專利名稱：：一種具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
：有機(jī)磷農(nóng)藥是國內(nèi)外廣泛生產(chǎn)和使用的農(nóng)藥產(chǎn)品，是目前保證農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施之一。目前，甲胺磷、甲基對硫磷、樂果、馬拉硫磷、敵百蟲、敵敵畏、氧化樂果、對硫磷、毒死蜱等有機(jī)磷農(nóng)藥，占據(jù)我國農(nóng)藥的主導(dǎo)市場.雖然國家已出臺(tái)有關(guān)措施限制甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷、磷胺等五種高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的生產(chǎn)與銷售，但是由于有機(jī)磷農(nóng)藥的長期超量施用，致使目前有機(jī)磷農(nóng)藥的污染成為了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中最嚴(yán)重的污染源之一，研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥具有誘變性和致畸胎性，哺乳動(dòng)物的神經(jīng)和免疫系統(tǒng)疾病大多與有機(jī)磷農(nóng)藥相關(guān)，這些疾病包括瘋牛病、海灣戰(zhàn)爭綜合癥、帕金森綜合癥等。有機(jī)磷農(nóng)藥在土壤中發(fā)生積累遷移，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，引發(fā)食品安全問題，也制約了我國農(nóng)產(chǎn)品的出口。如何消除有機(jī)磷農(nóng)藥對環(huán)境和人類的危害，已成為事關(guān)人類健康和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的問題。因此迫切需要建立一種有效方法用于治理環(huán)境污染以及去除農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留。與常規(guī)化學(xué)(強(qiáng)堿水解等)、物理(光降解等)降解方法效率低下，其水解產(chǎn)物也是環(huán)境的污染物相比，微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥具有費(fèi)用低、環(huán)境影響小、可最大限度降低污染物濃度、降解徹底，可用于其他技術(shù)難以應(yīng)用的場地等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)藥的微生物降解是指在微生物作用下使農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致農(nóng)藥的化學(xué)和物理性質(zhì)改變的過程，通過將農(nóng)藥從大分子化合物降解為小分子化合物，最后成為H20與C02，實(shí)現(xiàn)對環(huán)境的無害化降解。在實(shí)際生產(chǎn)中，利用有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌降解生態(tài)環(huán)境中的殘留農(nóng)藥和農(nóng)產(chǎn)品表面的農(nóng)藥污染，將可明顯減少農(nóng)民不必要的經(jīng)濟(jì)損失和所導(dǎo)致的社會(huì)問題；利用生物降解技術(shù)可以加速環(huán)境中外源污染物的降解，同時(shí)也是一種經(jīng)濟(jì)、高效且對生態(tài)環(huán)境安全的清潔手段。現(xiàn)已成為環(huán)境農(nóng)藥污染治理工作的熱點(diǎn)。但是現(xiàn)有的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌對有機(jī)磷農(nóng)藥樂果的降解率僅為60%左右，對作物營養(yǎng)、抑病的作用未進(jìn)行研究，功能單一，實(shí)際應(yīng)用效果不穩(wěn)，極大的限制了有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的使用。而現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌菌株的菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。但目前具有機(jī)磷農(nóng)藥降解效果的枯草芽孢桿菌株未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一種具備營養(yǎng)、抑病的功效，且對有機(jī)磷農(nóng)藥具有高降解率的枯草芽孢桿菌。本發(fā)明具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10(Baci1lussubtilisSbM-lO)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.3583，保藏日期為2010年01月18日；枯草芽孢桿菌SbM-10為桿狀，長為2.03.0微米，寬為0.70.8微米，鏈狀排列，無莢膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上粗糙，不透明，不閃光，蔓延，為污白色。本發(fā)明具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO為革蘭氏陽性菌，淀粉水解實(shí)驗(yàn)為陽性，V.P.試驗(yàn)為陽性，明膠穿剌表面液化呈漏斗狀。本發(fā)明具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO在肉汁瓊斜面上生長豐厚，粗糙，不透明，蠟質(zhì)，奶油色。本發(fā)明具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO中的芽孢為圓形到圓柱形，中生到次端生，壁薄，在30hr內(nèi)形成。分別以卵磷脂和Ca3(P04)2作為有機(jī)磷源、無機(jī)磷源對本發(fā)明的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO進(jìn)行解磷性能的測定(測定方法參見農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY412-2000)，測定結(jié)果顯示在無機(jī)磷發(fā)酵液中，速效磷產(chǎn)生量為0.45%左右，有機(jī)磷發(fā)酵液中，速效磷產(chǎn)生量為1.5%左右，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SbM-lO不僅能將有機(jī)磷或無機(jī)磷降解，還可將有機(jī)磷或無機(jī)磷轉(zhuǎn)化成速效磷，為作物提供磷素營養(yǎng)，有利于農(nóng)作物的吸收利用，對農(nóng)作物的生長有良好的促進(jìn)作用；通過降解有機(jī)磷農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)可知本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SbM-lO(BacillussubtilisSbM-10)對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率達(dá)到了70%以上，與現(xiàn)有的機(jī)磷農(nóng)藥降解菌及其他枯草芽孢桿菌相比較，降解率高，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對有機(jī)磷農(nóng)藥的效果好。通過抑菌實(shí)驗(yàn)可知本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對尖包嫌刀菌Fusariumoxysporum、擬枝抱嫌刀菌Fusariumsporotrichiodes、交鏈抱菌Alternaria、灰葡萄抱屬Thielaviopsisbasicola、棒抱屬Corynespora禾口炭疽菌屬Colletotrichum生長均有明顯的抑制作用。本發(fā)明的的枯草芽孢桿菌SbM-lO從微生物肥料生產(chǎn)菌株中，篩選得到的，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對作物具有營養(yǎng)和抑病的同時(shí)，還對有機(jī)磷農(nóng)藥具有很好的降解作用，本發(fā)明的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO應(yīng)用范圍廣泛，可延伸微生物肥料在生物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO(BacillussubtilisSbM-lO)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2010年01月18日，保藏號為CGMCCNo.3583。圖1為具體實(shí)施方式一中的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO的菌體的掃描電鏡圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO(BacillussubtilisSbM-10)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.3583，保藏日期為2010年01月18日；枯草芽孢桿菌SbM-lO為桿狀，長為2.03.0微米，寬為0.70.8微米，鏈狀排列，無莢膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上粗糙，不透明，不閃光，蔓延，為污白色。參照2007年由沈萍編寫、高等教育出版社出版的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》和2004年由楊文博編寫、化學(xué)工業(yè)出版社出版的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》對本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO進(jìn)行生理生化特性鑒定枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，淀粉水解實(shí)驗(yàn)為陽性，V.P.試驗(yàn)為陽性，明膠穿剌表面液化呈漏斗狀。本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO的最適生長溫度為2830°C。本實(shí)施方式具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO的篩選方法按照以下方法進(jìn)行從活化好的微生物肥料菌株斜面中挑取12環(huán)，接種于含有質(zhì)量濃度為40%的樂果的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4872hr，逐漸增大樂果在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的質(zhì)量比例，樂果占無機(jī)鹽培養(yǎng)基的質(zhì)量比依次為4%。、5%。、7%。、8%。，在培養(yǎng)的同時(shí)觀察各菌體生長狀況及發(fā)酵液渾濁程度，選取生長速度快，耐受性好的菌株，通過對發(fā)酵液中樂果殘留量的測定，最終確定具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis;其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基由0.2gNaCl、0.5gMgS04、0.5gK2S04、0.2gCaC03、0.OOlgFeS04和1000mlH20組成。本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-lO的菌體的掃描電鏡圖如圖l所示。對本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10進(jìn)行解磷功效實(shí)驗(yàn)和抑病功效實(shí)驗(yàn)的功效實(shí)驗(yàn)，具體方法如下—、解磷功效實(shí)驗(yàn)1、解磷功效實(shí)驗(yàn)(營養(yǎng)作用)分別以卵磷脂作為有機(jī)磷源，Ca3(P04)2為無機(jī)磷源，進(jìn)行菌株解磷性能的測定(測定方法參見農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY412-2000)，將枯草芽孢桿菌(本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10)以0.5%接種量分別接種于有機(jī)磷或無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，在溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72hr;取發(fā)酵液10ml加入適量無磷活性炭lg脫色，12000r/min低溫離心20min，取5ml上清液，采用鉬銻鈧比色法，Lambda20分光光度計(jì)680nm進(jìn)行速效磷含量的測定，測定結(jié)果為無機(jī)磷發(fā)酵液中，速效磷含量為O.432%;有機(jī)磷發(fā)酵液中，速效磷含量為1.481%;本實(shí)施方式的枯草芽孢桿菌SbM-10不僅能將有機(jī)磷或無機(jī)磷降解，還可將有機(jī)磷或無機(jī)磷轉(zhuǎn)化成速效磷，為作物提供磷素營養(yǎng)，有利于農(nóng)作物的吸收，對農(nóng)作的生長有良好的促進(jìn)作用；本實(shí)施方式的枯草芽孢桿菌對作物具有明顯的營養(yǎng)作用。2、降解有機(jī)磷農(nóng)藥樂果采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行降解有機(jī)磷樂果功效實(shí)驗(yàn)。第一組實(shí)驗(yàn)分別用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基和肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)；向無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基或肉湯液體培養(yǎng)基中按2%。質(zhì)量百分比加入質(zhì)量濃度為40%樂果(沙隆達(dá)鄭州農(nóng)藥有限公司產(chǎn))，其中無機(jī)鹽液體培養(yǎng)由0.5gKH2P04、0.5gK2HP04、0.2MgS04、0.lgCaCl2、0.2gNaC1、0.0001gMnS04、0.0001gFeCl3、1.0g(NH4)2S04禾P1000mlH20組成，肉湯液體培養(yǎng)基由3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl和1000mlH20組成。第二組實(shí)驗(yàn)分別用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基和肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)；向無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基或肉湯液體培養(yǎng)基中按4%。質(zhì)量百分比加入質(zhì)量濃度為40%樂果(沙隆達(dá)鄭州農(nóng)藥有限公司產(chǎn))，其中無機(jī)鹽液體培養(yǎng)由0.5gKH2P04、0.5gK2HP04、0.2MgS04、0.lgCaCl2、0.2gNaC1、0.0001gMnS04、0.0001gFeCl3、1.0g(NH4)2S04禾P1000mlH20組成，肉湯液體培養(yǎng)基由3.Og牛肉膏、10.Og蛋白胨、5.OgNaCl和1000mlH20組成。這兩組實(shí)驗(yàn)的具體操作如下向培養(yǎng)基加入樂果后，將本實(shí)施方式的枯草芽孢桿菌SbM-lO(BacillussubtilisSbM-10)按照1%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度為3(TC、轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72hr;然后取發(fā)酵液10ml，加入20ml乙腈(氣相色譜級)、2gNaCl充分震蕩，靜止30min，吸取10ml有機(jī)相，8(TC水浴蒸發(fā)至干，加10ml丙酮(氣相色譜級)溶解，用于氣相色譜測定。色譜條件色譜儀Agilent6890N;自動(dòng)進(jìn)樣器Agilent768;色譜柱50%聚苯基甲基硅氧烷(DB-17)，30mX0.53mrnX1.0ym;進(jìn)樣口溫度220。C;檢測器溫度250。C;柱溫15(TC(保持2min)—250°C(保持12min)，升溫速度8°C/min。氣體及流量載氣氮?dú)?，純度^99.999%，流速為10mL/min。燃?xì)?氫氣，純度^99.999%，流速為75mL/min;助燃?xì)饪諝猓魉贋?00mL/min。樂果的降解率測定方法參考中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T761-2008。這兩組實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果如表2所示。表2枯草芽孢桿菌對樂果的降解率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，第一組采用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對樂果的降解率為79.79%，采用肉湯液體培養(yǎng)基的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對樂果的降解率為91.49%;第二組采用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對樂果的降解率為73.59%，采用肉湯液體培養(yǎng)基的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對樂果的降解率為84.97%。通過這兩組實(shí)驗(yàn)可以看出，對于不同濃度的樂果，本實(shí)施方式的枯草芽孢桿菌均具有很好的降解效果。二、抑病功效實(shí)驗(yàn)抑病功效實(shí)驗(yàn)室條件下，挑取已活化好菌株(本實(shí)施方式的具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10)斜面12環(huán)于無菌水中，振蕩均勻，吸取0.05ml菌懸液于PDA培養(yǎng)基平板上，用玻璃刮刀涂勻后，在平板中心分別接種各病原菌，同時(shí)，將病原菌接種于空白平板上作為對照，菌塊直徑約5mm。各處理3次重復(fù)，3(TC恒溫培養(yǎng)，57d觀察生長狀況，測定各平板上病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(A-接種菌的處理組病原菌菌落直徑，cm，B-對照組病原菌菌落直徑，cm，0.5-接種點(diǎn)病原菌菌落直徑，cm)測定結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，對尖包嫌刀菌Fusariumoxysporum、擬枝抱嫌刀菌Fusariumsporotrichiodes、交鏈抱菌Alternaria、灰葡萄抱屬Thielaviopsisbasicola、棒抱屬Corynespora禾口炭疽菌屬Co11etotrichum生長均有明顯的抑制作用，對尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum的抑制率為44.2%、對擬枝孢鐮刀菌Fusariumsporotrichiodes的抑制率為81.0%、對交鏈孢菌Alternaria的抑制率為45.2%、對灰葡萄孢屬Thielaviopsisbasicola的抑制率為52.1%、對棒孢屬Corynespora的抑制率為47.1%、對炭疽菌屬Colletotrichum的抑制率為100%。本實(shí)施方式的枯草芽孢桿菌對病原菌生長的影響如表1所示。表l枯草芽孢桿菌對病原菌生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注CK表示未接種枯草芽孢桿菌的對照組病原菌菌落直徑，處理表示接種枯草芽孢桿菌病原菌菌落直徑。權(quán)利要求一種具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌，其特征在于具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10(BacillussubtilisSbM-10)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.3583，保藏日期為2010年01月18日；枯草芽孢桿菌SbM-10為桿狀，長為2.0～3.0微米，寬為0.7～0.8微米，鏈狀排列，無莢膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上粗糙，不透明，不閃光，蔓延，為污白色。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌，其特征在于具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌SbM-10為革蘭氏陽性菌，淀粉水解實(shí)驗(yàn)為陽性，V.P.試驗(yàn)為陽性，明膠穿剌表面液化呈漏斗狀。全文摘要一種具有營養(yǎng)、抑病及降解有機(jī)磷農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌，它涉及一種枯草芽孢桿菌。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的降解率低、對作物沒有營養(yǎng)、抑菌的作用的問題。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌SbM-10，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為3583，保藏日期為2010年01月18日；枯草芽孢桿菌為桿狀，長為2.0～3.0微米，寬為0.7～0.8微米，鏈狀排列，無莢膜，有芽孢；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上粗糙，不透明，不閃光，蔓延，為污白色。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對作物具有營養(yǎng)和抑病作用的同時(shí)，還對有機(jī)磷農(nóng)藥具有很好的降解作用，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌應(yīng)用范圍廣泛。文檔編號A62D3/02GK101787354SQ20101010934公開日2010年7月28日申請日期2010年2月11日優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日發(fā)明者吳皓瓊,曹亞彬,殷博,牛彥波,郭立姝申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所