專利名稱：納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菠蘿蛋白酶分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿莖和果實(shí)中的一類蛋白水解酶，廣泛用于食品領(lǐng)域、醫(yī) 藥工業(yè)及化妝品等領(lǐng)域，有澄清啤酒、水解蛋白、燒傷脫痂、抗腫消炎等功效。目前菠蘿蛋白 酶的提取方法主要有高嶺土吸附法、有機(jī)溶劑沉淀法和超濾法，生產(chǎn)中存在純化程度低、酶 液易失活等問題。研究表明，納米二氧化鈦粒徑和密度小，具有非常高的比表面積，對菠蘿 蛋白酶有很好的吸附作用。同時(shí)，二氧化鈦是一種安全的食用色素，用于食品加工過程安全 性好，對人體無害，并能耐受低濃度NaOH和HC1溶液的處理，有良好的化學(xué)惰性。本發(fā)明 將納米二氧化鈦燒結(jié)成多孔陶瓷材料填充到層析柱，利用柱層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)低溫連續(xù)吸附洗 脫，實(shí)現(xiàn)了菠蘿蛋白酶的高效純化。

發(fā)明內(nèi)容
為解決當(dāng)前菠蘿蛋白酶生產(chǎn)中酶純度不高的技術(shù)問題，本發(fā)明利用納米二氧化鈦 對菠蘿蛋白酶的高吸附性和多孔陶瓷高比表面積的特性，將納米二氧化鈦燒結(jié)成多孔陶瓷 吸附材料，通過柱層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對菠蘿蛋白酶的高效純化分離。 本發(fā)明的技術(shù)方案是將納米二氧化鈦、粘土、石英、活性碳、長石按照
4:3:i:i: i左右的比例混合均勻，加水調(diào)和，成型，于12(xrc煅燒ih，燒結(jié)成多
孔陶瓷吸附材料。將此材料裝于層析柱，純化菠蘿蛋白酶。調(diào)節(jié)菠蘿蛋白酶粗提液pH為 4. 7±0. 2，在15 25"下進(jìn)行吸附，酶液流速1. 5BV/h。吸附結(jié)束后，采用pH = 6. 0±0. 2， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，流速lBV/h。將洗脫液進(jìn)行陶瓷膜兩級超濾， 先用截留分子量為50KD的超濾膜超濾，除去較大分子量的雜蛋白，再用截留值10KD的超 濾膜超濾除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)，操作溫度在25 45t:，操作壓力在 0. 2 0. 35MPa。將超濾濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到成品達(dá)到600萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
本發(fā)明的有益效果是利用二氧化鈦對菠蘿蛋白酶的高吸附性燒結(jié)出納米二氧化 鈦多孔陶瓷吸附材料，通過柱層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對菠蘿蛋白酶的高效純化，得到成品達(dá)到600 萬活力單位的菠蘿蛋白酶，可作為食品、醫(yī)藥原料廣泛用于食品領(lǐng)域、醫(yī)藥工業(yè)及化妝品等 領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 按照納米二氧化鈦40 % ，粘土 30 % ，石英10 % ，活性碳10 % ，長石10 %的比例，將 各原料混合均勻，加水調(diào)和，成型，干燥，于120(TC條件下煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此 材料過篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細(xì)小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿皮渣破 碎榨汁，過濾，在3000r/min條件下離心得粗酶。調(diào)節(jié)菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 6，在25°C
3下進(jìn)行吸附，酶液流速1. 5BV/h。采用pH5. 8， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗 脫緩沖液流速lBV/h。在0. 3Mpa， 25°C的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超濾膜超 濾，除去較大分子量的雜蛋白；再在O. 35Mpa，3(TC條件下用截留值10KD的超濾膜超濾除去 較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)，濃縮倍數(shù)在5倍左右。濃縮液在_401:下凍結(jié)后， 放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，1小時(shí)后溫度升至-l(TC，恒溫5小時(shí)，然后逐步升溫到30°C， 干燥結(jié)束，得到成品600萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
實(shí)施例二 按照納米二氧化鈦38 % ，粘土 30 % ，石英10 % ，活性碳12 % ，長石10 %的比例，將 各原料混合均勻，加水調(diào)和，成型，干燥，于120(TC煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此材料過 篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細(xì)小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿破碎榨汁，過 濾，經(jīng)3000r/min離心得粗酶。將粗菠蘿蛋白酶溶解，調(diào)節(jié)菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7，在 15t:下進(jìn)行吸附，酶液流速1. 5BV/h。采用p朋.O，O. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖 液，洗脫緩沖液流速lBV/h。在0. 2Mpa， 25°C的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超 濾膜超濾，用截留值10KD的超濾膜超濾除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)，濃縮 倍數(shù)在6倍左右。濃縮液在_401:下凍結(jié)后，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，2小時(shí)后溫度升 至-l(TC ，恒溫6小時(shí)，然后逐步升溫到30°C ，干燥結(jié)束，得到成品610萬活力單位的菠蘿蛋 白酶。 實(shí)施例三 按照納米二氧化鈦42%，粘土29%，石英10%，活性碳10%，長石9%的比例，將 各原料混合均勻，加水調(diào)和，成型，干燥，于120(TC煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此材料過 篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細(xì)小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿莖破碎榨汁，過 濾，離心得粗酶。將粗菠蘿蛋白酶溶解，調(diào)節(jié)菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7，在2(TC下進(jìn)行吸 附，酶液流速1. 5BV/h。采用pH5. 9， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液 流速lBV/h。在0. 25Mpa，25t:的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超濾膜超濾，用截 留值10KD的超濾膜超濾除去小分子雜質(zhì)，濃縮倍數(shù)在5倍左右。濃縮液在_401:下凍結(jié)后， 放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，2小時(shí)后溫度升至-l(TC ，恒溫6小時(shí)，逐步升溫到30°C ，干燥 結(jié)束，得到成品603萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
權(quán)利要求
納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于步驟為制備納米二氧化鈦多孔陶瓷層析柱，將粗提的菠蘿蛋白酶溶液經(jīng)多孔陶瓷柱進(jìn)行柱層析后，將解吸液超濾濃縮，濃縮液冷凍干燥得到菠蘿蛋白酶粉。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米二氧化鈦多孔陶瓷的制備方法，其特征在于，利用納米 二氧化鈦對菠蘿蛋白酶的高吸附性，結(jié)合多孔陶瓷高比表面積的特性，將二氧化鈦燒結(jié)成多孔陶瓷吸附材料。將納米二氧化鈦、粘土、石英、活性碳、長石按照4 : 3 : i : i : i左 右的比例，混合均勻，加水調(diào)和，成型，于120(TC煅燒ih，制成多孔陶瓷吸附材料。將此材料 過篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細(xì)小粉末，采用濕法裝柱。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析的方法，其特征在于，將調(diào)節(jié) 菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7±0. 2，在15 25t:下進(jìn)行吸附，酶液流速1. 5BV/h。吸附結(jié)束 后，采用P朋.0±0. 2，0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液流速lBV/h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的超濾濃縮方法，其特征在于，采用陶瓷膜兩級超濾，先用截留 分子量為50KD的超濾膜超濾，除去較大分子量的雜蛋白，再用截留值10KD的超濾膜超濾 除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)。操作溫度在25 45t:，操作壓力在0. 2 0.35MPa。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍干燥方法，其特征在于，將超濾濃縮液在冷凍干燥機(jī)內(nèi) 進(jìn)行凍干，1 2小時(shí)后溫度升至-l(TC，恒溫5 6小時(shí)，逐步升溫到3(TC，干燥結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明是納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法，屬于酶分離純化技術(shù)領(lǐng)域，主要解決菠蘿蛋白酶純化和酶活性保留的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案包括利用陶瓷燒結(jié)技術(shù)將納米二氧化鈦制成多孔陶瓷柱層析填料，采用柱層析技術(shù)對菠蘿蛋白酶進(jìn)行純化，并通過超濾、冷凍干燥最大限度的保持酶活性，得到成品達(dá)到600萬活力單位的菠蘿蛋白酶，是一種高效、安全的制備高活性菠蘿蛋白酶的方法，產(chǎn)品可作為食品、醫(yī)藥原料廣泛用于食品、生物醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。
文檔編號C04B38/08GK101709294SQ20091023115
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者吳茂玉, 和法濤, 宋燁, 葛邦國, 趙巖, 馬超 申請人:吳茂玉;宋燁;趙巖