專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改變的效應(yīng)功能的多肽變體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包括Fc區(qū)變體的多肽。更具體而言，本發(fā)明涉及含F(xiàn)c區(qū)的多肽，因?yàn)樵谄銯c區(qū)中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，其具有改變的效應(yīng)功能。
相關(guān)領(lǐng)域的敘述抗體是蛋白質(zhì)，其具有與特定抗原的結(jié)合特異性。天然抗體通常是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，包括兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈。每個(gè)輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而在不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數(shù)目是不同的。每個(gè)重鏈和輕鏈還具有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈在其一個(gè)末端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，隨后是幾個(gè)恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈在其一個(gè)末端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，在其另一個(gè)末端為一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基被認(rèn)為構(gòu)成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的相互作用。
術(shù)語(yǔ)“可變”指在抗體之間可變區(qū)某些部分的序列差異很大，并且負(fù)責(zé)每種具體抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合特異性。然而，可變性不是平均的分布于整個(gè)抗體的可變區(qū)中。在輕鏈和重鏈的可變區(qū)中，它集中分布于稱(chēng)為互補(bǔ)決定簇(CDR)的三個(gè)節(jié)段中。可變區(qū)中保守性較高的部分稱(chēng)為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)分別包括四個(gè)FR，主要為β片層構(gòu)象，被三個(gè)CDR連接，這些CDR形成與β片層結(jié)構(gòu)相連的環(huán)狀，在一些情況成為該β一片層結(jié)構(gòu)的一部分)。每條鏈中的CDR通過(guò)FR緊密的結(jié)合在一起，并與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
恒定區(qū)不直接參與抗原抗體的結(jié)合，但具有各種效應(yīng)功能。根據(jù)抗體或免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將它們分成不同類(lèi)。主要有5類(lèi)免疫球蛋白Ig A、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以進(jìn)一步分為亞類(lèi)(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。相應(yīng)于免疫球蛋白不同類(lèi)的重鏈恒定區(qū)分別稱(chēng)為α、δ、ε、γ和μ。在各種人類(lèi)免疫球蛋白類(lèi)中，只有人IgG1、IgG2、IgG3和IgM已知可激活補(bǔ)體；并且人IgG1和IgG3介導(dǎo)ADCC比IgG2和IgG4更有效。
天然IgG1的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)

圖1，其中指出了天然抗體分子的各個(gè)部分。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱(chēng)為Fab段，每個(gè)片段帶有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及一個(gè)殘留的Fc片段，其名稱(chēng)反映了其易結(jié)晶的性能。人IgG Fc區(qū)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定(Deisenhofer，生物化學(xué)202361-2370(1981))。在人IgG分子中，通過(guò)木瓜蛋白酶切割N末端到Cys226，產(chǎn)生Fc區(qū)。Fc區(qū)對(duì)于抗體的效應(yīng)功能是重要的。
由抗體Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)功能可以分為兩種(1)在抗體與抗原結(jié)合之后發(fā)揮作用的效應(yīng)功能(這些功能涉及參與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)或Fc受體(FcR)-負(fù)荷細(xì)胞)；和(2)不依賴(lài)于抗原結(jié)合而發(fā)揮作用的效應(yīng)功能(這些功能提供在血循環(huán)中的持續(xù)性和通過(guò)胞吞作用穿過(guò)細(xì)胞屏障的能力)。Ward和Ghetie，治療免疫學(xué)277-94(1995)。
雖然抗體與所需抗原的結(jié)合具有中和效應(yīng)，這可能阻止外源抗原與其內(nèi)源靶點(diǎn)(例如受體或配體)的結(jié)合，但僅靠結(jié)合可能不能去除外源抗原。為了有效的去除和/或破壞外源抗原，抗體應(yīng)該同時(shí)具備與其抗原的高親和力和有效的效應(yīng)功能。
Fc受體(FcR)結(jié)合抗體和抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的相互作用引起各種反應(yīng)，包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)(見(jiàn)Daeron的綜述，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997)；)Ward和Ghetie，治療免疫學(xué)277-94(1995)；以及Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。
幾種抗體效應(yīng)功能由與抗體Fc區(qū)結(jié)合的Fc受體(FcR)介導(dǎo)。FcR根據(jù)其對(duì)免疫球蛋白同種型的特異性而被限定；IgG抗體的Fc受體被稱(chēng)為FcγR，IgE的為FcεR，IgA的為FcαR等等。已經(jīng)鑒定了FcγR的三個(gè)亞類(lèi)FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγR(CD16)。因?yàn)槊總€(gè)FcγR亞類(lèi)是由兩個(gè)或三個(gè)基因編碼，并且由于選擇性RNA剪接導(dǎo)致形成多種轉(zhuǎn)錄本，所以存在很多種FcγR同種型。編碼FcγRI亞類(lèi)的三個(gè)基因(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)簇集在1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的1q21.1區(qū)域；編碼FcγII同種型的三個(gè)基因(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC)和編碼FcγRIII的兩個(gè)基因(FcγRIIIA、和FcγRIIIB)均簇集于1q22區(qū)。這些不同的FcR亞型在不同類(lèi)型的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(見(jiàn)Ravetch和Kinet的綜述，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。例如，在人類(lèi)中，F(xiàn)cγRIIIB僅在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而FcγRIIIA在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞的一個(gè)亞群中發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，F(xiàn)cγRIIIA是在NK細(xì)胞上僅有的FcR受體，NK細(xì)胞是參與ADCC的細(xì)胞類(lèi)型之一。
FcγRI、FcγRII和FcγRIII是免疫球蛋白超家族(IgSF)受體；FcγRI在其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有三個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域，而FcγRII和FcγRIII在它們的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中僅有兩個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域。
Fc受體的另一種類(lèi)型是新生Fc受體(FcRn)。FcRn在結(jié)構(gòu)上與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相似，由與β2微球蛋白非共價(jià)結(jié)合的α鏈組成。
人和鼠抗體的FcγR結(jié)合位點(diǎn)先前定位在所謂的由殘基233-239組成的“低鉸鏈區(qū)”(EU標(biāo)號(hào)見(jiàn)Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Woof等，Molec.Immunol.23319-330(1986)；Duncan等，自然332563(1988)；Canfield和Morrison，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.1731483-1491(1991)；Chappel等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊889036-9040(1991)。在殘基233-239中，P238和S239已經(jīng)被引證為可能涉及結(jié)合過(guò)程，但是還從來(lái)沒(méi)有通過(guò)取代或缺失來(lái)評(píng)價(jià)這兩個(gè)殘基。
其它先前被引用的可能參與與FcγR結(jié)合的區(qū)域是針對(duì)人FcγRI的G316-K338(人IgG)(僅通過(guò)序列比較，沒(méi)有評(píng)估取代突變)(Woof等，Molec.Immunol.23319-330(1986))；針對(duì)人FcγRIII的K274-R301(人IgG1)(基于肽)(Sarmary等，Molec.Immunol.2143-51(1984))；針對(duì)人FcγRIII的Y407-R416(人IgG)(Gergely等，Biochem.soc.trans.12739-743(1984))；以及針對(duì)鼠FcγRII的N297和E318(鼠IgG2b)(Lund等，Molec.Immunol.2953-59(1992))。
將IgG3中的Pro331變成Ser，并且分析此變體與靶點(diǎn)的親和力。發(fā)現(xiàn)其親和力比未突變的IgG3的親和力低6倍，表明在FcγRI的結(jié)合過(guò)程中涉及Pro331。Morrison等，免疫學(xué)家，2119-124(1994)；和Canfield和Morrison，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.1731483-91(1991)。
C1q結(jié)合C1q和兩個(gè)絲氨酸蛋白酶，C1r和C1s，形成復(fù)合物C1，其為補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒(CDC)途徑的第一個(gè)組分。C1q為六價(jià)分子，其分子量約為460000，結(jié)構(gòu)與一束郁金香花相似，其中六個(gè)膠原狀莖與六個(gè)球狀頭相連。Burton和Woof，免疫學(xué)進(jìn)展.511-84(1992)。為了激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，C1q必需結(jié)合與抗原性靶點(diǎn)結(jié)合的至少兩個(gè)IgG1、IgG2或IgG3分子(其一致性是IgG4不能激活補(bǔ)體)，但需要結(jié)合一個(gè)IgM分子。Ward和Ghetie，治療免疫學(xué)277-94(1995)見(jiàn)第80頁(yè)。
根據(jù)化學(xué)修飾和結(jié)晶學(xué)研究的結(jié)果，Burton等(自然，288338-344(1980))提出在IgG上補(bǔ)體亞組分C1q的結(jié)合位點(diǎn)涉及至少兩個(gè)(C末端)CH2結(jié)構(gòu)域的β鏈。Burton(Molec.Immunol.22(3)161-206(1985))后來(lái)提出包括氨基酸殘基318到337的區(qū)域可能參與補(bǔ)體的固定。
Duncan和Winter(自然332738-40(1988))，(利用定點(diǎn)誘變的方法)，報(bào)道Glu318、Lys320和Lys322形成C1q的結(jié)合位點(diǎn)。Duncan和Winter的資料是通過(guò)檢測(cè)小鼠IgG2b同種型與豚鼠C1q的結(jié)合而得到的。通過(guò)含這些殘基的短合成肽抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的能力，證實(shí)了Glu318、Lys320和Lys322殘基在結(jié)合C1q中的作用。在1997年7月15日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5648260和1997年4月29日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5624821中，也報(bào)道了相似的結(jié)果。
通過(guò)分析人IgG亞類(lèi)實(shí)施補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的能力，表明了殘基Pro331在C1q結(jié)合中的作用。在IgG4中Ser331突變?yōu)镻ro331可提供激活補(bǔ)體的能力(Tao等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178661-667(1993)；Brekke等，歐洲免疫學(xué)雜志，242542-47(1994))。
根據(jù)對(duì)Winter的研究組與Tao等和Brekke等的論文的比較，Ward和Ghetie在他們的綜述文章中總結(jié)認(rèn)為C1q的結(jié)合涉及至少有兩個(gè)不同的區(qū)域一個(gè)在攜有Glu318、Lys320和Lys322殘基的CH2結(jié)構(gòu)域的β鏈上，另一個(gè)在十分靠近相同β鏈的轉(zhuǎn)角上，并在331位上包含一個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基。
其它報(bào)道表明位于人IgG1低鉸鏈區(qū)的殘基Leu235和Gly237在補(bǔ)體固定和激活中起關(guān)鍵作用。Xu等，免疫學(xué).150152A(摘要)(1993)。1994年10月22日公開(kāi)的WO94/29351中報(bào)道人IgG1的C1q和FcR結(jié)合所必須的氨基酸殘基位于CH2的N末端區(qū)域，即殘基231到238。
進(jìn)一步提出IgG結(jié)合C1q并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的能力也依賴(lài)位于兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間的糖類(lèi)組分(在正常情況下其錨著在Asn297上)的存在、缺失或修飾。Ward和Ghetie，治療免疫學(xué)277-94(1995)見(jiàn)第81頁(yè)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供親本多肽的含F(xiàn)c區(qū)的變體，此變體在人效應(yīng)細(xì)胞存在的條件下，比親本多肽更有效的介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，或以更強(qiáng)的親和力與Fcγ受體(FcγR)結(jié)合，并且在Fc區(qū)包括至少一個(gè)氨基酸修飾。例如，所述多肽變體可以包括抗體或免疫粘附素。所述親本多肽的Fc區(qū)優(yōu)選包括人Fc區(qū)；例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。所述多肽變體優(yōu)選包括在Fc區(qū)的氨基酸位點(diǎn)256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430之一或多處的氨基酸修飾(例如取代)，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
另外，本發(fā)明提供了多肽，其包括帶有改變了的Fcγ受體(FcγR)結(jié)合親和力的Fc區(qū)變體，此多肽包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。所述Fc區(qū)變體優(yōu)選包括人IgG Fc區(qū)的變體，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區(qū)的變體。因此應(yīng)注意，在上述領(lǐng)域的工作中，當(dāng)親本多肽具有非人類(lèi)的鼠Fc區(qū)時(shí)，不同于在此鑒定的殘基的那些被認(rèn)為影響FcR結(jié)合。例如，在鼠IgG2b/鼠FcγRII系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)IgG E318對(duì)結(jié)合是重要的(Lund等，分子免疫學(xué)27(1)53-59(1992))，而E318A對(duì)人IgG/人FcγRII系統(tǒng)沒(méi)有影響(下述表六)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，具有改變了的FcγR結(jié)合活性的多肽變體顯示與FcγR的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
例如，所述多肽變體顯示與FcγRI的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)氨基酸位點(diǎn)238、265、269、270、327或329的任何一或多個(gè)上的氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
所述多肽變體顯示與FcγRII的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
所述多肽變體顯示與FcγRIII的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，具有改變了的FcγR結(jié)合活性的多肽變體顯示與FcγR的結(jié)合增強(qiáng)，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、298、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、333、334、337、340、360、378、398或430，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
例如，所述多肽變體顯示與FcγRIII的結(jié)合增強(qiáng)，并且還任選進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRII結(jié)合降低。這類(lèi)變體的實(shí)例包括在Fc區(qū)的位點(diǎn)298和/或333上的氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
所述多肽變體顯示與FcγRII的結(jié)合增強(qiáng)，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398或430，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。與FcγRII結(jié)合增強(qiáng)的這些多肽變體可任選進(jìn)一步顯示與FcγRIII的結(jié)合降低，還可以例如包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為268、272、298、301、322或340，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供多肽，其包括具有改變了的新生Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力的Fc區(qū)變體，所述多肽包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。與FcRn結(jié)合降低的這些多肽可以包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或477，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。上述多肽變體可任選顯示與FcRn的結(jié)合增強(qiáng)，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
本發(fā)明還提供了組合物，其包括所述多肽變體和在生理上或藥理上可接受的載體或稀釋劑。將用于治療的此組合物滅菌，并且可凍干。
本發(fā)明還涉及本文公開(kāi)的多肽變體的診斷和治療應(yīng)用。在一個(gè)診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)目的抗原的存在的方法，所述方法包括將懷疑含有所述抗原的樣品暴露于所述多肽變體，并且檢測(cè)所述多肽變體與該樣品的結(jié)合。在一個(gè)治療應(yīng)用中，本發(fā)明提供了治療患有或易患疾病或病癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的本發(fā)明多肽變體，或包括所述多肽變體及可藥用載體的組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的編碼所述多肽變體的核酸；包含該核酸的載體，所述核酸可任選與控制序列可操作地連接，該控制序列能被該載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞識(shí)別；包含該載體的宿主細(xì)胞；產(chǎn)生多肽變體的方法，所述方法，包括培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以使所述核酸表達(dá)，并且可任選從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述多肽變體(例如從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備具有改變的Fc受體(FcR)親和力或改變的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)型細(xì)胞毒作用(ADCC)的活性的Fc區(qū)變體的方法，所述方法包括(a)將一或多個(gè)氨基酸修飾引入親本多肽的Fc區(qū)以產(chǎn)生Fc區(qū)變體；(b)檢測(cè)該Fc區(qū)變體與FcR的結(jié)合，或檢測(cè)該Fc區(qū)變體的ADCC活性。
所述方法的步驟(b)可以包括在體外檢測(cè)所述Fc區(qū)與一或多個(gè)FcR的結(jié)合。而且，在其步驟(b)中，所述方法可以鑒定FcR結(jié)合親和力提高或ADCC活性提高的Fc區(qū)變體。當(dāng)步驟(b)包括檢測(cè)Fc區(qū)與FcR的結(jié)合時(shí)，所述的FcR可以是例如人Fcγ受體III(FcγRIII)。當(dāng)步驟(b)包括檢測(cè)Fc區(qū)變體與至少兩種不同F(xiàn)cR的結(jié)合時(shí)，被檢測(cè)的所述FcR優(yōu)選包括人Fcγ受體II(FcγRII)和人Fcγ受體III(FcγRIII)。
附圖簡(jiǎn)述圖1是天然IgG的示意圖。CH1和CL結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵用黑線(xiàn)代表。V是可變區(qū)；C是恒定區(qū)；L鏈表示輕鏈，H鏈表示重鏈。
圖2表示野生型(wt)C2B8抗體的C1q結(jié)合；具有人IgG2恒定區(qū)(IgG2)的C2B8抗體；和變體K322A、K320A和E318A。
圖3描述變體P331A、P329A和K322A的C1q結(jié)合。
圖4A和4B描述E27抗IgE抗體輕鏈(圖4A；SEQ ID NO1)和重鏈(圖4B；SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
圖5為在實(shí)施例1所述FcR檢測(cè)中應(yīng)用而制備的“免疫復(fù)合物”的示意圖。其顯示含三個(gè)抗IgE抗體分子(“含F(xiàn)c區(qū)的多肽”)和三個(gè)IgE分子(“第一靶分子”)的六聚體。IgE在其Fc區(qū)中有兩個(gè)抗IgE抗體(E27)的“結(jié)合位點(diǎn)”。該復(fù)合物中每個(gè)IgE分子能夠進(jìn)一步與兩個(gè)VEGF分子結(jié)合(“第二靶多肽”)。VEGF具有兩個(gè)IgE結(jié)合位點(diǎn)。
圖6表示與野生型C2B8相比變體D270K和D270V的C1q結(jié)合結(jié)果。
圖7描述與野生型C2B8相比變體D270K和D270V的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)。
圖8表示293細(xì)胞產(chǎn)生的野生型C2B8抗體(293-Wt-C2B8)、CHO細(xì)胞產(chǎn)生的野生型C2B8抗體(CHO-Wt-C2B8)和各種變異抗體的C1q結(jié)合ELISA的結(jié)果。
圖9表示實(shí)施例3中檢測(cè)的野生型(wt)C2B8和各種變異抗體的C1q結(jié)合ELISA的結(jié)果。
圖10描述人IgG Fc區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，明示殘基Asp270、Lys326、Pro329、Pro331、Lys322和Glu333。
圖11表示實(shí)施例3中檢測(cè)的野生型C2B8和各種變異抗體的C1q結(jié)合ELISA的結(jié)果。
圖12表示野生型C2B8和雙變體K326M-E333S和K326-E333A的C1q結(jié)合ELISA結(jié)果。
圖13表示野生型C2B8和雙變體K326M-E333S和K326-E333A的CDC作用。
圖14描述具有人IgG4(IgG4)的C2B8、野生型C2B8(Wt-C2B8)、具有人IgG2恒定區(qū)(IgG2)的C2B8和所述變異抗體的實(shí)施例3中C1q結(jié)合ELISA的結(jié)果。
圖15A和15B表示親本抗體(E27)與FcγRIIB和FcγRIIIA的結(jié)合模式。圖15A表示人源化抗IgE E27 IgG1的單體(空心圓圈)、六聚體(實(shí)心方形)和由多六聚體(實(shí)心三角)組成的免疫復(fù)合物與人FcγRIIB(CD32)受體α亞單位的重組GST融合蛋白的結(jié)合模式。通過(guò)混合等克分子濃度的E27(其與人IgE的Fc區(qū)結(jié)合)和人骨髓瘤IgE，形成所述六聚體復(fù)合物(實(shí)心方形)。此六聚體是由3個(gè)IgG分子(均為150KD)和3個(gè)IgE分子(均為200KD)組成的穩(wěn)定的1.1kD復(fù)合物。所述免疫復(fù)合物(實(shí)心三角)為依次形成，首先通過(guò)混合等分子量的E27和重組抗VEGF IgE(具有能結(jié)合人VEGF的Fab可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的人IgE)形成六聚體。然后通過(guò)加入2×克分子濃度的人VEGF而連接六聚體，形成免疫復(fù)合物，VEGF是44KD的同型二聚體，每摩爾VEGF有兩個(gè)抗VEGF IgE結(jié)合位點(diǎn)。圖15B表示與人FcγRIIIA(CD16)受體α亞單位的重組GST融合蛋白的結(jié)合模式。
圖16A表示利用不同抗原抗體對(duì)的免疫復(fù)合物與FcγRIIA受體α亞單位的重組GST融合蛋白的結(jié)合。圖16B表示相同抗原抗體對(duì)與FcγRIIIA受體α亞單位的重組GST融合蛋白的結(jié)合。實(shí)心圓代表人IgEIgE E27 IgG1的結(jié)合；空心圓代表人VEGF人源化抗-VEGF IgG1的結(jié)合。
圖17概括了一些丙氨酸變體對(duì)不同F(xiàn)cγRs結(jié)合選擇性的差異。其顯示在IgE E27 IgG1的CH2結(jié)構(gòu)域中丙氨酸的變體與FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA的結(jié)合。1型與所有三個(gè)受體均不結(jié)合D278A(EU編號(hào)方式中的265)。2型增強(qiáng)與FcγRIIA和FcγRIIB的結(jié)合，而與FcγRIIIA的結(jié)合未受影響S280A(EU編號(hào)方式中的267)。3型增強(qiáng)與FcγRIIA和FcγRIIB的結(jié)合，但降低與FcγRIIIA的結(jié)合H281A(EU編號(hào)方式中的268)。4型降低與FcγRIIA和FcγRIIB的結(jié)合，而增強(qiáng)與FcγRIIA的結(jié)合S317A(EU編號(hào)方式中的298)。5型增強(qiáng)與FcγRIIIA的結(jié)合，而不影響與FcγRIIA和FcγRTIB的結(jié)合E352A、K353A(EU編號(hào)方式中的333和334)。
圖18A和18B分別比較了FcγRIIIA蛋白/蛋白檢測(cè)和以CHO GPI-FcγRIIIA細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)。圖18A說(shuō)明所選丙氨酸變體與FcγRIIA-GST融合蛋白的結(jié)合。S317A(EU編號(hào)方式中的298)和S317A/K353A(EU編號(hào)方式中的298和334)比E27野生型結(jié)合更好，而D278A(EU編號(hào)方式中的265)幾乎完全沒(méi)有結(jié)合。圖18B說(shuō)明在表達(dá)FcγRIIIA的重組GPI相連形式的CHO細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)合模式。
圖19A和圖19B分別比較了FcγRIIB蛋白/蛋白檢測(cè)和以CHO GPI-FcγRIIB細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)。圖19A說(shuō)明所選丙氨酸變體與FcγRIB-GST融合蛋白的結(jié)合。H281A(EU編號(hào)方式中的268)比E27野生型結(jié)合更好，而S317A(EU編號(hào)方式中的298)顯示結(jié)合降低。圖19B說(shuō)明在表達(dá)FcγRIIB的重組膜結(jié)合形式的CHO細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)合模式。
圖20顯示抗HER2 IgG1(HERCEPTIN)的CH2結(jié)構(gòu)域中的單個(gè)丙氨酸取代(在蛋白-蛋白檢測(cè)和以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)中均影響FcγRIIIA結(jié)合)改變了與外周血單核細(xì)胞(PBMC)效應(yīng)細(xì)胞上的FcγRIIIA結(jié)合的能力。將100ng/ml(實(shí)心圓)和1.25ng/ml(實(shí)心方形)的重組人源化抗HER2(HERCEPTIN)，與51Cr標(biāo)記的SK-BR-3細(xì)胞預(yù)溫育30分鐘(調(diào)理)，其中人源化抗HER2與表達(dá)HER2的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞結(jié)合。保持SK-BR-3腫瘤靶細(xì)胞的濃度恒定，效應(yīng)細(xì)胞的比例從0增加到100。在效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞(E∶T)比為100∶1時(shí)，在無(wú)抗體的條件下(陰影方形)自發(fā)的細(xì)胞毒活性為20％。不影響FcγRIIIA結(jié)合的單個(gè)丙氨酸突變，即變體G31＝R309A(EU編號(hào)方式中的292)，不影響ADCC(實(shí)心三角)。僅輕微增加對(duì)FcγRIIIA的結(jié)合的單個(gè)丙氨酸突變，即變體G30＝K307A(EU編號(hào)方式中的290)，也顯示在濃度1.25ng/ml時(shí)的所有E∶T比條件下(實(shí)心鉆石)與1.25ng/ml的野生型抗體(實(shí)心方形)相比輕微增強(qiáng)ADCC(即計(jì)算曲線(xiàn)下面積為ADCC活性增加1.1倍)。降低與FcγRIIIA的結(jié)合的單個(gè)丙氨酸突變，變體G34＝Q312A(EU編號(hào)方式中的295)，也顯示降低的ADCC活性(實(shí)心倒三角)。
圖21說(shuō)明在1.25ng/ml時(shí)，變體中對(duì)FcγRIIIA的結(jié)合具有最大程度增加的單個(gè)丙氨酸突變，即變體G36＝S317A(EU編號(hào)方式中的298)，在蛋白-蛋白檢測(cè)和基于細(xì)胞的檢測(cè)中與野生型(實(shí)心方形)相比，也顯示ADCC的最大增加(實(shí)心三角)。G36顯示ADCC活性有1.7倍的增加，如根據(jù)曲線(xiàn)下面積所計(jì)算。變體G17＝E282A(EU編號(hào)方式中的269)和G18＝D283A(EU編號(hào)方式中的270)均顯示與FcγRIIIA的結(jié)合降低以及ADCC效應(yīng)的降低。所述效應(yīng)細(xì)胞為PBMC。
圖22A描述IgG Fc區(qū)天然序列的對(duì)比。其顯示人IgG Fc區(qū)的天然序列，humIgG1(非A和A同種異型)(分別為SEQ ID NO3和4)、humIgG2(SEQID NO5)、humIgG3(SEQ ID NO6)和humIgG4(SEQ ID NO7)。人IgG1序列是非A同種異型，此序列和A同種異型之間的差別(第356和358位；EU編號(hào)系統(tǒng))在人IgG1序列的下面示出。還顯示了鼠IgGFc區(qū)的天然序列，murIgG1(SEQ ID NO8)、murIgG2A(SEQ ID NO9)、murIgG2B(SEQ IDNO10)和murIgG3(SEQ ID NO11)。圖22B顯示圖22A中Fc區(qū)序列的同一性百分率。
圖23描述了人IgG Fc區(qū)天然序列humIgG1(非A和A同種異型；分別為SEQ ID NO3和4)、humIgG2(SEQ ID NO5)、humIgG3(SEQ ID NO6)和humIgG4(SEQ ID NO7)的序列對(duì)比，用星號(hào)示出這些序列間的差異。
圖24顯示在4小時(shí)ADCC檢測(cè)中，所選變體與抗HER2 IgG(HERCEPTIN)的曲線(xiàn)下面積(AUC)。效應(yīng)細(xì)胞為PBMC(N＝5)。與FcγRIIIA結(jié)合已增強(qiáng)的變體G36(S317A；EU編號(hào)方式中的298)顯示ADCC活性增加；未顯示改變的FcγRIIIA結(jié)合的變體G31(R309A；EU編號(hào)方式中的292)也未改變ADCC活性；與FcγRIIIA的結(jié)合已降低的G14(D265A；EU編號(hào)方式中的278)其ADCC活性也降低。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述1.定義在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號(hào)方式是如在Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)(在此特別引入本文作為參考)所述的EU標(biāo)號(hào)?！叭鏚abat所述的EU標(biāo)號(hào)”指人IgG1 EU抗體的殘基編號(hào)。
“親本多肽”指包括下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列缺少一或多個(gè)在此報(bào)道的Fc區(qū)修飾，并且與在此報(bào)道的多肽變體相比有不同的效應(yīng)功能。所述親本多肽可以包括天然Fc區(qū)序列或具有先前存在的氨基酸序列修飾(例如添加、缺失和/或取代)的Fc區(qū)。
術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端，如圖1所示。所述“Fc區(qū)”可以是Fc區(qū)天然序列或Fc區(qū)變體。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的邊界可能不同，但人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為從氨基酸殘基Cys226或從Pro230到其羧基末端的一段序列。免疫球蛋白的Fc區(qū)通常包括兩個(gè)恒定區(qū)，CH2和CH3，例如如圖1所示。
人IgG Fc區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱(chēng)為“Cγ2”結(jié)構(gòu)域)通常從約氨基酸231延伸到約氨基酸340。所述CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特性在于它不與其它結(jié)構(gòu)域緊密成對(duì)。而是兩個(gè)N連接的分支糖鏈介于完整的天然IgG分子的兩個(gè)CH2之間。推測(cè)所述糖可以為結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對(duì)提供取代物，并且?guī)椭€(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton，分子免疫學(xué)22161-206(1985)。
“CH3結(jié)構(gòu)域”包括Fc區(qū)中從C末端到CH2結(jié)構(gòu)域的一段殘基(即IgG中從大約氨基酸殘基341到約氨基酸殘基447)。
“功能性Fc區(qū)”擁有天然Fc區(qū)的“效應(yīng)功能”。效應(yīng)功能的實(shí)例包括C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體，BCR)等。此效應(yīng)功能通常需要Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合，且能用諸如本文公開(kāi)的各種檢測(cè)方法檢測(cè)。
“Fc區(qū)天然序列”包括與自然中發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。人Fc區(qū)天然序列在圖23中給出，其包括人IgG1 Fc區(qū)(非-A和A同種異型)天然序列；人IgG2 Fc區(qū)天然序列；人IgG3 Fc區(qū)天然序列；人IgG4 Fc區(qū)天然序列以及其自然發(fā)生的變體。鼠Fc區(qū)天然序列見(jiàn)圖22A。
“Fc區(qū)變體”包括以至少一個(gè)在此定義的“氨基酸修飾”而區(qū)別于Fc區(qū)天然序列的氨基酸序列。優(yōu)選所述Fc區(qū)變體與Fc區(qū)天然序列或與親本多肽的Fc區(qū)相比，具有至少一個(gè)氨基酸取代，如在Fc區(qū)天然序列或親本多肽的Fc區(qū)中約1-10個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選約1-5個(gè)氨基酸取代。所述Fc區(qū)變體優(yōu)選與Fc區(qū)天然序列和/或與親本多肽的Fc區(qū)至少有大約80％的同源性，最優(yōu)選至少與其大約90％同源，更優(yōu)選至少與其大約95％同源。
“同源性”定義為在序列對(duì)比和必要時(shí)為獲得同源性最大百分率而引入空隙后變體的氨基酸序列中相同殘基的百分率。用于序列對(duì)比的方法和計(jì)算機(jī)程序在本領(lǐng)域中眾所周知。如“Align2”，Genentech Inc所有，其與用戶(hù)手冊(cè)一起于1991年10月10日提交美國(guó)軟件局，華盛頓特區(qū)20559。
術(shù)語(yǔ)“含F(xiàn)c區(qū)的多肽”指包括Fc區(qū)的多肽，例如抗體或免疫粘附素(見(jiàn)下述定義)。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR天然序列。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體(γ受體)結(jié)合并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類(lèi)(包括其等位基因變體及這些受體的另一種剪接形式)的FcR。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活性受體”)和FcγRIIB(“抑制性受體”)，其具有相似的主要區(qū)別在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。激活性受體FcγRIIA在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域中包含以免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域中包含以免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(ITIM)。(見(jiàn)綜述M in Daeron，免疫學(xué)年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法425-34(1994)；和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對(duì)FcR進(jìn)行了綜述。其它FcR，包括將來(lái)被鑒定的FcR均包含在本文術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)還包括負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒的新生受體FcRn。(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志.24249(1994))。
“抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒”和“ADCC”指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)FcR的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)識(shí)別在靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并且在隨后引起該靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)中第464頁(yè)上的表3總結(jié)了在造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是白細(xì)胞，其表達(dá)一或多個(gè)FcR并且發(fā)揮效應(yīng)功能。優(yōu)選這些細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并且發(fā)揮ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。所述效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源，例如血液或在此敘述的PBMC中分離。
“改變了”FcR結(jié)合親和力或ADCC活性的多肽變體是指與親本多肽或含F(xiàn)c區(qū)天然序列的多肽相比，提高了或降低了FcR結(jié)合活性和/或ADCC活性的變體。所述對(duì)FcR“展示增強(qiáng)的結(jié)合”的多肽變體以比親本多肽更強(qiáng)的親和力結(jié)合至少一個(gè)FcR。所述對(duì)FcR“展示降低的結(jié)合”的多肽變體以比親本多肽更弱的親和力結(jié)合至少一個(gè)FcR。這類(lèi)展示對(duì)FcR降低的結(jié)合的變體可幾乎或完全不與FcR結(jié)合，例如與FcR的結(jié)合為IgG Fc區(qū)天然序列的0-20％(如本文實(shí)施例部分所測(cè))。
以比親本多肽“更強(qiáng)的親和力”與FcR結(jié)合的多肽變體，是指當(dāng)結(jié)合試驗(yàn)中多肽變體和親本多肽的量基本相同時(shí)，以比親本抗體更強(qiáng)的親和力與上述FcR的任一或更多結(jié)合的變體。例如，所述與FcR結(jié)合親和力增強(qiáng)的多肽變體可展示比親本多肽強(qiáng)約1.15-100倍，例如約1.2-50倍的FcR結(jié)合親和力(如本文實(shí)施例所測(cè)的FcR結(jié)合親和力)。
“在人效應(yīng)細(xì)胞存在的條件下比親本抗體更有效地介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)”的多肽變體是，當(dāng)試驗(yàn)中多肽變體和親本抗體的量基本相同時(shí)，在體外或體內(nèi)更有效介導(dǎo)ADCC的變體。通常這類(lèi)變體可用本文公開(kāi)的體外ADCC試驗(yàn)鑒定，但也可用其它測(cè)定ADCC活性的試驗(yàn)或方法，例如在動(dòng)物模型中測(cè)定。優(yōu)選變體在例如本文所述體外試驗(yàn)中以比親本強(qiáng)約1.5-100倍，例如約2-50倍的效力介導(dǎo)ADCC。
“氨基酸修飾”是指預(yù)定氨基酸序列中的改變。修飾實(shí)例包括氨基酸取代、插入和/或缺失。在此優(yōu)選的氨基酸修飾是取代。
特定位點(diǎn)，例如Fc區(qū)的“氨基酸修飾”指特定殘基的取代或缺失，或指在特定殘基附近插入至少一個(gè)氨基酸殘基。在特定殘基“附近”插入指在距其一到二個(gè)殘基之處插入。該插入可在特定殘基的N端或C端。
“氨基酸取代”是指用另一個(gè)不同的“取代”氨基酸殘基取代預(yù)定氨基酸序列中已存在的至少一個(gè)氨基酸。所述取代殘基可以是“天然氨基酸殘基”(即由遺傳密碼編碼)且選自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組胺酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴(lài)氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。優(yōu)選所述的取代殘基不是半胱氨酸。用一或多個(gè)非天然氨基酸殘基進(jìn)行的取代也包含在本文的氨基酸取代的定義中。“非天然氨基酸殘基”指除上文所列天然氨基酸殘基以外的，能在肽鏈中與相鄰氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合的那些。非天然氨基酸殘基包括正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正纈氨酸、同型絲氨酸和其它氨基酸殘基類(lèi)似物，如Ellman等，酶學(xué)方法202301-336(1991)所述的那些。為了制備這些非天然氨基酸，可以應(yīng)用Noren等，科學(xué)244182(1989)和Ellman等，出處同上的方法。簡(jiǎn)言之，這些方法涉及化學(xué)激活非天然氨基酸殘基的抑制性tRNA，隨后進(jìn)行該RNA的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
“氨基酸插入”是指向預(yù)定氨基酸序列中摻入至少一個(gè)氨基酸。雖然所述插入通常包括一或二個(gè)氨基酸殘基的插入，但本發(fā)明考慮更大的“肽插入子”，例如約3-5個(gè)或高達(dá)約10個(gè)氨基酸殘基的插入。被插入的殘基可以是上述的天然或非天然殘基。
“氨基酸缺失”是指從預(yù)定氨基酸序列中除去至少一個(gè)氨基酸殘基。
“鉸鏈區(qū)”通常定義為從人IgGl的Glu216到Pro230的一段序列(Burton，分子免疫學(xué)22161-206(1985))。通過(guò)將形成重鏈內(nèi)S-S鍵的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸放置在相同的位置上，可以將其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgGl序列對(duì)比排列。
Fc區(qū)的“低鉸鏈區(qū)”通常定義為從鉸鏈區(qū)C末端最端處即Fc區(qū)的殘基233到殘基239的一段序列。在本發(fā)明之前，F(xiàn)cγR結(jié)合通常歸因于IgG Fc區(qū)的低鉸鏈區(qū)中的氨基酸殘基。
“C1q”是包括針對(duì)免疫球蛋白Fc區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的多肽。C1q與兩個(gè)絲氨酸蛋白酶C1r和C1s共同形成復(fù)合物C1，其是補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)途徑中的第一個(gè)組分。人C1q可從如Quidel，San Diego，CA等廠家購(gòu)得。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指多肽中結(jié)合另一分子的區(qū)域。對(duì)于FcR，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括多肽鏈中負(fù)責(zé)與Fc區(qū)結(jié)合的部分。一個(gè)有用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是FcRα鏈的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語(yǔ)“抗體”是指最廣泛意義上的抗體，特別包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們呈現(xiàn)所需生物學(xué)活性。
為本發(fā)明的目的而定義的“抗體片段”包括完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)，或是抗體中保留FcR結(jié)合能力的Fc區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括線(xiàn)性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w片段優(yōu)選至少保留鉸鏈區(qū)的部分并可任選保留IgG重鏈的CHl區(qū)。更優(yōu)選抗體片段保留一條IgG重鏈的完整恒定區(qū)并且包括一條IgG輕鏈。
在本文中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指得自基本同源之抗體群的抗體，即包含所述群體的各個(gè)抗體除了可能小量出現(xiàn)的突變外是相同的。單克隆抗體具有高度特異性，直接針對(duì)單個(gè)抗原性位點(diǎn)。而且，與通常含直接針對(duì)不同決定簇(表位)之不同種抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。修飾語(yǔ)“單克隆”指抗體的得自基本同源性抗體群的特點(diǎn)，不應(yīng)理解為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明所用的單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤方法制備(此方法首先在Kohler等，自然256495(1975)中敘述)，或可以通過(guò)重組DNA方法制備(例如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4816567)。還可利用如Clackson等，自然352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)所述方法，從噬菌體抗體文庫(kù)中分離“單克隆抗體”。
本文中的單克隆抗體尤其包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)型或亞類(lèi)之抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分同源或相同于另一物種或另一抗體類(lèi)型或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列，以及這類(lèi)抗體的片段，只要它們表現(xiàn)所需生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利4816567；和Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊816851-6855(1984))。
非人類(lèi)(例如鼠類(lèi))抗體的“人源化”形式是包括非人類(lèi)免疫球蛋白最小序列的嵌合抗體。大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者抗體超變區(qū)的殘基被來(lái)自非人物種(供者抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的具有所需特異性、親和力和能力的超變區(qū)殘基取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白Fv框架區(qū)(FR)的殘基被相應(yīng)的非人類(lèi)殘基代替。而且，人源化抗體可以包括在受者抗體或供者抗體中沒(méi)有的殘基。這些修飾用于進(jìn)一步改進(jìn)抗體特性。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中所有或基本上所有的超變環(huán)均對(duì)應(yīng)于非人類(lèi)免疫球蛋白的超變環(huán)，而且所有或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還任選至少包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。其細(xì)節(jié)見(jiàn)Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol 2593-596(1992)。
在本文中術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”是指抗體中負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包括來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸序列(即輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或來(lái)自“超變環(huán)”的氨基酸序列(即輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癋R”殘基是不同于本文定義的超變區(qū)殘基的那些可變區(qū)殘基。
在本文中術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”定義為抗體樣分子，其將異源“粘附素”蛋白(例如受體、配體或酶)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定區(qū)組合。結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括具有所需結(jié)合特異性之粘附素氨基酸殘基與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合，所述粘附素氨基酸不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))(即為“異源性”)。
本文中術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指細(xì)胞表面任何天然受體，或者其至少保留了性質(zhì)上對(duì)應(yīng)于天然受體的配體結(jié)合能力的任何區(qū)域或衍生物。在具體的實(shí)施方案中，所述受體來(lái)自具有與免疫球蛋白超家族成員同源的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面多肽。其它不屬于免疫球蛋白超家族但是明確屬于此定義的受體，是細(xì)胞因子受體，尤其是具有酪氨酸激酶活性的受體(受體酪氨酸激酶)，生血素和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族的成員，和細(xì)胞粘附分子，例如(E-、L-和P-)選擇素。
術(shù)語(yǔ)“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”用于定義受體的任何天然配體，包括細(xì)胞粘附分子，或者這類(lèi)天然配體的至少保留性質(zhì)上對(duì)應(yīng)于天然配體之受體結(jié)合能力的任何區(qū)域或衍生物。此定義尤其包括上述受體之配體的結(jié)合序列。
“抗體免疫粘附素嵌合體”包括使抗體的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(在本文中定義的)與至少一個(gè)免疫粘附素(在本申請(qǐng)中定義的)組合的分子?？贵w-免疫粘附素嵌合體的實(shí)例是雙特異性CD4-IgG嵌合體，見(jiàn)Berg等，PNAS(USA)884723-4727(1991)和Chamow等，免疫學(xué)雜志，1534268(1994)。
“分離”的多肽是指經(jīng)鑒定并且被分離和/或從其天然環(huán)境中的組分中回收的多肽。其天然環(huán)境中的污染組分是可能影響所述多肽的診斷或治療性應(yīng)用的物質(zhì)，可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽被純化(1)達(dá)到用Lowry法所測(cè)的肽重量大于95％，更優(yōu)選大于99％，(2)達(dá)到足以通過(guò)應(yīng)用spinning cup序列分析儀獲得至少15個(gè)殘基的N末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)達(dá)到勻質(zhì)性，如還原或非還原條件下的SDS-PAGE及考馬斯藍(lán)染色或優(yōu)選銀染所測(cè)定。分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)樵摱嚯奶烊画h(huán)境的至少一個(gè)組分將不存在。然而，分離的多肽通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。
“治療”是指治療性處理以及預(yù)防或防止性處理。需要治療的情況包括那些已經(jīng)患病和將被阻止疾病的情況。
“疾病”是指可能從所述多肽變體的治療中獲益的任何情況。這包括慢性和急性疾病或病癥，包括使哺乳動(dòng)物對(duì)所述疾病易感的那些病理狀況。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是癌癥。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌的”是指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀況，其以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)為典型特征。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸道癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰部癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和各種類(lèi)型的頭頸部癌。
“表達(dá)HER2的癌”是包含下述細(xì)胞的癌癥，所述細(xì)胞在其表面存在HER2受體蛋白(Semba等，PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等，自然319230-234(1986)(Genebank登記號(hào)X03363))，使得HER2抗體可以與該癌癥結(jié)合。
本文應(yīng)用的單詞“標(biāo)記”是指直接或間接與所述多肽相連的可檢測(cè)的化合物或組合物。所述標(biāo)記可以是其本身可被檢測(cè)(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者在酶標(biāo)記情況下，可以催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物之化學(xué)變化。
“分離”的核酸分子是已被鑒定的，從至少一種污染的核酸分子中分離的核酸，所述污染的核酸分子通常與所述分離的核酸分子在所述多肽核酸的天然源中相關(guān)。分離的核酸分子不同于其天然形式。因此，分離的核酸分子區(qū)別于天然細(xì)胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括一般性表達(dá)所述多肽之細(xì)胞中的核酸分子，例如該核酸分子在染色體上不同于天然細(xì)胞中的位置上。
“調(diào)控序列”是指可操作連接的編碼序列在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)所必需的序列。適合于原核生物的調(diào)控序列有啟動(dòng)子、可任選操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞可利用啟動(dòng)子、聚腺苷酸化位點(diǎn)和增強(qiáng)子。
當(dāng)使核酸與另一核酸序列功能關(guān)聯(lián)時(shí)，該核酸被“可操作地連接”。例如，如果一種多肽表達(dá)為參與該多肽分泌的前蛋白，則可將前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA可操作地與該多肽的DNA連接；如果一種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則將其可操作地與該編碼序列連接；或可將核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列連接以利于翻譯。通常，“可操作連接的”指待連接的DNA序列是連續(xù)的，如果是分泌性前導(dǎo)序列，則是連續(xù)的并為可讀取的。但增強(qiáng)子不必連續(xù)?？赏ㄟ^(guò)在常規(guī)限制性位點(diǎn)的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)連接。如果不存在這樣的位點(diǎn)，可按常規(guī)實(shí)踐利用合成的寡核苷酸接頭或連接子。
本文中，“細(xì)胞”“細(xì)胞系”“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用并且所有這些定義包括子代。因此，單詞“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試者細(xì)胞及其衍生的培養(yǎng)物而不考慮傳代次數(shù)。還應(yīng)該理解由于有意和非有意的突變，所有子代細(xì)胞的DNA含量可能不完全相同。與在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選之功能或生物活性相同的突變子代也包括在內(nèi)。需要指出差別之處可根據(jù)上下文明確。
本文中，術(shù)語(yǔ)“分子復(fù)合物”是指當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)異源分子(例如多肽)與另一個(gè)分子結(jié)合時(shí)形成地相對(duì)穩(wěn)定地結(jié)構(gòu)。在本文中優(yōu)選的分子復(fù)合物是免疫復(fù)合物。
“免疫復(fù)合物”是指當(dāng)至少一個(gè)靶分子和至少一個(gè)含異源Fc區(qū)的多肽與另一個(gè)分子結(jié)合形成大分子量復(fù)合物而形成的相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。免疫復(fù)合物的實(shí)例是抗原抗體聚合物和靶分子-免疫粘附素聚合物。除非指明，在本文中術(shù)語(yǔ)“免疫復(fù)合物”是指體外(ex vivo)復(fù)合物(即非天然形式)。然而，所述免疫復(fù)合物可以給哺乳動(dòng)物施用，例如用來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物中免疫復(fù)合物的清除。
術(shù)語(yǔ)“靶分子”是指能夠被異源分子結(jié)合并具有針對(duì)該異源分子的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的分子，通常是多肽。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合位點(diǎn)”是指該分子中另外一個(gè)分子能夠與之結(jié)合的區(qū)域。在本文中“第一靶分子”包括至少兩個(gè)不同的分析物(例如含F(xiàn)c區(qū)的多肽)的結(jié)合位點(diǎn)(例如，兩個(gè)到五個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn))，以使第一靶分子可以結(jié)合至少兩個(gè)分析分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述兩個(gè)或更多的結(jié)合位點(diǎn)是相同的(例如具有相同的氨基酸序列，此時(shí)靶分子是多肽)。下述的實(shí)施例1中，所述第一靶分子是IgE，并且在其Fc區(qū)中具有兩個(gè)獨(dú)立的能與含F(xiàn)c區(qū)多肽結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。其它的第一靶分子包括基本上相同的單體的二聚體(例如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，IL8和VEGF)，或者是包括兩個(gè)或更多的基本上相同的多肽鏈的多肽(例如抗體或免疫粘附素)?！暗诙蟹肿印卑ㄡ槍?duì)第一靶分子的至少兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)(例如兩個(gè)至五個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn))，以使第二靶分子能夠與至少兩個(gè)第一靶分子結(jié)合。優(yōu)選所述兩個(gè)或更多的結(jié)合位點(diǎn)相同(例如具有相同的氨基酸序列，此時(shí)所述靶分子是多肽)。在實(shí)施例2中，第二靶分子是VEGF，其具有一對(duì)不同的能與IgE抗體可變區(qū)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。也可包括其它第二靶分子，例如基本上相同的單體的其它二聚體(例如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素或IL8)或包括兩個(gè)或更多的基本上相同的結(jié)構(gòu)域的多肽(例如抗體或免疫粘附素)。
“分析物”是將要被分析的物質(zhì)。優(yōu)選的分析物是將要對(duì)其結(jié)合Fc區(qū)受體的能力進(jìn)行分析的含F(xiàn)c區(qū)的多肽。
“受體”是能夠結(jié)合至少一個(gè)配體的多肽。優(yōu)選的受體是具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并任選其它結(jié)構(gòu)域(例如跨膜結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或膜錨定結(jié)構(gòu)域)的細(xì)胞表面受體。在本文所述試驗(yàn)中被檢測(cè)的受體可以是完整受體或其片段或衍生物(例如融合蛋白，其包括該受體的與一個(gè)或多個(gè)異源多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。而且，所述待檢測(cè)其結(jié)合特性的受體可以存在于細(xì)胞中，或已被分離并可選擇包被在試驗(yàn)板或某些其它固相上。
短語(yǔ)“低親和力受體”指與目的配體有較弱結(jié)合親和力的受體，例如結(jié)合常數(shù)為大約50nM或更低。低親和力受體的實(shí)例包括FcγRII和FcγRIII。
II.實(shí)施本發(fā)明的模式本發(fā)明涉及制備多肽變體的方法?！坝H本”、“起始”、“非變體”多肽利用本領(lǐng)域中制備含F(xiàn)c區(qū)的多肽的可行技術(shù)制備。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述親本多肽是抗體，下文詳述了抗體制備方法的實(shí)例。然而所述親本多肽可以是包括Fc區(qū)的任何其它多肽，例如免疫粘附素。免疫粘附素制備方法詳見(jiàn)下文。
在另一實(shí)施方案中，可根據(jù)本文所述方法制備Fc區(qū)變體，此“Fc區(qū)變體”可以與所選異源多肽，例如抗體可變區(qū)或受體或配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。
親本多肽包括Fc區(qū)，通常親本多肽的Fc區(qū)將包括Fc區(qū)天然序列，優(yōu)選人類(lèi)Fc區(qū)天然序列。然而，所述親本多肽的Fc區(qū)可以在Fc區(qū)天然序列中具有一或多個(gè)已存在的氨基酸序列改變或修飾。例如，F(xiàn)c區(qū)的C1q結(jié)合活性已改變(Fc區(qū)修飾的其它類(lèi)型詳見(jiàn)下文)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述親本多肽Fc區(qū)是“概念上的”，并且雖然它在實(shí)際上不存在，但可根據(jù)所需Fc區(qū)變體的氨基酸序列實(shí)施抗體工程，產(chǎn)生含此序列的多肽或編碼所需Fc區(qū)變體氨基酸序列的DNA。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，已有編碼親本多肽Fc區(qū)的核酸，且此核酸序列已被改變以產(chǎn)生編碼所述Fc區(qū)變體的變異性核酸序列。
編碼起始多肽之氨基酸序列變體的DNA可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括，但不限于，通過(guò)對(duì)已制備的該多肽的DNA進(jìn)行定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。
定點(diǎn)誘變是制備取代變體的優(yōu)選方法。此技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知(見(jiàn)例如Carter等，核酸研究134431-4443(1985)和Kunkel等美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊82488(1987))。簡(jiǎn)言之，在進(jìn)行DNA的定點(diǎn)誘變中，首先將編碼所需突變的DNA和起始DNA的單鏈雜交，以改變起始DNA。雜交之后，利用所述雜交的寡核苷酸作為引物并利用該起始DNA的單鏈作為模板，應(yīng)用DNA聚合酶來(lái)合成完整的第二鏈。從而將編碼所需突變的寡核苷酸摻入到所得雙鏈DNA中。
PCR誘變也適合于制備起始多肽的氨基酸序列變體。見(jiàn)Higuchi，PCR實(shí)驗(yàn)方法，PP.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette等核酸研究.17723-733(1989)。簡(jiǎn)言之，當(dāng)小量模板DNA被用作PCR的起始物質(zhì)時(shí)，可以利用與模板DNA相應(yīng)區(qū)有略微差異的引物，擴(kuò)增相對(duì)大量的特異性DNA片段，其只在引物與模板不相同的位點(diǎn)上與模板的序列不相同。
用于制備變體的另外一種方法，盒式誘變，是以Well等，基因34315-323(1985)中敘述的方法為基礎(chǔ)。起始材料是包括用來(lái)突變的起始多肽的質(zhì)粒(或其它載體)。鑒定用來(lái)突變的起始DNA中的密碼子。在確定的突變位點(diǎn)的每側(cè)必須有一個(gè)唯一的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。如果沒(méi)有這樣的限制性位點(diǎn)，可以利用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變產(chǎn)生并將其引入起始多肽DNA中適當(dāng)位點(diǎn)。將質(zhì)粒DNA在這些位點(diǎn)切割，使其線(xiàn)性化。利用標(biāo)準(zhǔn)方法合成編碼限制性位點(diǎn)之間但包括所需突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸，其中寡核苷酸的雙鏈被分別合成，然后利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其雜交。此雙鏈寡核苷酸被稱(chēng)為盒。此盒被設(shè)計(jì)成具有與線(xiàn)性質(zhì)粒的末端相適合的5’和3’末端，以使它可以直接與質(zhì)粒相連接。此時(shí)此質(zhì)粒包含了突變的DNA序列。
或者或另外，可以確定編碼多肽變體的所需氨基酸序列，并且可以合成編碼此氨基酸序列變體的核酸序列。
為了制備具有改變了的體外和/或體內(nèi)Fc區(qū)受體結(jié)合親和力或活性，和/或改變了的體外和/或體內(nèi)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)活性的Fc區(qū)變體，對(duì)所述親本多肽的氨基酸序列進(jìn)行修飾。
通常，所述的修飾需要一或多個(gè)氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，取代殘基不對(duì)應(yīng)于圖22A中任何Fc區(qū)天然序列中相同位點(diǎn)上存在的殘基。例如，根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案，將人IgG3或IgG1 Fc區(qū)的Pro331用除Ser(在人IgG4天然序列中相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的殘基)以外的殘基代替。在一個(gè)實(shí)施方案中，在親本多肽中被取代殘基所取代的殘基不是丙氨酸和/或不是Fc區(qū)的殘基Ala339。在氨基酸取代的情況中，親本多肽中的殘基優(yōu)選用丙氨酸殘基取代。然而，本發(fā)明考慮了用任何其它氨基酸殘基取代親本多肽的殘基。例如所述取代可以是保守取代。這些保守取代見(jiàn)題為“優(yōu)選取代”的表1所示。通過(guò)制備一或多個(gè)非表1優(yōu)選的“取代舉例”可獲得更多的實(shí)質(zhì)變化。
表1
對(duì)Fc區(qū)生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)修飾，可以通過(guò)選擇下述取代而完成，所述取代的效應(yīng)明顯不同于在維持(a)取代區(qū)中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)上該分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積這幾方面的效應(yīng)。天然殘基根據(jù)共有側(cè)鏈特性被分成幾種(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水cyc，ser，thr；
(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro；(6)芳香族trp，tyr，phe。
非保守取代需要將這些類(lèi)型的一個(gè)成員與另一類(lèi)的成員互換。下表8中列舉了保守和非保守的氨基酸取代。
在本文實(shí)施例4中證實(shí)，可通過(guò)工程手段制備對(duì)一或多個(gè)FcR的結(jié)合親和力已改變的Fc區(qū)變體。如該實(shí)施例中所示，可以制備Fc區(qū)變體的不同類(lèi)型，例如下述表中的總結(jié)。當(dāng)Fc區(qū)變體具有多于一個(gè)的氨基酸取代時(shí)，通常，但并非必須，將相同類(lèi)型中的氨基酸取代組合以得到所需結(jié)果。
表2 Fc區(qū)變體的類(lèi)型
*去糖基化類(lèi)型
#優(yōu)選與其它Fc區(qū)修飾聯(lián)合(例如如本文中所報(bào)道)除了氨基酸取代，為了制備具有改變了的效應(yīng)功能的Fc區(qū)變體，本發(fā)明考慮對(duì)親本Fc區(qū)氨基酸序列的其它修飾。
例如，為了降低與FcR的結(jié)合，可以刪掉Fc區(qū)的一或多個(gè)氨基酸殘基。通常，為了制備此Fc區(qū)變體，去除Fc區(qū)中在此鑒定的影響FcR段結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)殘基(見(jiàn)下文實(shí)施例4)。通常，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，不超過(guò)大約1-10個(gè)的Fc區(qū)殘基將被刪除。包括一個(gè)或更多氨基酸缺失的所述Fc區(qū)優(yōu)選保留人Fc區(qū)天然序列或親本Fc區(qū)的至少約80％，更優(yōu)選保留至少大約90％，最優(yōu)選保留至少大約95％。
可以制備改變了效應(yīng)功能的氨基酸插入型Fc區(qū)變體。例如可以在一個(gè)或多個(gè)在此鑒定為影響FcR結(jié)合的Fc區(qū)位點(diǎn)附近引入至少一個(gè)氨基酸殘基(例如1-2氨基酸殘基，通常不超過(guò)10個(gè))。“附近”是指距在此鑒定的Fc區(qū)殘基在1-2個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)。這類(lèi)Fc區(qū)變體可以呈現(xiàn)增強(qiáng)或降低的Fc區(qū)結(jié)合和/或ADCC活性。為了制備這類(lèi)插入型變體，可評(píng)估含F(xiàn)cR結(jié)合區(qū)(例如目的FcR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)之多肽與待插入氨基酸殘基之Fc區(qū)的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)，以便涉及具有，例如增強(qiáng)的FcR結(jié)合能力的Fc區(qū)變體(例見(jiàn)Deisenhofer，生物化學(xué)20(9)2361-2370(1981)；Burmeister等，自然342379-383(1994))。這類(lèi)插入通常被置于Fc區(qū)環(huán)中，但不在Fc區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(即β鏈)中。
通過(guò)在親本Fc區(qū)中引入適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄行揎棧軌蛑苽湓谌诵?yīng)細(xì)胞存在的條件下比親本多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或以更強(qiáng)地親和力結(jié)合Fcγ受體(FcγR)的Fc區(qū)變體。此Fc區(qū)變體通常在Fc區(qū)中包括至少一個(gè)氨基酸修飾。優(yōu)選組合多個(gè)氨基酸修飾。例如，F(xiàn)c區(qū)變體可包括2、3、4、5等個(gè)取代，如在此鑒定的特異性Fc區(qū)位點(diǎn)。
所述親本多肽Fc區(qū)優(yōu)選人Fc區(qū)，例如人IgG1(A或非A同種型)、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區(qū)天然序列。這類(lèi)序列見(jiàn)圖23。
為了制備ADCC活性增強(qiáng)的Fc區(qū)，親本多肽優(yōu)選預(yù)先存在ADCC活性，例如它包括人IgG1或人IgG3 Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ADCC活性增強(qiáng)的變體比具有IgG1或IgG3 Fc區(qū)天然序列及該變體抗原結(jié)合區(qū)域的抗體實(shí)質(zhì)上更有效地介導(dǎo)ADCC。優(yōu)選所述變體包含F(xiàn)c區(qū)298、333和334位上的2-3個(gè)殘基取代，或基本由這些取代組成。最優(yōu)選位點(diǎn)298、333和334上的殘基被取代(例如用丙氨酸殘基取代)。而且，為了制備ADCC活性增強(qiáng)的Fc區(qū)變體，通常通過(guò)工程化手段產(chǎn)生對(duì)FcγRIII的結(jié)合親和力增強(qiáng)的Fc區(qū)變體，F(xiàn)cγRIII被認(rèn)為是在介導(dǎo)ADCC時(shí)重要的FcR。例如，可以在親本Fc區(qū)256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430的任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上引入氨基酸修飾，以產(chǎn)生這類(lèi)變體。對(duì)FcγRIII的結(jié)合親和力已增強(qiáng)的變體可以進(jìn)一步具有對(duì)FcγRII的降低的結(jié)合親和力，尤其是對(duì)FcγRIIB受體的降低的結(jié)合親和力。
優(yōu)選將氨基酸修飾引入Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域，因?yàn)楸疚膶?shí)驗(yàn)表明CH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔cR結(jié)合活性很重要。而且，與上述領(lǐng)域的介紹不一樣，本申請(qǐng)考慮了將修飾引入Fc區(qū)而不是引入其低鉸鏈區(qū)。
適于修飾以產(chǎn)生與Fcγ受體(FcγR)結(jié)合親和力或活性已降低的IgG Fc區(qū)變體的氨基酸位點(diǎn)包括Fc區(qū)中下述氨基酸位點(diǎn)的任何一個(gè)或多個(gè)238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。作為產(chǎn)生此類(lèi)變體的模板的親本Fc區(qū)優(yōu)選包括人IgG Fc區(qū)。當(dāng)殘基331被取代時(shí)，所述親本Fc區(qū)優(yōu)選非人IgG3天然序列，或者含位點(diǎn)331處之取代的Fc區(qū)變體優(yōu)選呈現(xiàn)增強(qiáng)的FcR結(jié)合，例如與FcγRII的結(jié)合。
為了產(chǎn)生與FcγR的結(jié)合降低的Fc區(qū)變體，可以在所述Fc區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上引入氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
呈現(xiàn)與FcγRI的結(jié)合降低的變體包括在Fc區(qū)的238、239、269、270、327、或329之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。
呈現(xiàn)與FcγRII的結(jié)合降低的變體包括在Fc區(qū)的238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。
呈現(xiàn)與FcγRIII的結(jié)合降低的變體包括在Fc區(qū)的238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。
還可以制備與一或多個(gè)FcγR結(jié)合增強(qiáng)的變體。這類(lèi)Fc區(qū)變體可以在Fc區(qū)的255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、298、301、305、307、309、312、3 15、320、322、326、330、331、333、334、337、340、360、378、398或430之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。
例如，F(xiàn)cγR結(jié)合活性增強(qiáng)的變體可以呈現(xiàn)與FcγRIII結(jié)合的增強(qiáng)，并可任選另呈現(xiàn)與FcγRII結(jié)合的降低；例如所述變體可在Fc區(qū)的298和/或333位上包含氨基酸修飾。
與FcγRII的結(jié)合增加的變體包括在Fc區(qū)的255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398或430之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。這類(lèi)變體可以進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRIII結(jié)合的降低。例如它們可以在Fc區(qū)的268、272、298、301、322或340之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾。
雖然優(yōu)選改變與FcγR的結(jié)合，但是本發(fā)明也考慮了對(duì)新生受體(FcRn)的結(jié)合親和力已改變的Fc區(qū)變體。預(yù)計(jì)FcRn親和力提高的Fc區(qū)變體具有更長(zhǎng)的血清半衰期，因此這類(lèi)分子可在要求所用多肽之半衰期較長(zhǎng)的動(dòng)物治療方法，例如慢性疾病的治療中應(yīng)用。相反，預(yù)計(jì)FcRn結(jié)合親和力降低的Fc區(qū)變體具有較短的半衰期，因此這類(lèi)分子可在例如縮短循環(huán)時(shí)間有利的情況，如體內(nèi)診斷顯影或當(dāng)多肽在血循環(huán)中長(zhǎng)期存在將具有副作用時(shí)，給哺乳動(dòng)物服用。預(yù)計(jì)FcRn結(jié)合親和力降低的Fc區(qū)變體不太可能通過(guò)胎盤(pán)，因此可以用于治療孕期婦女的疾病或病癥。
改變了與FcRn的結(jié)合親和力的Fc區(qū)變體包括在Fc區(qū)的238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。與FcRn的結(jié)合降低的變體通常包括在Fc區(qū)的252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或477之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體；與FcRn的結(jié)合增強(qiáng)的變體通常包括在Fc區(qū)的238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434之任一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上含有氨基酸修飾的那些變體。
按上述方法制備的多肽變體，可以進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，其通常依賴(lài)于多肽的應(yīng)用目的。這樣的修飾可以涉及氨基酸序列的進(jìn)一步改變(氨基酸的取代、插入和/或缺失)、與異源多肽的融合和/或共價(jià)修飾。此“進(jìn)一步修飾”可以在進(jìn)行上述導(dǎo)致Fc受體結(jié)合和/或ADCC活性改變的氨基酸修飾之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本文的Fc區(qū)修飾與本申請(qǐng)“相關(guān)領(lǐng)域”部分所引用文獻(xiàn)中公開(kāi)的Fc區(qū)取代組合。
或者或另外，將上述氨基酸修飾與改變Fc區(qū)的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾聯(lián)合，可能是有用的。
特定目的的起始多肽通常是與C1q結(jié)合且呈現(xiàn)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)的多肽。本文所述“進(jìn)一步的氨基酸修飾”通常用于改變起始多肽與C1q結(jié)合的能力和/或改變其補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用，例如降低且優(yōu)選消除這些功能。然而，本文亦涉及在一個(gè)或多個(gè)所需位置上含有取代并增強(qiáng)了C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用(CDC)的多肽。例如，起始多肽可能不能結(jié)合C1q和/或介導(dǎo)CDC，可以根據(jù)本文對(duì)其進(jìn)行修飾，以使其獲得這些進(jìn)一步的效應(yīng)功能。此外，可以對(duì)已具有C1q結(jié)合活性并可能還具有介導(dǎo)CDC之能力的多肽進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)這些活性中的一個(gè)或兩個(gè)。
為了制備改變了C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)作用的Fc區(qū)，被修飾的氨基酸位點(diǎn)通常選自重鏈位點(diǎn)270、322、326、327、329、331、333和334，其中IgG重鏈的殘基編號(hào)是EU標(biāo)號(hào)，見(jiàn)Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅改變上述8個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)來(lái)制備改變了C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)功能的多肽變異區(qū)。這種情況下，優(yōu)選僅改變殘基270、329或322。或者，對(duì)上述位點(diǎn)的兩個(gè)或多個(gè)進(jìn)行修飾。如果想使多個(gè)取代組合，通常使增加人C1q結(jié)合的取代(例如在氨基酸位點(diǎn)326、327、333和334)或降低人C1q結(jié)合的取代(例如在270、322、329和331上)組合。在后一實(shí)施方案中，可取代所有四個(gè)位點(diǎn)(即270、322、329和331)。優(yōu)選組合326、327、333或334位中的兩個(gè)、三個(gè)或所有位點(diǎn)上的進(jìn)一步取代，還可任選組合其它Fc區(qū)取代，以制備體內(nèi)或體外增強(qiáng)了人C1q結(jié)合并優(yōu)選增強(qiáng)了CDC活性的多肽。
脯氨酸在人IgG中329位上是保守的。該殘基優(yōu)選用丙氨酸取代，但本發(fā)明也涉及用任何其它氨基酸進(jìn)行取代，例如絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或纈氨酸。
脯氨酸在人IgG1、IgG2和IgG3的331位上是保守的，但在IgG4中不是(其在位點(diǎn)331上是絲氨酸)。殘基331優(yōu)選用丙氨酸或另一氨基酸如絲氨酸(用于IgG區(qū)域而不是IgG4)、甘氨酸或纈氨酸等取代。
人IgG中賴(lài)氨酸322是保守氨基酸，該殘基優(yōu)選用丙氨酸殘基取代，但也可用任何其它氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或纈氨酸取代。
人IgG中D270是保守氨基酸，此殘基可以被另一氨基酸，如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或賴(lài)氨酸取代。
人IgG中K326是保守氨基酸，此殘基可以被其它氨基酸殘基取代，這些氨基酸包括但不限于纈氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，優(yōu)選色氨酸。
同樣，人IgG中E333是保守氨基酸。E333優(yōu)選被具有較小側(cè)鏈的氨基酸殘基取代，例如纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸，優(yōu)選絲氨酸。
人IgG中K334是保守氨基酸，且可以用如丙氨酸或其它殘基將其取代。
在人IgG1和IgG3中，殘基327是丙氨酸。為了制備C1q結(jié)合增強(qiáng)的變體，可以用甘氨酸等其它殘基取代此丙氨酸。在人IgG2和IgG4中，殘基327是甘氨酸，可以用丙氨酸(或其它殘基)取代此甘氨酸，來(lái)降低C1q的結(jié)合。
如上所述，可以通過(guò)例如修飾C1q結(jié)合和/或FcR結(jié)合，并因此改變CDC活性和/或ADCC活性而設(shè)計(jì)改變了效應(yīng)功能的Fc區(qū)。例如，可以制備C1q結(jié)合增強(qiáng)和FcγRIII結(jié)合增強(qiáng)的Fc區(qū)變體；例如，ADCC活性和CDC活性均增強(qiáng)?；蛘撸谛枰档突蛳?yīng)功能時(shí)，可以設(shè)計(jì)其CDC活性和/或ADCC活性降低的Fc區(qū)變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以?xún)H增加這些活性中的一個(gè)活性，并且還可任選降低另一種活性，例如，來(lái)制備ADCC活性增強(qiáng)而CDC活性降低的Fc區(qū)變體，反之亦然。
在進(jìn)一步的氨基酸改變中，不參與維持多肽變體正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基還可以被取代，通常用絲氨酸取代，來(lái)提高該分子的氧化穩(wěn)定性并且防止異常交聯(lián)。
另一類(lèi)型的氨基酸取代用于改變多肽的糖基化模式。這可以通過(guò)刪除一個(gè)或多個(gè)在多肽中發(fā)現(xiàn)的糖組分，和/或增加一個(gè)或多個(gè)在多肽中不存在的糖基化位點(diǎn)來(lái)完成。典型的多肽糖基化是N-連接或O-連接。N-連接是指將糖基部分連接于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列，天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，是糖基部分與天冬酰胺側(cè)鏈進(jìn)行酶性連接的識(shí)別序列，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中任何一種所述三肽序列的存在產(chǎn)生了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化是指將N乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖與羥基氨基酸結(jié)合，雖然可以利用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴(lài)氨酸，但絲氨酸或蘇氨酸最為常用。通過(guò)改變氨基酸序列，以使多肽中包括一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列，可以方便地將糖基化位點(diǎn)引入多肽(用于N連接的糖基化位點(diǎn))。通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸插入或取代原始多肽的序列，也可以產(chǎn)生改變(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。糖基化變體的一個(gè)實(shí)例具有重鏈殘基Asn297的氨基酸取代。
而且，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的氨基酸取代，可以改變Fc區(qū)的類(lèi)、亞類(lèi)或同種型，產(chǎn)生與所需另一類(lèi)、亞類(lèi)或同種型有同源性更高的氨基酸序列的Fc區(qū)。例如，可以改變鼠Fc區(qū)，產(chǎn)生與人Fc區(qū)同源性更高的氨基酸序列；可以對(duì)人非-A型同種型IgG1 Fc區(qū)進(jìn)行修飾，得到人A型同種型IgG1Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行能改變FcR結(jié)合和/或ADCC活性的所述氨基酸修飾，并且將CH3缺失或?qū)⑵溆闷渌垠w結(jié)構(gòu)域取代。然而，優(yōu)選保留CH3結(jié)構(gòu)域(除了本文中所述的改變效應(yīng)功能的氨基酸修飾)。
可以對(duì)多肽變體進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)與起始多肽相比其生物學(xué)活性的任何變化。
所述多肽變體與非變異多肽相比，優(yōu)選基本上保留與抗原結(jié)合的能力，即結(jié)合能力不低于非變異多肽的約20倍，例如不低于5倍。利用例如熒光激活的細(xì)胞分類(lèi)分析(FACS)或放射免疫沉淀(RIA)等技術(shù)，可以檢測(cè)多肽變體的結(jié)合能力。
多肽變體的與FcR結(jié)合的能力可以被估測(cè)。在FcR為FcγRI、FcRn或FcγRIII A-V158等高親和力Fc受體的情況中，可在標(biāo)準(zhǔn)的ELISA實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)利用特異性結(jié)合所述多肽變體的抗體滴定單體多肽變體并且測(cè)定結(jié)合的多肽，而測(cè)定結(jié)合(見(jiàn)下述實(shí)施例2)。用于低親和力FcR的另一個(gè)FcR結(jié)合試驗(yàn)在實(shí)施例1和4中敘述。
為了檢測(cè)所述多肽變體的ADCC活性，用各種效靶比進(jìn)行體外ADCC檢測(cè)，例如實(shí)施例4中所述。對(duì)于此類(lèi)檢測(cè)有用的“效應(yīng)細(xì)胞”包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，可以在體內(nèi)對(duì)所述多肽變體的ADCC活性進(jìn)行檢測(cè)，例如在Clynes等.PNAS(USA)95652-656(1998)中所述的動(dòng)物模型體內(nèi)。
變體結(jié)合C1q和介導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)的能力可以被估測(cè)。
為了檢測(cè)C1q結(jié)合，可以進(jìn)行C1q結(jié)合ELISA試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，用多肽變體或起始多肽(對(duì)照)將試驗(yàn)板在包被緩沖液中包被過(guò)夜。然后洗滌并封閉所述平板。洗滌之后，每孔中加入一份人的C1q并且在室溫溫育2小時(shí)。隨后再次洗滌，然后每孔中加入100μl綿羊抗補(bǔ)體C1q過(guò)氧化物酶偶聯(lián)型抗體，并室溫溫育1小時(shí)。再次用洗滌緩沖液洗板，然后每孔加入含OPD(鄰苯二胺二氫氯化物(Sigma))的底物緩沖液。進(jìn)行30分鐘氧化反應(yīng)，觀察黃色的出現(xiàn)，然后通過(guò)加入100μl 4.5N H2SO4終止反應(yīng)。在(492-405)nm處測(cè)定吸收率。
多肽的實(shí)例是在此檢測(cè)中呈現(xiàn)“C1q結(jié)合顯著降低”的多肽。這意味著約100μg/ml多肽變體與100μg/ml具有未突變的IgG1 Fc區(qū)的對(duì)照抗體相比，其C1q結(jié)合下降約50倍或更多倍。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽變體“不結(jié)合C1q”，即100μg/ml多肽變體與100μg/ml對(duì)照抗體相比，其C1q結(jié)合下降約100倍或更多倍。
另一個(gè)變體實(shí)例是“對(duì)人C1q的結(jié)合親和力比親本多肽更高”的變體。例如，此類(lèi)分子與親本多肽相比，對(duì)人C1q的結(jié)合可以提高約2倍或以上，優(yōu)選約5倍或以上(例如這兩個(gè)分子的IC50值)。例如，與親本多肽相比，對(duì)人C1q的結(jié)合可以提高大約2-500倍，優(yōu)選從約2或5倍至約1000倍。
為了檢測(cè)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)檢測(cè)，例如在Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)中所述。簡(jiǎn)言之，用緩沖液稀釋各種濃度的多肽變體和人補(bǔ)體。將表達(dá)與所述多肽變體結(jié)合的抗原的細(xì)胞稀釋成～1×106細(xì)胞/ml。將多肽變體、稀釋的人補(bǔ)體和表達(dá)所述抗原的細(xì)胞的混合物加入96孔平底組織培養(yǎng)板中，在37℃和5％ CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。然后向每孔中加入50μlalamar blue(Accumed International)，并37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用96孔熒光光度計(jì)在激發(fā)光530nm和發(fā)射光590nm處，測(cè)定吸光度。結(jié)果可以用相對(duì)熒光單位(RFU)表示。樣品的濃度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算，并用與非變異多肽相比的活性百分率報(bào)道目的多肽變體的活性。
還有另一個(gè)變體實(shí)例“不激活補(bǔ)體”。例如，在這個(gè)檢測(cè)中，與0.6μg/ml具有未突變IgGl Fc區(qū)的對(duì)照抗體相比，0.6μg/ml多肽變體呈現(xiàn)大約0-10％CDC活性。所述變體優(yōu)選在上述CDC檢測(cè)中沒(méi)有任何CDC活性。
本發(fā)明還涉及與親本多肽相比CDC增強(qiáng)的多肽變體，例如在體內(nèi)或體外CDC活性增加大約2-100倍(例如每個(gè)被比較的分子的IC50值)。
A.受體結(jié)合檢測(cè)和免疫復(fù)合物本發(fā)明發(fā)展了受體結(jié)合檢測(cè)，其尤其利于檢測(cè)目的分析物對(duì)受體的親和力相對(duì)弱時(shí)該分析物與該受體的結(jié)合，例如對(duì)FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB而言在微克分子范圍內(nèi)。所述方法包括分子復(fù)合物的形成，與非復(fù)合的分析物相比，所述分子復(fù)合物對(duì)受體的親和力增加。優(yōu)選分子復(fù)合物是免疫復(fù)合物，其包括(a)含F(xiàn)c區(qū)的多肽(例如抗體或免疫粘附素)；(b)第一靶分子，其包括針對(duì)含F(xiàn)c區(qū)多肽的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；和(c)第二靶分子，其包括針對(duì)第一靶分子的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
下述實(shí)施例1中，所述含F(xiàn)c區(qū)的多肽是抗IgE抗體，例如E27抗體(圖4A-4B)。當(dāng)將E27與人的IgE以1∶1的克分子比率混合時(shí)，形成穩(wěn)定的由三個(gè)E27分子和三個(gè)IgE分子組成的六聚體。在下述的實(shí)施例1中，所述“第一靶分子”是嵌合形式的IgE，其中抗VEGF抗體的Fab部分與人IgE Fc部分融合，而所述“第二靶分子”是與Fab結(jié)合的抗原(即VEGF)。每個(gè)IgE分子結(jié)合兩個(gè)VEGF分子。每分子VEGF也結(jié)合兩個(gè)IgE分子。當(dāng)重組人VEGF以2∶1的克分子比率加入到IgEE27六聚體中時(shí)，通過(guò)IgEVEGF的相互作用，所述六聚體連接成更大分子量的復(fù)合物(圖5)。得到的免疫復(fù)合物的抗IgE抗體的Fc區(qū)結(jié)合FcR的親和力比非復(fù)合物抗IgE或IgEE27六聚體均更高。
考慮了用于受體檢測(cè)的其他形式的分子復(fù)合物。僅包括含F(xiàn)c區(qū)多肽第一靶分子結(jié)合物的實(shí)例包括免疫粘附素配體的結(jié)合物，例如VEGF受體(KDR)-免疫粘附素VEGF，以及全長(zhǎng)雙特異性抗體(bsAb)第一靶分子。另一個(gè)含F(xiàn)c區(qū)多肽第一靶分子第二靶分子的實(shí)例包括非封閉抗體可溶性受體配體的結(jié)合物，例如抗Trk抗體可溶性Trk受體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Urfer等，生物化學(xué)雜志.273(10)5829-5840(1998))。
除了在受體結(jié)合檢測(cè)中的應(yīng)用，上述免疫復(fù)合物還有進(jìn)一步應(yīng)用包括估測(cè)含F(xiàn)c區(qū)的多肽功能和在體內(nèi)免疫復(fù)合物的清除。因此，可以將免疫復(fù)合物給哺乳動(dòng)物施用(例如前臨床動(dòng)物研究)并檢測(cè)其半衰期。
為了檢測(cè)受體結(jié)合，可以將包括目的受體的至少兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽(例如FcR的α亞單位的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)包被在固相，例如試驗(yàn)板上。利用標(biāo)準(zhǔn)方法，可以將單獨(dú)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或受體融合蛋白包被在平板上。受體融合蛋白的實(shí)例包括受體-谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白、受體-殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白、受體-六聚His標(biāo)簽融合蛋白(分別包被在谷胱甘肽、殼多糖和鎳包被的平板上)?；蛘?，可以在檢測(cè)平板上包被捕獲分子，用于通過(guò)融合蛋白的非受體部分結(jié)合受體-融合蛋白。實(shí)例包括包被在檢測(cè)平板上用于捕獲受體-六聚His尾融合蛋白的抗六聚His F(ab’)2，或者包被在檢測(cè)平板上用于捕獲受體-GST融合蛋白的抗GST抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)了與至少表達(dá)所述受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞的結(jié)合。所述細(xì)胞可以是表達(dá)目的FcR的天然造血細(xì)胞，或者可以是用編碼FcR或其結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸轉(zhuǎn)化，以使結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)在被檢測(cè)細(xì)胞的表面的細(xì)胞。
將上述免疫復(fù)合物加到受體包被的平板中，并溫育足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使分析物與受體結(jié)合。然后洗滌平板以去除未結(jié)合的復(fù)合物，并根據(jù)已知的方法檢測(cè)分析物的結(jié)合。例如，可以利用與分析物特異性結(jié)合并任選與可檢測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合的試劑(例如抗體或其片段)進(jìn)行檢測(cè)(可檢測(cè)標(biāo)記物和將其與多肽連接的方法，在下述標(biāo)題為“多肽變體的非治療應(yīng)用”的章節(jié)中敘述)。
為了方便，所述試劑可以以試劑盒的形式提供，即在檢測(cè)分析物與目的受體結(jié)合能力的檢測(cè)中用于與分析物包裝在一起。試劑盒的成分通常以預(yù)先確定的比例提供。所述試劑盒可以提供第一靶分子和/或第二靶分子，或任選將它們組合在一起。所述試劑盒進(jìn)一步包括用所述受體或其結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如FcR的α亞單位的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)包被的檢測(cè)平板。通常在所述試劑盒中還提供用酶性標(biāo)記物直接或間接標(biāo)記的其它試劑，例如與被檢測(cè)的分析物特異性結(jié)合的抗體。在可檢測(cè)的標(biāo)記物是酶時(shí)，所述試劑盒包括酶所需要的底物和輔因子(例如提供可檢測(cè)的發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)的底物前體)。另外，可以包括其它衍生物，例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如檢測(cè)和/或洗滌裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對(duì)量可以廣泛的變化，以提供基本上優(yōu)化了檢測(cè)敏感性的試劑溶液的濃度。具體地，所述試劑可以是干粉，通常為凍干劑，包含溶解后能產(chǎn)生適當(dāng)濃度的試劑溶液的賦形劑。所述試劑盒最好包括實(shí)施該檢測(cè)的說(shuō)明書(shū)。
B.抗體制備在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本文中所述進(jìn)行修飾的含F(xiàn)c區(qū)的多肽是抗體。用于制備抗體的技術(shù)如下(i)抗原篩選和制備在所述多肽為抗體時(shí)，其直接針對(duì)目的抗原?？乖瓋?yōu)選為生物學(xué)上重要的多肽，給患有疾病或病癥的哺乳動(dòng)物施用該抗體可以導(dǎo)致此哺乳動(dòng)物在治療上受益。然而，也考慮了直接針對(duì)非多肽抗原(例如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5091178)的抗體。
在抗原是多肽時(shí)，其可以是跨膜分子(例如受體)或例如生長(zhǎng)因子等配體?？乖膶?shí)例包括如腎素等分子；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素-B鏈；前胰島素；卵泡刺激激素；降鈣素；黃體激素；胰高血糖素；因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)和vonWillebrands因子等凝血因子；蛋白C等抗凝血因子；心房利鈉激素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子α和β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)對(duì)T細(xì)胞表達(dá)和分泌的正常激活)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素；小鼠絨毛膜促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶；DNase；IgE；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子，例如NGF-β；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；粘著素；調(diào)節(jié)蛋白；整合素，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原，例如HER2、HER3或HER4受體；以及上述任何多肽的片段。
本發(fā)明所述抗體的優(yōu)選分子靶點(diǎn)包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受體家族成員，例如EGF受體，HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子，例如LFA-1、Macl、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β3整合素和αv/β3整合素包括其α或β亞單位(例如抗-CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長(zhǎng)因子，例如VEGF；組織因子(TF)；α干擾素(α-IFN)；白細(xì)胞介素，例如IL-8；IgE；血型(bloodgroup)抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。
可溶性抗原或其片段可任選與其它分子結(jié)合用作制備抗體的免疫原。對(duì)于跨膜分子，如受體，其片段(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)可以用作免疫原?；蛘?，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可以用作免疫原。此類(lèi)細(xì)胞可以衍生自天然來(lái)源細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞系)，或者可以是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于制備抗體的其它抗原和形式對(duì)本領(lǐng)域中的人員是顯而易見(jiàn)的。
(ii)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑進(jìn)行制備。利用雙功能或衍生試劑將相關(guān)抗原與在被免疫物種中有免疫原性的蛋白結(jié)合可能是有用的，所述蛋白包括例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述試劑包括馬來(lái)酰亞氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亞胺(通過(guò)半胱氨酸殘基結(jié)合)、N羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴(lài)氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基團(tuán)。
通過(guò)將100μg或5μg蛋白或結(jié)合物(分別對(duì)家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合并將此溶液在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行皮內(nèi)注射，可使動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性結(jié)合物或衍生物被免疫。一個(gè)月之后，用溶于弗氏完全佐劑中的肽或結(jié)合物通過(guò)多位點(diǎn)皮下注射加強(qiáng)免疫，其用量為初次注射量的1/5-1/10。7-14天之后，將動(dòng)物放血并檢測(cè)其血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫直到滴度穩(wěn)定(plateaus)。優(yōu)選用相同抗原與另一蛋白的結(jié)合物和/或通過(guò)另一交聯(lián)劑結(jié)合的結(jié)合物給動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。結(jié)合物也可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白融合體。也可以適當(dāng)應(yīng)用如明礬等聚集試劑，來(lái)提高免疫應(yīng)答。
(iii)單克隆抗體可以利用Kohler，自然256495(1975)中所述的雜交瘤方法或者通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4816567)制備單克隆抗體。
在雜交瘤方法中，按上述方法免疫小鼠或其它適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，例如倉(cāng)鼠或恒河猴(macaque monkey)，來(lái)誘導(dǎo)出產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體可與免疫中應(yīng)用的蛋白特異性結(jié)合。或者，可以將淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行免疫。然后，用聚乙二醇等適當(dāng)?shù)娜诤显噭⒘馨图?xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理與應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中接種并培養(yǎng)如此制備的雜交瘤細(xì)胞，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包括一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于雜交瘤的所述培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可防止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些可有效融合、支持所選抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定產(chǎn)生高水平抗體、并且對(duì)HAT等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，例如來(lái)源于MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的細(xì)胞系(得自Salk Institute Cell Distribution Center，圣迭戈，加利福尼亞，美國(guó))和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，馬里蘭，美國(guó))。還有報(bào)道將人雜交瘤細(xì)胞和小鼠-人異質(zhì)性雜交瘤細(xì)胞系用于制備人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志，1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)和應(yīng)用，51-63頁(yè)(Marcel Dekker，Inc.，紐約，1987))。
測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中直接針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，例如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，檢測(cè)由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
在產(chǎn)生具有所需的特異性、親和力和/或活性之抗體的雜交瘤細(xì)胞被鑒定之后，用有限稀釋方法將所述克隆進(jìn)行亞克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理和應(yīng)用，pp.59-103，Academic Press，1986))。用于此目的的適當(dāng)培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)形成腹水瘤。
用常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當(dāng)分離。
用傳統(tǒng)的方法可容易的分離編碼單克隆抗體的DNA并測(cè)定其序列(例如，利用能夠與編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。所述雜交瘤細(xì)胞可作為此類(lèi)DNA的優(yōu)選來(lái)源。所述DNA一經(jīng)分離，將其連接入表達(dá)載體，然后將載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。下面將詳細(xì)敘述抗體的重組制備。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗體片段可以從抗體噬菌體文庫(kù)中分離，所述抗體噬菌體文庫(kù)用在McCafferty等，自然348552-554中所述技術(shù)制備。在Clackson等，自然352624-628(1991)和Marks等，生物化學(xué)雜志222581-597(1991)中分別敘述了利用噬菌體文庫(kù)對(duì)鼠和人的抗體的分離。隨后的文獻(xiàn)敘述了高親和力(nM范圍)人抗體的產(chǎn)生，其通過(guò)鏈改組(chainshuffling)(Marks等，生物/技術(shù)，10779-783(1992))以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建很大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse等，核酸研究，212265-2266(1993))。因此，對(duì)于單克隆抗體的分離，這些技術(shù)是傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可替代方法。
也可以對(duì)DNA進(jìn)行修飾，例如，用編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列取代其鼠同源序列(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4816567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊816851(1984))，或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)連接至免疫球蛋白的編碼序列。
通常這類(lèi)免疫球蛋白多肽將取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)已產(chǎn)生嵌合型二價(jià)抗體，其包括特異性針對(duì)一個(gè)抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)，和特異性針對(duì)另一個(gè)抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iv)人源化和人抗體人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)被引入的非人類(lèi)來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人類(lèi)氨基酸殘基通常是“重要”的殘基，其典型地來(lái)源于“重要地”可變區(qū)。根據(jù)Winter和其同事的方法(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)2391534-1536(1988))，通過(guò)用人抗體的相應(yīng)序列取代鼠類(lèi)CDR或CDR序列，可以基本上進(jìn)行人源化。因此，此“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4816567)，其中基本上少于完整的人可變區(qū)的序列被來(lái)源于非人類(lèi)物種的相應(yīng)序列代替。實(shí)際上，人源化抗體是典型的人抗體，其中一些CDR殘基和一些FR殘基被鼠抗體類(lèi)似位點(diǎn)的殘基代替。
在制備人源化抗體中應(yīng)用的人重鏈和輕鏈可變區(qū)的選擇對(duì)于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適”方法，可在已知人可變區(qū)序列的完整文庫(kù)中篩選嚙齒類(lèi)抗體的可變區(qū)序列。然后，將與嚙齒類(lèi)序列最相近的人的序列作為人源化抗體的框架(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志.1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志.196901(1987))。另一種方法應(yīng)用來(lái)源于特定輕鏈或重鏈之所有人類(lèi)抗體共同序列的特定框架。相同的框架可以用于若干不同的人源化抗體(Carter等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志.，1512623(1993))。
更為重要的是抗體被人源化且保留對(duì)抗原的高親和力和其它良好的生物學(xué)活性。為了達(dá)到此目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，利用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物，通過(guò)此方法制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型為公眾可獲得且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。已有能說(shuō)明并顯示所選候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。觀察這些顯示結(jié)果可以分析所述殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與抗原結(jié)合能力的殘基。這樣，可以從受體篩選FR殘基，并將其與重要的序列組合，以得到所需抗體特性，例如對(duì)靶抗原的親和力增強(qiáng)。通常，CDR殘基直接并且主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
或者，現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過(guò)免疫，在沒(méi)有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠，將導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)抗原攻擊的人抗體。例如，見(jiàn)Jakobovits等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno，733(1993)；Duchosal等，自然355258(1992)。人抗體還可以來(lái)源于噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom等，分子生物學(xué)雜志227381(1991)；Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)；Vaughan等，自然生物技術(shù)14309(1996))。
(V)多特異性抗體多特異性抗體具有至少兩個(gè)不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)。雖然這樣的分子通常僅結(jié)合兩個(gè)抗原(即雙特異性抗原，BsAb)，但在本文中應(yīng)用時(shí)，此定義包括具有另外的特異性的抗體，例如三特異性抗體。BsAb的實(shí)例包括如下抗體，一個(gè)臂直接抗腫瘤細(xì)胞抗原而另外一個(gè)臂直接抗細(xì)胞毒作用觸發(fā)分子的BsAb，例如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗惡性B細(xì)胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細(xì)胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結(jié)腸癌)、抗CD3/抗黑素細(xì)胞刺激激素類(lèi)似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗CD3、抗pan腫瘤相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗CD3；一個(gè)臂特異性結(jié)合腫瘤抗原而另一個(gè)臂結(jié)合毒素的BsAb，例如抗saporin/抗Id-1、抗CD22/抗saporin、抗CD27/抗saporin、抗CD38/saporin、抗CEA/抗蓖麻蛋白A鏈、抗干擾素α(IFN-α)/抗雜交瘤獨(dú)特型、抗CEA/抗長(zhǎng)春花生物堿；使酶活化型前體藥物轉(zhuǎn)化的BsAb，例如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化絲裂霉素磷酸酯前體藥物轉(zhuǎn)化為絲裂霉素醇)；可以作為纖維蛋白溶解試劑的BsAb，例如抗血纖蛋白/抗組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、抗血纖蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)；將免疫復(fù)合物靶向于細(xì)胞表面受體的BsAb，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII)；用于治療感染性疾病的BsAb，例如抗CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于體內(nèi)或體外腫瘤檢測(cè)的BsAb，例如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb；和作為診斷工具的BsAb，例如抗兔IgG/抗鐵蛋白、抗馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生長(zhǎng)激素抑制因子/抗P物質(zhì)、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β半乳糖苷酶。三特異性抗體的實(shí)例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如(Fab’)2雙特異性抗體)。
用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域已知。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是以?xún)蓚€(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)為基礎(chǔ)，在此處所述兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，自然305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分類(lèi)，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤(quadromas))產(chǎn)生可能有10種不同抗體分子的混合物，其中只有一個(gè)具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常用親和層析方法完成的正確分子的純化更為麻煩，并且產(chǎn)量低。在WO93/08829和Traunecker等EMBO J.103655-3659(1991)中報(bào)道了相似的方法。
根據(jù)另一種方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)融合。所述融合抗體優(yōu)選具有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，至少包括部分鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)。優(yōu)選在至少一個(gè)融合抗體中存在具有第一重鏈恒定區(qū)(CH1)，其包括輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合蛋白(如果需要還包括免疫球蛋白輕鏈)的DNA插入不同表達(dá)載體，并且共轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗魃镏小＿@在構(gòu)建中應(yīng)用不等比的三種多肽提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，為調(diào)節(jié)三條多肽鏈片段的相互比例提供了很大的彈性。然而，當(dāng)相同比例的至少兩條多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量或當(dāng)所述比例不特別重要時(shí)，也可以將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。
在此方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一個(gè)臂中具有第一結(jié)合特異性的雜合型免疫球蛋白重鏈和在另一個(gè)臂中具有的雜合型重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)此不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)易于從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中分離所需雙特異性化合物，因?yàn)樵趦H為雙特異性分子一半的部分中免疫球蛋白輕鏈的存在提供了簡(jiǎn)捷的分離方法。此方法在WO94/04690中公開(kāi)。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見(jiàn)如Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。根據(jù)在WO096/27011中所述另一個(gè)方法，可以設(shè)計(jì)一對(duì)抗體分子之間的界面，來(lái)使從重組細(xì)胞培養(yǎng)基中回收的異源二聚體的百分率最大。優(yōu)選的界面至少包括抗體恒定區(qū)的CH3結(jié)構(gòu)域的一部分。在這個(gè)方法中，用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)代替第一抗體界面中的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈。通過(guò)用較小氨基酸側(cè)鏈(如丙氨酸或前氨酸)代替大氨基酸側(cè)鏈，可在第二個(gè)抗體分子的界面上構(gòu)建相同或類(lèi)似大側(cè)鏈的互補(bǔ)“溝”。這使異二聚體的產(chǎn)量超過(guò)其它不必要的終產(chǎn)物如同源二聚體。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源結(jié)合”的抗體。例如，可以將異源結(jié)合物中的一種抗體與親和素偶聯(lián)，將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，有人稱(chēng)這樣的抗體可以將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向非必要細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)試劑和多種交聯(lián)技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4676980。
本發(fā)明還涉及雙價(jià)以上的抗體，例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志14760(1991)。
雖然本文中的相關(guān)多肽優(yōu)選抗體，但也包括根據(jù)本文所述方法修飾的含F(xiàn)c區(qū)的多肽。這種分子的實(shí)例是免疫粘附素。
C.免疫粘附素的制備最簡(jiǎn)單最直接的免疫粘附素設(shè)計(jì)是將粘附素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD))與免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)結(jié)合。通常，當(dāng)制備本發(fā)明的免疫粘附素時(shí)，將編碼所述粘附素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸在C末端與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列的N末端融合，然而N末端融合也是可能的。
通常在此融合中，編碼的嵌合多肽至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的功能性鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還可以與恒定區(qū)的Fc區(qū)的C末端或者緊鄰重鏈CH1的N-末端處或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行融合。進(jìn)行所述融合的確切位點(diǎn)并不重要；特殊位點(diǎn)是眾所周知的，并且為了使免疫粘附素的生物活性、分泌或結(jié)合特性最佳，可以對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行選擇。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述粘附素序列與免疫球蛋白G1(IgG1)Fc區(qū)的N末端融合?？梢詫⒄麄€(gè)重鏈恒定區(qū)與粘附素序列融合。然而，更優(yōu)選在融合中應(yīng)用起始于鉸鏈區(qū)中正好在木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)(即殘基216，使重鏈恒定區(qū)的第一個(gè)殘基成為114)上游或其它免疫球蛋白類(lèi)似位點(diǎn)的序列，所述木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)在化學(xué)上定義IgG Fc區(qū)。在具體優(yōu)選實(shí)施方案中，粘附素氨基酸序列與IgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)和CH2和CH3，或者(b)CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域融合。
對(duì)于雙特異性免疫粘附素，所述免疫粘附素均組裝為多聚體，尤其是異源二聚體或異源四聚體。通常，這些組裝好的免疫粘附素具有已知的單位結(jié)構(gòu)。在IgG、IgD和IgE中形成基本的四鏈結(jié)構(gòu)單位。四鏈單位在較高分子量免疫球蛋白中重復(fù)；通常IgM以通過(guò)二硫鍵維持的四個(gè)基本單位的五聚體形式存在。IgA球蛋白，偶爾也包括IgG，在血清中也以多聚體的形式存在。在多聚體的情況中，每個(gè)四單位可以相同或不同。
在本文范圍之內(nèi)組裝的免疫粘附素的實(shí)例圖示如下(a)ACL-ACL；(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH或VLCL-ACH)；(c)ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH或VLCL-VHCH)；(d)ACL-VHCH-(ACH或ACL-VHCH或VLCL-ACH)；(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH或VLCL-ACH)；(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2；其中每個(gè)A代表相同或不同粘附素氨基酸序列；VL是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；VH是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；CL是免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)；CH是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)；n是大于1的整數(shù)；Y是共價(jià)交聯(lián)試劑的殘基。
為了簡(jiǎn)短，上述結(jié)構(gòu)僅顯示了關(guān)鍵特征；它們即沒(méi)有表明免疫球蛋白的連接結(jié)構(gòu)域(J)或其它結(jié)構(gòu)域，也沒(méi)有顯示二硫鍵。然而，在結(jié)合活性需要此結(jié)構(gòu)域時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行構(gòu)建，使其出現(xiàn)在它們?cè)诿庖咔虻鞍追肿又姓紦?jù)的常規(guī)位置上。
或者，可將粘附素序列插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，以得到包括嵌合重鏈的免疫球蛋白。在這個(gè)實(shí)施方案中，在免疫球蛋白每個(gè)臂中，在鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域之間或在CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間，將粘附素序列與免疫球蛋白重鏈的3’末端融合。在Hoogenboom等，分子免疫學(xué)281027-1037(1991)中報(bào)道了相似的構(gòu)建體。
雖然在本發(fā)明的免疫粘附素中不需要免疫球蛋白輕鏈的存在，但也可使免疫球蛋白輕鏈與粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價(jià)結(jié)合，或直接與粘附素融合。在前一種情況中，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達(dá)。通過(guò)分泌，雜合重型鏈和輕鏈被共價(jià)結(jié)合，從而提供包括兩個(gè)二硫鍵連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。例如，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4816567(1989年3月28日公布)中報(bào)道了適合制備此類(lèi)結(jié)構(gòu)的方法。
通過(guò)將編碼粘附素部分的cDNA序列與免疫球蛋白cDNA序列融合在同一閱讀框架內(nèi)，可最方便地構(gòu)建免疫球蛋白粘附素。然而，還可以應(yīng)用與基因組免疫球蛋白片段的融合(例如，Aruffo等，細(xì)胞611303-1313(1990)；Stamenkovic等，細(xì)胞661133-1144))。后一種類(lèi)型的融合需要存在用于表達(dá)的Ig調(diào)節(jié)序列。通過(guò)雜交或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，可以根據(jù)來(lái)源于脾或外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)的公開(kāi)序列，分離編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。將編碼免疫粘附素中“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA串聯(lián)插入質(zhì)粒載體，所述載體可在所選的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)有效的表達(dá)。
D.載體、宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的編碼本文所述多肽變體的核酸、含有該核酸的載體和宿主細(xì)胞，制備所述多肽變體的重組技術(shù)。
為了多肽變體的重組制備，分離編碼此多肽的核酸，并將其插入用于進(jìn)一步克隆(DNA的擴(kuò)增)或表達(dá)的可復(fù)制載體中。利用常規(guī)方法可以很容易地分離和測(cè)序編碼所述多肽變體的DNA(例如，通過(guò)利用能與編碼所述多肽變體的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。所述載體通常包括但不限于一個(gè)或多個(gè)下述成分信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號(hào)序列成分本發(fā)明的多肽變體不但可以直接重組制備，還可以制備成帶有異源性多肽的融合多肽，所述異源多肽優(yōu)選信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。所選異源信號(hào)序列優(yōu)選是能被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切割)的序列。對(duì)于不能識(shí)別并加工天然多肽變體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，用原核信號(hào)序列代替所述信號(hào)序列，所述原核信號(hào)序列例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌，天然信號(hào)序列可以用下述序列代替，例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬α因子前導(dǎo)序列)，或者酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或者在WO90/13646中所述信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰疹病毒gD信號(hào)。
將這類(lèi)前體區(qū)域的DNA與編碼所述多肽變體的DNA連接在同一閱讀框架內(nèi)。
(ii)復(fù)制起始成分表達(dá)載體和克隆載體均包含能使所述載體在一個(gè)或多個(gè)所選的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，此序列是能使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起始點(diǎn)或自主復(fù)制序列。在各種細(xì)菌、酵母和病毒中這樣的序列眾所周知。來(lái)源于質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)適合于大部分革蘭氏陰性菌，2μ質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)復(fù)制起始點(diǎn)可用于在哺乳動(dòng)物中克隆載體。通常，復(fù)制起始點(diǎn)成分對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不是必須的(通常應(yīng)用SV40復(fù)制起始點(diǎn)，只是因?yàn)槠浒ㄔ缙趩?dòng)子)。
(iii)篩選基因成分表達(dá)載體和克隆載體可以包括篩選基因，其也被稱(chēng)為可篩選標(biāo)記。典型的篩選基因編碼蛋白，所述蛋白(a)提供對(duì)抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如編碼芽孢桿菌D丙氨酸消旋酶的基因。
篩選方案的一個(gè)實(shí)例中利用藥物來(lái)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些用異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能夠提供藥物耐受性的蛋白，并因此在篩選中存活。此類(lèi)顯性篩選的實(shí)例應(yīng)用了新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一個(gè)適合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可篩選標(biāo)記是那些能夠鑒定競(jìng)爭(zhēng)攝取所述多肽變體核酸的細(xì)胞的篩選標(biāo)記，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和II(優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)金屬硫蛋白基因)，腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)苷脫羧酶等。
例如，首先通過(guò)在含氨甲喋呤(Mtx，DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有的轉(zhuǎn)化體，鑒定用DHFR篩選基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。當(dāng)使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞為DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
或者，通過(guò)在含針對(duì)所述可篩選標(biāo)記的篩選試劑(如氨基糖苷類(lèi)抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可以篩選用編碼多肽變體、野生型DHFR蛋白，和另一種篩選標(biāo)記如氨基萄糖苷3’磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(尤其是含內(nèi)源性DHFR的野生型宿主細(xì)胞)。見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4965199。
適合于在酵母中應(yīng)用的篩選基因是在酵母質(zhì)粒YRp7 (Stinchcomb等，自然，28239(1979))中存在的trp1基因。所述trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株提供了可篩選標(biāo)記，所述突變株例如ATCC 44076或PEP4-1，Jones等，遺傳學(xué)，8512(1977)。通過(guò)在無(wú)色氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1損傷的存在，為檢測(cè)轉(zhuǎn)化提供了有效的環(huán)境。同樣，可以用有Lue2基因的已知質(zhì)?；パa(bǔ)Leu2缺陷型酵母株(ATCC20622或38626)。
另外，可以將來(lái)源于1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母屬酵母。另外，用于大規(guī)模產(chǎn)生重組小牛凝乳酶的乳酸克魯維酵母(K.Lactis)表達(dá)系統(tǒng)已被報(bào)道，Van den Berg，生物/技術(shù)，8135(1990)。還有用于克魯維酵母屬工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定型多拷貝表達(dá)載體的報(bào)道。Fleer等，生物/技術(shù)，9968-975(1991)(47頁(yè))。
(iv)啟動(dòng)子成分表達(dá)載體和克隆載體通常包括被宿主生物識(shí)別并與多肽變體核酸可操作地連接的啟動(dòng)子。適合于在原核宿主細(xì)胞中應(yīng)用的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子、β內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。然而，其它已知地細(xì)菌啟動(dòng)子也是適合的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還包括與編碼所述多肽變體的DNA可操作地連接的Shine-Dalgarno(SD)序列。
已經(jīng)知道用于真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。實(shí)際上，所有的真核基因均具有富含AT的區(qū)域，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)序列是CNCAAT，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3’末端是AATAAA序列，它是在編碼序列的3’末端加polyA尾的信號(hào)序列。將所有這些序列適當(dāng)?shù)牟迦胝婧吮磉_(dá)載體。
用于酵母宿主的適合的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。
其它具有由生長(zhǎng)條件控制的附加轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢(shì)的誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子，是下述酶的啟動(dòng)子區(qū)乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73657中進(jìn)一步敘述了用于酵母表達(dá)的適合的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子也被方便的與酵母啟動(dòng)子一起應(yīng)用。
通過(guò)啟動(dòng)子對(duì)在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中載體的多肽變體轉(zhuǎn)錄進(jìn)行控制，只要所述啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞相容，其可以來(lái)源于病毒基因組如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，并且最優(yōu)選猴40(SV40)；異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，例如肌動(dòng)蛋白或免疫球蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為另包括SV40病毒復(fù)制起始點(diǎn)的SV40限制性片段方便的獲得。人巨細(xì)胞病毒的即早啟動(dòng)子可以作為HindIII E限制性片段方便的得到。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4419446中敘述了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體的DNA表達(dá)系統(tǒng)。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4601978中敘述了此系統(tǒng)的改良版本。另見(jiàn)Reyes等，自然297598-601(1982)中所述的在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下，在小鼠細(xì)胞中人β干擾素cDNA的表達(dá)。另外，勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列可以被用作為啟動(dòng)子。
(v)增強(qiáng)子元件成分通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入所述載體，通?？商岣呔幋a本發(fā)明多肽變體的DNA在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。已知很多來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，通常應(yīng)用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。另見(jiàn)Yaniv等，自然29717-18中所述的用于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。所述增強(qiáng)子可以剪接入載體中多肽變體編碼序列的5’端或3’端，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’端。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止成分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還包括對(duì)終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA必須的序列。此類(lèi)序列通?？蓮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA的5’(偶爾從3’)非翻譯區(qū)得到。這些區(qū)域包括被轉(zhuǎn)錄為多肽變體mRNA的非翻譯部分中多腺苷酸化片段的核苷酸片段。一個(gè)有用的轉(zhuǎn)錄終止成分是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。見(jiàn)WO94/11026和其中所述表達(dá)載體。
(vii)宿主細(xì)胞的篩選和轉(zhuǎn)化用于克隆或表達(dá)本發(fā)明載體中DNA的合適的宿主細(xì)胞是上述原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。用于此目的的適合的原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌等真細(xì)菌，如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的埃希菌屬(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷白菌屬、變形菌桿屬、沙門(mén)菌屬(例如鼠傷寒沙門(mén)菌)、沙雷菌屬(粘質(zhì)沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。優(yōu)選大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31446)，份聲明大腸桿菌B、大腸桿菌X177(ATCC31537)和大腸桿菌W3110(ATCC27325)等其它菌株也適合。這些實(shí)例是用于說(shuō)明而不是限制于此。
除了原核生物，絲狀真菌或酵母等真核微生物也是對(duì)多肽變體編碼載體適合的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。然而，多種其它屬、種和株也是可公開(kāi)得到的并可用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeraml1)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP183070)；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP244234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉等。
用于表達(dá)糖基化多肽變體的適合宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的容許型昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞，所述宿主包括草地夜蛾(毛蟲(chóng))、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株可以公開(kāi)地獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾(autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作為根據(jù)本發(fā)明的病毒，尤其是用于草地夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽牛花、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關(guān)注最多的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或亞克隆培養(yǎng)成懸浮培養(yǎng)液的293細(xì)胞，Graham等，普通病毒新雜志(J.GenVirol.)3659(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊774216(1980))；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，紐約科學(xué)院年鑒(Annals N.Y.Acad.Sci.)38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Hep G2)。
宿主細(xì)胞用上述用于多肽變體制備的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在改進(jìn)型傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進(jìn)已適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
(viii)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽變體的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham’s F10(Sigma)、最小基本培養(yǎng)基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良型Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)均適合于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。另外，在Ham等，酶學(xué)方法5844(1979)；Barnes等，生物化學(xué)年鑒102255(1980)；美國(guó)專(zhuān)利4767704、4657866、4927762、4560655或5122469；WO90/03430；WO87/00195；或美國(guó)專(zhuān)利Re.30985中所述任何培養(yǎng)基可作為所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何所述培養(yǎng)基可在需要時(shí)補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸)、緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷嘧啶)、抗生素(例如遺傳霉素(GENTAMYCINTM))、痕量元素(定義為通常以微摩爾級(jí)終濃度出現(xiàn)的無(wú)機(jī)化合物)、葡萄糖或一種等價(jià)能源。還包括任何其它必須補(bǔ)充物，其相應(yīng)濃度為本領(lǐng)域已知。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用于表達(dá)型宿主細(xì)胞的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此很熟悉。
(ix)多肽變體的純化當(dāng)應(yīng)用重組技術(shù)時(shí)，所述多肽變體可以在細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)空間中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述多肽變體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，第一步通過(guò)離心或超濾除去顆粒狀碎片，即宿主細(xì)胞或其裂解片段。Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992)中敘述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體的方法。簡(jiǎn)言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的條件下融解細(xì)胞團(tuán)超過(guò)30分鐘。通過(guò)離心可以將細(xì)胞碎片除去。在所述多肽分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)濃縮此類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的上清。在任何上述步驟中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制劑，并且可以包括抑制外來(lái)污染物生長(zhǎng)的抗生素。
從所述細(xì)胞中制備的多肽變體組合物可利用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適合性取決于該多肽變體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類(lèi)和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的多肽變體(Lindmark等，免疫學(xué)方法雜志，621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有的小鼠同種型和人γ3(GuSS等，EMBO J.51567-1575(1986))。與親和配體結(jié)合的基質(zhì)最常用瓊脂糖，但也可利用其它基質(zhì)。具有機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時(shí)更短。在所述多肽變體包括CH3結(jié)構(gòu)域的情況中，Bakerbond ABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，PhilliPBSurg，NJ)有利于純化。根據(jù)待回收的多肽變體，還可以應(yīng)用其它蛋白純化技術(shù)，例如在離子交換柱上的分級(jí)分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅層析、在陽(yáng)離子或陰離子交換樹(shù)脂層析(例如聚天冬氨酸柱)上進(jìn)行的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何最初純化步驟之后，利用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，可以對(duì)包括所述目的多肽變體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度條件下進(jìn)行(例如大約0-0.25M鹽濃度)。
E.藥物配制通過(guò)將具有所需純度的所述多肽變體與可選擇的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington氏藥學(xué)，第16版，Osol，A.編(1980))混合，可制備用于儲(chǔ)存的多肽變體的治療劑型，其為凍干劑型或水溶液形式。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量或濃度下對(duì)受體沒(méi)有毒性，并且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苯甲酰氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化鹽酸胱胺，苯索氯銨；酚、丁基或芐基醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)乙醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性多聚體，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、雙糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類(lèi)，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫(TWEENTM)、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述劑型還可以包括一種以上對(duì)被治療的特殊適應(yīng)癥必須的活性化合物，優(yōu)選那些具有不相互抑制的互補(bǔ)活性的化合物。這些分子以對(duì)所需目的有效的量適當(dāng)?shù)慕M合。
還可以將所述活性成分裝入通過(guò)例如團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊中，分別如在膠體藥物運(yùn)送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液(micdrosphere)、極小顆粒(nano-particle)和極小膠囊(nanocapsule))或巨乳液(macroemulsion)中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微膠囊。所述技術(shù)見(jiàn)Remington氏藥學(xué)第16版，Osol，A.編(1980)。
用于體內(nèi)施用的所述制劑必須無(wú)菌。這可通過(guò)除菌濾膜過(guò)濾容易地完成。
可以制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含所述變體的固體疏水性多聚體的半滲透基質(zhì)，所述基質(zhì)具有一定形狀例如薄膜或微膠囊?？蒯尰|(zhì)包括聚脂、水凝膠(例如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)，或聚乙烯醇)、聚交脂(美國(guó)專(zhuān)利3773919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙酯、LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚體和亮氨酰脯氨酸乙酸(leuprolide acetate)組成的可注射微球體)等可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物、聚-D-(-)-3-羥基丁酸。乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羥基乙酸等多聚體能使分子的釋放超過(guò)100天，而某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間較短。當(dāng)裝入膠囊中的抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存留時(shí)，由于暴露于37℃潮濕環(huán)境，其可能變性或凝聚，導(dǎo)致生物活性的喪失并可能導(dǎo)致免疫原性的改變。根據(jù)所涉及的機(jī)制，可以針對(duì)穩(wěn)定性設(shè)計(jì)合理的策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)所述凝聚機(jī)制是通過(guò)硫-二硫化物互換而形成分子內(nèi)S-S鍵，那么通過(guò)修飾巰基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、利用適當(dāng)添加劑和開(kāi)發(fā)特異性多聚體基質(zhì)組合物等方法，可以獲得穩(wěn)定性。
F.所述多肽的非治療應(yīng)用本發(fā)明多肽變體可以用作親和純化試劑。在這個(gè)方法中，可利用本領(lǐng)域熟知的方法將多肽變體固定于Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙等固相上。使固相化多肽變體與含有待純化抗原的樣品接觸，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┫礈熘С窒啵鋈軇┛梢曰旧铣悠分谐怂兓目乖獾乃形镔|(zhì)，其中所述抗原已與固相化多肽變體結(jié)合。最終，用另一種適當(dāng)?shù)娜軇?，例如pH5.0的甘氨酸緩沖液等洗滌支持相，使抗原從多肽變體中釋放。
所述多肽變體還可以用于診斷試驗(yàn)，例如，檢測(cè)特定的細(xì)胞、組織或血清中相關(guān)抗原的表達(dá)。
對(duì)于診斷應(yīng)用，通常用可檢測(cè)物質(zhì)對(duì)所述多肽變體進(jìn)行標(biāo)記。可以應(yīng)用各種標(biāo)記物，其通常分為以下幾種(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。利用例如在免疫學(xué)最新方案(Current Protocols in Immunology)，卷1和2，Coligen等編，Wiley-interscience，紐約，New York Pubs.(1991)中所述方法，用放射性同位素對(duì)所述多肽進(jìn)行標(biāo)記，并且可以利用閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射活性。
(b)可以應(yīng)用熒光標(biāo)記，例如稀土元素螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物，例如羅丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白和得克薩斯紅?？梢岳美缭诿庖邔W(xué)最新方案，出處同上，中所述技術(shù)，將所述熒光標(biāo)記物與所述多肽變體連接。利用熒光計(jì)定量熒光。
(c)可以應(yīng)用各種酶-底物標(biāo)記，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4275149中提供了對(duì)其中一些的綜述。所述酶通常催化發(fā)色底物的化學(xué)變化，可以利用各種技術(shù)測(cè)定這些變化。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以被分光光度計(jì)所檢測(cè)。或者，所述酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。用于定量熒光改變的技術(shù)見(jiàn)上面的敘述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)激發(fā)電子，然后發(fā)出可以被檢測(cè)(例如，用化學(xué)發(fā)光儀)或給熒光受體提供能量的光。酶標(biāo)記的實(shí)例包括螢光素酶(例如螢火蟲(chóng)螢光素酶或細(xì)菌螢光素酶，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4737456)、螢光素、2，3-二氫二氮雜萘二酮、蘋(píng)果酸酯脫氫酶、脲酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)等過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。在O’Sullivan等，制備酶免疫分析所用酶-抗體偶聯(lián)物的方法，酶學(xué)方法，(J.Langone和H.Van Vunakis編)，Academic press，紐約，73147-166(1981)中敘述了將酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。
酶-底物組合的實(shí)例包括(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)，氫過(guò)氧化物酶為底物，由氫過(guò)氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺氫氯化物(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)，以對(duì)硝基苯磷酸鹽為發(fā)色底物；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，有發(fā)色底物(例如對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或發(fā)熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以應(yīng)用其它多種酶-底物組合。其綜述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4275149和4318980。
有時(shí)，標(biāo)記物與多肽變體間接連接。技術(shù)人員知道用于此的各種技術(shù)。例如，可使多肽與生物素偶聯(lián)，并使上述三類(lèi)標(biāo)記物之任一與抗生物素蛋白結(jié)合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性結(jié)合，使標(biāo)記物能以這種方式間接與多肽變體偶聯(lián)?；蛘?，為使標(biāo)記物與多肽變體間接連接，將多肽變體與小分子半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，并將上述不同類(lèi)型標(biāo)記物之一與抗半抗原多肽變體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。如此可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與多肽變體的間接偶聯(lián)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，多肽變體不需要標(biāo)記，其存在可利用與該多肽變體結(jié)合的標(biāo)記抗體檢測(cè)。
本發(fā)明多肽變體可用于任何已知的試驗(yàn)方法，如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、直接和間接夾心試驗(yàn)，及免疫沉淀試驗(yàn)。Zola，單克隆抗體技術(shù)指南，147-158頁(yè)(CRC Press，Inc.1987)。
所述多肽變體還可以用于體內(nèi)診斷試驗(yàn)。通常用放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標(biāo)記所述多肽變體，以便該抗原或其表達(dá)細(xì)胞可利用免疫閃爍成像術(shù)定位。
G.多肽變體的體內(nèi)應(yīng)用可以將本發(fā)明的多肽變體用于治療哺乳動(dòng)物，例如患有(或易感)疾病或病癥，并可以從所述多肽體的施用中獲益的患者?？梢杂盟龆嚯淖凅w治療的疾病很多，包括腫瘤(例如在多肽變體結(jié)合HER2受體、CD20或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)時(shí))；過(guò)敏性疾病如哮喘等(用抗IgE抗體)；和LFA-1介導(dǎo)的疾病(例如在所述多肽變體是抗LFA-1或抗-ICAM-1抗體時(shí))等。
在抗體結(jié)合HER2受體的情況中，所述疾病優(yōu)選表達(dá)HER2的腫瘤，例如以HER2受體過(guò)表達(dá)為特點(diǎn)的良性或惡性腫瘤。這樣的腫瘤包括但不限于乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸道腫瘤、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰部癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類(lèi)型的頭頸部腫瘤。
根據(jù)本文所述，可以制備具有ADCC活性增強(qiáng)或降低的Fc區(qū)變體的多肽。這類(lèi)分子可以在不同疾病的治療中應(yīng)用。
例如，在需要破壞或消除組織或外來(lái)微生物的疾病或病癥的治療中，可以使用ADCC活性增強(qiáng)的多肽變體。例如，所述多肽可以用于治療癌癥；炎性疾病；感染(例如細(xì)菌、病毒、真菌或酵母感染)；和其它需要去除組織的疾病(例如甲狀腺腫)等。
在所述多肽的ADCC活性被降低的情況中，這類(lèi)變體可在需要含F(xiàn)c區(qū)的具有較長(zhǎng)半衰期的多肽的疾病或病癥治療中應(yīng)用，而且所述多肽優(yōu)選無(wú)不必要的效應(yīng)功能。例如，含F(xiàn)c區(qū)多肽可以是抗組織因子(TF)抗體；抗IgE抗體；和抗整合素抗體(例如抗α4β7抗體)。所述含F(xiàn)c區(qū)多肽的作用的可能機(jī)制可以是阻斷配體-受體結(jié)合對(duì)。而且，所述ADCC活性降低的含F(xiàn)c區(qū)多肽可以是激動(dòng)劑抗體。
所述多肽變體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，包括胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，需要進(jìn)行局部免疫抑制治療時(shí)傷患處內(nèi)部給藥。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。另外，所述多肽變體可以通過(guò)脈沖輸注適當(dāng)給藥，尤其多肽變體劑量漸低的情況。優(yōu)選所述劑量通過(guò)注射給藥，最優(yōu)選靜脈或皮下注射，部分地依據(jù)所述給藥是簡(jiǎn)短還是持續(xù)。
對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，所述多肽變體的適當(dāng)劑量取決于待治療疾病的類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、所述多肽是用于預(yù)防還是治療目的、先前的治療、患者的病史和對(duì)所述多肽變體的應(yīng)答、以及主治醫(yī)師的判斷。所述多肽變體適于給患者一次給藥或系列給藥。
根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和類(lèi)型，給患者用藥時(shí)，不管是一次或多次單獨(dú)給藥還是連續(xù)輸注，首劑可以是約1μg/kg-15mg/kg(如0.1-20mg/kg)多肽變體。通常每日劑量可能約1μg/kg-100mg/kg或更多，這取決于上述因素。數(shù)日或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)給藥，可根據(jù)情況將治療持續(xù)至對(duì)疾病癥狀的所需抑制出現(xiàn)為止。但也可使用其它劑量方案。此治療的進(jìn)程可通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)和試驗(yàn)輕易監(jiān)控。
所述多肽變體組合物的配制、用量和給藥方式應(yīng)與良好醫(yī)療實(shí)踐一致。這方面考慮的因素包括具體所治疾病、具體所治哺乳動(dòng)物、每個(gè)患者的臨床狀況、病因、給藥部位、給藥方法、給藥方案和醫(yī)務(wù)人員知道的其它因素。所給多肽變體的“治療有效量”可以根據(jù)這些考慮控制，且是預(yù)防、緩解或治療疾病或病癥所必須的最小量。所述多肽變體不必，但可選擇與目前常用于預(yù)防或治療所述疾病的一或多種試劑進(jìn)行配伍。這些其它試劑的有效劑量取決于制劑中多肽變體的量、疾病或治療的類(lèi)型、和上述其它因素。這些試劑的應(yīng)用與以前所用劑量和給藥途徑相同，或者是以前使用劑量的1-99％。
通過(guò)參考下述實(shí)施例，本發(fā)明將被充分理解。但是，它們不應(yīng)該被理解為限制本發(fā)明的范圍。本文中提及的文獻(xiàn)和專(zhuān)利均引入本文作為參考。
實(shí)施例1 低親和力受體結(jié)合試驗(yàn)該試驗(yàn)測(cè)定IgG Fc區(qū)與被表達(dá)為His6-谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)-標(biāo)簽融合蛋白的重組FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIAα亞單位的結(jié)合。因?yàn)镮gG1 Fc區(qū)對(duì)FcγRI的親和力在納摩爾范圍內(nèi)，可以在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中通過(guò)滴定單體IgG并用多克隆抗IgG測(cè)定結(jié)合型IgG而測(cè)定IgG1 Fc區(qū)變體的結(jié)合(見(jiàn)實(shí)施例2)。然而FcγR家族其它成員(即FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA)對(duì)IgG的親和力在微摩爾范圍內(nèi)，單體IgG1與這些受體的結(jié)合不能在ELISA試驗(yàn)中可靠地測(cè)定。
以下試驗(yàn)利用了重組抗-IgE E27(圖4A和4B)的Fc變體，當(dāng)與人IgE以1∶1摩爾濃度混合時(shí)，其形成由三個(gè)抗IgE分子和三個(gè)IgE分子組成的穩(wěn)定的六聚體。構(gòu)建IgE的重組嵌合形式(嵌合IgE)，它由人IgE Fc區(qū)和抗VEGF抗體的Fab段組成(Presta等，癌癥研究574593-4599(1997))，每分子抗VEGF抗體結(jié)合兩個(gè)VEGF分子。當(dāng)將重組人VEGF以2∶1的摩爾比加到嵌合型IgE∶E27六聚體中時(shí)，所述六聚體通過(guò)嵌合型IgE Fab∶VEGF相互作用連接成更大分子量的復(fù)合物。此復(fù)合物的E27組分與FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIAα亞單位以高親和力結(jié)合，其可用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)。
材料和方法受體包被Fcγ受體α亞單位表達(dá)為293細(xì)胞中His6標(biāo)記的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的GST融合蛋白，其產(chǎn)生ECD-6His-GST融合蛋白(Graham等，普通病毒學(xué)雜志3659-74(1977)和Gorman等DNA Prot.Eng.Tech.23-10(1990))，用Ni-NTA柱層析(Qiagen，Australia)將緩沖液換成磷酸鹽緩沖液而使其純化。其濃度可利用氨基酸組分分析所得消光系數(shù)以280nm處的吸收值確定。受體通過(guò)加入1μg/ml受體-GST融合蛋白的PBS溶液100μl，并4℃保溫48小時(shí)，以100μl/孔包被到Nunc F96 maxisorb平板(目錄號(hào)439454)上。試驗(yàn)前，用250μl洗滌緩沖液(含0.5％TWEEN 20TM的PBS pH7.4)將培養(yǎng)板洗滌3次，并用250μl試驗(yàn)緩沖液(50mM Tris鹽緩沖液，0.05％TWEEN 20TM，0.5％RIA級(jí)牛白蛋白(Sigma A7888)，和2mM EDTA pH7.4)進(jìn)行封閉。
免疫復(fù)合物形成將溶于PBS的等摩爾量(1∶1)的E27和重組嵌合IgE加到12×75mm聚丙烯試管中(其中每分子嵌合IgE結(jié)合兩分子重組人VEGF)，25℃旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。E27(抗IgE)/嵌合IgE(IgE)六聚體在此保溫期間形成。加入重組人VEGF(165型，MW 44000)使其相對(duì)于IgE濃度為摩爾比2∶1，并且于25℃再旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。VEGF-嵌合IgE的結(jié)合將E27嵌合IgE六聚體連接成更大分子量的復(fù)合物，其通過(guò)E27抗體的Fc區(qū)與FcγRα亞單位ECD包被的平板結(jié)合。
E27嵌合IgEVEGF以E27濃度5μg將(摩爾比為1∶1∶2)復(fù)合物加入FcγRα亞單位包被的平板，試驗(yàn)緩沖液中四份的總IgG為1μg，在環(huán)形(orbital)搖床(shaker)上25℃保溫120分鐘。
復(fù)合物檢測(cè)平板用洗滌緩沖液洗5次以去除未結(jié)合的復(fù)合物，加入100μl特異性為1∶10000試驗(yàn)緩沖液的馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)型山羊抗人IgG(γ)重鏈(Boehringer Mannheim 1814249)，在環(huán)形搖床上25℃保溫90分鐘，從而檢測(cè)IgG的結(jié)合。平板用洗滌緩沖液洗5次以去除未結(jié)合的HRP山羊抗人IgG，加入100μl底物溶液(0.4mg/ml鄰苯二胺二氫氯化物，Sigma P6912，6mM H2O2的PBS溶液)，25℃保溫8分鐘，從而檢測(cè)結(jié)合的抗IgG。加入100μl 4.5N H2SO4終止酶反應(yīng)，在96孔板密度儀(MolecularDevices)上于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定顯色產(chǎn)物。E27變體復(fù)合物的結(jié)合用含野生型E27的復(fù)合物的百分率表示。
實(shí)施例2 對(duì)人IgG抗體中唯一C1q結(jié)合位點(diǎn)的鑒定在本研究中，鑒定了人IgG1抗體“C2B8”的CH2結(jié)構(gòu)域中的突變(Reff等，血液83435(1994))，其消除了抗體與C1q的結(jié)合，但不改變抗體的構(gòu)象，也不影響與各個(gè)FcγR的結(jié)合。用丙氨酸掃描誘變方法在人IgG1中鑒定了5個(gè)變體，D270K、D270V、K322A、P329A和P331，其為非裂解型且與C1q的結(jié)合降低。所述資料顯示人IgG1的核心C1q結(jié)合位點(diǎn)不同于鼠IgG2b的。另外，發(fā)現(xiàn)K322A、P329A和P331A與CD20抗原及4種Fc區(qū)受體，F(xiàn)cγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn，能夠正常地結(jié)合。
材料和方法C2B8變體的構(gòu)建應(yīng)用了分別區(qū)克隆到前述PRK載體(Gorman等，DNA蛋白工程技術(shù)2∶3(1990))上的抗CD-20抗體C2B8(Reff等，血液83435(1994))的嵌合輕鏈和重鏈。通過(guò)定點(diǎn)誘變方法(Kunkel等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊82488(1987))，構(gòu)建重鏈Fc區(qū)的丙氨酸掃描變體。如前述(Werther等，免疫學(xué)雜志1574986(1996))將重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染的24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，并在5天后收集分泌型抗體。所述抗體用Protein A-SEPHAROSE CL-4BTM(Pharmacia)純化，更換緩沖液，并利用Centricon-30(Amicon)濃縮至0.5ml PBS溶液，4℃保存。應(yīng)用總Ig結(jié)合ELISA測(cè)定所述抗體濃度。
C1q結(jié)合ELASA用pH9的包被緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液)中指定濃度的C2B8將Costar 96孔板4℃包被過(guò)夜。然后將平板用PBS/0.05％TWEEN 20TM(pH7.4)洗3次，并用200μl不含乙基硫代汞水楊酸鈉的ELISA稀釋劑(0.1M NaPO4/0.1M NaCl/0.1％明膠/0.05％ TWEEN20TM/0.05％ProClin300)室溫封閉1小時(shí)。平板用洗滌緩沖液洗3次，每孔加入100μl 2μg/ml C1q(Quidel，San Diego，CA)，室溫保溫2小時(shí)。然后平板用洗滌緩沖液洗6次。每孔加入100μl 1∶1000稀釋的綿羊抗補(bǔ)體C1q過(guò)氧化物酶偶聯(lián)型抗體(Biodesign)，室溫保溫1小時(shí)。平板再用洗滌緩沖液洗6次，并每孔加入100μl含OPD(鄰苯二胺二氫氯化物(Sigma))的底物緩沖液(PBS/0.012％H2O2)。氧化反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，通過(guò)黃色的出現(xiàn)實(shí)施觀察，然后加入100μl 4.5N H2SO4終止反應(yīng)。用微滴板記錄儀(SPECTRAMAX250TM，Molecular Devices Corp)在(492-405)nm波長(zhǎng)處讀取吸收值。平行進(jìn)行相應(yīng)對(duì)照的反應(yīng)(即對(duì)各個(gè)濃度的C288進(jìn)行無(wú)C1q的ELISA反應(yīng)，還進(jìn)行無(wú)C2B8的ELISA反應(yīng))。對(duì)于各個(gè)變體，通過(guò)利用4參數(shù)曲線(xiàn)擬合程序(KALEIDAGRAPHTM)繪制吸光度(492-405nm)比C2B8濃度(μg/ml)的曲線(xiàn)，并比較EC50值，可測(cè)定C1q結(jié)合。
補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒(CDC)試驗(yàn)本試驗(yàn)基本按文獻(xiàn)(Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法202163(1996))進(jìn)行。用RHB緩沖液(RPMI1640/20mMHEPES(pH7.2)/2mM谷氨酰胺/0.1％BSA/100μg/ml慶大霉素)將C2B8稀釋成各種濃度(0.08-20μg/ml)。用RHB緩沖液將人補(bǔ)體(Quidel)稀釋成1∶3，并用RHB緩沖液將表達(dá)CD20抗原的WIL2-S細(xì)胞(可從ATCC獲得，Manassas，VA)稀釋至1×106細(xì)胞/ml。將含等體積C2B8、稀釋的人補(bǔ)體和WIL2-S細(xì)胞的混合物150μl加到96孔平底組織培養(yǎng)板中，在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。然后每孔加入50μl alamarblue(Accumed International)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用96孔熒光計(jì)以530nm激發(fā)光和590nm發(fā)射光測(cè)定吸光度。按Gazzano-Santoro等所述，用相對(duì)熒光單位(RFU)表示結(jié)果。根據(jù)C2B8標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的濃度，并給出各個(gè)變體相對(duì)于野生型C2B8的活性百分率。
C2B8變體的CD20結(jié)合能力用文獻(xiàn)(Reff等，(1994)，出處同上；Gazzano-Santoro等的綜述(1996)，出處同上)所述方法測(cè)定C2B8及其變體與CD20抗原的結(jié)合。將WIL2-S細(xì)胞培養(yǎng)3-4天，使其密度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml。用FACS緩沖液(PBS/0.1％BSA/0.02 NaN3)洗滌并離心細(xì)胞兩次，將細(xì)胞重懸，使其濃度為5×106細(xì)胞/ml。將200μl細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml)和20μl稀釋的C2B8樣品加到5ml試管中，并在室溫?cái)嚢璞?0分鐘。然后用2ml冷FACS緩沖液洗滌混合物，離心后用200μl冷FACS緩沖液重懸。向懸浮液中加入10μl山羊抗人IgG-FITC(American Qualex Labs)并將所述混合物在室溫下避光攪拌保溫30分鐘。保溫之后，用2ml FACS緩沖液洗滌所述混合物，離心后重懸于1ml冷的固定緩沖液(1％福爾馬林的PBS溶液)。用流式細(xì)胞術(shù)分析樣品，結(jié)果用相對(duì)熒光單位(RFU)表示，利用4參數(shù)曲線(xiàn)擬合程序(KALEIDAGRAPHTM)繪制針對(duì)抗體濃度的曲線(xiàn)。EC50值以其對(duì)C2B8參考物的百分比表示。
FcγR結(jié)合ELISAFcγRIα亞單位-GST融合蛋白通過(guò)加入受體-GST融合蛋白的1μg/ml PBS溶液100μl而包被到Nunc F96 maxisorb平板(目錄號(hào)439454)上。試驗(yàn)前，平板用250μl洗滌緩沖液(PBS pH7.4，含0.5％TWEENTM)洗3次，并用250μl試驗(yàn)緩沖液(50mM Tris鹽緩沖液，0.05％TWEENTM，0.5％RIA級(jí)牛白蛋白(Sigma A7888)，和2mM EDTA pH7.4)封閉。將在1ml試驗(yàn)緩沖液中稀釋為10μg/ml的樣品加到FcγRIα亞單位包被的平板中，并在環(huán)形搖床上25℃保溫120分鐘。平板用洗滌緩沖液洗5次以去除未結(jié)合的復(fù)合物，加入100μl特異性為1∶10000試驗(yàn)緩沖液的馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)型山羊抗人IgG(γ)重鏈(Boehringer Mannheim1814249)，在環(huán)形搖床上25℃保溫90分鐘，從而檢測(cè)IgG的結(jié)合。平板用洗滌緩沖液洗5次以去除未結(jié)合的HRP山羊抗人IgG，加入100μl底物溶液(0.4mg/ml鄰苯二胺二氫氯化物，Sigma P6912，6mM H2O2的PBS溶液)，25℃保溫8分鐘，從而檢測(cè)結(jié)合的抗IgG。加入100μl 4.5N H2SO4終止酶反應(yīng)，在96孔板密度儀(Molecular Devices)上于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定顯色產(chǎn)物。變體的結(jié)合表示為野生型分子的百分率。
FcγRII和III結(jié)合ELISA按實(shí)施例1所述進(jìn)行。
對(duì)于IgG變體的FcRn結(jié)合活性檢測(cè)，在50mM碳酸緩沖液(pH9.6)中用2μg/ml鏈親合素(Zymed，South San Francisco)將ELISA平板4℃包被過(guò)夜，并用PBS-0.5％BSA(pH7.2)室溫封閉1小時(shí)。將溶于PBS-0.5％BSA、0.05％吐溫20、pH7.2中的生物素化FcRn(利用來(lái)自Research Organics，Cleveland，OH的生物素-X-NHS進(jìn)行制備，使用時(shí)濃度為1-2μg/ml)加到平板中，并保溫1小時(shí)。將溶于PBS-0.5％BSA、0.05％吐溫20、pH6.0中的倍比稀釋的IgG標(biāo)準(zhǔn)品(1.6-100ng/ml)或變體，加到所述平板中，并保溫2小時(shí)。以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(Kirgaard & Perry Laboratories)為底物，利用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊F(ab’)2抗人IgG F(ab’)2，在上述pH6.0緩沖液(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)中測(cè)定結(jié)合的IgG。在各步驟之間，用PBS-0.05％吐溫20(pH7.2或pH6.0)洗滌平板。在Vmax平板記錄儀(MolecularDevices，Menlo Park，CA)上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用4參數(shù)非直線(xiàn)回歸曲線(xiàn)擬和程序(KaleidaGraph，Synergy software，Reading，PA)繪制滴定曲線(xiàn)。計(jì)算相當(dāng)于滴定曲線(xiàn)中點(diǎn)吸收值的IgG變體濃度，然后除以相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線(xiàn)中點(diǎn)吸收值的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
結(jié)果和討論通過(guò)丙氨酸掃描誘變，在C2B8的CH2結(jié)構(gòu)域中構(gòu)建了以E318A、K320A和K322A起始d幾個(gè)單點(diǎn)突變。所有構(gòu)建的變體均與CD20抗原正常結(jié)合(表3)。
表3
(+)表示結(jié)合，(-)表示結(jié)合消失
*對(duì)于C1q結(jié)合，每個(gè)+號(hào)相當(dāng)于約33％的結(jié)合。
在分析人補(bǔ)體與具有人Fc區(qū)的抗體的結(jié)合時(shí)，E318A和K320A激活補(bǔ)體的能力基本上與野生型C2B8相同(表3)。E318A和K320A對(duì)C1q的結(jié)合與野生型C2B8相比差別很小。K320A與C1q的結(jié)合僅降低10％，而E318A與C1q的結(jié)合約降低30％(圖2)。所述結(jié)果表明E318A和K320A取代對(duì)補(bǔ)體激活和C1q結(jié)合的影響很小。另外，在C1q結(jié)合研究中，C2B8的人IgG1被IgG2代替，并作為陰性對(duì)照。IgG2變體的C1q親和力比E318A和K320A變體低很多(圖2)。故這些結(jié)果證實(shí)，E318和K320不構(gòu)成人IgG1的C1q結(jié)合核心位點(diǎn)。相反，K322A取代對(duì)補(bǔ)體激活和C1q結(jié)合均有顯著影響。K322A變體用上述CDC試驗(yàn)檢測(cè)沒(méi)有CDC活性，其對(duì)C1q的結(jié)合比野生型C2B8低100倍(圖2)。在人類(lèi)系統(tǒng)中，K322是唯一被提為對(duì)補(bǔ)體激活和C1q結(jié)合具有顯著影響之C1q結(jié)合核心位點(diǎn)的殘基。
由于Duncan和Winter的研究是用小鼠IgG2b進(jìn)行的，且上述結(jié)果表明人IgG1中K320和E318不參與C1q結(jié)合，在不依附于任何理論的前提下，上述資料提示鼠IgG的C1q結(jié)合區(qū)與人的不同。為對(duì)此作進(jìn)一步研究并鑒定不與C1q結(jié)合并因此不激活補(bǔ)體的其它變體，根據(jù)對(duì)C2B8 Fc的三維結(jié)構(gòu)的評(píng)估，在K322附近構(gòu)建了幾個(gè)點(diǎn)突變。檢測(cè)了所構(gòu)建變體K274A、N276A、Y278A、S324A、P329A、P331A、K334A和T335A結(jié)合C1q和激活補(bǔ)體的能力。這些取代中多數(shù)對(duì)C1q結(jié)合和補(bǔ)體激活的影響很小或無(wú)影響。在上述試驗(yàn)中，P329A和P331A變體不激活補(bǔ)體且與C1q的結(jié)合降低。P331A變體不激活補(bǔ)體，且對(duì)C1q的結(jié)合比野生型C2B8低60倍(圖3)。將圖3中所用抗體的濃度范圍擴(kuò)展到100μg/ml以觀察C1q與P331A變體的結(jié)合飽和度。突變P329A產(chǎn)生一種不激活補(bǔ)體的抗體，其對(duì)C1q的結(jié)合比野生型C2B8(圖2)降低100倍(圖3)。
檢測(cè)不與C1q結(jié)合并因此不激活補(bǔ)體的變體與Fc受體FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、和FcRn結(jié)合的能力。該研究利用人源化抗IgE抗體，即具有這些突變的IgG1(見(jiàn)實(shí)施例1)進(jìn)行。結(jié)果表明變體K322A和P329A與所有Fc受體的結(jié)合程度等同于野生型蛋白(表4)。但P331A與FcγRIIB的結(jié)合略有下降。
總之，經(jīng)鑒定人IgG1 CH2結(jié)構(gòu)域COOH末端的兩個(gè)氨基酸取代K322A和P329A導(dǎo)致C1q結(jié)合下降100多倍且不能激活CDC途徑。這兩個(gè)變體，K322A和P329A，以等同于野生型抗體的親和力結(jié)合所有Fc受體。根據(jù)表4的結(jié)果，在不依附于任何理論的前提下，我們認(rèn)為人IgG1的C1q結(jié)合中心在K322、P329和P331附近，其不同于鼠IgG2b的結(jié)合中心，后者由E318、K320和K322組成。
表4
a與FcγRs的結(jié)合中，所述變體以E27(抗IgE)為背景制備。
上述結(jié)果表示為野生型的百分率。
利用本實(shí)施例所述方法檢測(cè)了在人C1q結(jié)合中所涉及的另一殘基。用賴(lài)氨酸和纈氨酸取代殘基D270，分別產(chǎn)生變體D270K和D270V。這些變體與人C1q的結(jié)合均降低(圖6)，且為非裂解型(圖7)。這兩個(gè)變體與CD20抗原正常結(jié)合，并恢復(fù)ADCC作用。
實(shí)施例3 C1q結(jié)合增強(qiáng)的變體下述研究表明，位點(diǎn)K326、A327、E333和K334的殘基取代導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)C1q的結(jié)合比野生型抗體至少增加約30％的變體。這表明K326、A327、E333和K334是通過(guò)CDC途徑提高抗體功效的潛在位點(diǎn)。本研究的目的是通過(guò)增加與C1q的結(jié)合而提高抗體的CDC活性。通過(guò)在K326和E333上的定點(diǎn)誘變，構(gòu)建了幾個(gè)與C1q結(jié)合增強(qiáng)的變體。在K326位點(diǎn)上增加結(jié)合的殘基依次是K＜V＜E＜A＜G＜D＜M＜W，在E333位點(diǎn)上增加結(jié)合的殘基依次是E＜Q＜D＜V＜G＜A＜S。構(gòu)建了四個(gè)變體K326M、K326D、K326E和E333S，它們對(duì)C1q的結(jié)合比野生型抗體至少增加2倍。變體K326W與C1q的結(jié)合增加了約5倍。
按上述實(shí)施例2的方法制備野生型C2B8抗體的變體。在C1q結(jié)合ELISA中包括另一個(gè)對(duì)照抗體，即基本上按美國(guó)專(zhuān)利5736137中所述方法在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中制備的野生型C2B8，以其證實(shí)在293腎細(xì)胞系中產(chǎn)生的野生型C2B8與在CHO中產(chǎn)生的抗體(見(jiàn)圖8中“CHO-wt-C2B8”)具有相同的C1q結(jié)合活性。本實(shí)例中C1q結(jié)合ELISA、CDC分析和CD20結(jié)合潛力分析按實(shí)施例2所述進(jìn)行。
如圖8所示，在C2B8中K326和E333位點(diǎn)上的丙氨酸取代導(dǎo)致產(chǎn)生與C1q的結(jié)合增加了30％的變體。
構(gòu)建了其它幾個(gè)在K326和E333位點(diǎn)上的單點(diǎn)突變變體，并且檢測(cè)了其結(jié)合C1q和激活補(bǔ)體的能力。構(gòu)建的所有抗體與CD20抗原結(jié)合正常。
對(duì)于K326，構(gòu)建的其它單點(diǎn)變體是K326A、K326D、K326E、K326G、K326V、K326M和K326W。如圖9所示，這些變體與C1q的結(jié)合親和力均比野生型抗體增加。K326W、K326M、K326D和K326E的C1q結(jié)合至少增加兩倍(表5)。在K326的各種變體中，K326W對(duì)C1q的親和力最強(qiáng)。
表5
用疏水性以及帶電荷的殘基進(jìn)行的取代可產(chǎn)生與C1q結(jié)合增強(qiáng)的變體。甚至用甘氨酸進(jìn)行的取代(已知其賦予鏈彈性，且在自然中相當(dāng)保守)可產(chǎn)生對(duì)C1q的親和力比野生型抗體更高的變體。這表明該位點(diǎn)上的任何氨基酸取代可產(chǎn)生對(duì)C1q的親和力增強(qiáng)的變體。根據(jù)對(duì)三維結(jié)構(gòu)的評(píng)估，K326和E333位于所述C1q結(jié)合核心位點(diǎn)的附近(圖10)。
除了丙氨酸，也可以用其它氨基酸殘基取代E333。這些變體，即E333S、E333G、E333V、E333D和E333Q，與C1q的結(jié)合均比野生型抗體增強(qiáng)(圖11)。如表5所示，對(duì)C1q結(jié)合親和力的順序如下E333S＞E333A＞E333G＞E333V＞E333D＞E333Q。與具有大側(cè)鏈氨基酸殘基的其它變體(E333V、E333D、E333Q)相比，用小側(cè)鏈氨基酸殘基(即絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸)取代產(chǎn)生的變體對(duì)C1q具有更高的親和力。變體E333S對(duì)C1q的親和力最高，其結(jié)合比野生型抗體高兩倍。這(不受限于任何理論)表明333位點(diǎn)對(duì)C1q結(jié)合的影響也可能部分歸因于殘基的極性。
還制備了雙變體。如圖12和13所示，雙變體K326M-E333S和K326A-E333A與野生型C2B8相比，對(duì)人C1q的結(jié)合至少?gòu)?qiáng)三倍(圖12)，在介導(dǎo)CDC方面至少?gòu)?qiáng)兩倍(圖13)?？杉有员砻鬟@些是獨(dú)立作用的變體。
如圖14所示，通過(guò)將人IgG1恒定區(qū)中A327變成甘氨酸，可制備C1q結(jié)合增加的另一種變體。相反，在人IgG2恒定區(qū)中，將G327變成丙氨酸可降低所述IgG2抗體的C1q結(jié)合。
實(shí)施例4 對(duì)人IgG抗體中FcR結(jié)合位點(diǎn)的鑒定在本研究中，評(píng)估了IgG1抗體中Fc區(qū)各個(gè)殘基的突變對(duì)其與FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIIA以及FcRn結(jié)合的影響。鑒定了與FcR的結(jié)合增強(qiáng)及降低的抗體變體。
材料和方法IgG1變體的構(gòu)建將分別具有圖4A和4B中輕鏈和重鏈序列的重組抗IgE E27作為下述實(shí)驗(yàn)的親本抗體。此抗體結(jié)合抗原IgE，且具有非A同種型IgG1 Fc區(qū)。通過(guò)定點(diǎn)誘變(Kunkel等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊82488(1987))，在上述親本抗體的重鏈中構(gòu)建Fc區(qū)的變體。如前述(Werther等，免疫學(xué)雜志，1574986(1996))，將重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系中。在共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將培養(yǎng)基變成無(wú)血清培養(yǎng)基，并在5天后收集分泌的抗體。所述抗體用蛋白G-SEPHAROSE(Pharmacia)純化，更換緩沖液，并利用Centricon-30(Amicon)濃縮成0.5ml PBS溶液，4℃保存。濃度用氨基酸組成分析所得消光系數(shù)以280nm處吸收值確定。
高親和力FcγRIA結(jié)合ELISAFcγRIA在293細(xì)胞中被表達(dá)為His6標(biāo)記的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白，用Ni-NTA柱層析純化。
為了純化FcγRIA，三天后去除轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清。加入蛋白酶抑制劑50μl抑酶肽(Sigma)/50ml上清和PMSF(1mM)。在攪拌室(stirred cell)(Amicon)中將上清濃縮到10ml，并對(duì)1升柱緩沖液(50mM Tris pH8.0，20mM咪唑，300mM NaCl)4℃透析過(guò)夜。第二天早上對(duì)新鮮柱緩沖液4℃再透析4小時(shí)。將所述溶液上樣至已用10ml柱緩沖液平衡的1ml Ni++柱(NTA超流樹(shù)脂，Qiagen)上。用10ml柱緩沖液洗柱，并用2.5ml洗脫緩沖液(50mM TrispH8.0，250mM咪唑，300mM NaCl)洗脫蛋白。將蛋白濃縮到0.5ml，并將緩沖液更換為PBS。濃度用氨基酸組成分析所得消光系數(shù)以280nm處吸收值確定。
每孔加入1.5μg/ml受體的PBS溶液100μl，4℃保溫24小時(shí)，從而使純化的受體以每孔約150ng包被到Nunc F96 maxisorb平板(目錄號(hào)439454)上。試驗(yàn)前，平板用250μl洗滌緩沖液(含0.5％TWEEN 20的PBS pH7.4)洗3次，并用250μl試驗(yàn)緩沖液(50mM Tris鹽緩沖液，0.05％TWEEN 20，0.5％RIA級(jí)牛白蛋白(Sigma A7888)，和2mM EDTA pH7.4)封閉。
向FcγRIA亞單位包被板的最前面4個(gè)孔中加入100μl IgE，其濃度為10μg/ml。在隨后四個(gè)孔中加入80μl試驗(yàn)緩沖液，然后加入10μg/ml E27IgG至終濃度為2μg/ml。平板在環(huán)形搖床上25℃保溫2小時(shí)。
為了進(jìn)行檢測(cè)，用洗滌緩沖液洗滌平板5次以去除未結(jié)合的抗體。通過(guò)加入100μl與蛋白G(BIORAD)偶聯(lián)的馬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)1∶5000，可檢測(cè)IgG與GST-FcγRIA的結(jié)合。將HRP偶聯(lián)物在環(huán)形搖床上25℃保溫1.5小時(shí)。用洗滌緩沖液將平板洗滌5次，去除未結(jié)合的HRP偶聯(lián)物。結(jié)合通過(guò)加入100μl底物溶液(0.4mg/ml鄰苯二胺二氫氯化物，SigmaP6912，6mM H2O2的PBS溶液)并在25℃保溫10分鐘以檢測(cè)。加入100μl4.5N H2SO4終止酶反應(yīng)，在96孔板密度儀(Molecular Devices)上于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定顯色產(chǎn)物。
2μg/ml IgG時(shí)E27變體的結(jié)合表示為野生型E27的比率。
FcγRIA THP-1試驗(yàn)向serocluster平板(Costar)的前三個(gè)孔中加入100μl E27，其在試驗(yàn)緩沖液(1×PBS，0.1％BSA，0.01％NaN3)中的濃度為20μg/ml。向隨后三個(gè)孔中加入92.5μl試驗(yàn)緩沖液，然后加入7.5μl 20μg/mlE27 IgG至終濃度1.5μg/ml。每孔加入100μl THP-1細(xì)胞，其在FACS試驗(yàn)緩沖液中的濃度為5百萬(wàn)細(xì)胞/ml。將平板在冰上保持30分鐘。
為了檢測(cè)，用洗滌緩沖液將細(xì)胞洗滌2次以去除未結(jié)合的抗體。加入100μl FITC偶聯(lián)型山羊抗人IgG重鏈特異性F(ab’)2片段(JacksonImmunoresearch)1∶200，檢測(cè)IgG與FcγRIA的結(jié)合。使FITC偶聯(lián)物與細(xì)胞在冰上保持30分鐘。用試驗(yàn)緩沖液洗滌細(xì)胞三次以去除未結(jié)合的FITC偶聯(lián)物。細(xì)胞用2.5μg/ml P.I.(SIGMA)染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
1.5μg/ml IgG時(shí)E27變體的結(jié)合表示為野生型E27的比率。
將來(lái)自平板試驗(yàn)(FcγRIA ELISA)和基于細(xì)胞的試驗(yàn)(FcγRIA THP-1試驗(yàn))的數(shù)據(jù)平均，得到FcγRIA結(jié)合活性。
低親和力FcγR結(jié)合ELISA按實(shí)施例1所述進(jìn)行FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA結(jié)合ELISA，并檢測(cè)穩(wěn)定的六聚體(由三個(gè)抗IgE分子和三個(gè)IgE分子組成)。
FeRn結(jié)合ELISA在檢測(cè)IgG變體的FcRn結(jié)合活性時(shí)，用在50mM碳酸緩沖液(pH9.6)中濃度為2μg/m1的鏈親和素將ELISA平板4℃包被過(guò)夜，并用PBS-0.5BSA(pH7.2)室溫封閉1小時(shí)。將溶于PBS-0.5％BSA，0.05％吐溫20(pH7.2)中的生物素化FcRn(用來(lái)自Research Organics，Cleveland，OH的生物素-X-NHS制備，使用濃度為1-2μg/ml。)加到所述平板，并保溫1小時(shí)。將溶于PSB-0.5％BSA、0.05％吐溫20(pH6.0)的倍比稀釋的IgG標(biāo)準(zhǔn)品(1.6-100ng/ml)或變體加到所述平板中，保溫2小時(shí)。結(jié)合的IgG用上述pH6.0緩沖液(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)中的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊F(ab’)2抗人IgG F(ab’)2，及隨后的3，3`，5，5`-四甲基聯(lián)苯胺(Kergaard & Perry Laboratories)底物測(cè)定。在各步驟之間，平板用PSB-0.05％吐溫20(pH7.2或pH6.0)洗滌。在Vmax平板記錄儀(MolecularDevices，Menlo Park，CA)上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用4參數(shù)非直線(xiàn)回歸曲線(xiàn)擬和程序(KaleidaGraph，Synergy software，Reading，PA)繪制滴定曲線(xiàn)。計(jì)算對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)品滴定曲線(xiàn)中點(diǎn)吸收值的IgG變體濃度，然后用除以標(biāo)準(zhǔn)品滴定曲線(xiàn)的中點(diǎn)吸收值所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
體外ADCC試驗(yàn)為了制備鉻51標(biāo)記的靶細(xì)胞，在組織平板中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，并將其收集于10mM EDTA的無(wú)菌PBS溶液中。在所有試驗(yàn)中用SK-BR-3細(xì)胞，一種3+HER2-過(guò)表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系，作為靶細(xì)胞。用細(xì)胞培養(yǎng)基將脫壁細(xì)胞洗滌兩次。將細(xì)胞(5×106)用200μCi鉻51(NewEngland Nuclear/DuPont)37℃標(biāo)記1小時(shí)，并間或攪拌。用細(xì)胞培養(yǎng)液將標(biāo)記的細(xì)胞洗滌三次，然后將其重新懸浮至濃度為1×105細(xì)胞/ml。細(xì)胞在試驗(yàn)前不調(diào)理，或如下調(diào)理，即與rhuMAb HER2野生型(HERCEPTIN)或7種Fc突變體(G14、G18、G17、G36、G30、G31和G34)保溫，它們?cè)赑BMC試驗(yàn)中濃度分別是100ng/ml和1.25ng/ml，在NK試驗(yàn)中濃度分別為20ng/ml和1ng/ml。
通過(guò)收集正常健康供體的肝素抗凝血細(xì)胞，制備外周血單核細(xì)胞，并用等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。然后將所述血細(xì)胞置于淋巴細(xì)胞分離液(LYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM)(LSMOrganon Teknika)上層并按說(shuō)明書(shū)離心。在LSM血漿分界面上收集單核細(xì)胞，并用PBS洗滌三次。將效應(yīng)細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中，終濃度為1×107細(xì)胞/ml。
通過(guò)LSM純化之后，用NK細(xì)胞分離試劑盒和磁柱(Miltenyi Biotech)按說(shuō)明書(shū)，通過(guò)陰性選擇從PBMC中分離自然殺傷(NK)細(xì)胞。收集分離的NK細(xì)胞，洗滌，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基至終濃度2×106細(xì)胞/ml。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)NK細(xì)胞同一性。
通過(guò)將效應(yīng)細(xì)胞(PBMC或NK)用細(xì)胞培養(yǎng)基沿著微滴定板(100μl終體積)的各行進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽涓鞣N效靶比。對(duì)于PBMC，效應(yīng)細(xì)胞的濃度范圍為1.0×107/ml到2.0×104/ml，而對(duì)于NK，其范圍為2.0×106/ml到3.9×103/ml。滴定效應(yīng)細(xì)胞之后，向平板的每孔中加入100μl濃度為1×105細(xì)胞/ml的鉻51標(biāo)記的靶細(xì)胞(調(diào)理的或未調(diào)理的)。這導(dǎo)致PBMC細(xì)胞的起始效靶比為100∶1，NK細(xì)胞的起始效靶比為20∶1。所有試驗(yàn)均做雙份，每個(gè)平板均包括自發(fā)裂解對(duì)照(無(wú)效應(yīng)細(xì)胞)和總裂解對(duì)照(靶細(xì)胞加100μ11％十二烷基硫酸鈉，1N氫氧化鈉)。將平板37℃保溫18小時(shí)，其后用上清收集系統(tǒng)(Skatron Instrument，Inc.)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在Minaxi auto-γ5000系列γ計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)1分鐘。結(jié)果用下式表示為細(xì)胞毒百分率％細(xì)胞毒＝(樣品cpm-自發(fā)裂解)/(總裂解-自發(fā)裂解)×100然后用4參數(shù)曲線(xiàn)擬和程序評(píng)價(jià)所述資料(KaleidaGraph 3.0.5)。
結(jié)果制備了各種抗體，其具有不同于親本抗體的FcR結(jié)合活性。所述變體的FcR結(jié)合資料見(jiàn)下表6和表7。與E27親本抗體相比，另一抗體，T370Q，也呈現(xiàn)增強(qiáng)的FcRn結(jié)合。
表6CH2結(jié)構(gòu)域變體IG2 Res#EU FcRn FcγRIFcγRIIAFcγRIIBFcγRIIIA(Kabat) 均值 sd n 均值 sd n 均值 sd 均值 sd 均值 sd對(duì)所有FcγR的結(jié)合降低1 233-236 0.54(0.20) 3 0.12(0.06) 60.08(0.01) 0.12(0.01) 0.04(0.02) n＝2ELLG＞PVA-2 P238A(251)1.49(0.17) 3 0.60(0.05) 50.38(0.14) 0.36(0.15) 0.07(0.05) n＝414 D265A(278)1.23(0.14) 4 0.14(0.04) 60.07(0.01) 0.13(0.05) 0.09(0.06) n＝417 E269A(282)1.05 0.52(0.03) 60.65(0.18) 0.75(0.29) 0.45(0.13) n＝518 D270A(283)1.05 0.76(0.12) 60.06(0.01) 0.11(0.05) 0.14(0.04) n＝558 N297A(314)0.80(0.18) 8 0.15(0.06) 70.05(0.00) 0.10(0.02) 0.03(0.01) n＝352 A327Q(346)0.97 0.63(0.15) 70.13(0.03) 0.14(0.03) 0.06(0.01) n＝464 P329A(348)0.80 0.48(0.10) 60.08(0.02) 0.12(0.08) 0.21(0.03) n＝4對(duì)FcγRII和FcγRIII的結(jié)合降低3 S239A(252)1.06 0.81(0.09) 70.73(0.25) 0.76(0.36) 0.26(0.08) n＝333 E294A(311)0.75 0.90(0.08) 40.87(0.19) 0.63(0.17) 0.66(0.14) n＝534 Q295A(312)0.79 1.00(0.11) 40.62(0.20) 0.50(0.24) 0.25(0.09) n＝539 V303A(322)1.26(0.21) 3 0.91(0.11) 50.86(0.10) 0.65(0.17) 0.33(0.09) n＝8對(duì)FcγRII和FcγRIII的結(jié)合增加11 T256A(269)1.91(0.43) 6 1.14(0.14)4 1.41(0.27) 2.06(0.66) 1.32(0.18) n＝930 K290A(307)0.79(0.14) 3 1.01(0.08)4 1.29(0.21) 1.40(0.18) 1.28(0.21) n＝744 D312A(331)1.50(0.06) 4 1.01(0.12) 5 1.20(0.24)1.19(0.07)1.23(0.14)n＝351 K326A(345)1.03 1.04(0.05) 4 1.26(0.21)1.49(0.27)1.22(0.28)n＝5197 A330(349)K 1.28 1.25 1.28 n＝1273 A339(359)T 1.23 1.11 1.23 1.42 n＝1影響FcγRII10 R255A(268)0.59(0.19) 4 1.26(0.26) 8 1.30(0.20)1.59(0.42)0.98(0.18)n＝512 E258A(271)1.18 1.18(0.13) 4 1.33(0.22)1.65(0.38)1.12(0.12)n＝515 S267A(280)1.08 1.20(0.14) 4 1.64(0.18)2.06(0.35)1.14(0.25)n＝716 H268A(281)1.02(0.22) 3 1.05(0.11) 4 1.22(0.14)1.45(0.23)0.52(0.09)n＝1219 E272A(285)1.34(0.24) 4 1.04(0.06) 4 1.24(0.11)1.58(0.19)0.74(0.12)n＝421 N276A(289)1.15(0.21) 3 1.05(0.14) 4 1.29(0.20)1.34(0.40)0.95(0.04)n＝423 D280A(295)0.82 0.97(0.06) 4 1.34(0.14)1.60(0.31)1.09(0.20)n＝1025 E283A(300)0.71 0.97(0.03) 4 1.24(0.23)1.20(0.17)1.01(0.14)n＝526 H285A(302)0.85 0.96(0.07) 4 1.26(0.12)1.23(0.15)0.87(0.04)n＝427 N286A(303)1.24(0.04) 2 0.94(0.20) 131.28(0.23)1.39(0.14)1.03(0.08)n＝531 R292A(309)0.81(0.18) 4 0.93(0.02) 4 0.27(0.14)0.18(0.07)0.90(0.18)n＝936 S298A(317)0.80 1.10(0.04) 3 0.40(0.08)0.21(0.11)1.30(0.18)n＝1238 R301A(320)0.86 1.06(0.10) 4 1.12(0.12)1.26(0.14)0.21(0.08)n＝638B R301M(320)0.88 1.06(0.12) 4 1.29(0.17)1.56(0.12)0.48(0.21)n＝440 V305A(324)1.46(0.48) 6 1.04(0.19) 101.12(0.12)1.23(0.22)0.84(0.15)n＝441 T307A(326)1.81(0.32) 6 0.99(0.14) 4 1.19(0.37)1.35(0.33)1.12(0.18)n＝1242 L309A(328) 0.63(0.18) 4 0.93(0.18) 61.13(0.08)1.26(0.12)1.07(0.20)n＝345 N315A(334) 0.76(0.14) 3 1.27(0.36) 61.15(0.06)1.30(0.17)1.07(0.21)n＝548 K320A(339) 1.10 0.98(0.09) 51.12(0.11)1.22(0.05)0.87(0.17)n＝449 K322A(341) 0.98 0.94(0.05) 61.15(0.11)1.27(0.24)0.61(0.14)n＝550 S324A(343) 1.08 0.95(0.05) 40.82(0.22)0.70(0.12)1.12(0.17)n＝465 P331A(350) 0.85 1.30(0.34) 81.29(0.14)1.47(0.28)1.03(0.19)n＝354 E333A(352) 1.03(0.01) 2 0.98(0.15) 50.92(0.12)0.76(0.11)1.27(0.17)n＝1056 T335A(354) 0.98 1.00(0.05) 40.79(0.22)0.65(0.26)0.92(0.54)n＝357 S337A(356) 1.03 1.17(0.23) 31.22(0.30)1.26(0.06)0.94(0.18)n＝4影響FcγRIII5 K248A(261) 0.87 0.95(0.05) 51.06(0.12)1.01(0.12)0.71(0.05)n＝46 D249A(262) 0.93 1.04(0.10) 41.02(0.12)0.94(0.02)0.66(0.07)n＝57 M252A(265) 0.64(0.13) 4 0.99(0.10) 51.01(0.18)1.15(0.22)0.65(0.17)n＝69 S254A(267) ＜0.100.96(0.08) 40.97(0.24)1.15(0.38)0.73(0.14)n＝316 H268A(281) 1.02(0.22) 3 1.05(0.11) 41.22(0.14)1.45(0.23)0.52(0.09)n＝1219 E272A(285) 1.34(0.24) 4 1.04(0.06) 41.24(0.11)1.58(0.19)0.74(0.12)n＝422 Y278A(291) 0.90 0.96(0.02) 41.11(0.08)1.10(0.16)0.67(0.11)n＝429 T289A(306) 0.86 0.93(0.03) 40.96(0.33)0.83(0.22)0.62(0.19)n＝732 E293A(310) 0.85 1.11(0.07) 41.08(0.19)1.07(0.20)0.31(0.13)n＝635 Y296F(313) 0.79 1.07(0.12) 40.97(0.26)0.84(0.18)0.52(0.09)n＝536 S298A(317) 0.80 1.10(0.04) 30.40(0.08)0.21(0.11)1.30(0.18)n＝1238 R301A(320) 0.86 1.06(0.10) 41.12(0.12)1.26(0.14)0.21(0.08)n＝638B R301M(320) 0.88 1.06(0.12) 41.29(0.17)1.56(0.12)0.48(0.21)n＝449 K322A(341) 0.98 0.94(0.05) 61.15(0.11)1.27(0.24)0.61(0.14)n＝554 E333A(352) 1.03(0.01) 2 0.98(0.15) 50.92(0.12)0.76(0.11)1.27(0.17)n＝1055 K334A(353) 1.05(0.03) 2 1.10(0.06) 41.01(0.15)0.90(0.12)1.39(0.19)n＝17對(duì)FcγR無(wú)影響4 K246A(259) 1.03 0.94(0.06) 41.02(0.10)0.92(0.15)1.14(0.38)n＝44B K246M(259) 0.69 0.83(0.05) 50.83(0.06)0.76(0.05)0.95(0.09)n＝35B K248M(261) 0.79 0.95(0.06) 40.89(0.09)0.83(0.04)1.01(0.23)n＝38 I253A(266) ＜0.100.96(0.05) 41.14(0.02)1.18(0.06)1.08(0.14)n＝313 T260A(273) 1.09 0.93(0.09) 40.89(0.14)0.87(0.10)0.89(0.08)n＝420 K274A(287) 1.18 1.02(0.04) 40.86(0.09)0.96(0.10)1.11(0.08)n＝324 V282A(299) 1.13(0.07) 2 0.96(0.02) 41.15(0.13)1.15(0.20)1.00(0.18)n＝428 K288A(305) 0.38(0.12) 5 0.88(0.15) 15 1.15(0.26)1.14(0.20)1.06(0.04)n＝437 Y300F(319) 0.74(0.10) 2 1.07(0.15) 41.11(0.04)1.09(0.09)1.01(0.10)n＝343 Q311A(330) 1.62(0.25) 4 0.93(0.05) 41.11(0.06)1.19(0.13)0.93(0.17)n＝346 K317A(336) 1.44(0.18) 4 0.92(0.17) 61.13(0.05)1.18(0.27)1.10(0.23)n＝447 E318A(337) 0.85 0.92(0.07) 41.04(0.10)1.17(0.23)1.01(0.05)n＝353 A330Q(349) 0.76 0.96(0.10) 41.01(0.12)1.02(0.02)0.75(0.18)n＝3
表7CH3結(jié)構(gòu)域變體IG2 Res#EU FcRnFcγRI FcγRIIA FcγRIIBFcγRIIIA(Kabat) 均值sd n均值sd n均值 sd 均值 sd 均值 sdB1 K338(358)A 1.140.90(0.05) 30.78(0.09)0.63(0.08) 0.15(0.01)n＝2B1A K338(358)M 0.780.99(0.08) 30.99(0.13)0.93(0.15) 0.49(0.04)n＝2B2 K340(360)A 1.021.04(0.07) 31.05(0.18)0.96(0.20) 0.84(0.11)n＝2B2A K340(360)M 1.201.17(0.11) 31.10(0.12)1.20(0.19) 0.75(0.12)n＝2B3 Q342(363)A 1.091.13(0.11) 31.01(0.10)1.09(0.23) 0.98(0.10)n＝2B4 R344(365)A 0.771.04(0.08) 30.89(0.14)0.91(0.04) 0.97(0.07)n＝4B5 E345(366)A 1.181.06(0.05) 31.03(0.10)0.98(0.10) 0.97(0.13)n＝4B6 Q347(368)A 0.951.04(0.06) 31.00(0.03)0.92(0.02) 1.04(0.12)n＝4B7 R355(376)A 1.061.09(0.07) 30.84(0.09)0.87(0.11) 0.98(0.09)n＝4B8 E356(377)A 1.21(0.11) 21.05(0.04) 30.90(0.02)0.99(0.13) 0.92(0.03)n＝3B9 M358(381)A 0.961.06(0.07) 31.11(0.06)1.16(0.25) 0.91(0.09)n＝3B10 T359(382) 1.041.04(0.05) 31.13(0.10)1.15(0.04) 1.23(0.26)n＝3B11 K360(383)A 1.30(0.08) 41.02(0.04) 31.12(0.10)1.12(0.08) 1.23(0.16)n＝6B12 N361(384)A 1.161.00(0.03) 30.82(0.07)0.82(0.12) 1.08(0.06)n＝3B13 Q362(385)A 1.25(0.24) 31.00(0.04) 31.03(0.10)1.02(0.03) 1.03(0.16)n＝4B14 Y373(396)A 0.860.98(0.07) 30.84(0.11)0.75(0.08) 0.67(0.04)n＝5B15 S375(398)A 1.17(0.19) 50.95(0.02) 31.08(0.06)1.14(0.11) 1.04(0.05)n＝6B16 D376(399)A 1.45(0.36) 41.00(0.05) 30.80(0.16)0.68(0.14) 0.55(0.10)n＝5B17 A378(401)Q 1.32(0.13) 3 1.06(0.05) 31.40(0.17)1.45(0.17)1.19(0.17)n＝5B18 E380(405)A 2.19(0.29) 6 1.04(0.06) 31.18(0.01)1.07(0.05)0.92(0.12)n＝2B19 E382(407)A 1.51(0.18) 4 1.06(0.03) 30.95(0.11)0.84(0.04)0.76(0.17)n＝3B20 S383(408)A 0.74 1.03(0.03) 30.92(0.04)0.94(0.05)0.88(0.07)n＝3B21 N384(410)A 0.88 1.00(0.01) 31.05(0.19)1.10(0.18)0.96(0.18)n＝8B22 Q386(414)A 0.70(0.10) 2 1.14(0.08) 31.08(0.13)1.19(0.25)0.98(0.14)n＝9B23 E388(416)A 0.64(0.12) 2 1.15(0.09) 30.87(0.03)0.94(0.09)0.62(0.04)n＝3B24 N389(417)A 0.73 1.00(0.02) 30.98(0.15)0.81(0.04)0.75(0.02)n＝3B25 N390(418)A 0.87 1.06(0.04) 30.99(0.10)0.94(0.02)0.87(0.09)n＝3B26A Y391(419)A 1.14 1.00(0.08) 30.97(0.10)0.94(0.02)0.86(0.05)n＝3B26B Y391(419)F 0.81(0.10) 2 1.00(0.01) 31.05(0.12)1.11(0.08)1.01(0.15)n＝5B27 K392(420)A 0.97 1.01(0.08) 30.92(0.20)0.94(0.01)0.79(0.22)n＝3B28 L398(426)A 0.94(0.04) 2 1.13(0.15) 61.17(0.11)1.20(0.08)0.94(0.04)n＝3B29 S400(428)A 0.64(0.07) 3 1.10(0.09) 30.95(0.04)0.99(0.08)0.83(0.07)n＝2B30 D401(430)A 1.10(0.09) 3 1.13(0.16) 61.11(0.12)1.19(0.11)0.97(0.10)n＝5B31 D413(444)A 1.21(0.07) 2 1.00(0.01) 30.83(0.08)0.84(0.06)0.90(0.16)n＝2B32 K414(445)A 1.02 1.00(0.04) 30.64(0.15)0.58(0.18)0.82(0.27)n＝3B33 S415(446)A 0.44 1.04(0.03) 30.90(0.11)0.88(0.05)0.86(0.18)n＝2B34 R416(447)A 1.08 0.96(0.04) 30.68(0.05)0.80(0.05)0.71(0.08)n＝2B35 Q418(449)A 0.77(0.03) 2 0.98(0.01) 31.00(0.01)0.96(0.02)0.96(0.05)n＝2B36 Q419(450)A 0.76(0.01) 2 0.97(0.02) 30.68(0.09)0.63(0.07)0.86(0.08)n＝3B37 N421(452)A 0.98 0.99(0.01) 30.90(0.03) 0.81(0.0) 0.87(0.12) n＝2B38 V422(453)A 1.01 0.98(0.02) 30.89(0.0) 0.83(0.05) 0.83(0.12) n＝2B39 S424(455)A 1.41(0.14) 3 0.98(0.03) 31.04(0.06) 1.02(0.02) 0.88(0.09) n＝2B40 E430(461)A 0.93(0.03) 2 1.05(0.02) 31.24(0.11) 1.28(0.10) 1.20(0.18) n＝5B41 H433(464)A 0.41(0.14) 2 0.98(0.03) 30.92(0.18) 0.79(0.18) 1.02(0.15) n＝3B42 N434(465)A 3.46(0.37) 7 1.00(0.04) 30.97(0.07) 0.98(0.13) 0.74(0.12) n＝5B43 H435(466)A ＜0.10 4 1.25(0.09) 30.77(0.05) 0.72(0.05) 0.78(0.03) n＝3B44 Y436(467)A ＜0.10 2 0.99(0.02) 20.93(0.05) 0.91(0.06) 0.91(0.15) n＝3B45 T437(468)A 0.99(0.07)1.00(0.02) 31.12(0.18) 1.00(0.22) 0.77(0.19) n＝5B46 Q438(469)A 0.79(0.05) 2 1.02(0.05) 30.80(0.10) 0.72(0.16) 1.01(0.17) n＝5B47 K439(470)A 0.70(0.04) 2 0.98(0.04) 30.78(0.16) 0.68(0.22) 0.86(0.19) n＝4B48 S440(471)A 0.99 1.01(0.02) 31.10(0.15) 1.11(0.26) 0.93(0.01) n＝3B49 S442(473)A 0.86 1.02(0.02) 30.98(0.08) 0.91(0.11) 0.95(0.10) n＝5B50 S444(475)A 0.80 1.01(0.02) 31.07(0.03) 1.03(0.03) 0.88(0.12) n＝2B51 K447(478)A 0.62(0.12) 3 1.02(0.03) 30.95(0.05) 0.91(0.05) 0.84(0.09) n＝2對(duì)FcγR的結(jié)合增加了的變體在本實(shí)施例中所測(cè)的結(jié)合值大都≥1.20，對(duì)FcγR的結(jié)合降低了的那些變體在本實(shí)施例中所測(cè)的結(jié)合值大都≤0.80。對(duì)FcγRn的結(jié)合增加了的變體在本實(shí)施例中所測(cè)的結(jié)合值大都≥1.30，對(duì)FcγRn的結(jié)合降低了的那些變體在本實(shí)施例中所測(cè)的結(jié)合值大都≤0.70。除了丙氨酸變體，還制備了各種非丙氨酸取代型變體，它們的FcR結(jié)合活性總結(jié)在下表中。
表8非丙氨酸變體IG2 Res#EU FcRnFcγRI FcγRIIA FcγRIIB FcγRIIIA(Kabat) 均值 sd n 均值 sd n均值 sd 均值 sd均值 sd222 D249(262)E0.97 0.99 0.84 n＝1176 T256(269)G1.10(0.03) 1.06(0.07) 0.96(0.27) n＝2254 T256(269)N1.03 0.89 1.13 n＝1157 D265(278)N0.02(0.01) 0.03(0.01) 0.02(0.01) n＝3158 D265(278)E0.11(0.04) 0.03(0.01) 0.02(0.01) n＝3189 S267(280)G R131 1.21(0.05) 0.97(0.16) 0.09(0.02) n＝3H131 0.59(0.09) n＝384 H268(281)N1.33 1.41 0.56 n＝185 H268(281)S1.35 1.38 0.81 n＝187 H268(281)Y1.19 1.29 0.76 n＝1168 E269(282)D0.89(0.10) 0.73(0.07) 1.13(0.21) n＝2169 E269(282)Q0.08(0.01) 0.16(0.00) 0.28(0.03) n＝292 D270(283)N0.06(0.01) 0.10(0.02) 0.04(0.00) n＝293 D270(283)E0.55(0.05) 0.38(0.05) 1.17(0.01) n＝2223 E272(285)Q1.93 1.81 0.82 n＝1224 E272(285)N0.43 0.23 0.50 n＝1167 K274(287)Q0.86 0.94 0.62 n＝1165 N276(289)K0.81 0.77 0.61 n＝1233 N276(289)Q 1.09 0.79 0.91 n＝179 D280(295)N 1.26(0.07) 1.38(0.04) 1.13(0.13) n＝2149 D280(295)S 1.07(0.06) 1.04(0.08) 1.09(0.06) n＝2226 E283(300)Q 1.12 1.24 1.19 n＝1227 E283(300)S 1.03 1.07 0.85 n＝1228 E283(300)N 1.18 1.28 0.94 n＝1229 E283(300)D 1.14 1.23 0.95 n＝123 N286(303)Q 1.52 1.13 0.96 n＝1237 N286(303)S 1.72 1.38 1.32 n＝1238 N286(303)D 1.41 1.23 0.98 n＝173 K290(307)Q 1.17 1.26 1.40 n＝175 K290(307)S 1.27 1.34 1.26 n＝177 K290(307)E 1.14 1.10 1.20 1.30 n＝178 K290(307)R 1.25 1.05 1.15 1.08 n＝1177 K290(307)G 1.07 1.21 1.23 n＝180 R292(309)K 0.71(0.17) 0.75(0.10) 1.15(0.18) n＝381 R292(309)H 0.21(0.09) 0.12(0.01) 0.92(0.08) n＝282 R292(309)Q 0.47(0.12) 0.25(0.06) 0.45(0.09) n＝383 R292(309)N 0.54(0.16) 0.29(0.07) 0.88(0.02) n＝3144 E293(310)Q 0.85(0.03) 0.77(0.13) 0.99(0.04) n＝2145 E293(310)D 0.90(0.02) 0.88(0.07) 0.37(0.07) n＝2147 E293(310)K 1.13(0.04) 1.31(0.17) 0.72(0.08) n＝4173 E294(311)Q1.01 0.95 0.84 n＝1174 E294(311)D0.37 0.26 0.14 n＝1185 Y296(313)H0.90 0.81 0.92 n＝1186 Y296(313)W0.96 0.93 1.38 n＝170 S298(317)G0.87(0.17) 0.63(0.33) 0.46(0.09) n＝471 S298(317)T0.41(0.21) 0.40(0.19) 0.89(0.20) n＝372 S298(317)N0.08(0.01) 0.16(0.03) 0.06(0.01) n＝2218 S298(317)V0.11(0.06) 0.17(0.01) 0.33(0.19) n＝3219 S298(317)L1.14(0.12) 1.42(0.31) 0.34(0.04) n＝3150 V303(322)L0.89(0.05) 0.73(0.10) 0.76(0.09) n＝4151 V303(322)T0.64(0.11) 0.34(0.05) 0.20(0.05) n＝4217 E318(337)K1.03 1.08 0.72 n＝1172 K320(339)R0.71 0.66 0.68 n＝1202 K320(339)M1.34 1.40 1.27 n＝1204 K320(339)Q1.23 1.12 1.17 n＝1205 K320(339)E1.29 1.34 1.12 n＝1235 K320(339)R1.24 0.95 0.86 n＝1155 K322(341)R0.87(0.07) 0.87(0.21) 0.92(0.15) n＝3156 K322(341)Q0.87(0.02) 0.92(0.23) 0.78(0.18) n＝3206 K322(341)E1.38 1.34 0.81 n＝1207 K322(341)N0.57 0.36 0.04 n＝1213 S324(343)N1.151.090.97n＝1214 S324(343)Q0.820.830.78n＝1215 S324(343)K0.660.370.77n＝1216 S324(343)E0.820.730.81n＝1208 K326(345)S1.441.621.37n＝1209 K326(345)N1.041.001.27n＝1210 K326(345)Q1.361.411.15n＝1211 K326(345)D1.682.011.36n＝1212 K326(345)E1.34(0.27) 1.47(0.33) 1.26(0.04) n＝2131 A327(346)S0.23(0.06) 0.22(0.05) 0.06(0.01) n＝4159 A327(346)G0.92(0.09) 0.83(0.10) 0.36(0.05) n＝3196 A330(349)D0.180.080.07n＝1197 A330(349)K1.281.251.28n＝1198 P331(350)S1.000.860.86n＝1199 P331(350)N0.860.650.23n＝1200 P331(350)E1.060.910.42n＝1203 P331(350)K0.940.710.33n＝1141 E333(352)Q0.70(0.05) 0.64(0.09) 1.10(0.03) n＝2142 E333(352)N0.59(0.04) 0.52(0.07) 0.56(0.10) n＝2143 E333(352)S0.94n＝1152 E333(352)K0.85(0.14) n＝3153 E333(352)R0.75(0.04) 0.66(0.03) 0.84(0.05) n＝2154 E333(352)D 1.26(0.04) n＝3178 E333(352)G0.870.76 1.05 n＝1179 K334(353)G0.76(0.08) 0.60(0.13) 0.88(0.22) n＝5135 K334(353)R1.15(0.09) 1.33(0.18) 0.68(0.07) n＝5136 K334(353)Q1.08(0.11) 1.10(0.21) 1.31(0.26) n＝7137 K334(353)N1.16(0.11) 1.29(0.30) 1.15(0.16) n＝7138 K334(353)S1.01(0.11) 1.03(0.05) 1.19(0.08) n＝3139 K334(353)E0.74(0.15) 0.72(0.12) 1.30(0.09) n＝4140 K334(353)D0.51(0.09) 0.40(0.03) 1.13(0.09) n＝4190 K334(353)M 1.18 1.061.01 1.35 n＝1191 K334(353)Y 1.15 1.081.05 1.31 n＝1192 K334(353)W 1.16 0.940.91 1.07 n＝1193 K334(353)H 1.11 1.091.07 1.26 n＝1220 K334(353)v1.13(0.11) 1.09(0.15) 1.34(0.18) n＝3221 K334(353)L1.051.09 1.38 n＝1171 T335(354)Q0.860.79 0.84 n＝1194 T335(354)E1.241.30 1.19 n＝1195 T335(354)K1.191.14 1.30 n＝1273 A339(359)T 1.23 1.111.23 1.42 n＝1下表總結(jié)了各種組合變體的FcR結(jié)合活性。
表9組合變體IG2Res#EUFcRn FcγRIFcγRIIAFcγRIIBFcγRIIIA(Kabat) 均值 sd n 均值 sd n 均值 sd 均值 sd 均值 sd96 S267(280)A 1.411.720.84 n＝1H268(281)A134 E333(352)A 0.72(0.08) 0.63(0.13) 1.30(0.12)n＝5K334(353)A1059 T256(269)A 0.44(0.03) 0.22(0.04) 1.41(0.06)n＝2S298(317)A1051 T256(269)A 0.47(0.01) 0.30(0.03) 1.21(0.26)n＝2D280(295)AS298(317)AT307(326)A106 T256(269)A 0.110.080.90 n＝1D280(295)AR292(309)AS298(317)AT307(326)A107 S298(317)A 0.34(0.05) 0.16(0.08) 1.53(0.24)n＝5E333(352)A109 S298(317)A 0.41(0.07) 0.19(0.08) 1.62(0.34)n＝6K334(353)A110 S298(317)A 0.35(0.13) 0.18(0.08) 1.66(0.42)n＝11E333(352)AK334(353)A246 S267(280)A 1.62(0.15) 2.01(0.45) 1.04(0.12)n＝2E258(271)A247 S267(280)A 1.60(0.18) 1.72(0.13) 0.88(0.07)n＝3R255(268)A248 S267(280)A 1.54(0.08)1.96(0.37) 1.13(0.07) n＝2D280(295)A250 S267(280)A 1.51(0.13)1.82(0.32) 0.95(0.05) n＝3E272(285)A251 S267(280)A 1.67(0.11)1.85(0.10) 0.92(0.09) n＝3E293(310)A264 S267(280)A 1.48(0.12)2.03(0.30) 0.89(0.04) n＝2E258(271)AD280(295)AR255(268)A269 E380(405)A 8.55(0.94) 3 1.02(0.07)1.05(0.11) 1.02 n＝2N434(465)A270 E380(405)A 12.6(1.7) 0.99(0.06)0.99(0.11) 0.96 n＝2N434(465)AT307(326)A271 E380(405)A 1.01(0.01) 2 0.98 1.04 0.92 n＝1L309(328)A272 N434(465)A 3.15(0.42) 2 0.94(0.11)0.96(0.17) 0.88 n＝2K288(305)A
討論本研究包括人IgG1對(duì)人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIA和FcRn的完整圖譜。根據(jù)人Fc區(qū)晶體結(jié)構(gòu)(Deisenhofer，生物化學(xué)202361-2370(1981))對(duì)人IgG1 Fc(CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)中暴露子溶質(zhì)的所有氨基酸實(shí)施丙氨酸掃描。將CH2和CH3中各個(gè)暴露的氨基酸分別變成丙氨酸，分析變體IgG與所有5種人類(lèi)受體的結(jié)合；用人源化抗IgE E27 IgG1作為親本多肽評(píng)價(jià)所有變體。FcγRI和FcRn是高親和力受體，可在試驗(yàn)中評(píng)估IgG單體對(duì)這兩種受體的結(jié)合。FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRII是低親和力受體，需要應(yīng)用免疫復(fù)合物。因此，對(duì)于FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIII使用ELISA型試驗(yàn)，其中將預(yù)先形成的六聚體(由三個(gè)抗IgE E27和三個(gè)IgE分子組成)與FcγR和作為檢測(cè)試劑的抗人IgG Fc-HRP或蛋白G-HRP結(jié)合，所述六聚體。為了增強(qiáng)結(jié)合，通過(guò)加入人VEGF可以將所述六聚體連接成多聚體(利用抗VEGF IgE)。所述六聚體結(jié)合低親和力FcγR的能力明顯強(qiáng)于IgG單體，而多聚體則強(qiáng)于六聚體(圖15A和15B)。應(yīng)用六聚體復(fù)合物是因?yàn)槠淇商峁┏浞值慕Y(jié)合，并且需要較少的IgG。利用其它抗體抗原形成的復(fù)合物也是可能的試劑，只要所述每個(gè)抗原分子包括至少兩個(gè)相同的抗體結(jié)合位點(diǎn)。例如，每個(gè)VEGF二聚體包括兩個(gè)抗VEGF A.4.6.1結(jié)合位點(diǎn)(Kim等，生長(zhǎng)因子753(1992)和Kim等，自然362841(1993))。VEGF抗VEGF多聚體也與低親和力FcγRIIA和FcγRIIIA結(jié)合(圖16A和168)。
一旦實(shí)施完整的丙氨酸掃描，就可發(fā)現(xiàn)若干種丙氨酸變體。部分變體與所有FcγR的結(jié)合均降低(G14，圖17)，而其它變體顯示僅與一種FcγR的結(jié)合降低(G36，圖17)、僅與一種FcγR的結(jié)合增強(qiáng)(G15、G54、G55，圖17)，或與一種FcγR的結(jié)合降低同時(shí)與另一種FcγR的結(jié)合增強(qiáng)(G16，圖17)。
還可以在單個(gè)Fc區(qū)變體中將各個(gè)丙氨酸變體進(jìn)行組合；例如S298(317)A和K334(353)A的組合結(jié)合FcγRIIIA的能力強(qiáng)于單獨(dú)的S298(317)A或K334(334)A(圖18A和B；并比較表6和9中的變體36、55和109)(括號(hào)內(nèi)的殘基序號(hào)為EU標(biāo)號(hào)，與Kabat一樣)。同樣，S298(317)A和E333(352)A的組合結(jié)合FcγRIIIA的能力強(qiáng)于單獨(dú)的S298(317)A或E333(352)A(比較表6和9中變體36、54和107)。
還檢測(cè)了所選IgG變體與轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FcγR的結(jié)合。利用GPI-link，將人FcγRIIIAα鏈細(xì)胞外部分轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，而對(duì)于人FcγRIIB則將其全長(zhǎng)受體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞。對(duì)于所測(cè)的變體，其結(jié)合細(xì)胞的模式與在蛋白蛋白(ELISA)試驗(yàn)中的相同(圖18A-B和19A-B)。
這些變體的一個(gè)應(yīng)用是提高抗體的ADCC效應(yīng)。這可通過(guò)修飾Fc區(qū)中導(dǎo)致與FcγRIIIA的結(jié)合增強(qiáng)的一個(gè)或多個(gè)殘基而實(shí)現(xiàn)。FcγRIIIA結(jié)合增強(qiáng)可以導(dǎo)致對(duì)NK細(xì)胞的結(jié)合增強(qiáng)，NK細(xì)胞僅攜帶FcγRIIIA并且能夠介導(dǎo)ADCC。所篩選的丙氨酸變體，無(wú)論是與FcγRIIIA結(jié)合降低型(變體17、18、34；見(jiàn)表6)、對(duì)FcγRIIIA結(jié)合無(wú)影響型(變體31；見(jiàn)表6)，或與FcγRIIIA結(jié)合增強(qiáng)型(變體30、36；見(jiàn)表6)，均利用人PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞在體外ADCC試驗(yàn)中檢測(cè)。因?yàn)榘屑?xì)胞是HER2過(guò)表達(dá)的SKBR3細(xì)胞，可用抗HER2抗體的VH/VL結(jié)構(gòu)域HERCEPTIN(Carter等，PNAS(USA)894285-4289(1992)的表1中humAb4D5-8)取代抗IgE E27的VH/VL來(lái)制備此試驗(yàn)所用IgG Fc變體。這些變體顯示的ADCC模式與其FcγRIIIA結(jié)合模式十分相關(guān)(圖20和21)。應(yīng)注意蛋白蛋白試驗(yàn)中與FcγRIIIA結(jié)合的增強(qiáng)程度最大的變體，變體36 S298(317)A，在1.25ng/ml時(shí)ADCC效應(yīng)也強(qiáng)于野生型HERCEPTIN(圖21)。
實(shí)施例5 Fc變體與多形態(tài)Fc受體的結(jié)合在人群中發(fā)現(xiàn)了幾種人型FcγR的等位基因變體。這些等位基因變體形式在與人和鼠的IgG的結(jié)合中存在差異，多項(xiàng)相關(guān)研究揭示與特定等位基因的存在相關(guān)的臨床表現(xiàn)(Lehrnbecher等，血液94(12)4220-4232(1999)綜述)。對(duì)兩種FcγRIIA形式，R131和H131，及其與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性進(jìn)行了幾項(xiàng)研究(Hatta等，基因和免疫153-60(1999)；Yap等，Lupus 8305-310(1999)；和Lorenz等，歐洲免疫遺傳學(xué)22397-401(1995))。只有FcγRIIIA的兩個(gè)等位基因形式，F(xiàn)158和V158，正處于研究中(Lehrnbecher等，出處同上；和Wu等，臨床研究雜志100(5)1059-1070(1997))。在該實(shí)施例中，檢測(cè)了所篩選的針對(duì)FcγRTIA或FcγRIIIA的兩種等位基因形式的IgG變體。Fc受體結(jié)合試驗(yàn)基本按上述實(shí)施例所述進(jìn)行。然而，對(duì)于FcγRIIIA-V158，實(shí)施了(a)實(shí)施例1的低親和力受體結(jié)合試驗(yàn)(其分析IgG復(fù)合物與FcγRIIIA-V158的結(jié)合)；和(b)實(shí)施例4的高親和力FcγR結(jié)合試驗(yàn)(其分析IgG單體與FcγRIIIA-V158的結(jié)合)。這些結(jié)果總結(jié)于表10中。
表10變體對(duì)FcγRIIA和FcγRIIIA多形受體的結(jié)合IgG復(fù)合物 IgG復(fù)合物 IgG復(fù)合物 IgG復(fù)合物IgG單體IG2Res#EUFcγRIIA-R131 FcγRIIA-H131 FcγRIIIA-F158 FcγRIIIA-V158 FcγRIIIA-V158(Kabat)均值 sd n均值 sdn均值 sd n均值 sdn 均值 sd n11 T256(269)A 1.41(0.27) 91.32(0.18) 90.97(0.03) 2 1.20 1254 T256(269)N 1.03 11.13 10.95 1 0.88 114 D265(278)A 0.07(0.01) 40.09(0.06) 40.01 115 S267(280)A 1.64(0.18) 71.05(0.03) 21.14(0.25) 7189 S267(280)G 1.21(0.05) 30.59(0.09) 30.09(0.02) 316 H268(281)A 1.22(0.14) 12 1.09(0.01) 20.52(0.09) 1225 E283(300)A 1.24(0.23) 51.01(0.14) 5 0.78 1226 E283(300)Q 1.12 11.19 1 0.89 1227 E283(300)S 1.03 10.85 1 0.83 1228 E283(300)N 1.18 10.94 1 0.63 1229 E283(300)D 1.14 10.95 1 0.67 130 K290(307)A 1.29(0.21) 71.28(0.21) 71.12(0.05) 2 1.13 173 K290(307)Q 1.17 11.40 11.02 1 1.30 175 K290(307)S 1.27 11.26 11.05 1 1.62 177 K290(307)E 1.10 11.30 10.98 1 1.50 178 K290(307)R 1.05 11.08 11.07 1 1.24 1177 K290(307)G 1.07 11.23 11.11 1 2.29 131 R292(309)A 0.27(0.14) 90.90(0.18) 9 0.94 180 R292(309)K 0.71(0.17) 31.15(0.18) 3 1.64 181 R292(309)H 0.21(0.09) 20.92(0.08) 2 1.21 182 R292(309)Q 0.47(0.12) 30.45(0.09) 3 0.56 183 R292(309)N 0.54(0.16) 30.88(0.02) 3 0.91 1144 E293(310)Q 0.85(0.03) 20.99(0.04) 21.00 1 0.97 133 E294(311)A 0.87(0.19) 50.66(0.14) 5 0.68 1173 E294(311)Q 1.01 10.84 1 0.79 1174 E294(311)D 0.37 10.14 1 0.26 136 S298(317)A 0.40(0.08) 12 1.30(0.18) 12 1.02(0.04) 2 1.96 170 S298(317)G 0.87(0.17) 40.46(0.09) 40.88 1 1.88 171 S298(317)T 0.41(0.21) 30.89(0.20) 30.96 1 0.75 172 S298(317)N 0.08(0.01) 20.06(0.01) 20.66 1 0.17 1218 S298(317)V 0.11(0.06) 30.33(0.19) 30.88 1 0.39 1219 S298(317)L 1.14(0.12) 30.34(0.04) 30.83 1 0.67 140 V305(324)A 1.12(0.12) 41.04 10.84(0.15) 441 T307(326)A 1.19(0.37) 12 1.37(0.13) 21.12(0.18) 1245 N315(334)A 1.15(0.06) 51.11(0.06) 21.07(0.21) 546 K317(336)A 1.13(0.05) 41.04 11.10(0.23) 448 K320(339)A 1.12(0.11) 41.16 10.87(0.17) 454 E333(352)A 0.92(0.12) 10 1.27(0.17) 10 1.10(0.10) 2 1.29 1141 E333(352)Q 0.70(0.05) 21.10(0.03) 21.05 11.00 1142 E333(352)N 0.59(0.04) 20.56(0.10) 20.64 10.56 1143 E333(352)S 0.94 10.99 11.07 1152 E333(352)K 0.85(0.14) 30.88 10.81 1153 E333(352)R 0.75(0.04) 20.84(0.05) 20.93 10.83 1154 E333(352)D 1.26(0.04) 31.00 11.70 1178 E333(352)G 0.87 11.05 11.23 155 K334(353)A 1.01(0.15) 17 1.39(0.19) 17 1.07(0.09) 31.60(0.01) 2135 K334(353)R 1.15(0.09) 50.68(0.07) 50.88 1136 K334(353)Q 1.08(0.11) 71.31(0.26) 71.27(0.01) 21.92 1137 K334(353)N 1.16(0.11) 71.15(0.16) 71.19(0.06) 21.70 1138 K334(353)S 1.01(0.11) 31.19(0.08) 31.25 11.82 1139 K334(353)E 0.74(0.15) 41.30(0.09) 41.17 12.75 1140 K334(353)D 0.51(0.09) 41.13(0.09) 41.07 1179 K334(353)G 0.76(0.08) 50.88(0.22) 50.94 11.28 1190 K334(353)M 1.06 11.35 10.99 12.08 1191 K334(353)Y 1.08 11.31 10.98 11.72 1192 K334(353)W 0.94 11.07 10.96 11.53 1193 K334(353)H 1.09 11.26 10.97 12.06 1220 K334(353)V 1.13(0.11) 31.34(0.18) 31.00 12.89 1221 K334(353)L 1.05 11.38 10.96 13.59 165 P331(350)A 1.29(0.14) 3 1.03(0.19) 30.96 1 0.78 1198 P331(350)S 1.00 1 0.86 10.54 1199 P331(350)N 0.86 1 0.23 10.24 1200 P331(350)E 1.06 1 0.42 10.36 1203 P331(350)K 0.94 1 0.33 10.26 196 S267(280)A 1.54(0.12) 3 1.07(0.06) 20.84 1H268(281)A110 S298(317)A 0.35(0.13) 11 1.66(0.42) 11 1.19(0.18) 3E333(352)AK334(353)A271 E380(405)A 0.98 1 0.92 11.10 1L309(328)A
對(duì)于FcγRIIIA，所篩選的IgG1變體與相對(duì)較高親和力的FcγRIIIA-V158的結(jié)合模式等同于與相對(duì)較低親和力的FcγRIIIA-F158的(F158形式用于分析所有變體)。顯示與FcγRIIIA-F158形式的結(jié)合增強(qiáng)的IgG1變體，其與FcγRIIIA-V158形式的結(jié)合也增強(qiáng)，但不明顯。對(duì)于FcγRIIA-R131(用于分析所有變體)和FcγRIIA-H131，所篩選的IgG1變體的結(jié)合模式有顯著差異。與天然IgG1相比，S267(280)A、H268(281)A和S267(280)A/H268(281)A顯示與FcγRIIA-R131的結(jié)合增加，但未顯示與FcγRIIA-H131的結(jié)合增加。相反，S267(280)G與FcγRIIA-R131的結(jié)合增加，但與FcγRIIA-H131的結(jié)合降低(表10)。其他變體與FcγRIIA的兩種等位基因形式的結(jié)合相似V305(324)A、T307(326)A、N315(324)A、K317(336)A和K320(339)A。
權(quán)利要求
1.包含一個(gè)Fc區(qū)的親本多肽的變體，所述變體在人的效應(yīng)細(xì)胞存在的條件下更有效地介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，或者以比所述親本多肽更強(qiáng)的親和力結(jié)合Fcγ受體(FcγR)，并且所述變體在Fc區(qū)中包括至少一個(gè)氨基酸修飾。
2.權(quán)利要求1的變體，其包括抗體。
3.權(quán)利要求1的變體，其中所述親本多肽Fc區(qū)包括人IgG Fc區(qū)。
4.權(quán)利要求3的變體，其中所述人IgG Fc區(qū)包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區(qū)。
5.權(quán)利要求1的變體，其以比所述親本多肽更有效約1.5-100倍的效力介導(dǎo)ADCC作用。
6.權(quán)利要求1的變體，其以比所述親本多肽更強(qiáng)的親和力結(jié)合FcγRIII。
7.權(quán)利要求6的變體，其以比所述親本多肽更弱的親和力進(jìn)一步結(jié)合FcγRII。
8.權(quán)利要求1的變體，其Fc區(qū)包括至少1個(gè)氨基酸取代。
9.權(quán)利要求1的變體，其Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域中包括至少1個(gè)氨基酸修飾。
10.權(quán)利要求1的變體，其Fc區(qū)，而不是其低鉸鏈區(qū)，包括至少1個(gè)氨基酸修飾。
11.權(quán)利要求1的變體，其包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
12.權(quán)利要求11的變體，其包括在所列氨基酸位點(diǎn)上的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
13.權(quán)利要求11的變體，其包括在所列氨基酸位點(diǎn)上的三個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
14.包括帶有改變了的Fcγ受體(FcγR)結(jié)合親和力的Fc區(qū)變體的多肽，所述多肽包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc區(qū)殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中所述Fc區(qū)變體包括人IgG Fc區(qū)變體。
16.權(quán)利要求14的多肽，其與FcγR的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
17.權(quán)利要求14的多肽，其與FcγRI的結(jié)合降低。
18.權(quán)利要求17的多肽，其與FcγRI的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)氨基酸位點(diǎn)238、265、269、270、327、329的任何一個(gè)或多個(gè)上的氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
19.權(quán)利要求14的變體，其與FcγRII的結(jié)合降低。
20.權(quán)利要求19的變體，其與FcγRII的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
21.權(quán)利要求14的多肽，其與FcγRIII的結(jié)合降低。
22.權(quán)利要求21的多肽，其與FcγRIII的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
23.權(quán)利要求14的多肽，其與FcγR結(jié)合的增強(qiáng)，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、298、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、333、334、337、340、360、378、398或430，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
24.權(quán)利要求23的多肽，其與FcγRIII的結(jié)合增強(qiáng)。
25.權(quán)利要求24的多肽，其進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRII結(jié)合降低。
26.權(quán)利要求25的多肽，其與FcγRIII的結(jié)合增強(qiáng)并進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRII結(jié)合降低，其中所述多肽包括在Fc區(qū)的位點(diǎn)298和/或333上的氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
27.權(quán)利要求23的變體，其與FcγRII的結(jié)合增強(qiáng)。
28.權(quán)利要求27的變體，其與FcγRII的結(jié)合增強(qiáng)，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398或430，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
29.權(quán)利要求27的變體，其進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRIII的結(jié)合降低。
30.權(quán)利要求27的變體，其與FcγRII的結(jié)合增強(qiáng)并進(jìn)一步呈現(xiàn)與FcγRIII結(jié)合降低，其中所述多肽包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為268、272、298、301、322或340，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
31.包括具有改變了的新生Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力的Fc區(qū)變體的多肽，所述多肽包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
32.權(quán)利要求31的多肽，其與FcRn的結(jié)合降低。
33.權(quán)利要求32的多肽，其與FcRn的結(jié)合降低，并且包括在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾，所述位點(diǎn)為252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或477，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
34.權(quán)利要求31的多肽，其與FcRn的結(jié)合增強(qiáng)。
35.權(quán)利要求34的多肽，其與FcRn的結(jié)合增強(qiáng)，并且在Fc區(qū)的下述任何一或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸修飾238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)為如Kabat所述的EU標(biāo)號(hào)。
36.包括權(quán)利要求1中所述多肽變體及藥理上可接受的載體的組合物。
37.經(jīng)滅菌的權(quán)利要求36的組合物。
38.分離的編碼權(quán)利要求1中所述多肽變體的核酸。
39.包括權(quán)利要求38中所述核酸的載體。
40.含權(quán)利要求39中所述載體的宿主細(xì)胞。
41.用于制備多肽變體的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求40中所述宿主細(xì)胞，以使所述核酸表達(dá)。
42.權(quán)利要求41的方法，其進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述多肽變體。
43.治療哺乳動(dòng)物中疾病的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1中所述多肽變體。
44.用于制備Fc區(qū)變體的方法，所述Fc區(qū)變體具有改變的Fc受體(FcR)結(jié)合親和力或改變的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)活性，該方法包括(a)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾引入親本多肽的Fc區(qū)以制備Fc區(qū)變體。(b)檢測(cè)所述Fc區(qū)變體與FcR的結(jié)合，或檢測(cè)所述Fc區(qū)變體的ADCC活性。
45.權(quán)利要求44的方法，其中步驟(b)包括在體外檢測(cè)所述Fc區(qū)變體與FcR的結(jié)合。
46.權(quán)利要求44的方法，其中步驟(b)包括鑒定FcR結(jié)合親和力增強(qiáng)或ADCC活性增強(qiáng)的Fc區(qū)變體。
47.權(quán)利要求44的方法，其中FcR是人Fcγ受體III(FcγRIII)。
48.權(quán)利要求44的方法，其中步驟(b)包括檢測(cè)所述Fc區(qū)變體與至少兩種不同F(xiàn)cR的結(jié)合。
49.權(quán)利要求48的方法，其中Fc受體包括人Fcγ受體II(FcγRII)和人Fcγ受體III(FcγRIII)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括Fc區(qū)變體的多肽,更具體而言,本發(fā)明涉及含F(xiàn)c區(qū)的多肽,由于在其Fc區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾,所述多肽具有改變的效應(yīng)功能。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1343221SQ00804905
公開(kāi)日2002年4月3日 申請(qǐng)日期2000年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月15日
發(fā)明者倫納德·G·普雷斯塔 申請(qǐng)人:杰南技術(shù)公司