專利名稱：多環(huán)芳烴厭氧降解混合菌群的富集與馴化篩選方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多環(huán)芳烴厭氧降解 菌群的富集與馴化篩選方法及應用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAH)是一類具有致癌、致畸、致突變作用的有機物，在環(huán)境中分布廣泛且 具有生物難降解性因而引起人們的廣泛關(guān)注。多環(huán)芳烴的好氧生物降解是最快的，并且已經(jīng) 分離馴化出多株好氧降解菌。然而，、地下含水層或污染土壤通常是厭氧狀態(tài)，使污染帶中的 好氧微生物被厭氧微生物所替代，因此，多環(huán)芳烴的厭氧生物降解比好氧生物降解更加可行 且經(jīng)濟有效。由于缺少高效的多環(huán)芳烴的厭氧降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土壤及地下水厭 氧生物修復技術(shù)的進一步發(fā)展和應用研究。因此，篩選出多環(huán)芳烴高效厭氧降解菌對于治理 和修復多環(huán)芳烴污染土壤及地下水有重要的意義。
到目前為止，國內(nèi)還沒有關(guān)于富集與馴化篩選多環(huán)芳烴厭氧降解菌群方面的文獻報道。 李小明，陳堅，倫世儀在文獻中報道的"降解對苯二甲酸厭氧微生物群快速馴化與富集技術(shù)"， 是與本申請最為相關(guān)的技術(shù)，但是由于多環(huán)芳烴特別是高于四環(huán)的稠環(huán)芳烴更難于被厭氧生 物降解，同時由于多環(huán)芳烴的水溶解性很低且對微生物有較高的毒性作用，使得對苯二甲酸 厭氧微生物群的馴化與富集技術(shù)無法適用于多環(huán)芳烴的厭氧降解微生物群的馴化篩選。同時， 馴化的環(huán)境條件，馴化周期，及馴化的過程參數(shù)選定等都對馴化效果有密切的關(guān)系，這些都 需要經(jīng)過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。其具體步 驟如下
(1) 選用受石油污染的土壤，按土與水的質(zhì)量比為1 1.2:1的比例加入去離子水，按土 與硫化鈉的質(zhì)量比為200 300:1的比例加入硫化鈉，按土與多環(huán)芳烴的質(zhì)量比為5000 6000:1的比例加入多環(huán)芳烴晶體混合物，按土與電子受體的質(zhì)量比為150 200:1的比例加入 電子受體，混合均勻后密封靜置時間大于6個月。
(2) 向體積為100 200mL的厭氧瓶中加入7.5-8.0mL濃度為lg/L的萘、菲、芴和芘 的丙酮溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為150:10:1:1，為除去丙酮將厭氧瓶開口放置2天。
(3) 按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然 后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3:1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附 劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60。C的烘箱中放置2天。(4) 在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向歩驟(2)中的厭氧瓶中入50-60 mL基礎培養(yǎng)基、0.5mL 微量金屬液和O.l mL維生素c溶液，為指示厭氧瓶內(nèi)的厭氧狀態(tài)加入O.l mL刃天青溶液； 其中基礎培養(yǎng)基的組成為NH4C1:1.2 g丄-1， KH2P04: 1.2 g'L1， MgCl2: 0.15 g丄-1， CaCl2'2H20: 0.05 g'L";微量金屬液的組成為CoCl2'6H20: 35 mg'i;1， CuCl2: 0.20 mg'i;1， H3B03: 6.0 mg丄1， MnCl2-4H20: 25 mg.L1， Na2Mo04.2H20: 3.0 mg.L 、 NiCl2. 2H20: 2.0 mg.L1， ZnCl2: 2.5 mg'L-1。
(5) 在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向步驟(4)中的厭氧瓶內(nèi)按水與吸附劑的質(zhì)量比為160 170:1的比例加入步驟(3)處理后的吸附劑，按水與電子受體的質(zhì)量比為200 300:1的比例 加入電子受體，按水與硫化鈉質(zhì)量比為1500 2000:1的比例加入硫化鈉。將密封后的厭氧瓶 放置轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中5 7天。
(6) 在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水土質(zhì)量比為200 250:1的比例向步驟(5)中的厭氧瓶 內(nèi)接入步驟(1)馴化的土壤。將密封后厭氧瓶在溫度為20±2°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器 中培養(yǎng)20~25天后。按接種體積比為200 250:1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(2)至(5)處理后的厭氧 瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于5之后即可獲得去除多環(huán)芳烴的厭氧降解菌群。
所述電子受體為硝酸鈉或硫酸鈉，所述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。 本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠富集與馴化篩選到對多環(huán)芳烴具有厭氧降解性能好
的微生物菌群，對多環(huán)芳烴的最大降解速率范圍為0.4 1.8mg丄—、d—1。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。在污染的土壤中 按質(zhì)量比加入水、硫化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉和多環(huán)芳烴混合物，密封后進行厭氧降解微生物 的富集與馴化。6個月后在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向加入多環(huán)芳烴、基礎培養(yǎng)基、微量金屬液、 維生素c溶液及吸附劑的厭氧瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤，并且按質(zhì)量比加入電子受體及硫化 鈉。在溫度為20土2'C、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20 25天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán) 次數(shù)大于5次后即可得到厭氧降解多環(huán)芳烴的微生物菌群。
下面是以運用馴化的混合菌群進行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗，進一步說明本發(fā)明。
實施例1
運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在硝酸鹽還原條件下進行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗， 結(jié)果表明純菌種能夠?qū)?、菲、芴和芘進行有效的厭氧降解；當萘的初始濃度為28.6mg/L時， 35天后能降解到0.05mg/L以下，當菲的初始濃度為1.02 mg/L時，25天后能降解到0.05mg/L以 下，當芴的初始濃度為0.11mg/L時，20天后能降解至lJ0.01mg/L以下，當芘的初始濃度為0.12 mg/L時，20天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的厭氧降解速率分別為(菌體濃度
為5xl()7個/mL) : 1.04mg.L工.cT"; 0.06 mg.L1《、0.01 mg.L".d"及0.01 mg.L1.(11。
5實施例2
運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在硫酸鹽還原條件下進行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗， 結(jié)果表明純菌種能夠?qū)?、菲、芴和芘進行有效的厭氧降解；當萘的初始濃度為29.2mg/L時， 35天后能降解到0.05mg/L以下，當菲的初始濃度為0.97 mg/L時，25天后能降解到0.05mg/L以 下，當芴的初始濃度為0.09mg/L時，20天后能降解到0.01mg/L以下，當芘的初始濃度為O.ll mg/L時，20天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的厭氧降解速率分別為(菌體濃度 為5xl()7個/mL)0.97mg.L十d、 0.05 mg丄".d"; 0.01 mg丄".d4及0.01 mg.L"'d1。
權(quán)利要求
1. 一種多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選技術(shù)，其特征在于，該技術(shù)的具體步驟如下(1)選用受石油污染的土壤，按土與水的質(zhì)量比為1～1.2:1的比例加入去離子水，按土與硫化鈉的質(zhì)量比為200～300:1的比例加入硫化鈉，按土與多環(huán)芳烴的質(zhì)量比為5000～6000:1的比例加入多環(huán)芳烴晶體混合物，按土與電子受體的質(zhì)量比為150～200:1的比例加入電子受體，混合均勻后密封靜置時間大于6個月。(2)向體積為100～200mL的厭氧瓶中加入7.5～8.0mL濃度為1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為150:10:1:1，為除去丙酮將厭氧瓶開口放置2天。(3)按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3:1的比例用99％的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60℃的烘箱中放置2天。(4)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向步驟(2)中的厭氧瓶中入50～60mL基礎培養(yǎng)基、0.5mL微量金屬液和0.1mL維生素c溶液，為指示厭氧瓶內(nèi)的厭氧狀態(tài)加入0.1mL刃天青溶液；其中基礎培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.2g·L-1，KH2PO41.2g·L-1，MgCl20.15g·L-1，CaCl2·2H2O0.05g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O35mg·L-1，CuCl20.20mg·L-1，H3BO36.0mg·L-1，MnCl2·4H2O25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.0mg·L-1，ZnCl22.5mg·L-1。(5)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向步驟(4)中的厭氧瓶內(nèi)按水與吸附劑的質(zhì)量比為160～170:1的比例加入步驟(3)處理后的吸附劑，按水與電子受體的質(zhì)量比為200～300:1的比例加入電子受體，按水與硫化鈉質(zhì)量比為1500～2000:1的比例加入硫化鈉。將密封后的厭氧瓶放置轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中5～7天。(6)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水土質(zhì)量比為200～250:1的比例向步驟(5)中的厭氧瓶內(nèi)接入步驟(1)馴化的土壤。將密封后厭氧瓶在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20～25天后。按接種體積比為200～250:1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(2)至(5)處理后的厭氧瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于5之后即可獲得去除多環(huán)芳烴的厭氧降解菌群。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選技術(shù)，其特征在于，所 述電子受體為硝酸鈉、硫酸鈉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選技術(shù)，其特征在于，所 述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
4. 一種權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的應用，其特征在于，運用馴化的混合菌群 在硝酸鹽還原條件下進行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗，結(jié)果表明純菌種能夠?qū)痢⒎?、荷和芘進行有效的厭氧降解；當萘的初始濃度為28.6mg/L時，35天后能降解到0.05mg/L以下，當菲的初始濃度為1.02mg/L時，25天后能降解到0.05mg/L以下，當芴的初始濃度為O.ll mg/L時， 20天后能降解到0.01mg/L以下，當芘的初始濃度為0.12mg/L時，20天后能降解到0.01mg/L以 下；萘、菲、芴和芘的厭氧降解速率分別為(菌體濃度為5xlOMVmL) : 1.04mg丄-、d"; 0.06 mg.L".d"; 0.01mg.L-、d-i及0.01mg.L1.(11。
5.—種權(quán)利要求1所述多環(huán)芳徑厭氧降解菌群的應用，其特征在于，運用馴化的混合菌群 在硫酸鹽還原條件下進行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗，結(jié)果表明純菌種能夠?qū)痢⒎?、芴?芘進行有效的厭氧降解；當萘的初始濃度為29.2mg/L時，35天后能降解到0.05mg/L以下，當 菲的初始濃度為0.97mg/L時，25天后能降解到0.05mg/L以下，當芴的初始濃度為0.09 mg/L時， 20天后能降解到0.01mg/L以下，當芘的初始濃度為0.11mg/L時，20天后能降解到0.01mg/L以 下；萘、菲、芴和芘的厭氧降解速率分別為(菌體濃度為5xl(f個/mL) : 0.97mg七—、d—、 0.05 mg.L".d"; 0.01 mg.L、d"及0.01 mg.L、d1。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種多環(huán)芳烴厭氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應用。在污染的土壤中按質(zhì)量比加入電子受體、硫化鈉和多環(huán)芳烴混合物，密封靜置6個月后在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按比例加入基礎培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的混合液，進行土壤馴化，在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向厭氧瓶內(nèi)加入多環(huán)芳烴、基礎培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑，按水與土的質(zhì)量比向厭氧瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤，并且按質(zhì)量比加入電子受體與硫化鈉。在溫度為20±2℃的旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)20～25天后進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，循環(huán)5次以上即可得到厭氧降解多環(huán)芳烴的微生物菌群。本方法能夠富集與馴化篩選到厭氧降解性能好的微生物菌群，對多環(huán)芳烴的降解速率范圍為0.01～1.04mg·L^-1·d^-1。
文檔編號A62D3/00GK101440354SQ200710188010
公開日2009年5月27日 申請日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者丁愛中, 豆俊峰 申請人:北京師范大學