專利名稱：特別適于維持骨細胞活性的人造穩(wěn)定的磷酸鈣相組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠維持其上的骨細胞活性的具生物活性的人造穩(wěn)定的燒結(jié)磷酸鈣相組合物。本發(fā)明可用于評價正常和異常骨細胞活性的醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)學(xué)治療，包括骨和牙組織更換和修復(fù)以及體外的骨移植片組織工程。
背景技術(shù)：
骨是由無機或礦物相、有機基質(zhì)相和水組成的復(fù)雜礦化體系。無機礦物相由結(jié)晶的磷酸鈣鹽組成，而有機基質(zhì)相主要由膠原蛋白質(zhì)和其它非膠原蛋白質(zhì)組成。骨的鈣化作用取決于形成礦化組織的有機相和無機相之間的緊密聯(lián)系。
骨生長的過程要調(diào)整到滿足結(jié)構(gòu)和功能的需要。與骨形成、維持、和吸收有關(guān)的細胞是成骨細胞、骨細胞和破骨細胞。成骨細胞合成骨的有機基質(zhì)和類骨質(zhì)，該類骨質(zhì)在磷酸鈣晶體生長和骨膠原結(jié)合以后礦化。骨細胞調(diào)節(jié)骨礦物和細胞外液之間的鈣和磷酸鹽的流動。破骨細胞的功能是吸收骨并且是骨修復(fù)過程中必不可少的。骨形成和骨吸收的天然平衡受到干擾會導(dǎo)致各種骨紊亂。已經(jīng)證明提高破骨活性將導(dǎo)致骨密度降低的骨疾病，例如常見的骨質(zhì)疏松、纖維性骨炎和Paget氏病。所有這些疾病都是骨吸收增加的結(jié)果。
為了了解骨細胞功能調(diào)節(jié)的機理，重要的是能夠測定骨細胞的正常功能和在各種骨疾病中這種活性的紊亂程度。這樣才可以找到可以使異常骨細胞活性恢復(fù)到正常水平以內(nèi)的藥物。除了識別異常和正常骨細胞活性的病因和測定該活性以外，人們還需要開發(fā)出用來治療由于導(dǎo)致骨組織損傷的疾病、外科切除或生理外傷的原因而導(dǎo)致的異常骨細胞活性的組合物和方法。更換和修復(fù)骨組織(例如用骨植入物)的治療更是人們所需要的。
幾個研究機構(gòu)已經(jīng)研制了直接觀察體外分離破骨細胞活性的方法。已經(jīng)在天然材料例如抹香鯨牙質(zhì)(Boyde等人，Brit.Dent.J.156，216，1984)或骨(Chambers等人，J.Cell Sci.66，383，1984)的薄片上培養(yǎng)從骨髓細胞群分離的破骨細胞。后面一個小組已經(jīng)能顯示出其它的單核吞噬細胞系不具有吸收活性(Chambers & Horton，CalcifTissue Int.36，556，1984)。近來使用其它的細胞培養(yǎng)技術(shù)來研究破骨細胞系的嘗試依然依賴于使用皮層骨片(Amano等人和Kerby等人，J.Bone& Min.Res.7(3))，在這種情況下，吸收活性的定量取決于深度可變的吸收凹痕區(qū)域的二維分析或取決于吸收體積的定位。這種技術(shù)當測定比較厚的基體時提供的最高精確度為約50％。另外這些分析技術(shù)耗時過長并需要高級的專門設(shè)備并需要培訓(xùn)。此外，骨或齒質(zhì)片的制備和隨后的檢查是一種既不容易也不實用的測定破骨細胞活性的方法。
使用人造磷酸鈣制品作為破骨細胞培養(yǎng)的基體幾乎沒有取得成功。Jones等人(Anat.Embryol 170，247，1984)報道了破骨細胞在體外吸收合成磷灰石，但是沒有提供支持這種觀測結(jié)果的實驗證據(jù)。Shimizu等人(Bone and Mineral 6，261，1989)已經(jīng)報道說分離的破骨細胞僅吸收早衰的骨表面，而不合成鈣基羥基磷灰石。這些結(jié)果表明有功能的破骨細胞難以在體外培養(yǎng)。
有幾個機構(gòu)已經(jīng)嘗試提供適于治療替代骨組織的組合物。美國專利US4871578公開了一種形成可用作植入物的無孔平滑羥基磷灰石涂層的方法。美國專利US4983182公開了一種陶瓷植入物，它們含有氧化鋯的燒結(jié)體和α-TCP和氧化鋯的涂層或羥基磷灰石和氧化鋯。美國專利US4988362公開了一種用于將一種生物陶瓷與另一種生物陶瓷熔合在一起的組合物。美國專利US4990163公開了一種用于生產(chǎn)由α-TCP和β-TCP組成的生物陶瓷的涂層。盡管這些不同種類的組合物可用作植入物等的生物適應(yīng)性涂層，但是，這些組合物中沒有一種表明能以可靠和重現(xiàn)的方式(例如能定量測定骨基質(zhì)中破骨細胞吸收和成骨細胞分泌的特異活性)培養(yǎng)活性破骨細胞和成骨細胞。此外，已開發(fā)出的現(xiàn)有組合物中沒有一種能被控制以便能可靠地生產(chǎn)具有常規(guī)的組成和形態(tài)，使之與在體內(nèi)和體外具有相似的生物活性性能的各種膜、較厚的涂層和整體陶瓷件。
申請人已公開的國際PCT專利申請WO94/26872公開了一種形成具有骨細胞功能的磷酸鈣相的薄膜的燒結(jié)方法。這是在其上破骨細胞能顯示出長久活性和成骨細胞可分泌骨基質(zhì)的第一種合成材料薄層。正如在該申請中所描述的，在制備具有所需比例的羥基磷灰石與磷酸三鈣薄膜時，應(yīng)考慮到許多因素。這些參數(shù)包括1)用于制備溶膠—凝膠羥基磷灰石物質(zhì)的反應(yīng)物質(zhì)的用量；2)反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合的速率；3)當制備溶膠—凝膠時的混合時間和速率；4)沉淀和分離的速率和方法；5)在制備溶膠—凝膠時的工藝環(huán)境條件；6)在浸漬涂覆膜時從溶膠—凝膠體系中取出基體的速度；7)燒結(jié)溫度；8)在受控氣氛例如惰性氣體、真空或有水蒸汽存在的氣氛中的燒結(jié)；9)基體的性質(zhì)，石英是產(chǎn)生透明基體的優(yōu)選實施方式，其基體上涂覆有穩(wěn)定的磷酸鈣相。
在該PCT專利申請中提出為了在石英基體上達到寬范圍的羥基磷灰石與磷酸三鈣的比例，要使其比值達到10∶90-90∶10，需要考慮到這些參數(shù)中的許多因素。指出在空氣氣氛下的燒結(jié)溫度為約800-1100℃。證實在800℃時，膜的主要成分是羥基磷灰石。燒結(jié)溫度為約900℃時，達到的比例為約70∶30。在1000℃時，達到的比例為約10∶90，而在1100℃時膜的主要成分是磷酸三鈣。它還指出燒結(jié)在真空中1000℃下進行時達到的比例為約66∶34。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的比例是50∶50-20∶80。最佳比例約為333∶666。為了達到這些比例，可以考慮上面給出的幾個因素。但是，人們要求使上述幾個因素的可變性達最小，并以精確可重現(xiàn)的方式達到最佳膜組成所要求的比例。令人驚奇地是，盡管人們認為α-磷酸三鈣在水中是可溶的，但是膜在各種含水介質(zhì)中是穩(wěn)定的。
本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定本體的存在，能夠穩(wěn)定組合物并防止它們在生理液體中發(fā)生降解。因此，磷酸三鈣本體在該組合物的膜、涂層或整體陶瓷件中消失主要是由于破骨細胞的活性，而不是由于溶解過程。穩(wěn)定的人造生物活性組合物首先是這樣的一種組合物，即它們能維持破骨細胞和成骨細胞活性并能容易地測定這兩種細胞的生理活性以及能制定診斷和治療對策。穩(wěn)定本體能穩(wěn)定在燒結(jié)期間形成的磷酸鈣相內(nèi)的α-磷酸三鈣，以提供穩(wěn)定形式的α-磷酸三鈣，這種物質(zhì)不會在生理液體中降解，而且它會形成具有維持和促進骨細胞活性的細胞相容形態(tài)的磷酸鈣相。
本發(fā)明的概況本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的組合物，該組合物能廣泛地應(yīng)用于各種診斷和治療。按照本發(fā)明的一個方面，所述的穩(wěn)定組合物可以用來產(chǎn)生薄膜、涂層、粉末和整體陶瓷構(gòu)件，它們具有同樣的表面球狀微孔和內(nèi)部微孔。另外，為了提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相類似的三維骨組織，該整體陶瓷的結(jié)構(gòu)內(nèi)部也可存在大孔。按任何方法制成的組合物能促進在其上培養(yǎng)的骨細胞的活性并生長出用作骨移植物的體外工程人造骨組織。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種具生物活性的人造燒結(jié)組合物，用來提供能穩(wěn)定地維持其上的骨細胞活性的形態(tài)，所述組合物含有穩(wěn)定的磷酸鈣相，它們是在穩(wěn)定本體的存在下，在燒結(jié)溫度下由羥基磷灰石物質(zhì)轉(zhuǎn)變成難溶和穩(wěn)定的磷酸三鈣而產(chǎn)生的。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了用來穩(wěn)定人造燒結(jié)的磷酸鈣相組合物的方法，所述的磷酸鈣相具有適合于維持其上的骨細胞活性的形態(tài)，該方法包括通過燒結(jié)將羥基磷灰石物質(zhì)主要轉(zhuǎn)變成α磷酸三鈣，并提供使所形成的α-磷酸三鈣穩(wěn)定和難溶于磷酸鹽相的穩(wěn)定本體。
按照本發(fā)明的另一個方面，提供了用來維持骨細胞活性的燒結(jié)人造微孔多晶結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)含有經(jīng)過燒結(jié)的穩(wěn)定磷酸鈣相，而所述的磷酸鈣相具有松散的內(nèi)連圓形顆粒的球狀表面形態(tài)，并且在結(jié)構(gòu)內(nèi)有內(nèi)連微孔。
按照本發(fā)明的又一個方面，提供的是可植入的鈣化骨基質(zhì)，它含有a)用來維持基質(zhì)的結(jié)構(gòu)；b)穩(wěn)定的磷酸鈣相層，該磷酸鈣相是在穩(wěn)定本體的存在下，在燒結(jié)溫度下由羥基磷灰石物質(zhì)轉(zhuǎn)變成磷酸三鈣而產(chǎn)生的，其中穩(wěn)定本體使磷酸鈣相不溶和穩(wěn)定。
c)由在穩(wěn)定磷酸鈣相層上培養(yǎng)的成骨細胞沉積而成的界面層；和d)由這類培養(yǎng)的成骨細胞分泌出的礦化膠原基質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了培養(yǎng)有功能的骨細胞的方法，所述的方法包括—向基體上的穩(wěn)定的磷酸鈣相人造燒結(jié)膜上涂覆懸浮在生理介質(zhì)中的骨細胞懸浮液，所述的燒結(jié)膜含有穩(wěn)定和難溶的α-磷酸三鈣復(fù)合物。
按照本發(fā)明的又一方面，提供了監(jiān)測和定量測定骨細胞活性的試劑盒，該試劑盒包括—具有磷酸鈣相燒結(jié)膜的基體，所說的磷酸鈣相含有穩(wěn)定和難溶的α-磷酸三鈣，—粘附到所述基體上的多孔骨細胞培養(yǎng)裝置。
按照本發(fā)明的再一個方面，提供了用來體外礦化膠原基質(zhì)的組織工程的方法，該方法包括下列步驟—提供一種具有松散內(nèi)連的圓形顆粒的球狀表面形態(tài)并且在結(jié)構(gòu)內(nèi)有內(nèi)連微孔的人造穩(wěn)定的組合物，—向組合物上施加懸浮在生理介質(zhì)中的成骨細胞懸浮液，—培育由成骨細胞在培養(yǎng)液中選出的礦化膠原基質(zhì)；和—向患者體內(nèi)植入分離出的膠原骨基質(zhì)。
附圖的簡要描述

圖1是CaO活性對羥基磷灰石和磷酸三鈣的穩(wěn)定性影響的主要區(qū)域示意圖。
圖2是在穩(wěn)定的硅本體存在下通過轉(zhuǎn)變本發(fā)明的羥基磷灰石物質(zhì)形成的磷酸鈣本體相的曲線圖。
圖3是CaO/Al2O3對CaO活性影響的曲線圖。
圖4是CaO/TiO2和CaO/B2O3的比對CaO活性影響的曲線圖。
圖5包括圖(a)、(b)和(c)，表示(a)在組合物與基體的界面處；(b)剛好在界面以上和(c)在膜的頂部的能量分散X射線光譜的結(jié)果。
圖6是由活性成骨細胞在本發(fā)明的穩(wěn)定薄膜組合物上沉積的礦化膠原骨基質(zhì)的橫截面SEM。
圖7(a)是由在穩(wěn)定的組合物上培養(yǎng)的成骨細胞產(chǎn)生的熒光鈣化骨基質(zhì)沉積的照片。
圖7(b)是在穩(wěn)定的薄膜組合物上未培養(yǎng)成骨細胞和沒有看到熒光鈣化骨基質(zhì)的對照照片。
圖8是在由人造生物活性穩(wěn)定組合物組成的整體三維固體陶瓷上的破骨細胞吸收凹坑的SEM。
圖9是在人造生物活性穩(wěn)定組合物的薄膜上的破骨細胞吸收凹坑的SEM。
圖10是在表示石英基體上的人造穩(wěn)定組合物的薄層形態(tài)的橫截面TEM的放大顯微照片。
圖11是作為薄膜而涂覆的穩(wěn)定組合物的SEM顯微照片，表示表面微孔結(jié)構(gòu)。
圖12(a)是在無穩(wěn)定本體存在時燒結(jié)的市售羥基磷灰石的SEM顯微照片。
圖12(b)是在硅穩(wěn)定本體存在下燒結(jié)的市售羥基磷灰石的SEM顯微照片。
圖13是天然骨上的破骨細胞的SEM，表示天然吸收凹坑。
圖14是說明用本發(fā)明方法制備的整體陶瓷的球表面形態(tài)的SEM顯微照片。
優(yōu)選實施方案的詳細描述磷酸鈣物質(zhì)的組成按申請人的已公開的共同未決PCT申請WO94/26872中所述。該方法持續(xù)可靠地提供了一種磷酸鈣相薄膜，該相的羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例在合適的50∶50-20∶80比例范圍內(nèi)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有穩(wěn)定本體存在時，能夠顯著地和意想不到地穩(wěn)定磷酸鈣相中的α-TCP，從而提供了能維持和提高成骨細胞和破骨細胞活性的生物活性組合物，該組合物可以以可重復(fù)再現(xiàn)的方式給這種活性定量，并且制定了診斷和治療骨組織損傷的對策。
應(yīng)該明白，本文所使用的術(shù)語“穩(wěn)定的”是指通過轉(zhuǎn)變羥基磷灰石而形成的磷酸鈣相，當將它們置于室溫條件下或在體內(nèi)或體外的生理環(huán)境下時能保持穩(wěn)定不變的結(jié)晶和化學(xué)結(jié)構(gòu)。還應(yīng)該明白，術(shù)語“生物活性”是指在基本上或完全由本發(fā)明的組合物制成的結(jié)構(gòu)中能維持成骨細胞骨生長，同時促進由破骨細胞自然控制的組合物的細胞外吸收并且在與正常骨代謝極相似的過程中避免非特異性化學(xué)和/或細胞溶解和/或降解的能力。這種生物活性在有骨細胞存在下在體外和體內(nèi)使用這些物質(zhì)時存在。術(shù)語“磷酸鈣相”包括在燒結(jié)產(chǎn)品中的各種磷酸鈣，例如羥基磷灰石α-TCP、β-TCP、八磷酸鈣、磷酸四鈣和磷酸二鈣。
最初認為為了體外維持骨細胞活性，適用的磷酸鈣產(chǎn)品是純的或基本上是純的羥基磷灰石，并且認為在制膜時要選擇磷酸鈣?，F(xiàn)在已經(jīng)確定羥基磷灰石占主要量的材料不能促進破骨細胞和成骨細胞的正常功能，實際上，在有破骨細胞存在時可觀察到的活性極小。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于提供了包含羥基磷灰石和α-磷酸三鈣的磷酸鈣相混合物，所以在更寬的范圍內(nèi)提高了吸收程度，而主要由α-磷酸三鈣組成的膜提供了最高程度的吸收，而主要由羥基磷灰石組成的膜所提供的吸收程度可被忽略。正是這個關(guān)于α-磷酸三鈣存在的認識，它部分說明了為什么目前研制的磷酸鈣材料可以促進在這類材料上培養(yǎng)的骨細胞的功能特性。以薄膜形式如可以透過光或反射光的形式提供穩(wěn)定磷酸鈣相使得可以實施診斷方法，以此評價在該膜上培養(yǎng)的骨細胞的幾種功能特性。
令人驚奇地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使羥基磷灰石溶膠—凝膠物質(zhì)的制備標準化并選擇非常特定范圍的燒結(jié)溫度不僅實現(xiàn)了所要求的比例，而且還發(fā)現(xiàn)通過將按溶膠—凝膠法制得的羥基磷灰石轉(zhuǎn)變成α-磷酸三鈣可以形成最佳的組合物。在這些優(yōu)選的最佳膜組合物中只檢測到很少或未檢測到β-磷酸三鈣。無需制備羥基磷灰石和α-磷酸三鈣各自相的混合物。采用在公開的PCT申請WO94/26872中所述的技術(shù)來制備溶膠—凝膠羥基磷灰石就足已。用于在具有較高pH的介質(zhì)中制備這類羥基磷灰石物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)如下
起始溶液由水溶液組成，反應(yīng)物完全溶解于該溶液中并且進行很好地混合。羥基磷灰石以細顆粒的形式懸浮在懸浮液中，在制備后老化溶膠—凝膠物質(zhì)24小時后，由光散射實驗獲得的顆粒大小從平均大小為0.3微米到1微米。
羥基磷灰石物質(zhì)在中性和/或堿性介質(zhì)中是穩(wěn)定的。優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)的pH值較高，通常在約12的范圍內(nèi)。向第二種鈣溶液中滴加第一種磷酸鹽溶液，以防止形成三磷酸一氫四鈣，由此得到所要求的羥基磷灰石產(chǎn)物。過濾溶膠—凝膠物質(zhì)，干燥成粉末，在氧化鋁坩堝中于1000℃下進行煅燒和燒結(jié)，形成在潮濕環(huán)境的正常條件下呈穩(wěn)定狀態(tài)的鈣基羥基磷灰石。在1200℃以上的燒結(jié)溫度下，該相主要轉(zhuǎn)變成α-磷酸三鈣，只有少量的其它相例如β-TCP、八磷酸鈣、磷酸四鈣或磷酸二鈣形成。對于本領(lǐng)域熟練的專業(yè)人員來說應(yīng)該清楚在燒結(jié)的穩(wěn)定磷酸鈣相中還會形成其它的“摻雜”物質(zhì)。這類物質(zhì)也可在燒結(jié)前就加入到羥基磷灰石物質(zhì)中。存在或加入這類摻雜物最好對組合物和穩(wěn)定組合物的形態(tài)沒有影響，它們會影響對其上的骨細胞活性的維持。
就燒結(jié)過程而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石物質(zhì)干燥膜的燒結(jié)可以在標準型高溫爐中進行，無需控制爐內(nèi)氣氛。在使用新的爐子或使用以前用于其它目的已被污染的爐子時，最好使爐子在燒結(jié)溫度以上的范圍內(nèi)循環(huán)空燒結(jié)幾次。這樣預(yù)處理后的爐子除去了任何揮發(fā)性物質(zhì)并準備投入使用。無需另外的步驟。在試運轉(zhuǎn)期間和用來燒結(jié)涂層物質(zhì)的正常使用期間可以有外界空氣存在，只要存在的外界空氣對方法無不利影響并且所要求的比例結(jié)果恒定。在這種條件下，在所需的比例為50∶50-20∶80，在有石英物質(zhì)存在時，燒結(jié)溫度的范圍可以是920-1100℃。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當溫度增加時，羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化率也增加。當燒結(jié)溫度的范圍為920-950℃時，比例可以由50∶50改變成333∶666。在燒結(jié)溫度選擇在950-1000℃的范圍內(nèi)時，比例大約為333∶666。溫度增加到超出1000℃以上高達1100℃時，進一步提高了轉(zhuǎn)化率并生成比例在333∶666-20∶80范圍內(nèi)的組合物。優(yōu)選的燒結(jié)溫度大約為975℃，此時可達到的比例為333∶666。
羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉(zhuǎn)變過程通過如下的反應(yīng)進行；
在任何溫度下的轉(zhuǎn)變程度與周圍氣氛中水的分壓和改變CaO濃度的因素有關(guān)。
形成的磷酸三鈣的性質(zhì)是重要的。對于非化學(xué)計量的Ca/P比例為1.5-1.60的羥基磷灰石來說(Nakamura，Thermochimica Acta，第165卷，1990)，以及于許多市售羥基磷灰石粉末(Aldrich化學(xué)公司)來說，在將粉末加熱到1100℃，然后冷卻到低于1000℃時，經(jīng)常形成β-磷酸三鈣。β-TCP是一種穩(wěn)定的難溶化合物，它會呈現(xiàn)出象礦物白磷鈣石那樣的性質(zhì)。在由如上描述的水溶液形成的通過溶膠—凝膠法產(chǎn)生的羥基磷灰石物質(zhì)的轉(zhuǎn)變過程中以及在由另一種沉淀反應(yīng)形成的鈣基羥基磷灰石粉末中，發(fā)現(xiàn)在低于1000℃的溫度下，在有穩(wěn)定本體存在時形成較多α-磷酸三鈣。在開發(fā)磷酸鈣基涂層產(chǎn)品時，α-TCP已經(jīng)不很引人注意，其原因在于它們具有較高的溶解度而在生理液體中降解，結(jié)果只能通過在1250℃以上的溫度下高溫轉(zhuǎn)變純羥基磷灰石而產(chǎn)生。
由該轉(zhuǎn)變反應(yīng)式，可以看出控制體系中CaO活性的任何因素將改變羥基磷灰石的轉(zhuǎn)變溫度和可逆性。據(jù)信加入的諸如SiO2的穩(wěn)定本體與CaO反應(yīng)，反應(yīng)式如下
從而使轉(zhuǎn)變在低溫下進行。在反應(yīng)中每1摩爾CaO需1摩爾SiO2才能使反應(yīng)完全。也可能存在形成具有其它CaO/SiO2比的不同硅酸鹽的其它反應(yīng)。
當通過用二氧化硅形成硅酸鈣來除去CaO時，如圖1所示，形成TCP相的溫度被降低到與轉(zhuǎn)變制得的羥基磷灰石組合物的數(shù)據(jù)相一致的溫度。加入硅本體使轉(zhuǎn)變線向右移動，即向形成主要是α-TCP的低溫方向移動。
所提出的二氧化硅直接起著與其它的相例如β-磷酸三鈣比較，促進α-磷酸三鈣形成的作用的機理是硅本體進入羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)并相對于β相來說更加穩(wěn)定α相。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，現(xiàn)已證實起始羥基磷灰石物質(zhì)的性質(zhì)和二氧化硅的加入方式是重要的。當向市售的純羥基磷灰石粉末中加入二氧化硅粉末并共同研磨促進混合時，在1000℃以上的高燒結(jié)溫度下觀察到的轉(zhuǎn)變產(chǎn)品是β-TCP。相反，在向用本發(fā)明方法制備的粉末中加入金屬有機溶液的二氧化硅時，主要轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的α-磷酸三鈣，如圖2所示，該相存在于950℃線的低溫下。這種轉(zhuǎn)變是不可逆的。在高溫下，摻雜粉末的轉(zhuǎn)變溫度被降低，從純粉末的1200℃以上降低到摻雜二氧化硅的粉末的約950℃。如上所述，可以認為這種結(jié)果是由于形成了硅酸鈣，從而在冷卻至低溫時保持了產(chǎn)生穩(wěn)定相的組成。
按本發(fā)明方法制備的摻入穩(wěn)定本體的粉末具有可重現(xiàn)且穩(wěn)定的相組成并且該相組成具有所要求的表面形態(tài)和內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)的一個原因是，羥基磷灰石物質(zhì)原本是用溶膠—凝膠法作為非常細的顆粒而制備的。穩(wěn)定本體例如金屬有機溶液形式的硅本體的加入使這些顆粒的每一個與硅本體層密切接觸，致使混合充分。在燒結(jié)時，二氧化硅與轉(zhuǎn)化反應(yīng)中釋放的CaO極為靠近。為此可以認為在各個顆粒的表面上形成的難溶硅酸鈣本體限制了反應(yīng)的可逆性并防止α-磷酸三鈣在含水生理介質(zhì)中溶解。
與二氧化硅類似，可以推斷鈦、鋁和硼也可降低轉(zhuǎn)化溫度，因此可作為穩(wěn)定劑使用。圖3和4示出了溫度降低與形成CaO/Al/Ti/Ba復(fù)合物的關(guān)系。這些金屬也可用來除去羥基磷灰石中的CaO，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的α-TCP。選擇穩(wěn)定劑(摻雜劑)和分散化合物的重要因素是(a)需要與所形成的形成穩(wěn)定鈣化合物的CaO相配合，(b)必須能優(yōu)選地以圍繞在新形成的顆粒外表面上的方式在整個溶膠—凝膠物質(zhì)中均勻地分散，(c)應(yīng)該不會穩(wěn)定磷酸鈣體系中不需要的相，和(d)當在生物領(lǐng)域中應(yīng)用時，必須無毒性。適用于本發(fā)明的穩(wěn)定本體是形成氧化物(優(yōu)選形成金屬氧化物)的那些物質(zhì)。優(yōu)選的金屬氧化物選自能形成所要求的組成和形態(tài)的那些氧化物，例如鋁、鋯、鍺、鉻、釩和鈮的氧化物，更優(yōu)選地選自氧化硅和氧化鈦。這類穩(wěn)定本體的混合物也是適用的。
燒結(jié)是在穩(wěn)定本體的存在下進行的。穩(wěn)定本體可以在燒結(jié)過程中通過羥基磷灰石由基體擴散而提供或在燒結(jié)前向羥基磷灰石中加入穩(wěn)定本體來提供。無論是以擴散形式還是以加入形式來提供穩(wěn)定本體，其用量都應(yīng)足以穩(wěn)定磷酸鈣相，而所述的磷酸鈣相是以薄膜、粉末、厚的涂層、整體陶瓷件和具有內(nèi)部巨孔的整體陶瓷的形式存在的。優(yōu)選地，為了維持和促進骨細胞活性，要形成可以重現(xiàn)的并且在燒結(jié)過程中是存在的穩(wěn)定本體的函數(shù)的獨特生物活性表面形態(tài)和內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)。
根據(jù)其欲使用的用途，可以提供各種形式的組合物，例如以用于診斷的薄膜形式或用于骨或牙植入物上的厚涂層的形式存在的組合物。這里，所述薄膜的厚度為0.1-5微米，用于其它基體的厚涂層的厚度為5微米。整體陶瓷件是指其功能與基體無關(guān)的較大的整體三維結(jié)構(gòu)。
一個優(yōu)選的實施方案是在石英基體表面上燒制羥基磷灰石物質(zhì)。石英基體提供足夠的能擴散到磷酸鈣相中并產(chǎn)生足夠量硅本體的硅本體源。如圖5(a)在組合物與基體的界面處，圖5(b)剛好在界面上和圖5(c)在膜的頂部所示，硅本體可以存在于整個膜組合物中。在燒結(jié)期間，硅本體從石英表面上釋放出來并擴散通過羥基磷灰石物質(zhì)層的表面。在羥基磷灰石轉(zhuǎn)變成α-磷酸三鈣(羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例在優(yōu)選的范圍內(nèi))的過程中，硅本體與CaO反應(yīng)，形成硅酸鈣，硅酸鈣與α-磷酸三鈣形成穩(wěn)定的復(fù)合物。對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來說，應(yīng)該清楚在燒結(jié)期間釋放出穩(wěn)定本體進入磷酸鈣相中的其它的基體或添加劑也可在本發(fā)明中使用。該穩(wěn)定本體可以選自金屬氧化物和非金屬氧化物，例如硅、鋁、鋯、硼、鈦、鍺、鉻、釩、鈮的氧化物和其混合物。含有或由鋁、鋯、硼、鈦和這些物質(zhì)的各種混合物制成的基體可作為用于提供穩(wěn)定本體的源。
按照本發(fā)明，施加在合適載體上的薄膜明顯地有助于研究和理解骨細胞的功能特性。正如本發(fā)明所提供的，穩(wěn)定膜的組成使得它們可以在其上培養(yǎng)各種類型的骨細胞。在研究破骨細胞活性時，可以調(diào)節(jié)表面組成，以促使膜材料的磷酸鈣本體從顯著的吸收程度調(diào)節(jié)到磷酸鈣本體的吸收達到可忽略的程度。類似地，通過測定鈣化骨基質(zhì)的構(gòu)成來研究成骨細胞的活性。提供足夠薄的薄膜從而使破骨細胞對本體的吸收可以通過所吸收的磷酸鈣本體的消失來測定，這就提供了一種與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比簡單、價廉的分析方法。按本發(fā)明制成的膜組成維持了骨細胞的生物功能。在透明的支承基體例如石英或玻璃上施加這種膜的優(yōu)點是導(dǎo)致了包括自動機器閱讀在內(nèi)的簡易判斷診斷方法的技術(shù)。
理想的膜厚大于0.1微米，原因是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膜厚小于0.1微米時難以獲得均勻的無間隙的覆蓋膜。至于如何限制膜的上限，任何所需的厚度將取決于其最終用途。正如將要討論的，吸收程度可以通過透光率來測定，優(yōu)選地，它要求膜的厚度小于10微米?；w是容易耐所需燒結(jié)溫度并具有所需透明度的石英，從而可以通過透光率實驗來測定膜材料中磷酸鈣本體的吸收程度。
研制的薄膜可以在試劑盒及其類似物中使用，用來評價骨細胞的活性。可將膜以“試劑盒”的形式裝配，它包括石英基體、其上預(yù)涂覆有磷酸鈣的薄膜，它們可以在細胞培養(yǎng)容器(可能地是24孔，任選地為無菌的多孔板，直徑為約15mm)中使用，作為適合于培養(yǎng)混合骨細胞群體的體系。該裝置簡單并僅依賴于常規(guī)的實驗設(shè)備和使用技術(shù)，適合于進行定量分析，該裝置的造價低，但強度足以承受正常的操作水平并可在塑料盒中進行多個包裝，例如分24個試樣包裝。薄膜表面有明確和可重現(xiàn)的化學(xué)性，當使用適宜的包裝材料包裝時，其機械強度足以承受運輸壓力。
在每一種情況下，培養(yǎng)條件應(yīng)使單核細胞或多核細胞形式的破骨細胞在功能狀態(tài)下存活，并能吸收膜中的人造磷酸鈣。同樣地，成骨細胞在這樣的培養(yǎng)條件下也能活性分泌鈣化骨基質(zhì)。
這些基體可以用來評定破骨細胞的吸收活性，監(jiān)測由于疾病或在培養(yǎng)介質(zhì)中所含的藥劑例如會直接或間接影響破骨細胞吸收活性的藥物而導(dǎo)致的吸收活性量的改變。這種基體還適用于培養(yǎng)活性成骨細胞，以觀察和測定其分泌的骨基質(zhì)以及使用沉積的礦化基質(zhì)進行體內(nèi)移植。如圖6所示，通過在穩(wěn)定薄膜12的表面(如在石英基體14上提供的)上培養(yǎng)的成骨細胞來沉積礦化膠原基質(zhì)10。圖中示出了一個類似于膠凝線的良好結(jié)合的邊界層16，并與相同類型的由成骨細胞在體內(nèi)在新骨和老骨的界面上形成的膠凝線類似。這清楚地表明加壓穩(wěn)定的組合物具有成骨細胞生理活性，從而進一步證實這種穩(wěn)定的組合物可以用作為重要的骨修復(fù)產(chǎn)品。
所述裝置可作為定量測定破骨細胞的吸收活性或由于成骨細胞的活性而造成的骨類材料的累積量。這類活性分析可以在連續(xù)的實時監(jiān)控、延時時間間隔或終點測定的情況下進行。測定骨細胞活性的步驟是上述監(jiān)控方法中常用的，其中骨細胞(動物或人)是在一個或多個裝置中在特定條件下培養(yǎng)的。培養(yǎng)周期為幾小時到許多天，優(yōu)選地為約2-10天(最佳時間取決于細胞種類和方案)，在此期間，可以連續(xù)地監(jiān)控、周期地監(jiān)控破骨活性的范圍或在正在進行的基礎(chǔ)上對其簡單地不進行監(jiān)控，這樣有利于最終點的測定。同樣地，通過測定鈣化骨基質(zhì)積累的程度可以觀測成骨細胞活性。如圖7所示，涂覆有本發(fā)明的穩(wěn)定膜和同時與成骨細胞一起培養(yǎng)的石英盤顯示出大量的熒光，這表明有礦化骨基質(zhì)存在。相反，在只有介質(zhì)(b)存在的情況下涂覆在石英上的穩(wěn)定膜未顯示出熒光。鈣化骨基質(zhì)的量直接與可測定的發(fā)射出的熒光量成正比。四環(huán)素是天然的熒光材料。當細胞吸收四環(huán)素時，四環(huán)素可被代謝，分泌出它們的代謝物并被摻入到新形成的骨基質(zhì)中。四環(huán)素僅僅在被成骨細胞代謝時產(chǎn)生熒光。這表明成骨細胞在穩(wěn)定的組合物上活性分泌出骨基質(zhì)。
一旦制備了溶膠—凝膠羥基磷灰石物質(zhì)，就可用各種技術(shù)將其作為薄膜涂覆在所需基體上。例如，浸涂法(C.J.Brinker等人，F(xiàn)undamentalsof Sol-Gel Dip Coating，Thin Solid Film，第201卷，第1期，97-108，1991)由一系列步驟構(gòu)成以恒定的速度從溶膠或溶液中取出基體，在適當?shù)臏囟认赂稍锿扛驳囊后w膜，將膜燒制成最終的陶瓷。
在旋轉(zhuǎn)涂覆時，將溶膠—凝膠滴在板上，板以一定的速度旋轉(zhuǎn)，通過離心作用足以使溶液均勻地分布。隨后按與浸涂法相同的方法進行處理。
應(yīng)該認識到有各種技術(shù)可以用來向基體上施加溶膠—凝膠的薄膜。其它的技術(shù)包括噴涂溶膠—凝膠、滾涂溶膠—凝膠、涂鋪溶膠—凝膠和涂抹溶膠—凝膠。
涂覆統(tǒng)一尺寸的單個盤的另一種方法是用溶膠—凝膠膜覆蓋大的基體。燒結(jié)基體上的整個膜。然后可以在膜上采用諸如柵格類的裝置，將其分成多個獨立的實驗區(qū)。
在涂覆溶膠—凝膠物質(zhì)的各種技術(shù)中，所形成的膜的厚度和質(zhì)量(氣孔率、微結(jié)構(gòu)、結(jié)晶狀態(tài)和均勻性)受多種因素影響。這些因素包括起始溶膠的物理特性、組成和濃度、基體表面的清潔度、基體的取出速度和燒成溫度。對于浸涂法來說，厚度通常主要取決于取出速率和溶膠粘度。由于溶膠的不均勻性會導(dǎo)致形成微孔和破裂，所以涂層操作應(yīng)在清潔的室內(nèi)進行，以避免溶膠的顆粒污染。在熱處理階段，要求溫度要高，以產(chǎn)生所需的微結(jié)構(gòu)和所需的羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉(zhuǎn)變。
用浸涂法制備磷酸鈣膜的目的有下面兩個方面(a)制備具有所需質(zhì)量(均勻性、厚度和氣孔率等)的膜；和(b)制備用于生物試驗的在透明基體上的半透明磷酸鈣膜。
還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明穩(wěn)定的人造組合物不僅適用于制備薄膜和厚膜，還適合于制備粉末和整體陶瓷。陶瓷是用本文所述的溶膠—凝膠法制備的燒結(jié)粉末來制備的，其中添加二氧化硅形成所需的穩(wěn)定的羥基磷灰石/α-磷酸三鈣相混合物。在一個實施方案中，磨細經(jīng)過燒結(jié)的粉末，使其足以形成0.5-1mm厚的圓片，然后與滴加的具有相同摻雜物組成的溶膠-凝膠物質(zhì)混合形成有助于保持顆粒的潮濕粉末。在試驗?zāi)ぶ性诖蠹s5噸/cm2的壓力下單軸壓制潮濕的粉末。所制成的整塊材料具有極好的生坯強度，然后將其在1000℃于空氣中燒制1小時。這類陶瓷保持了所有與用作薄膜或涂層的穩(wěn)定組合物相同的特性。對于SiO2穩(wěn)定的組合物來說，X射線衍射表明在初始粉末和最終陶瓷之間相組成幾乎沒有變化。如圖8的平面圖所示，表面構(gòu)型與圖9所示的涂覆在石英基體上的組合物有驚人的相似之處。破骨細胞在薄膜和整體陶瓷上的吸收能力很類似。通過在整體陶瓷上存在的吸收凹坑18，可以觀察到破骨細胞的吸收，它們與在薄膜(圖8和9)上所示的吸收凹坑相似。
正如本專業(yè)領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所認識到的，通過將陶瓷制成整件的形狀可以制成用于所需目的的大型整件陶瓷。所制成的整件產(chǎn)品保持了所需的穩(wěn)定磷酸鈣相組成以及促進其上的骨細胞活性的微孔球形表面形態(tài)和內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)。
制備用于生物領(lǐng)域的陶瓷的一個特定方面是制備在內(nèi)部結(jié)構(gòu)中具有導(dǎo)致生物活性的細的球形表面微孔和內(nèi)部微孔和孔徑為50-1000微米或更大的大尺寸結(jié)構(gòu)的陶瓷件。這促使體系中的骨修復(fù)與體內(nèi)生理骨修復(fù)更為接近。處在該范圍下限的這種巨孔特別適合于所要求的骨基質(zhì)的快速生長，而處在該范圍上限的這種巨孔使得細胞進入其內(nèi)部，從而例如進行骨移植片的體外組織制備。在采用諸如二氧化硅的穩(wěn)定本體摻雜并在使用前進行燒結(jié)的粉末時，通過將這種粉末與所需大小的苯乙烯球混合可制備多孔陶瓷。在所需壓力下壓制摻有苯乙烯球的濕粉末后，通過在約400-600℃的溫度下熱解除去苯乙烯。接著按以前所說的常規(guī)方法在1000℃下燒制多孔陶瓷。這種工藝的結(jié)果是所形成的具有外層球形微孔結(jié)構(gòu)、亞外層內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)和內(nèi)部巨孔結(jié)構(gòu)的整體陶瓷，從而使得細胞通過整個整體陶瓷部件中遷移并起作用。
作為本領(lǐng)域熟練的普通技術(shù)人員應(yīng)該清楚，為了使陶瓷結(jié)構(gòu)內(nèi)具有氣孔，也可使用與苯乙烯類似的物質(zhì)。能夠在正常的燒結(jié)溫度下的溫度范圍內(nèi)進行熱解的其它物質(zhì)也可用來形成微孔結(jié)構(gòu)。所使用的物質(zhì)還應(yīng)該不留有任何毒性殘余物。還應(yīng)該清楚其它的方法也可用來形成微孔，例如機械鉆孔、使用激光器或使用發(fā)泡劑。
由于本發(fā)明的一個顯著方面是提供羥基磷灰石和α-磷酸三鈣相的混合物，這些物相通過由溶膠—凝膠羥基磷灰石形成的摻雜粉末產(chǎn)生的表面形態(tài)而連接，所以本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚用該粉末制備膜、涂層和整體構(gòu)件的其它的方法也可在本發(fā)明中使用。這包括使用已知技術(shù)例如等離子或熱噴涂或電泳沉積。
參見圖10，橫截面TEM顯微照片示出了石英基體(a)，包含小晶粒的界面層(b)和包括膜表面的上層(c)形式的層梯度，其中的膜表面由包埋在顆粒中的小晶體構(gòu)成，所述的顆粒提供球形微孔結(jié)構(gòu)。在燒結(jié)過程中，硅本體從石英中釋放出來，在羥基磷灰石轉(zhuǎn)變成燒結(jié)薄層的α-磷酸三鈣時在羥基磷灰石中擴散。界面層(b)結(jié)晶結(jié)構(gòu)要比具有大的磷酸鈣相的多晶顆粒表面的小。
該人造燒結(jié)組合物的形態(tài)獨特，以前未曾報道或經(jīng)證實過。現(xiàn)在，我們所揭示的表面形態(tài)具有松散內(nèi)連的圓顆粒球形表面，其中的圓形顆粒具有內(nèi)連的微孔結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所具有的形態(tài)成功地維持了功能性破骨細胞和成骨細胞的培養(yǎng)。
涂層表面形態(tài)具有特定的形式，包括有類似于珊瑚狀的松散內(nèi)連的球形結(jié)構(gòu)(圖11)。顆粒的大小在約0.5-1微米的范圍(橫向尺寸)內(nèi)改變。涂層在與基體垂直的方向上是多孔的，它們在接近表面處所具有的平面密度要比接近基體處的大。這種形態(tài)使得涂層內(nèi)的液體介質(zhì)和其它生理液體可以滲透。相反，用其它共同沉淀方法制備的羥基磷灰石的表面形態(tài)不會產(chǎn)生由本發(fā)明提供的微孔結(jié)構(gòu)。參見圖12(a)和12(b)，在無穩(wěn)定本體(a)和有穩(wěn)定本體(b)存在的情況下制備的羥基磷灰石膜的表面形態(tài)與圖11中用本發(fā)明組合物制備的相比無微孔。另外，已有報道合成的多晶羥基磷灰石不會被破骨細胞吸收(Shimizu，Bone and Minerology，第6卷，1989)。
球形表面形態(tài)是由大小可與最初由成骨細胞在形成骨的過程中形成的附聚沉積物相比的圓形顆粒構(gòu)成。本發(fā)明的組合物提供的表面形態(tài)與細胞在體內(nèi)預(yù)期接觸的形態(tài)相匹配。圖13中示出了典型的破骨細胞吸收凹坑，其中基體是骨。如圖9所示，在本發(fā)明人造組合物上由破骨細胞20形成的吸收凹坑18與圖13天然骨中看見的極為類似，圖13說明破骨細胞在兩個體系中起類似的作用。這就是說人造燒結(jié)組合物的表面形態(tài)與細胞在體內(nèi)預(yù)期接觸的形態(tài)相匹配。
穩(wěn)定組合物的整體微孔可確保接近人造材料表面處的鈣或磷酸鹽離子的濃度限定在細胞在體內(nèi)與天然骨細胞接觸時細胞所期望的范圍內(nèi)，所述的天然骨細胞由羥基磷灰石、膠原和其它纖維組織構(gòu)成。在導(dǎo)致吸收的由破骨細胞參與的細胞外溶解過程中，這種復(fù)合材料致使溶解產(chǎn)品有一個特定的局部濃度。在無機人造羥基磷灰石或α-TCP溶解或吸收期間，所產(chǎn)生的限定某些細胞行為的濃度被限定在較窄的范圍內(nèi)，為了使細胞在人造表面上達到可與天然骨相匹配的活性，必須采用一些手段來調(diào)節(jié)元素例如鈣的局部濃度。組合物的氣孔率可以通過介質(zhì)的流動或擴散來實現(xiàn)這一目的。
本發(fā)明的穩(wěn)定的生物活性人造組合物提供了獨特的化學(xué)組合物，它具有獨特的表面形態(tài)和以前從未證實過的內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)和體外具有穩(wěn)定的骨細胞生物活性的組合物并且這種組合物在體內(nèi)能夠容易、精確和可重復(fù)地定量以前從未報道過。穩(wěn)定組合物的性質(zhì)是通用的，可將它們制成粉末、薄膜、厚涂層、整體陶瓷件或巨孔整體陶瓷件。在各種情況下，獨特的表面形態(tài)、內(nèi)部微孔率以及穩(wěn)定的磷酸鈣相組成得到保持。如圖14所示，用本發(fā)明的穩(wěn)定組合物制成的整體陶瓷的微孔表面形態(tài)得到保持。
本發(fā)明的穩(wěn)定組合物適合于體外診斷，以便以大規(guī)模和自動方式表征異常骨細胞的功能。穩(wěn)定的人造組合物還易于用作骨和牙植入物的涂層，以促進組織再生和修復(fù)。該組合物的結(jié)構(gòu)應(yīng)使其與體內(nèi)骨組織和細胞極為相似，因此可與體內(nèi)骨組織和細胞相匹配，以避免帶來排斥外來材料的問題。
本發(fā)明的組合物具有所需的物理特性以及與體內(nèi)硬組織的親合性/相匹配性，致使它們能用于各種治療領(lǐng)域中，例如用于提供體內(nèi)植入物以及體內(nèi)再生和修復(fù)骨組織，例如替代髖部和膝蓋、骨折和牙的植入物。所述組合物還可用于在體外進行的各種組織工程應(yīng)用，以提供人造骨材料，然后將這種材料作為體內(nèi)骨移植物而被植入，用于骨組織替代、再生和修復(fù)。病人可提供用于在組合物上培養(yǎng)的破骨細胞和成骨細胞，以降低組織排斥的機會，由此產(chǎn)生完全相匹配的骨移植物。另外，供體骨細胞也可用于該目的?？梢栽谟谢驔]有用于產(chǎn)生骨組織的骨細胞的存在下制備這種移植物，用于組織移植。但是，優(yōu)選地是含有細胞的移植物來自于自體供體，使得與組織排斥有關(guān)的問題減至最小。粉末形式的穩(wěn)定組合物還可用作醫(yī)學(xué)治療。穩(wěn)定的粉末可以混合并懸浮在與組織相匹配并且無毒的聚合物中，然后在體內(nèi)施用以填充骨組織上的孔隙。
可使用本發(fā)明組合物的所有用途都具有優(yōu)點，即破骨細胞和成骨細胞可以通過任何形式的組合物而起作用，由此使骨組織體系更接近體內(nèi)存在的體系。本發(fā)明的人造生物活性組合物促進了骨質(zhì)傳輸和吸收，以便可以發(fā)生正常組織的愈合和再生，同時在正常骨組織重建過程中吸收人造材料。
下面的方法舉例說明提供生物活性人造燒結(jié)組合物的本發(fā)明的有關(guān)方面，所述的組合物具有穩(wěn)定的磷酸鈣本體，它還顯示出維持其上的骨細胞活性的獨特形態(tài)。方法1.制備羥基磷灰石溶膠—凝膠物質(zhì)下面的方法是制備足夠量的用于制備目的的溶膠—凝膠羥基磷灰石。溶液A含有硝酸鈣四水合物和溶液B含有正磷酸二氫銨(一價堿)。混合溶液A和溶液B，生成所需的溶膠—凝膠即溶液C。向4.722g硝酸鈣(Ca(NO3)2)中加入40ml二次蒸餾水以制備溶液A。以中等速度攪拌該溶液達足夠的時間以溶解全部的硝酸鈣，攪拌時間通常在3分鐘以內(nèi)。向該溶液中加入3ml氫氧化銨(NH4OH)，再攪拌約3分鐘。測定溶液的pH值，要求pH值約為12。向該溶液中加入37ml二次蒸餾水，使溶液的總體積達到約80ml。再攪拌溶液7分鐘并蓋上該溶液。
向250ml裝有1.382gNH4H2PO4的燒杯中加入60ml二次蒸餾水以制備溶液B。蓋上燒杯并以中等速度攪拌3-4分鐘，直到全部的NH4H2PO4溶解。向該溶液中加入71ml NH4OH，然后蓋上燒杯，再連續(xù)攪拌約7分鐘。測定溶液的pH值，要求pH值約為12。向該溶液中再加入61ml二次蒸餾水，蓋上溶液以使溶液的總體積達到約192ml。再攪拌溶液7分鐘并蓋上溶液。
接著合并溶液B和溶液A，以制備所需的溶膠—凝膠。將所有的溶液A加入到500ml試劑瓶中。以中等速度開始攪拌，并以大約256ml/小時的速率向試劑瓶中加入溶液B，直到將全部的192ml溶液B供入溶液A中。過量的溶液B可用于補償在250ml燒杯中保留的或在轉(zhuǎn)移過程中管子中的任何溶液。在完成加料和溶液A與溶液B的合并以后，以中等速度連續(xù)攪拌所制成的溶液大約23-24小時。觀察產(chǎn)生的溶膠—凝膠是否有任何異常的沉淀或附聚。如果發(fā)生了任何異常的沉淀或附聚，那么必須丟棄溶液并次開始制備過程。然后小心地將該溶膠轉(zhuǎn)移到另一個500ml試劑瓶中，以避免混入可能存在在原始試劑瓶的壁上的任何顆粒附聚物。向離心瓶中加入大約240ml的溶液C即生成的溶膠—凝膠，并在室溫下以500rpm的速度離心20分鐘。離心后，在不干擾沉降物的情況下倒掉180ml上清液。通過以平穩(wěn)轉(zhuǎn)動的方式混合使沉降物緩慢地再懸浮約30分鐘。然后測定溶膠—凝膠的粘度，優(yōu)選地為20-60cP。隨后就可以將溶膠—凝膠用于浸涂所選擇的基體或用于其它應(yīng)用。方法2.制備摻雜二氧化硅的羥基磷灰石物質(zhì)按如下方法制備二氧化硅溶液。所確定的量為每4ml溶液中大約含有0.168gSiO2。將4ml二氧化硅溶液加入到60ml在方法1中制備的經(jīng)離心的羥基磷灰石溶膠—凝膠物質(zhì)中，并與轉(zhuǎn)變反應(yīng)中生成的0.168gCaO反應(yīng)。硅溶液組分正硅酸四丙酯Si(OC3H7)47.32gm2-甲氧基乙醇CH3OCH2CH2OH34.5gm將二氧化硅溶液加入到由方法1制備的羥基磷灰石物質(zhì)中，以使SiO2的濃度與在燒結(jié)轉(zhuǎn)變過程中產(chǎn)生的CaO的濃度的比為1M SiO2/l摩爾CaO。方法3.制備薄膜根據(jù)基體的性質(zhì)，可用方法1或方法2制備羥基磷灰石溶膠—凝膠物質(zhì)的方法來制備薄膜。如果基體能提供燒結(jié)膜中所需的穩(wěn)定本體的話，那么可以采用方法1。如果基體不能提供這類穩(wěn)定本體，那么將需要采用具有摻雜添加劑的方法2。
在將薄膜涂覆到基體上之前，需要徹底地清潔基體，以確保膜具有令人滿意的覆蓋度。在基體是石英的情況下，通過將盤放置在玻璃燒杯中并向玻璃燒杯中加入鉻酸清洗溶液并覆蓋整個盤來實現(xiàn)清潔。然后蓋上燒杯。接著在水浴中聲處理該盤1小時。用自來水沖洗酸20分鐘。通過三次更換二次蒸餾水除去殘余的自來水。在最后一次更換二次蒸餾水后，用不起毛的抹布擦干各單個盤并檢查石英表面上的毛病。需要時用壓縮氮氣或空氣清除表面上的任何殘余顆粒。將所述盤在無菌環(huán)境下存放在帶蓋容器中。這種方法可用來清潔任何類型的石英基體。
將具有適當組成的石英盤基體或其它基體浸漬在方法1制備的溶膠—凝膠中。抓住盤的邊緣以避免觸及表面。將盤浸漬在溶膠中，優(yōu)選地是通過機械方法進行。按預(yù)定的取出速度從溶膠中取出盤。除去盤一側(cè)上的涂層。然后將涂覆的基體置于清潔的陪替式培養(yǎng)皿中，蓋上蓋并在室溫下干燥。在燒結(jié)前形成的膜應(yīng)該是均勻，無裂紋、塊或孔隙。應(yīng)該清楚涂覆盤表面的浸涂工藝也可用來涂覆其它形狀的基體，例如平面矩形石英基體。方法4.制備羥基磷灰石干粉將按方法1或2制備的溶膠—凝膠物質(zhì)在100℃干燥約8小時。然后采用研缽、研杵和其它能研磨和產(chǎn)生細顆粒的機械方法研磨干燥的物質(zhì)。隨后按下面如方法7所述的標準的燒結(jié)過程燒結(jié)粉末，其不同之處在于將粉末置于坩堝中進行燒結(jié)，然后在冷卻后再次研磨。可用相同的方法制備摻雜或穩(wěn)定的羥基磷灰石。方法5.生產(chǎn)整體陶瓷件按照下面的方法用摻雜二氧化硅的羥基磷灰石粉末制備陶瓷(三維整件)。摻雜的溶膠—凝膠物質(zhì)是按方法2制成的。貯存部分溶膠—凝膠物質(zhì)并將剩余的一部分過濾。在120℃下干燥粉末，研磨制成細粉末。將約0.09gm的粉末置于塑料盤中。使用玻璃滴管形成初始溶膠—凝膠物質(zhì)的滴液，所述的溶膠—凝膠當與粉末混合時重量約為0.055gm。將溶膠與粉末混合成潮濕狀，但不是濕的漿料。將該潮濕狀漿料裝入到直徑為6.25mm的不銹鋼模中，以2千公斤/分鐘的壓力壓制。從壓模中取出整件，在空氣中干燥，并按方法7在帶蓋的氧化鋁坩堝中進行燒制。其表面形態(tài)與圖14所示的人造燒結(jié)薄膜的形態(tài)極為相似。方法6.制備具有微孔結(jié)構(gòu)的整體陶瓷件將按方法2制備的摻雜有穩(wěn)定本體例如二氧化硅并在1000℃下燒結(jié)的羥基磷灰石粉末與大小合適的苯乙烯球混合，用另外的溶膠—凝膠物質(zhì)濕潤粉末，在約1噸/cm2的壓力下壓制，以便不會擠壓苯乙烯。采用剩余溶膠和2.5％(重量)的聚乙烯醇溶液濕潤混合物，壓實粉末/苯乙烯以增加其生坯強度。在空氣或氧氣中加熱到550℃進行熱解，除去苯乙烯。然后按方法7所描述的標準燒結(jié)的方式將微孔陶瓷燒制到1000℃。方法7.燒結(jié)羥基磷灰石物質(zhì)下面的燒結(jié)過程可以在各種尺寸，能在環(huán)境溫度至1100℃的溫度下進行操作的標準實驗室窯爐內(nèi)進行，該窯爐被設(shè)計成可以使其內(nèi)部溫度保持在精確和穩(wěn)定的狀態(tài)，尤其使溫度處在800-1100℃的范圍內(nèi)，例如使用Lindberg型51744或894-Blue M爐子。將按方法3、4、5或6制備的組分小心地轉(zhuǎn)移到標準陶瓷板上(如在Lindberg爐中通常進行的)。陶瓷板在燒結(jié)過程中用作載體，從而可以容易地向爐子中裝入和取出多個基體。將爐溫設(shè)置到可以達到所需的HAα-TCP比例的溫度。使用可以用程序控制的爐子例如Lindberg型894-Blue M的爐子，可使爐子被程序控制，以保持所要求的溫度，溫度通常被設(shè)置在920-1100℃，燒結(jié)時間最長為1小時，以確保硅本體擴散通過由羥基磷灰石和α-磷酸三鈣所形成的梯度層。在使用不能用程序控制的爐子的情況下，可以使用獨立式計時器，旨在在選擇的溫度下在所需的燒結(jié)時間結(jié)束時提醒操作者關(guān)閉爐子。在將爐內(nèi)溫度冷卻到手可以接觸并安全的溫度(大約60℃)后，在任何時間取出帶有燒結(jié)基體的陶瓷板。然后可以包裝或貯存單個基體用于最終的應(yīng)用。
根據(jù)該方法，羥基磷灰石/α-磷酸三鈣的薄膜和增厚涂層可以按穩(wěn)定的方式來生產(chǎn)，其產(chǎn)品具有所需的組成，結(jié)果使得各種工藝參數(shù)的變化程度達到最小，以確保這種穩(wěn)定性。
盡管在本文中詳細描述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，但是對于本領(lǐng)域內(nèi)那些熟練的技術(shù)人員來說應(yīng)該清楚在不違背本發(fā)明精神或所附的權(quán)利要求書范圍的情況下可改變本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.用來提供能穩(wěn)定地維持其上的骨細胞活性形態(tài)的生物活性人造燒結(jié)組合物，所述的組合物含有穩(wěn)定的磷酸鈣相，該磷酸鈣相是在有穩(wěn)定本體存在的情況下，通過在燒結(jié)溫度下將羥基磷灰石物質(zhì)轉(zhuǎn)變成難溶并且穩(wěn)定的磷酸三鈣而產(chǎn)生的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的穩(wěn)定的磷酸三鈣主要是α-磷酸三鈣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述的組合物為粉末、薄膜、厚涂層或三維整體材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述的膜厚約0.1-10微米。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述的羥基磷灰石物質(zhì)在燒結(jié)前就被施加在基體上，所述基體含有選自硅本體、鋁本體、鋯本體、鋇本體、鈦本體和它們的混合物的組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述的穩(wěn)定本體是在燒結(jié)期間從所述的基體中釋放出來的或者是在燒結(jié)前添加到羥基磷灰石物質(zhì)中的。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、5或6的組合物，其中所述的穩(wěn)定本體選自硅、鍺、鉻、釩、鈮、鈦、硼、鋁、鋯和其混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述的組合物被涂覆到石英基體上，硅本體是在燒結(jié)期間從石英中釋放到所形成的磷酸鈣相中以穩(wěn)定α-磷酸三鈣。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述的硅本體是在燒結(jié)前以溶液形式加入到羥基磷灰石物質(zhì)中的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9的組合物，其中所述的硅本體是正硅酸四丙酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的磷酸鈣相中羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例為50∶50-20∶80。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的組合物難溶于pH值為約6.4-7.3的生理液體中。
13.用來提供能穩(wěn)定地維持其上的骨細胞活性形態(tài)的生物活性人造燒結(jié)組合物的制備方法，所述的方法包括通過燒結(jié)使羥基磷灰石物質(zhì)主要轉(zhuǎn)變成α-磷酸三鈣，和提供起穩(wěn)定作用的本體以使所形成的α-磷酸三鈣穩(wěn)定并在磷酸鹽相中難溶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所形成的組合物為粉末、薄膜、涂層或三維固體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述所羥基磷灰石物質(zhì)被施加在基體上，所述基體含有選自硅本體、鋁本體、鋯本體、鈦本體、硼本體、鍺本體、鉻本體、釩本體、鈮本體和它們的混合物的組分。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的穩(wěn)定本體是從所述的基體中釋放到在燒結(jié)期間形成的羥基磷灰石相中的。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或16的方法，其中所述的穩(wěn)定本體選自硅、鋁、鋯、鈦、硼、鍺、鉻、釩、鈮和其混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的羥基磷灰石物質(zhì)被涂覆到石英基體上，硅本體是在燒結(jié)期間從石英中釋放到所形成的磷酸鈣相中以穩(wěn)定α-磷酸三鈣。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在燒結(jié)前以溶液的形式將硅本體加入到羥基磷灰石物質(zhì)中。
20.根據(jù)權(quán)利要求13或19的方法，其中所述的硅本體是正硅酸四丙酯。
21.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的磷酸鈣相中羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例為50∶50-20∶80。
22.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中羥基磷灰石物質(zhì)的燒結(jié)是在900-1100℃的溫度下進行的。
23.用來維持骨細胞活性的燒結(jié)人造微孔多晶結(jié)構(gòu)，所述的結(jié)構(gòu)含有燒結(jié)的穩(wěn)定磷酸鈣相，該磷酸鈣相在所述的結(jié)構(gòu)中具有內(nèi)連微孔的松散內(nèi)連圓形顆粒的球形表面形態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的多晶結(jié)構(gòu)，其中所述的結(jié)構(gòu)具有如圖10所示的球形表面形態(tài)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的多晶結(jié)構(gòu)，其中所述的圓形顆粒的橫向尺寸在0.5-1微米的范圍內(nèi)。
26.一種可植入的鈣化骨基質(zhì)，含有a)用來維持所述基質(zhì)的結(jié)構(gòu)；b)穩(wěn)定的磷酸鈣相層，該磷酸鈣相是在穩(wěn)定本體的存在下，通過在燒結(jié)溫度下將羥基磷灰石物質(zhì)轉(zhuǎn)變成磷酸三鈣而產(chǎn)生的，其中穩(wěn)定本體使磷酸鈣相不溶并穩(wěn)定；c)由在上述的穩(wěn)定的磷酸鈣相層上培養(yǎng)的成骨細胞沉積而成的界面層；和d)由這種培養(yǎng)的成骨細胞分泌的礦化膠原基質(zhì)。
27.權(quán)利要求26所述的可植入的鈣化骨基質(zhì)，其中所述的骨基質(zhì)不含包括成骨細胞在內(nèi)的骨細胞。
28.權(quán)利要求26所述的可植入的鈣化骨基質(zhì)，其中所述的基質(zhì)包含患者的包括成骨細胞在內(nèi)的骨細胞。
29.權(quán)利要求26所述的可植入的鈣化骨基質(zhì)，其中所述的基質(zhì)能被破骨細胞吸收。
30.用權(quán)利要求1或2的組合物制成的整體陶瓷微孔結(jié)構(gòu)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的整體陶瓷微孔結(jié)構(gòu)，其中所述的結(jié)構(gòu)具有內(nèi)部巨孔。
32.一種用權(quán)利要求1或2所述的燒結(jié)組合物涂覆的可植入的裝置。
33.一種主要由權(quán)利要求1所述的組合物組成的可植入的裝置。
34.培養(yǎng)有功能的骨細胞的方法，所述方法包括將懸浮在生理介質(zhì)中的骨細胞懸浮液施加到在基體上的穩(wěn)定磷酸鈣相的人造燒結(jié)膜上，所述的膜含有穩(wěn)定且難溶的α-磷酸三鈣復(fù)合物。
35.一種用來監(jiān)測和定量測定骨細胞活性的試劑盒，所述的試劑盒包含具有磷酸鈣相燒結(jié)膜的基體，所述的磷酸鈣相含有穩(wěn)定和難溶的α-磷酸三鈣，粘附到所述基體上的多孔骨細胞培養(yǎng)裝置。
36.一種用于體外對礦化膠原基質(zhì)進行處理的方法，該方法包括如下的步驟—提供一種具有松散內(nèi)連圓形顆粒的球狀表面形態(tài)并且在結(jié)構(gòu)內(nèi)有內(nèi)連微孔的人造穩(wěn)定的組合物，—向該組合物上施加懸浮在生理介質(zhì)中的成骨細胞懸浮液，—培育由成骨細胞在培養(yǎng)液中選出的礦化膠原基質(zhì)；和—將分離出的膠原骨基質(zhì)植入病人體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供能穩(wěn)定地維持其上的骨細胞活性形態(tài)的生物活性人造穩(wěn)定的燒結(jié)磷酸鈣相組合物。所述組合物含有穩(wěn)定的磷酸鈣相,它們是在有穩(wěn)定本體存在的情況下在燒結(jié)溫度下通過將羥基磷灰石物質(zhì)轉(zhuǎn)變成難溶和穩(wěn)定的磷酸三鈣而產(chǎn)生的。本發(fā)明在評價異常骨細胞活性以及醫(yī)學(xué)治療的醫(yī)學(xué)診斷,包括骨和牙組織更換和修復(fù)以及體外骨接肢組織工程方面有許多用途。
文檔編號C04B38/00GK1195336SQ96196686
公開日1998年10月7日 申請日期1996年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月1日
發(fā)明者悉尼·M·皮尤, 蒂莫西·J·N·史密斯, 邁克爾·塞耶, 薩拉·多西·蘭斯塔夫 申請人:米列姆·貝爾羅吉克公司