生產(chǎn)的研究也越來越受到人們的關(guān)注。目前，D-乳酸的用途主要表現(xiàn)在(1)D-乳酸是合成防除禾本科雜草的優(yōu)良除草劑一驃馬(PumaSuper)和新型廣譜高效除草劑一威霸的原料，同時(shí)也是二甲四氯丙酸、氟系除草劑等新型農(nóng)藥的原料；(2)由高光學(xué)純度(光學(xué)純度97。/。以上)D-乳酸與甲醇酯化合成的D-乳酸甲酯在醫(yī)藥、農(nóng)藥、溶劑的原料及其它手性化合物的合成前體及中間體；(3)用于生產(chǎn)聚乳酸聚乳酸將逐步替代現(xiàn)有的可降解性塑料，并具有與聚烯烴類相競爭的能力。到2010年，聚乳酸年需求量將突破100萬噸。乳酸經(jīng)脫水環(huán)化制得丙交酯，丙交酯經(jīng)開環(huán)聚合制得聚乳酸(PLA)。因?yàn)槿樗崾鞘中苑肿铀韵鄳?yīng)地，所合成的聚乳酸有聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。但是，PLLA的熔點(diǎn)較低及降解速度相對較慢卻成了限制其進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。最新研究顯示，PLLA和PDLA的共混復(fù)合物可以將聚乳酸的熔點(diǎn)從177"C提髙到225°C，調(diào)整PLLA和PDLA共混復(fù)合物中不同組分的比例可調(diào)控最終材料的降解速度，這為聚乳酸的應(yīng)用帶來了更廣闊的前景。而PDLA正是通過添加髙光學(xué)純D-乳酸聚合制備而成的。以上產(chǎn)品的巨大的巿場潛力催生了髙效高光學(xué)純D-乳酸生產(chǎn)研究的開展。直接利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)手性乳酸，與化學(xué)合成法、手性拆分法及酶轉(zhuǎn)化法相比，發(fā)酵法不僅可通過菌種選育或代謝調(diào)控而獲得光學(xué)純度的D-乳酸，而且發(fā)酵原料來源廣泛、生產(chǎn)成本低、可循環(huán)利用、環(huán)境友好，已成為全世界近80%的廠家生產(chǎn)手性乳酸采用的方法。1994年，Kosaki等人利用菊糖芽孢乳桿菌(S;ora/fl"o6fltc/〃w/""http://mwATCC15538)以葡萄糖為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵37h后，D-乳酸的最高產(chǎn)量達(dá)98g/L，光學(xué)純度達(dá)到99%;曰本達(dá)依賽爾(夕4七》)化學(xué)工業(yè)公司1997年巳擁有每年10噸光學(xué)純度97%以上的0-乳酸生產(chǎn)能力；2003年，RemediosYanez和AnaBelenMoldes等人以纖維素為原料，利用丄fl"o6ac說wscoow/orw!'cw&s;.to^weraATCC25600發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵時(shí)加入纖維素酶和p-葡萄糖苷酶，同時(shí)進(jìn)行纖維素的糖化和D-乳酸的發(fā)酵，在39'C,pH5.4的條件下發(fā)酵48h，D-乳酸產(chǎn)率達(dá)到0.5g七"七-1，對纖維素產(chǎn)率為0.89gD-乳酸/g纖維素，但D-乳酸產(chǎn)量較低；2004年，G.Bustos，A.B.Moldes和J丄.Alonso等人利用響應(yīng)面優(yōu)化法對丄0加^"7/""00^/07^發(fā)酵生產(chǎn)0-乳酸的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最終采用玉米漿5g/L,酵母裔3.6g/L和蛋白胨10g/L的培養(yǎng)基，發(fā)酵96h后得到D-乳酸58.9g/L;2006年，T.Tanak^M.Hoshina等人以脫月旨米糠(麩)為原料，禾!]用丄fl"o6a"7/twcte/6n/ecWsm6s,De/6rMec&z'IFO3202發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵時(shí)加入米糠、淀粉酶、纖維素酶同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵，最終0-乳酸的質(zhì)量產(chǎn)率可以達(dá)到對米糠28%和酶水解糖液78°/。，D-乳酸的光學(xué)純度為95%。國內(nèi)對D-乳酸生產(chǎn)菌和生產(chǎn)工藝公開和報(bào)道得較少。本研究室的丁子建等于2004首次報(bào)道利用芽孢乳桿菌(&oro/a"ok^7/^sp.)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝，發(fā)酵72小時(shí)后D-乳酸產(chǎn)量為40.7g/L,光學(xué)純度達(dá)96.04%，本工藝的產(chǎn)物光學(xué)純度較髙，但產(chǎn)量相對偏低；2006年，楊文革等報(bào)道了利用乳酸桿菌采用組合發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)D-乳酸的工藝，從葡萄糖出發(fā)，發(fā)酵2538小時(shí)，產(chǎn)酸可達(dá)75131g/L乳酸，光學(xué)純度達(dá)99%,但該工藝使用了組合發(fā)酵法，即發(fā)酵過程需按照有氧發(fā)酵、微氧發(fā)酵和最后的厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵三步驟分階段調(diào)控進(jìn)行，搡作和控制相對困難。因此，選育高光學(xué)純度的D-乳酸生產(chǎn)菌，以及開發(fā)搡作簡單、產(chǎn)酸效率高的D-乳酸發(fā)酵工藝是D-乳酸工業(yè)的發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一株優(yōu)良的D-乳酸生產(chǎn)菌株，以及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，使得該生產(chǎn)菌株所產(chǎn)的D-乳酸具有髙光學(xué)純度，且通過提供合適的發(fā)酵工藝條件，使得利用該生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝不僅簡單方便，而且原料易得，成本低廉，在保證產(chǎn)物高光學(xué)純度的基礎(chǔ)上達(dá)到較高的產(chǎn)酸能力。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明釆取以下技術(shù)方案一、髙光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌芽孢乳桿菌&ow/a"oZ)flc///isp.Y2-8菌株1、從土壤中篩選產(chǎn)D-乳酸原始菌株以葡萄糖高糖液體培養(yǎng)基對南京地區(qū)土壤樣品中的耐高糖〗敫生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，再通過高葡萄糖-溴甲酚綠顯色平板在厭氧培養(yǎng)條件下對耐高糖的產(chǎn)酸菌株進(jìn)行單離，挑選變色圈直徑大且變色速度快的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵研究，獲得一株D-乳酸同型發(fā)酵菌株，命名為5^ora/a"o6ad//jDX12,超低溫保藏備用。S/wratocto6flc//^DX12經(jīng)BIOLOG全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，表明該菌株與芽孢乳桿菌S/7ora/"cto6a"7/w相似度(SIM)為0.60,經(jīng)16SrDNA序列分析表明與該序列相似度高于99%的菌株均為S/wra/fl"o^c///w屬菌株，其中與菌株*0"0/^/0^"7/^/"w"m^ATCC15538相似度為99.8%，確定為芽孢乳桿菌的一新菌株。2、菌株Y2-8的選育方法采用低能離子注入法將D-乳酸同型發(fā)酵DX12菌株進(jìn)行誘變后，在pH試劑型平板上篩選，以出發(fā)菌變色圈為對照，以變色圈直徑大于出發(fā)菌株0.5cm為正向突變標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到18株產(chǎn)量正突變株；最后，對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，釆用C18柱以HPLC法對16株產(chǎn)量正突變株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量測定。經(jīng)傳代發(fā)酵試驗(yàn)，獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)D-乳酸菌株，命名為Sjwra/acfokicWiwsp.Y2-8。本發(fā)明對芽孢乳桿菌S/7ora/"ctoZw"7/wDX12的誘變突變株Y2-8的生物特征進(jìn)行了鑒定，對該菌的革蘭氏染色觀察表明該菌株為G+桿菌，有芽孢，大小為0.5nmx23nm。在平板培養(yǎng)基中生長36h后，菌落大小為1.52mm,生長溫度范圍是2542'C,最適溫度是37。C,生長pH是47.5,最適pH是6.0;其生理生化特性表現(xiàn)在，對過氧化氫酶反應(yīng)陰性，明膠不液化，不形成吲哚，不還原硝酸鹽，石蕊牛奶不變色。纖維醇、麥芽糖、D-蔗糖、甘露糖及a-D-乳糖利用結(jié)果為陽性，D-阿拉伯糖、D-半乳糖及檸檬酸利用結(jié)果為陰性，在兼性厭氧條件下生長。二、利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸，其特征在于在厭氧條件下進(jìn)行平板培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，以淀粉類糖化液為碳源，通過在發(fā)酵罐中通入惰性氣體的方式進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，使工藝過程全程厭氧進(jìn)行。(1)平板培養(yǎng)將芽孢乳桿菌Y2-8接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3040。C，培養(yǎng)時(shí)間2036h;平板培養(yǎng)基重量百分配比為葡萄糖1015%，酵母裔0.10.3%，無水乙酸鈉0.20.5%，無水硫酸鎂0.010.05%,磷酸二氫鉀0.10.3%，瓊月旨1.8%,水余量，pH7.0;(2)種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的芽孢乳桿菌Y2-8接種到種子培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3040。C,培養(yǎng)時(shí)間1218h。種子培養(yǎng)基所需的碳源包括濃度為2%5%的葡萄糖、玉米糖化液中的一種或兩者的混合物；種子培養(yǎng)基所需的氮源包括濃度為0.2%1.0%的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、麩皮的一種或多種的混合物；種子培養(yǎng)基中的無機(jī)離子重量百分配比為無水硫酸鎂0.010.05%,硫酸亞鐵0.0010.005%,硫酸錳0.0010.005%,碳酸鈣1.53%,水余量，pH7.0。種子培養(yǎng)階段通過23cm液體石蠟液封，或增大裝液量的同時(shí)降低轉(zhuǎn)速而實(shí)現(xiàn)厭氧培養(yǎng)；種子培養(yǎng)階段中可在搖瓶中添加玻璃珠，以增強(qiáng)傳質(zhì)效果。(3)發(fā)酵產(chǎn)酸將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵，直接以淀粉類糖化液為碳源，接種量為5%10%(v/v),發(fā)酵溫度304(TC，以總流速每升培養(yǎng)基0.62L/min量通入惰性氣體，采用中和劑將發(fā)酵體系pH控制在5.07.0，發(fā)酵72120h。發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基的碳源包括濃度為10%18%的葡萄糖、玉米糖化液中的一種或兩者的混合物；發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基的氮源包括濃度為0.2%2.0%的尿素、硫酸銨、氨水、酵母有、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、麩皮中的一種或多種的混合物；發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基中的無機(jī)離子重量百分配比為無水硫酸鎂0.010.1%,硫酸亞鐵0.0010.01%,硫酸錳0.0010.01%,水余量，pH7.0。發(fā)酵產(chǎn)酸所用的中和劑包括KOH、NaOH、Na2C03、CaC03、CaO、氨水、碳氨中的一種或多種的組合。本發(fā)明的有益效果在于提供了一株穩(wěn)定高產(chǎn)高光學(xué)純D-乳酸的菌株；而本發(fā)明利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，從平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)到發(fā)酵產(chǎn)酸一直保持厭氧條件，無需嚴(yán)格分步調(diào)控，搡作簡單；本發(fā)酵工藝的各步培養(yǎng)基成分易得，且配方簡單，生產(chǎn)成本較低；利用本發(fā)明的菌株和發(fā)酵工藝生產(chǎn)的D-乳酸光學(xué)純度高達(dá)99.1。/。，且發(fā)酵液中0-乳酸含量達(dá)9.1%16.5%，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的微生物分類命名為芽孢乳桿菌Spora/a"o6ac77/Msp.Y2-8,保藏曰期為2008年4月IO日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號:CCTCCNo:M208052。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l本實(shí)施例說明芽孢乳桿菌Y2-8的選育方法。1、從土壤中篩選產(chǎn)D-乳酸原始菌株以100g/L葡萄糖高糖液體培養(yǎng)基對南京地區(qū)土壤樣品中的耐高糖微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，再通過100g/L葡萄糖-溴甲酚綠顯色平板在厭氧培養(yǎng)條件下對耐高糖的產(chǎn)酸菌株進(jìn)行單離，挑選變色圈直徑大且變色速度快的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵研究。產(chǎn)物的光學(xué)純度檢測采用高效液相色譜手性固定相法進(jìn)行檢測，配位體交換柱型號為SumichiralCA5000，流動(dòng)相為lmM的CuS04溶液，紫外檢測波長為254nm。獲得一株D-乳酸菌株，命名為Spora/actokjc///^DX12,超低溫保藏備用。2、菌株Y2-8的選育方法為(1)低能離子注入誘變?nèi)捬跖囵B(yǎng)3天的Spora/a"o6acz7/wsDX12菌泥，用0.85%的生理鹽水制成菌懸液，于無菌空白培養(yǎng)皿制成菌膜后進(jìn)行離子注入。離子能量為10keV,注入劑量為0.40x1015、2.4x1015、4.4xl015、6.60xl015ions/cm2，注入時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為15s。(2)pH試劑型平板篩選用生理鹽水洗脫菌膜，將菌懸液涂布于150^葡萄糖-溴甲酚綠顯色平板后置于37'C厭氧培養(yǎng)。以出發(fā)菌變色圏為對照，以變色圈直徑大于出發(fā)菌株0.5cm為正向突變標(biāo)準(zhǔn)，共篩到16株產(chǎn)量正突變株。采用C18柱以HPLC法對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量測定，流動(dòng)相為2.5mM的NH4H2P04溶液，紫外檢測波長為230nm。產(chǎn)物的光學(xué)純度檢測釆用高效液相色譜手性固定相法進(jìn)行檢測，配位體交換柱型號為SumichiralCA5000,流動(dòng)相為1mM的CuS04溶液，紫外檢測波長為254nm。18株產(chǎn)量正突變株D-乳酸發(fā)酵結(jié)果如表1所示。表l產(chǎn)量正突變株D-乳酸定量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)經(jīng)傳代發(fā)酵試驗(yàn)考察遺傳穩(wěn)定性后，獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn)D-乳酸菌株，命名為Y2-8。菌株Y2-8傳代發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2菌株Y2-8的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化依次對初始發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)離子和中和劑的種類及濃度進(jìn)行優(yōu)化。菌株Y2-8在優(yōu)化后條件下獲得了16.5%乳酸發(fā)酵結(jié)果，D-乳酸光學(xué)純度達(dá)99.iy。。實(shí)施例2本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基葡萄糖10%,酵母膏0.2%，無水乙酸鈉0.2%，無水硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀0.2%,瓊脂1.8%,水余量，pH7.0;種子培養(yǎng)基葡萄糖2%,酵母奢0.3%,玉米漿0.4%,麩皮0.3%,無水硫酸鎂0.02%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鈣1.5%，水余量，pH7,0;發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10%,玉米漿1.5%，無水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30'C,培養(yǎng)時(shí)間36h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，加入10粒玻璃珠，并以23cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)12h后，當(dāng)種子液0066()1達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配制3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.06L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度30'C，以流加氨水的形式發(fā)酵體系pH控制在5.0,攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵96h,采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)9.1%,光學(xué)純度為99.03%。實(shí)施例3本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基葡萄糖12%,酵母膏0.1%，無水乙酸鈉0.3%,無水硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.3%,瓊脂1.8%,水余量，pH7.0;種子培養(yǎng)基葡萄糖5%,牛肉膏0.6%，無水硫酸鎂0.01%,硫酸亞鐵0.003%，硫酸錳0.005%,碳酸錦2%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液(葡萄糖計(jì))10%,酵母膏0.2%，無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C,培養(yǎng)時(shí)間30h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，以2-3cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度40。C,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時(shí)間18h,當(dāng)種子液OD66o，達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以7.5%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.06L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度4(TC,通過流加NaOH溶液使發(fā)酵體系pH控制在7.0,撹拌轉(zhuǎn)速250rpm，發(fā)酵72h，釆用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)9.3%，光學(xué)純度為98.8%。實(shí)施例4本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝，平板培養(yǎng)基葡萄糖15%,酵母裔0.3%，無水乙酸鈉0.5%，無水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%,瓊脂1.8%，水余量，pH7.0;種子培養(yǎng)基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%,酵母嗇0.3%,蛋白胨0.2%，無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.005%,硫酸錳0.003%,麩皮0.5%,碳酸錦3%，水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液(葡萄糖計(jì))10%,蛋白胨1.0%,無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鈞5%，水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度40'C,培養(yǎng)時(shí)間20h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37"C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間18h,當(dāng)種子液OD660nm達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.06L/min量通入氮?dú)猓l(fā)酵溫度37'C,pH控制在5.0,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵120h,釆用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)9.3。/。，光學(xué)純度為99%。實(shí)施例5本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基同實(shí)施例2。種子培養(yǎng)基葡萄糖3%,酵母膏0.2%,無水硫酸鎂0.02%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鉤1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液加部分葡萄糖至葡萄糖濃度達(dá)15%,牛肉膏1.2%,無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,氧化鈣6%,水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3(TC,培養(yǎng)時(shí)間36h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為120mL的種子培養(yǎng)基中，加入15粒玻璃珠，培養(yǎng)溫度37'C,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100rpm,培養(yǎng)時(shí)間18h,當(dāng)種子液OD660nm達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.06L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度37'C，通過流加NaOH使發(fā)酵體系pH控制在6.0，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，發(fā)酵120h,采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)13.6%,光學(xué)純度為99%。實(shí)施例6本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基:同實(shí)施例3。種子培養(yǎng)基玉米糖化液3%，玉米漿1.0%，無水硫酸鎂0.02%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鉤1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖15%，酵母膏1.0%，麩皮0.4%，無水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鈣4%，水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C,培養(yǎng)時(shí)間30h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，加入IO粒玻璃珠，并以2cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110rpm,培養(yǎng)時(shí)間13h,當(dāng)種子液OD66tan達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速lL/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度35'C，間歇性流加碳酸鈉溶液維持發(fā)酵體系pH控制在6.0,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵120h，采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)14.5%,光學(xué)純度為99.1%。實(shí)施例7本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基同實(shí)施例4。種子培養(yǎng)基玉米糖化液5%，麩皮1.0%，無水硫酸鎂0.02%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸錦1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液(葡萄糖計(jì))15%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%，硫酸銨0.4%,無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鈣4%,水佘量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度4(TC，培養(yǎng)時(shí)間20h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，以2cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110rpm，培養(yǎng)時(shí)間18h，當(dāng)種子液OD660nm達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.06L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度42'C,流加碳氨使發(fā)酵體系pH控制在5.0,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,發(fā)酵96h，采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)14.2%,光學(xué)純度為99.1%。實(shí)施例8本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基同實(shí)施例2。種子培養(yǎng)基玉米糖化液2%，蛋白胨0.6%,無水硫酸鎂0.02%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%，碳酸鉤1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖18%,酵母膏0.4%,牛肉奢0.4%,玉米漿0.4%,尿素0.4%,無水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30'C,培養(yǎng)時(shí)間36h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，以2cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間18h,當(dāng)種子液OD66o，達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.2L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度35'C，流加碳氨使發(fā)酵體系pH控制在6.0,攪拌轉(zhuǎn)速300ipm，發(fā)酵96h，采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)15.9%,光學(xué)純度為99.0%。實(shí)施例9本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基同實(shí)施例3。種子培養(yǎng)基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%，酵母膏0.3%，蛋白胨0.2%，無水硫酸鎂0.02%,硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,麩皮0.5%,碳酸鉤1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米糖化液(葡萄糖計(jì))18%,酵母奢0.5%，蛋白胨0.4%,麩皮0.7%，氨水0.4%,無水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,碳酸鉤5%,水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)時(shí)間30h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，加入IO粒玻璃珠，并以3cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間18h，當(dāng)種子液OD柳nm達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.2L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度37t:,流加碳酸鈉使發(fā)酵體系pH控制在5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,發(fā)酵120h，采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)15.8%,光學(xué)純度為99%。實(shí)施例10本實(shí)施例說明利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的工藝。平板培養(yǎng)基同實(shí)施例4。種子培養(yǎng)基葡萄糖和玉米糖化液混合液5%,酵母有0.3%,蛋白胨0.2%,無水硫酸鎂0.04%，硫酸亞鐵0.001%,硫酸錳0.001%,麩皮0.5%,碳酸錦1.5%,水余量，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖和玉米糖化液混合液(葡萄糖計(jì))18%，酵母奢0.6%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.4%,無水硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.001%，硫酸錳0.001%，碳酸鉤5%，水余量，pH7.0。將芽孢乳桿菌Y2-8接種到平板培養(yǎng)基中，置于厭氧條件下，培養(yǎng)溫度40'C，培養(yǎng)時(shí)間20h。將平板培養(yǎng)好的芽孢乳桿菌接種到裝液量為60mL的種子培養(yǎng)基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液體石蠟進(jìn)行液封后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120rpm,培養(yǎng)時(shí)間18h,當(dāng)種子液OD66(^達(dá)到5左右時(shí)即可轉(zhuǎn)接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。選用5.0L發(fā)酵罐，配置3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%接種量進(jìn)行接種，以總流速0.2L/min量通入氮?dú)?，發(fā)酵溫度37'C，流加氨水使發(fā)酵體系pH控制在6.0,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,發(fā)酵120h，采用液相色譜測定，發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)16.3%,光學(xué)純度為99.1%。權(quán)利要求1、一株高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌，分類命名為芽孢乳桿菌Sporolactobacillussp.Y2-8，其保藏登記號為CCTCCNoM208052。2、利用權(quán)利要求1所述芽孢乳桿菌印woto"o&ad〃wssp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸，其特征在于在厭氧條件下進(jìn)行平板培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，通過在發(fā)酵罐中通入惰性氣體的方式進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，使工藝過程全程厭氧進(jìn)行。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述芽孢乳桿菌S/wra/flc/o6flC77/wsp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于(1)平板培養(yǎng)將芽孢乳桿菌Y2-8接種至平板培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度3040°C,培養(yǎng)時(shí)間2036h;(2)種子培養(yǎng)將平板培養(yǎng)的芽孢乳桿菌Y2-8接種到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度304(TC,培養(yǎng)時(shí)間1218h;(3)發(fā)酵產(chǎn)酸將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵，直接以淀粉類糖化液為碳源，接種量為5%10%(v/v),發(fā)酵溫度3040。C,以總流速每升培養(yǎng)基0.6~2L/min量通入惰性氣體，釆用中和劑將發(fā)酵體系pH控制在5.07.0,發(fā)酵72120h。4、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌S戶ra/flcfo6fld//^sp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的平板培養(yǎng)基重量百分配比為葡萄糖1015%,酵母奢0.10.3%,無水乙酸鈉0.20.5%,無水硫酸鎂0.010.05%,磷酸二氫鉀0.10.3%，瓊脂1.8%,水余量，pH7.0。5、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌S/oro/ac/o6acz7/wsp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基的碳源包括濃度為2%5%的葡萄糖、玉米糖化液中的一種或兩者的混合物；氮源及生長因子包括濃度為0.2%1.0%的酵母裔、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、麩皮中的一種或多種的混合物；無機(jī)離子重量百分配比為無水硫酸鎂0.01~0.05%,硫酸亞鐵0.0010.005%，硫酸錳0.0010.005%,碳酸鉤1.5~3%,水余量，pH7.0。6、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌S/ora/acto6。c///wssp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基的碳源包括濃度為10%18%的葡萄糖、玉米糖化液中的一種或兩者的混合物；氮源及生長因子包括濃度為%2.0%的尿素、硫酸銨、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、麩皮中的一種或多種的混合物；無機(jī)離子重量百分配比為無水硫酸鎂0.010.1%,硫酸亞鐵0.0010.01%，硫酸錳0.0010.01%，水余量，pH7.0。7、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌Spora/""ok^77wsp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的種子培養(yǎng)階段以23cm液體石蠟液封，或增大裝液量的同時(shí)降低轉(zhuǎn)速而實(shí)現(xiàn)厭氧培養(yǎng)。8、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌S戶ra/a"o6ac!7Ztwsp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的種子培養(yǎng)階段中可在搖瓶中添加玻璃珠，以增強(qiáng)傳質(zhì)效果。9、根據(jù)權(quán)利要求2和3所述芽孢乳桿菌Spora/acto6an7/i/ssp.Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝，其特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)酸階段所用的中和劑包括NaOH、KOH、Na2C03CaC03、CaO、氨水、碳氨等一種或多種的組合。全文摘要本發(fā)明公開了一株高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌，芽孢乳桿菌Sporolactobacillussp.Y2-8菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的工藝。整個(gè)發(fā)酵工藝包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸，從平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)到發(fā)酵產(chǎn)酸一直保持厭氧條件，無需嚴(yán)格分步調(diào)控，操作簡單；本發(fā)酵工藝的培養(yǎng)基成分易得，且配方簡單，生產(chǎn)成本較低；利用本發(fā)明的菌株和發(fā)酵工藝生產(chǎn)的D-乳酸光學(xué)純度高達(dá)99.1％，且發(fā)酵液中D-乳酸含量達(dá)9.1％～16.5％，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。文檔編號C12N1/20GK101285047SQ200810098908公開日2008年10月15日申請日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日發(fā)明者何冰芳,柏中中,歐陽平凱,王麗娟,許婷婷申請人:南京工業(yè)大學(xué)