專利名稱：一株降解菊酯類農(nóng)藥的芽孢桿菌及其菌劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及
農(nóng)藥的芽孢桿菌，及其菌劑的生產(chǎn)方法。
株分離自甘藍(lán)葉際的能高效降解擬除蟲菊酯類
背景技術(shù)：
菊酯類農(nóng)藥是廣譜性殺蟲劑，具有速效、高效、低毒、低殘留，對作物安全等特點， 能有效的防治糧油作物和經(jīng)濟(jì)作物的害蟲。近幾年來其使用量越來越大，擬除蟲菊酯已經(jīng) 成為傳統(tǒng)有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品之一，但是，菊酯類殺蟲劑在茶葉、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物上的過高 殘留，帶來了食品安全問題。近些年發(fā)現(xiàn)其對水生態(tài)系統(tǒng)也有較大危害，如王彥美等(高效 氯氟氰菊酯對黃鱔的急性毒性作用，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(12) :4999-5000)報道48h時 0. 0552 i！ g/L的高效氯氟氰菊酯即使黃鱔全部死亡。 國內(nèi)外對菊酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行了一些研究，主要有農(nóng)藥的使用和殘留、降低農(nóng)殘 的對策、農(nóng)藥在植物體內(nèi)和環(huán)境中的降解規(guī)律、農(nóng)藥降解微生物的研究等。但是，對于如何 降低農(nóng)殘的研究僅限于合理使用農(nóng)藥、改進(jìn)農(nóng)藝措施、加強(qiáng)管理等，還缺乏直接降低靶標(biāo)農(nóng) 藥殘留的有效方法；另外，對農(nóng)藥降解菌的研究多局限于菌株的分離及其生理特性的測定。
劉君寒等( 一株氯氰菊酯降解菌的分離和鑒定，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2007,30(3): 68-72)從氯氰菊酯污染土壤中，分離到一株可降解氯氰菊酯和聯(lián)苯菊酯銅綠假單胞菌。洪 永聰?shù)劝l(fā)表文章(蠟狀芽孢桿菌菌株TR2對氯氰菊酯降解作用的小區(qū)試驗，青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報(自然科學(xué)版)2008，24(4) :291-293)指出通過室內(nèi)盆栽和茶園小區(qū)的試驗，蠟狀芽孢 桿菌菌株TR2可有效減少茶園小區(qū)氯氰菊酯的殘留。 植物的葉際是指植物的地上部分，包括葉、莖、花、果等的表面或內(nèi)部的小環(huán)境。在 植物的葉際范圍內(nèi)生活著多種微生物，主要有細(xì)菌、真菌、放線菌等，這些在葉際生存的微 生物稱為葉際微生物。對于葉際微生物而言，植物葉際環(huán)境相當(dāng)惡劣，在強(qiáng)烈的日照下，其 表面干燥，溫度可以達(dá)到4(TC 55t:，紫外線強(qiáng)烈，而夜晚溫度又驟降，還有刮風(fēng)、下雨等 天氣變化等。因此，對于分離自土壤、污泥等來源的微生物，不一定能適應(yīng)植物葉際的惡劣 環(huán)境。本專利是從植物葉際分離出的一株菊酯類農(nóng)藥降解菌，能夠在植物葉際環(huán)境下保持 良好的降解性能。目前尚未發(fā)現(xiàn)從植物葉際分離出降解菊酯類農(nóng)藥的芽孢桿菌及其菌劑生 產(chǎn)方法的文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株分離自甘藍(lán)葉際的能夠高效降解菊酯類農(nóng)藥的芽孢桿 菌，并提供該菌劑的生產(chǎn)方法。 本發(fā)明所提供的生防菌株是由我們實驗室從甘藍(lán)的葉面上分離篩選出來的。將其 編號為TL-3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2008年 10月13日，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。保藏編號為:CGMCC No. 2698。 該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為FJ361191 。在http: 〃www. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登錄細(xì)菌菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行 比較，結(jié)果表明與枯草芽孢桿菌的相似性最高，可以達(dá)到99. 7%以上。
本發(fā)明所述的菌劑的生產(chǎn)方法如下
1、培養(yǎng)基配制 1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，
加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 3)種子培養(yǎng)基(液體，10L) :MgS041. 0g， KH2P045. 0g， NaCl 5. 0g， K2HP04 15. 0g， 蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5 ;4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) :MgS04 20g， KH2P04 100g， NaCl 100g， K2HP04300g， 糖蜜10kg， (NH4)2S04 lkg，加水至200L， pH 7. 0-7. 5 ;
以上培養(yǎng)基均在12rC滅菌20min。 2、菌種活化挑取菊酯類農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基，3(TC連續(xù)劃線挑單菌落 培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C ， 150r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜；
3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% _10%的接 種量接種菊酯農(nóng)藥降解菌，于25-37t:，通氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種菊酯類農(nóng)藥降解菌，于 25-37°C ，通氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。 5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至1(Tcell/mL，加入 甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%-2%)和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%-5%)，灌裝保藏。使用時用水稀 釋500-1000倍。 由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的菊酯類農(nóng)藥降解菌劑能夠有效降解作物表面殘留的菊 酯類農(nóng)藥。以下通過具體實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本 發(fā)明的精神實質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
實施例1 :菊酯類農(nóng)藥降解菌劑生產(chǎn)
(1)培養(yǎng)基配制 1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水 至1L， pH 7. 2 ; 2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L， pH
7. 2 ; 3)種子培養(yǎng)基(液體，10L) :MgS04 1. 0g， KH2P04 5. 0g， NaCl 5. 0g， K2HP04 15. 0g， 蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.2;4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) :MgS04 20g，KH2P04 1 00g，NaCl 100g，K2HP04 3 00g，糖 蜜10kg， (NH4)2S04 lkg，加水至200L， pH 7. 2 ;
以上培養(yǎng)基均在12rC滅菌20min。 2、菌種活化挑取菊酯類農(nóng)藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基，3(TC連續(xù)劃線挑單菌落 培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C ， 150r/min搖床振蕩培養(yǎng)過夜；
3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%的接種量接種菊酯農(nóng)藥降解菌，于3(TC，通氣培養(yǎng)20h，得到液體種子。 4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種菊酯類農(nóng)藥降解菌，于30°C， 通氣培養(yǎng)26h，得到活菌體培養(yǎng)物。 5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至1(Tcell/mL，加入
甘氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)和甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%)，灌裝保藏。 實施例2 :菊酯類農(nóng)藥降解菌劑對甘藍(lán)葉面高效氯氰菊酯降解效果 1)選取未經(jīng)施用高效氯氰菊酯的甘藍(lán)，選取兩個地塊，各15m2，噴灑施用量為3g/
畝； 2) 6h后，均勻噴施農(nóng)藥降解菌劑(用清水稀釋500倍)，以噴施清水作對照；
3)2d后，五點取樣法檢測甘藍(lán)葉面高效氯氰菊酯殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對照組高效 氯氰菊酯殘留量減少80%左右。 實施例3 :菊酯類農(nóng)藥降解菌劑對油菜葉面氟氯氰菊酯降解效果 1)選取未經(jīng)施用氟氯氰菊酯的油菜，選取兩個地塊，各15!112，噴灑施用量為lg/
畝； 2) 6h后，均勻噴施農(nóng)藥降解菌劑(用清水稀釋800倍)，以噴施清水作對照；
3)2d后，五點取樣法檢測油菜葉面氟氯氰菊酯的殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對照組氟氯 氰菊酯殘留量減少75%左右。
權(quán)利要求
一株能夠高效降解菊酯類農(nóng)藥的芽孢桿菌，其特征在于該菌株是一株枯草芽孢桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.2698。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞 交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為FJ361191。
3. 用權(quán)利要求1所述芽孢桿菌的菌劑生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以糖蜜為主 要營養(yǎng)物質(zhì)，步驟包括培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株分離自甘藍(lán)葉際的能夠高效降解菊酯類農(nóng)藥的芽孢桿菌，并提供該菌劑的生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)鑒定這株菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2698，該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為FJ361191。其菌劑的生產(chǎn)方法包括5個步驟培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的菊酯類農(nóng)藥降解菌劑能夠有效降解植物葉片表面菊酯類農(nóng)藥，減少農(nóng)藥殘留，保障食品安全，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
文檔編號A62D3/00GK101724580SQ20081022488
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者唐玲, 莊國強(qiáng), 莊緒亮, 張保國, 李林, 白志輝 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心